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9.14: E. coli als Modellsystem - Biologie


Jede Oberfläche Ihres Körpers beherbergt ein blühendes mikrobielles Ökosystem. Dies gilt insbesondere für den Magen-Darm-Trakt, der von Mund und Speiseröhre (mit einem Umweg in die Nase) über den Magen in den Dünn- und Dickdarm und den Dickdarm verläuft291. Diese Umgebungen unterscheiden sich in Bezug auf eine Reihe von Eigenschaften, einschließlich Unterschieden in pH und O2 Ebenen. In der Nähe von Mund und Speiseröhre O2 sind hoch und Mikroben können aerobe (O2 abhängige) Atmung, um Energie aus der Nahrung zu gewinnen. Durch das System bewegen O2 die Spiegel sinken bis anaerob (ohne O2) Mechanismen erforderlich sind. An verschiedenen Stellen entlang der Länge des Magen-Darm-Trakts werden Mikroben mit unterschiedlichen ökologischen Präferenzen und Anpassungsfähigkeiten gefunden.

Eine Herausforderung im Zusammenhang mit der Charakterisierung der genauen Komplexität des Mikrobioms, das an verschiedenen Orten vorhanden ist, besteht darin, dass die vorhandenen Organismen oft für ihr Wachstum voneinander abhängig sind; wenn sie voneinander isoliert sind, wachsen sie nicht. Die Standardmethode zum Zählen von Bakterien besteht darin, sie im Labor mit Platten mit Wachstumsmedien zu züchten. Die Proben werden so verdünnt, dass einzelne Bakterien (isoliert voneinander) auf der Platte landen. Wenn sie wachsen und sich teilen, bilden sie makroskopische Kolonien und es ist möglich, die Anzahl der „koloniebildenden Einheiten“ (KBE) pro ursprünglichem Probenvolumen zu zählen. Dies liefert ein Maß für die Anzahl der einzelnen vorhandenen Bakterien. Wenn ein Organismus unter den Testbedingungen keine Kolonie bilden kann, scheint er in der Population nicht vorhanden zu sein. Aber wie bereits erwähnt, sind einige Bakterien völlig von anderen abhängig und wachsen daher nicht isoliert. Um dieses Problem zu vermeiden, verwenden neuere molekulare Methoden DNA-Sequenzanalysen, um zu identifizieren, welche Organismen vorhanden sind, ohne sie züchten zu müssen292. Das Ergebnis dieser Art von Analyse zeigt die wahre Komplexität der mikrobiellen Ökosysteme, die auf und in uns leben293.

Für unsere Zwecke konzentrieren wir uns auf ein bekanntes, aber relativ kleines Mitglied dieser mikrobiellen Gemeinschaft, Escherichia coli294. E coli gehört zur Familie der Enterobacteriaceae und kommt im Dickdarm von Vögeln und Säugetieren vor295. coli ist ein sogenannter fakultativer Aerobier, der sowohl in einer anaeroben als auch in einer aeroben Umgebung überleben kann. Diese Flexibilität sowie E. coli Im Allgemeinen machen die nicht anspruchsvollen Nährstoffanforderungen die Züchtung im Labor einfach. Darüber hinaus ist der häufig verwendete Laborstamm von E coli, bekannt als K12, verursacht beim Menschen keine Krankheit. Das heißt, es gibt andere Stämme von E coli, wie zum Beispiel E coli O157:H7, das pathogen ist (krankheitserregend). coli O157:H7 enthält 1.387 Gene, die nicht im E coli K12. Es wird geschätzt, dass die beiden E coli Stämme wichen vor etwa 4 Millionen Jahren von einem gemeinsamen Vorfahren ab. Die Details dessen, was macht E coli O157: H7 pathogen ist ein faszinierendes Thema, das hier aber nicht unseren Rahmen sprengt296.

Adaptives Verhalten und Gennetzwerke (die Lac-Antwort): Lactose ist ein Disaccharid (ein Zucker) bestehend aus D-Galactose und D-Glucose. Es wird biologisch ausschließlich von weiblichen Säugetieren synthetisiert. Säugetiere verwenden Laktose in der Milch als Kalorienquelle (Energie) für Säuglinge. Ein Grund (es wird vermutet) ist, dass Laktose von den meisten Mikroben nicht leicht verdaut wird. Das Lactose-Synthesesystem stammt aus einer evolutionären Modifikation eines angestammten Gens, das das Enzym Lysozym kodiert. Durch Duplikation und Mutation wurde ein Gen erzeugt, das für das Protein α-Lactoalbumin kodiert. α-Lactoalbumin wird nur in Brustdrüsen exprimiert, wo es mit einem ubiquitär exprimierten Protein, der Galactosyltransferase, einen Komplex bildet, um das Protein Lactose-Synthase zu bilden297.

E coli ist in der Lage, Laktose zu verstoffwechseln, aber nur, wenn es keinen besseren (einfacheren) Zucker gibt. Wenn Glukose oder andere Verbindungen in der Umwelt vorhanden sind, werden die Gene, die für die Verstoffwechslung von Laktose erforderlich sind, ausgeschaltet. Für werden zwei Gene benötigt E coli Laktose zu verstoffwechseln. Die erste kodiert Laktosepermease. Laktose, die groß und stark hydrophil ist, kann nicht durch die E coli Zellmembran. Lactosepermease ist ein Membranprotein, das es der Laktose ermöglicht, in die Zelle einzudringen und ihren Konzentrationsgradienten herunterzubewegen. Das zweite Gen, das an der Laktoseverwertung beteiligt ist, kodiert für das Enzym β-Galactosidase, das Laktose in D-Galactose und D-Glucose spaltet, die beide durch Proteine, die konstitutiv (dh ständig) in der Zelle exprimiert werden, metabolisiert werden können. Wie genau funktioniert dieses System? Wie werden die Gene zur Laktoseverwertung in Abwesenheit von Laktose ausgeschaltet und wie werden sie eingeschaltet, wenn Laktose vorhanden ist und Energie benötigt wird? Die Antworten veranschaulichen allgemeine Prinzipien der Interaktionsnetzwerke, die die Genexpression steuern.

In E coli, wie bei vielen Bakterien sind mehrere Gene in sogenannten Operons organisiert. In einem Operon kontrolliert eine einzelne regulatorische Region die Expression mehrerer Gene. Es ist auch bei Bakterien üblich, dass mehrere Gene, die an einem einzigen Stoffwechselweg beteiligt sind, im gleichen Operon (im gleichen Bereich der DNA) lokalisiert sind. Ein wirkungsvoller Ansatz zur Untersuchung von Genen ist die Suche nach relevanten mutierten Phänotypen. Wie gesagt, Wildtyp (also normal) E coli können auf Laktose als einzige Energiequelle wachsen. Um die Laktoseverwertung zu verstehen, können wir also mutant aussehen E coli die nicht auf Laktose wachsen können298. Um das Screening auf solche Mutationen relevanter zu machen, prüfen wir zunächst, ob die Mutante auf Glukose wachsen kann. Wieso den? Weil wir (in diesem Fall) nicht wirklich an Mutationen in Genen interessiert sind, die den normalen Stoffwechsel stören, zum Beispiel die Fähigkeit, Glukose zu verwenden; Wir wollen die Gene verstehen, die an dem spezifischen Prozess des Laktosestoffwechsels beteiligt sind. Eine solche Analyse ergab eine Reihe von unterschiedlichen Mutationsklassen:. einige führten zu einer Unfähigkeit, auf das Vorhandensein von Laktose im Medium zu reagieren, andere führten zur Derepression, das heißt der konstanten Expression von zwei Genen, die an der Fähigkeit zur Verstoffwechslung von Laktose beteiligt sind, Laktosepermease und β-Galactosidase. In diesen mutierten Stämmen wurden beide Gene exprimiert, wenn Lactose vorhanden war oder nicht. Durch Kartierung (mit dem Hfr-System, siehe oben), wo sich diese Mutationen im Genom von . befinden E coliund einer Reihe anderer Experimente wurde das folgende Modell erzeugt.

Die Gene, die Laktosepermease kodieren (Spitzen) und β-Galactosidase (lacZ) sind Teil eines Operons, bekannt als lac Operon. Dieses Operon wird durch zwei verschiedene Faktoren reguliert. Die erste ist das Produkt eines konstitutiv aktiven Gens, lacI, das ein Polypeptid kodiert, das sich zu einem tetrameren Protein zusammenfügt, das als Transkriptionsrepressor wirkt. In einer typischen Zelle sind ~10 lac-Repressorproteine ​​vorhanden. Das lac-Repressorprotein bindet an Stellen im Promotor des lac Operon. Wenn es an diese Stellen gebunden ist, blockiert das Repressorprotein die Transkription (Expression) des lac Operon. Die Bindungsstellen des Repressors innerhalb des lac Der Operon-Promotor scheint seine einzige funktionell signifikante Bindungsstelle im gesamten zu sein E coli Genom. Das zweite regulatorische Element im System ist als Aktivatorstelle bekannt. Es kann das Katabolyt-Aktivatorprotein (oder CAP) binden, das von einem Gen kodiert wird, das sich außerhalb des lac-Operons befindet. Die DNA-Bindungsaktivität von CAP wird durch die Bindung eines Cofaktors, des zyklischen Adenosinmonophosphats (cAMP), reguliert. cAMP reichert sich in der Zelle an, wenn Nährstoffe, insbesondere Nährstoffe, die freie Energie liefern (wie Glukose), niedrig sind. Seine Anwesenheit dient als Signal dafür, dass die Zelle Energie benötigt. In Abwesenheit von cAMP bindet CAP nicht an oder aktiviert die Expression von lac Operon, aber in seiner Gegenwart (d. h. wenn Energie benötigt wird) ist das CAP-cAMP-Protein aktiv, bindet an eine Stelle im lac Operon-Promotor, rekrutiert und aktiviert RNA-Polymerase, was zur Synthese von Lactosepermease- und β-Galactosidase-RNAs und -Proteinen führt. Aber selbst wenn die Energieniveaus niedrig sind (und die cAMP-Werte hoch sind), ist die lac Operon ist in Abwesenheit von Lactose inaktiv, da das lac-Repressorprotein an Stellen (mit 0 . markiert)1, 02, und 03) in lac die regulatorische Region des Operons.

Was passiert also, wenn Laktose in der Umgebung der Zelle auftritt? Nun, offensichtlich nichts, da die Zellen den Lac-Repressor exprimieren, also keine Lactose-Permease vorhanden ist und die Lactose ohne sie nicht in die Zelle gelangen kann. Diese Vorhersage setzt jedoch voraus, dass das System auf molekularer Ebene perfekt und deterministisch funktioniert. Dies ist jedoch nicht der Fall, das System ist jedoch stochastisch, das heißt, es unterliegt zufälligen Prozessen - es ist verrauscht und wahrscheinlich. Angesichts der geringen Anzahl von lac-Repressormolekülen pro Zelle (~10) gibt es einen kleinen, aber signifikanten Wahrscheinlichkeit, dass das lac-Operon einer bestimmten Zelle zufällig frei von gebundenem Repressor ist. Wenn dies unter Bedingungen auftritt, in denen CAP aktiv ist, dann sehen wir, wenn Laktose vorhanden ist, die Wirkung einer positiven Rückkopplungsschleife299. Wenn Laktose hinzugefügt wird, reagieren diejenigen Zellen, die zufällig sowohl die Laktosepermease als auch die β-Galactosidase (ein kleiner Prozentsatz der gesamten Zellpopulation) exprimiert haben: Laktose dringt in diese Zellen ein (da die Permease vorhanden ist) und da auch β-Galactosidase vorhanden ist, wird es in Allolacton umgewandelt (eine durch β-Galactosidase katalysierte Reaktion. Allolacton bindet an das lac-Repressorprotein und hemmt dessen Aktivität. In Gegenwart von Allolacton hemmt der Repressor nicht mehr lac Operon-Expression und es gibt einen weiteren Anstieg (~1000-fach) der Expressionsrate von Lactosepermease und β-Galactosidase. β-Galactosidase katalysiert auch die Hydrolyse von Lactose zu D-Galactosidase und D-Glucose, die dann zum Antrieb des Zellstoffwechsels verwendet werden. Durch diesen Prozess geht die Zelle im Wesentlichen von keinem Ausdruck der lac Operon zur vollständigen Expression und wird bei voller Expression in der Lage, Laktose zu metabolisieren. Gleichzeitig werden diejenigen Zellen, die (zufällig) keine Lactosepermease und β-Galactosidase exprimieren, überhaupt nicht in der Lage sein, Lactose zu metabolisieren. Also obwohl alle E coli Zellen, die in einer Kultur vorhanden sind, können genetisch identisch sein, sie können aufgrund der stochastischen Natur der Genexpression verschiedene Phänotypen exprimieren. Ein Beispiel für ein solches Verhalten ist im Applet „Grundlagen der PhET-Genexpression“ dargestellt300. Im Fall des lac-Systems führt die verrauschte Natur der Genexpression mit der Zeit dazu, dass immer mehr Zellen ihre Kopie des lac-Operons aktivieren. Sobald Laktose im System vorhanden ist, hält ihr Eintritt in die Zelle und ihre Umwandlung in Allolacton das lac-Repressorprotein in einem inaktiven Zustand und ermöglicht eine fortgesetzte Expression des lac-Operons.

Was passiert, wenn Laktose aus der Umwelt verschwindet, was bestimmt, wie lange es dauert, bis die Zellen in den Zustand zurückkehren, in dem sie die Laktose nicht mehr exprimieren lac Operon? Die Antwort wird durch die Auswirkungen von Zellteilung und Regulationsprozessen bestimmt. In Abwesenheit von Laktose sinkt die Allolactonkonzentration und das lac-Repressorprotein kehrt in seinen aktiven Zustand zurück und hemmt die Expression des lac Operon. Es wird keine neue Lactosepermease und β-Galactosidase synthetisiert und ihre Konzentrationen werden aufgrund des Abbaus sinken. Gleichzeitig und weil ihre Synthese gestoppt wurde, nimmt die Konzentration der Lactosepermease und der β-Galactosidase mit jeder Zellteilung um ~50% ab. Mit der Zeit werden die Proteine ​​verdünnt (und abgebaut) und so kehren die Zellen in den Ausgangszustand zurück, d lac Operon ausgeschaltet und keine Kopien von Lactosepermease oder β-Galactosidase vorhanden.


Verringerung der Energieüberflutung Escherichia coli kontinuierliche Kulturen mit steigender spezifischer Wachstumsrate und Kohlenstoffverschwendung

Wachstumssubstrate, aerobe/anaerobe Bedingungen, spezifische Wachstumsrate (μ) etc. stark beeinflussen Escherichia coli Zellphysiologie hinsichtlich Zellgröße, Biomassezusammensetzung, Gen- und Proteinexpression. Um die Regulation hinter diesen unterschiedlichen Phänotypeigenschaften zu verstehen, ist es nützlich, Kohlenstoffflussmuster im metabolischen Netzwerk zu kennen, die im Allgemeinen durch metabolische Flussanalyse (MFA) berechnet werden. Selten wird jedoch in denselben Experimenten die Zusammensetzung der Biomasse und die Kohlenstoffbilanz sorgfältig gemessen, was möglicherweise zu verzerrten MFA-Ergebnissen und fragwürdigen Schlussfolgerungen führen könnte. Daher führten wir in denselben Experimenten sowohl eine detaillierte Kohlenstoffbilanz- als auch eine Biomassezusammensetzungsanalyse durch, um eine genauere quantitative Analyse des Stoffwechsels und der MFA zu ermöglichen.

Ergebnisse

Wir haben fortschrittliche kontinuierliche Kultivierungsmethoden (A-Stat und D-Stat) zur kontinuierlichen Überwachung angewendet E coli K-12 MG1655 Fluss- und Energiemetabolismus-dynamische Reaktionen auf eine Änderung der μ- und Glukose-Acetat-Co-Nutzung. Überraschenderweise wurde eine Reduzierung des ATP-Austritts um 36 % mit zunehmender μ und Kohlenstoffverschwendung an Nicht-CO . festgestellt2 Nebenprodukte bei konstanter Biomasseausbeute. Die offensichtliche Diskrepanz zwischen konstantem Biomasseertrag und Rückgang des ATP-Austritts könnte durch den Anstieg der Kohlenstoffverschwendung von 3 auf 11% in der Kohlenstoffbilanz erklärt werden, der durch das entdeckte neue Ausscheidungsprofil von E coli Pyrimidin-Weg-Zwischenprodukte Carbamoyl-Phosphat, Dihydroorotat und Orotat. Wir fanden heraus, dass die Muster der Kohlenstoffverschwendung nicht nur von μ, sondern auch von der Fähigkeit zur gemeinsamen Nutzung von Glukose-Acetat abhängen. Die Akkumulation dieser Verbindungen wurde an das zweiphasige Acetatakkumulationsprofil gekoppelt. Ein Acetatüberlauf wurde parallel zur Verringerung des TCA-Zyklus und der Glykolyseflüsse und der Induktion des Pentosephosphatwegs beobachtet.

Schlussfolgerungen

Daraus kann geschlossen werden, dass der Acetatstoffwechsel einer der wichtigsten regulierenden Faktoren des zentralen Kohlenstoffstoffwechsels ist. Noch wichtiger ist, dass unsere Modellrechnungen mit der tatsächlichen Biomassezusammensetzung und detaillierten Kohlenstoffbilanzanalysen unter stationären Bedingungen mit -omics-Datenvergleich die Bedeutung eines umfassenden systembiologischen Ansatzes für ein besseres Verständnis der Stoffwechsel- und Kohlenstoffumleitungsmechanismen zeigen, die möglicherweise zu mehr Erfolg führen metabolische Technik.


Organisation und Sequenz des Genoms

Sequenzanalyse. Um die zusammenhängende Genomsequenz zu erhalten, wurde ein kombinierter Ansatz verwendet, der die systematische Sequenzanalyse ausgewählter Large-Insert-Klone (Cosmide und BACs) sowie zufälliger Small-Insert-Klone aus einer Whole-Genom-Shotgun-Bibliothek umfasste. Dies gipfelte in einer zusammengesetzten Sequenz von 4.411.529 Basenpaaren (bp) (Fig. 1, 2 (PDF-Datei: 890K)) mit einem G + C-Gehalt von 65,6%. Dies ist die zweitgrößte derzeit verfügbare bakterielle Genomsequenz (nach der von Escherichia coli) 9 . Das Initiationscodon für die dnaA Gen, ein Kennzeichen für den Ursprung der Replikation, oriC, wurde als Startpunkt für die Nummerierung gewählt. Das Genom ist reich an repetitiver DNA, insbesondere an Insertionssequenzen, und an neuen Multigenfamilien und duplizierten Haushaltsgenen. Der G + C-Gehalt ist im gesamten Genom relativ konstant (Abb. 1), was darauf hindeutet, dass horizontal übertragene Pathogenitätsinseln mit atypischer Basenzusammensetzung wahrscheinlich fehlen. Mehrere Regionen mit einem überdurchschnittlich hohen G + C-Gehalt (Fig. 1) wurden nachgewiesen. Diese entsprechen Sequenzen, die zu einer großen Genfamilie gehören, die die polymorphen G + C-reichen Sequenzen (PGRSs) umfasst.

Der äußere Kreis zeigt die Skala in MB, wobei 0 den Replikationsursprung darstellt. Der erste Ring von außen bezeichnet die Positionen der stabilen RNA-Gene (tRNAs sind blau, andere sind rosa) und die direkte Wiederholungsregion (rosa Würfel) der zweite Ring nach innen zeigt die kodierende Sequenz pro Strang (im Uhrzeigersinn, dunkelgrün gegen den Uhrzeigersinn, hellgrün ) der dritte Ring zeigt repetitive DNA (Insertionssequenzen, orange 13E12 REP-Familie, dunkelrosa Prophagen, blau) der vierte Ring zeigt die Positionen der Mitglieder der PPE-Familie (grün) der fünfte Ring zeigt die Mitglieder der PE-Familie (violett, ohne PGRS) und der sechste Ring zeigt die Positionen der PGRS-Sequenzen (dunkelrot). Das Histogramm (Mitte) stellt den G+C-Gehalt dar, mit <65 % G+C in Gelb und >65 % G+C in Rot. Die Figur wurde mit Software von DNASTAR erstellt.

Gene für stabile RNA. Es wurden 50 Gene gefunden, die für funktionelle RNA-Moleküle kodieren. Diese Moleküle waren die drei Spezies, die von dem einzigartigen ribosomalen RNA-Operon produziert wurden, der 10Sa-RNA, die am Abbau von Proteinen beteiligt ist, die von abnormaler Messenger-RNA kodiert werden, der RNA-Komponente von RNase P und 45 Transfer-RNAs. No4.5S-RNA konnte nachgewiesen werden. Die rrn Operon ist ungewöhnlich lokalisiert, da es etwa 1.500 Kilobasen (kb) vom mutmaßlichen oriC die meisten Eubakterien haben eine oder mehrere rrn Operons in der Nähe von oriC um den während der Replikation erhaltenen Gendosiseffekt auszunutzen 10 . Diese Anordnung kann mit dem langsamen Wachstum von . zusammenhängen M. tuberkulose. Die Gene, die für tRNAs kodieren, die 43 der 61 möglichen Sense-Codons erkennen, waren im gesamten Genom verteilt, und mit einer Ausnahme verwendet keines dieser Gene A an der ersten Position des Anticodons, was darauf hindeutet, dass während der Translation ein starkes Wobble auftritt. Dies steht im Einklang mit dem hohen G + C-Gehalt des Genoms und der daraus resultierenden Voreingenommenheit bei der Codon-Nutzung. Drei Gene, die tRNAs für Methionin kodieren, wurden gefunden, eines dieser Gene (metV) befindet sich in einer Region, die dem Replikationsterminus entsprechen kann ( 1 , 2 (PDF-Datei: 890 K)). Wie metV ist mit defekten Genen für Integrase und Exzision verbunden, vielleicht war es einmal Teil eines Phagen oder eines ähnlichen mobilen genetischen Elements.

Insertionssequenzen und Prophagen. Sechzehn Kopien der promiskuitiven Insertionssequenz IS6110 und sechs Kopien des stabileren Elements IS1081 befinden sich im Genom von H37Rv 8 . Eine Kopie von IS1081 ist abgeschnitten. Die Untersuchung der genomischen Sequenz führte zur Identifizierung von weiteren 32 verschiedenen Insertionssequenzelementen, von denen die meisten noch nicht beschrieben wurden, und der 13E12-Familie repetitiver Sequenzen, die einige der Eigenschaften mobiler genetischer Elemente aufweisen (Abb. 1) . Die neu entdeckten Insertionssequenzen gehören hauptsächlich zu den IS3 und ist256 Familien, obwohl sechs von ihnen eine neue Gruppe definieren. Es gibt weitgehende Ähnlichkeit zwischen IS1561 und ist1552 mit Einfügungssequenzelementen gefunden in Nokardie und Rhodococcus spp., was darauf hindeutet, dass sie unter den Actinomyceten weit verbreitet sein könnten.

Die meisten Einfügungssequenzen in M. tuberkulose H37Rv scheint in intergene oder nicht-kodierende Regionen, oft in der Nähe von tRNA-Genen, inseriert worden zu sein ( 1 ). Viele sind geclustert, was auf die Existenz von Insertions-Hotspots hindeutet, die verhindern, dass Gene inaktiviert werden, wie es für beschrieben wurde Rhizobium 11. Die chromosomale Verteilung der Insertionssequenzen ist informativ, da anscheinend eine Selektion gegen Insertionen im Quadranten stattgefunden hat oriC und eine Überrepräsentation in der direkten Wiederholungsregion, die den Prototyp IS . enthält6110. Dieser Bias wurde auch experimentell in einer Transposon-Mutagenese-Studie beobachtet 12 .

Mindestens zwei Prophagen wurden in der Genomsequenz nachgewiesen und ihre Anwesenheit könnte erklären, warum M. tuberkulose zeigt eine anhaltende Lyse auf niedrigem Niveau in der Kultur. Die Prophagen phiRv1 und phiRv2 sind beide 10 kb lang und ähnlich organisiert, und einige ihrer Genprodukte weisen eine deutliche Ähnlichkeit mit denen auf, die von bestimmten Bakteriophagen aus kodiert werden Streptomyces und saprophytische Mykobakterien. Die Insertionsstelle von phiRv1 ist faszinierend, da sie einem Teil einer repetitiven Sequenz der 13E12-Familie entspricht, die selbst in das Biotin-Operon integriert zu sein scheint. Einige Stämme von M. tuberkulose beschrieben, dass Biotin als Wachstumsergänzung benötigt wird, was darauf hindeutet, dass phiRv1 einen polaren Effekt auf die Expression der distalen bio Genen oder dass eine abweichende Exzision auftreten kann, die zu einer Mutation führt. Während der seriellen Dämpfung von M. bovis das führte zum Impfstamm M. bovis BCG, der phiRv1-Prophage, ging verloren 13 . In einer systematischen Untersuchung der genomischen Diversität von Prophagen und Insertionssequenzen (S.V.G. et al., Manuskript in Vorbereitung), nur IS1532 zeigte eine signifikante Variabilität, was darauf hinweist, dass die meisten Prophagen und Insertionssequenzen derzeit stabil sind. Aus diesen kombinierten Beobachtungen kann jedoch geschlossen werden, dass der horizontale Transfer von genetischem Material in den freilebenden Vorfahren der M. tuberkulose Der Komplex trat wahrscheinlich in der Natur auf, bevor der Tuberkelbazillus seine spezialisierte intrazelluläre Nische einnahm.

Gene, die Proteine ​​kodieren. 3.924 offene Leserahmen wurden im Genom identifiziert (siehe Methoden), was ∼ 91 % der potentiellen Kodierungskapazität ausmacht (Abb. 1, 2 (PDF-Datei: 890 K)). Einige dieser Gene scheinen Stoppcodons im Leseraster oder Leserastermutationen zu haben (unabhängig von der Quelle der sequenzierten DNA) und können entweder Leserasterverschiebung während der Translation verwenden oder Pseudogenen entsprechen. In Übereinstimmung mit dem hohen G + C-Gehalt des Genoms werden GTG-Initiationscodons (35%) häufiger verwendet als in Bacillus subtilis (9%) und E coli (14%), obwohl ATG (61%) der häufigste translationale Start ist. Es gibt einige Beispiele für atypische Initiationscodons, das bemerkenswerteste ist das ATC, das von verwendet wird infC, die in beiden mit ATT beginnt B. subtilis und E coli 9, 14. Die Ausrichtung der Gene (Abb. 1) ist in Bezug auf die Replikationsrichtung leicht verzerrt, da ∼ 59 % mit der gleichen Polarität wie die Replikation transkribiert werden, verglichen mit 75 % in B. subtilis. In anderen Bakterien wird angenommen, dass Gene, die in die gleiche Richtung wie die Replikationsgabeln transkribiert werden, effizienter exprimiert werden 9 , 14 . Auch hier ist die gleichmäßigere Verteilung der Genpolarität in M. tuberkulose kann das langsame Wachstum und die seltenen Replikationszyklen widerspiegeln. Drei Gene (dnaB, recA und Rv1461) wurden von Sequenzen befallen, die für Inteine ​​(Proteinintrons) kodieren, und in allen drei Fällen ihre Gegenstücke in M. leprae enthalten auch Inteine, aber an anderen Stellen 15 (S.T.C. et al., unveröffentlichte Beobachtungen).

Proteinfunktion, Zusammensetzung und Vervielfältigung. Durch verschiedene Datenbankvergleiche haben wir ∼ 40 % der vorhergesagten Proteine ​​genaue Funktionen zugeschrieben und bei weiteren 44 % Informationen oder Ähnlichkeiten gefunden. Die restlichen 16% ähnelten keinem bekannten Protein und könnten für spezifische mykobakterielle Funktionen verantwortlich sein. Untersuchung der Aminosäurezusammensetzung der M. tuberkulose Proteom durch Korrespondenzanalyse 16 und der Vergleich mit dem anderer Mikroorganismen, deren Genomsequenzen verfügbar sind, ergab eine statistisch signifikante Präferenz für die Aminosäuren Ala, Gly, Pro, Arg und Trp, die alle von G + C-reichen Codons kodiert werden, und eine vergleichsweise Verringerung der Verwendung von Aminosäuren, die von A + T-reichen Codons wie Asn, Ile, Lys, Phe und Tyr kodiert werden (Fig. 3). Dieser Ansatz identifizierte auch zwei Gruppen von Proteinen, die reich an Asn oder Gly sind und zu neuen Familien gehören, PE und PPE (siehe unten). Der Anteil des Proteoms, der durch Genduplikation entstanden ist, ähnelt dem in E coli oder B. subtilis ( 51% refs 9, 14 ), außer dass der Grad der Sequenzkonservierung beträchtlich höher ist, was darauf hindeutet, dass es eine ausgedehnte Redundanz oder unterschiedliche Produktion der entsprechenden Polypeptide geben kann. Das scheinbare Fehlen von Divergenz nach Genduplikation stimmt mit der Hypothese überein, dass M.tuberkulose ist neuer Abstammung 6.

Beachten Sie die extreme Position von M. tuberkulose und die Verschiebung der Aminosäurepräferenz, die den zunehmenden G + C-Gehalt von links nach rechts widerspiegelt. Verwendete Abkürzungen: Ae, Aquifex aeolicus Af, Archäoglobus fulgidis Bb, Borrelien burgdorfei Bs, B. subtilis Ce, Caenorhabditis elegans Ec, E coli Hi, Haemophilus influenzae Hp, Helicobacter pylori Mg, Mycoplasma genitalium Mj, Methanococcus Jannaschi MP, Mycoplasma pneumoniae Berg, M. tuberkulose Mth, Methanobacterium thermoautotrophicum SC, Saccharomyces cerevisiae Ss, Synechozystis sp. Stamm PCC6803. F1 und F2, erste und zweite Fakultätsachse 16 .


DISKUSSION

BILD 7 Zusammenfassung, wie sich eine Reaktion auf Stickstoffmangel in E. coli auf die Kreuzfütterung auswirkt. Die Pfeildicke zeigt den relativen Fluss an. (A) Niedriges NH4 + Ausscheidungsspiegel von R. palustris (Rp) begrenzen die Fähigkeit von E. coli (Ec) um NH . zu erhalten4 + durch Diffusion durch die Membran als NH3. Niedriges NH4 + Verfügbarkeit wird von E. coli durch die Sensorkinase NtrB wahrgenommen, die den Reaktionsregulator NtrC phosphoryliert (siehe Referenz 19 für Details darüber, wie die Stickstoffverfügbarkeit wahrgenommen und übertragen wird). NtrC reguliert die Expression vieler Gene, die an der Stickstoffaufnahme beteiligt sind, einschließlich des Gens für das hochaffine NH4 + Transporter AmtB. Höhere AmtB-Werte ermöglichen es E. coli, die geringen Mengen an NH . aufzunehmen4 + von R. palustris ausgeschieden, unterstützt das Wachstum von E. coli und die wechselseitige Ausscheidung organischer Säuren, die R. palustris als Kohlenstoffquelle nutzt. (B) Ohne NtrC bleiben die E coli-AmtB-Spiegel niedrig und R. palustris hat einen Wettbewerbsvorteil bei der Rückgewinnung von ausgeschiedenem NH4 + . Aus Mangel an Stickstoff verlangsamen sich das Wachstum von E. coli und die Überkreuzung mit organischen Säuren, wodurch die Stabilität des Mutualismus bedroht wird. PTS, Phosphotransferase-System. (Angepasst von Referenz 12.)

Abstrakt

Noroviren (NoVs) sind eine der Hauptursachen für akute Gastroenteritis, die sowohl Ausbrüche als auch endemische Infektionen umfasst. Die Entwicklung von Präventionsstrategien, einschließlich Impfstoffen, für die am stärksten anfälligen Gruppen (Kinder <5 Jahre, ältere Menschen und Personen, die unter Engpässen leiden, wie Militärpersonal und Reisende) ist wünschenswert. Die Entwicklung von NoV-Impfstoffen war jedoch mit vielen Schwierigkeiten konfrontiert, darunter genetische/antigene Diversität, begrenztes Wissen über NoV-Immunologie und Viruszyklus, das Fehlen einer permissiven Zelllinie für die Kultivierung und das Fehlen eines weit verbreiteten und erfolgreichen Tiermodells. Impfstoffkandidaten beruhen auf der Inokulation von virusähnlichen Partikeln (VLPs), die durch das Hauptkapsidprotein VP1 gebildet werden, subvirale Partikel aus der hervorstehenden Domäne von VP1 (P-Partikel) oder virale Vektoren mit einem durch biotechnologische Technologien hergestellten NoV-Capsidgen-Insert. Es wurden polivalente Impfstoffe entwickelt, die mehrere NoV-Genotypen und/oder andere auf dem enterischen Weg erworbene Viren umfassen. Ein VLP-Impfstoffkandidat hat klinische Studien der Phase II erreicht und mehrere andere befinden sich in präklinischen Entwicklungsstadien. In diesem Artikel diskutieren wir die wichtigsten Herausforderungen bei der Entwicklung eines NoV-Impfstoffs und den aktuellen Status vorherrschender Kandidaten.


Dickson Lab @ MSU

Dickson A und Brooks III CL*. PLOS-Komp. Biol. (2013)

Damit Zellen funktionieren, müssen die Konzentrationen aller Proteine ​​in der Zelle auf dem richtigen Niveau gehalten werden (Proteostase). Diese Aufgabe – kompliziert durch zellulären Stress, Proteinfehlfaltung, Aggregation und Abbau – wird von einer Sammlung von Chaperonen übernommen, die die Konfigurationslandschaft eines bestimmten Clientproteins durch die Bildung von Protein-Chaperon-Komplexen verändern. Die Menge all dieser Komplexe und die Übergänge zwischen ihnen bilden das Proteostase-Netzwerk. Vor kurzem wurde ein Computermodell (FoldEco) eingeführt, das experimentelle Daten zu einer systemweiten Beschreibung des Proteostase-Netzwerks von E. coli synthetisiert. Dieses Modell beschreibt die Konzentrationen aller Spezies im System über die Zeit, die unterschiedliche Konformationen des Clientproteins sowie Protein-Chaperon-Komplexe umfassen. Wir wenden auf dieses Modell ein neu entwickeltes Analysetool an, um Mediationswahrscheinlichkeiten in komplexen Netzwerken zu berechnen. Dies ermöglicht es uns, die Wahrscheinlichkeit zu bestimmen, mit der ein bestimmtes Chaperon-System verwendet wird, um Übergänge zwischen Client-Protein-Konformationen zu vermitteln, wie zum Beispiel die Faltung oder die Korrektur von fehlgefalteten Konformationen. Wir ermitteln, wie sich diese Wahrscheinlichkeiten sowohl über verschiedene Proteine ​​hinweg als auch mit Systemparametern wie der Syntheserate ändern und zeigen jeweils detailliert auf, welche Faktoren die Verwendung eines Chaperonsystems gegenüber einem anderen steuern. Wir stellen fest, dass die verschiedenen Chaperonsysteme nicht orthogonal arbeiten und sich gegenseitig kompensieren können, wenn ein System deaktiviert oder überlastet ist. Dies kann die Analyse von Knockout-Experimenten erschweren, bei denen die Konzentration des nativen Proteins sowohl mit als auch ohne Anwesenheit verglichen wird eines bestimmten Chaperonsystems. Diese Studie gibt auch ein allgemeines Rezept für die Durchführung einer übergangspfadbasierten Analyse eines Netzwerks gekoppelter chemischer Reaktionen, die auch in anderen Arten von Netzwerken nützlich sein kann.


Die nik Operon von Escherichia coli kodiert ein periplasmatisches Bindungsprotein-abhängiges Transportsystem für Nickel

Laboratoire de Gériétique Moléculaire des Microorganismes, CNRS-URA 1486, INSA, Bâtiment 406, 20 Avenue Albert Einstein, 69621 Villeurbanne Cedex, Frankreich.

Laboratoire de Gériétique Moléculaire des Microorganismes, CNRS-URA 1486, INSA, Bâtiment 406, 20 Avenue Albert Einstein, 69621 Villeurbanne Cedex, Frankreich.

Laboratoire de Gériétique Moléculaire des Microorganismes, CNRS-URA 1486, INSA, Bâtiment 406, 20 Avenue Albert Einstein, 69621 Villeurbanne Cedex, Frankreich.

Laboratoire de Gériétique Moléculaire des Microorganismes, CNRS-URA 1486, INSA, Bâtiment 406, 20 Avenue Albert Einstein, 69621 Villeurbanne Cedex, Frankreich.

Laboratoire de Gériétique Moléculaire des Microorganismes, CNRS-URA 1486, INSA, Bâtiment 406, 20 Avenue Albert Einstein, 69621 Villeurbanne Cedex, Frankreich.

Laboratoire de Gériétique Moléculaire des Microorganismes, CNRS-URA 1486, INSA, Bâtiment 406, 20 Avenue Albert Einstein, 69621 Villeurbanne Cedex, Frankreich.

Zusammenfassung

Die vollständige Nukleotidsequenz des Escherichia coli nik Locus, von dem vorgeschlagen wurde, dass er das spezifische Transportsystem für Nickel kodiert, wurde bestimmt. Es wurde gefunden, dass es fünf überlappende offene Leserahmen enthält, die eine einzelne Transkriptionseinheit bilden. Abgeleitete Aminosäuresequenz der nik operon zeigt, dass seine fünf Genprodukte, NikA bis NikE, hochgradig homolog zu Komponenten von Oligopeptid- und Dipeptid-bindenden Protein-abhängigen Transportsystemen von mehreren Gram-negativen und Gram-positiven Spezies sind. NikA stellt das periplasmatische Bindungsprotein dar, NikB und NikC ähneln integralen Membrankomponenten von periplasmatischen Permeasen und NikD und NikE besitzen typische ATP-bindende Domänen, die ihre Energiekopplungsrolle für den Transportprozess nahelegen. Insertionsmutationen in nik Gene hoben die nickelhaltige Hydrogenase-Aktivität unter Nickellimitierung vollständig auf und veränderten die Geschwindigkeit des Nickeltransports deutlich. Zusammengenommen stützen diese Daten die Vorstellung, dass die nik Operon kodiert ein typisches periplasmatisches Bindungsprotein-abhängiges Transportsystem für Nickel.


Eine Vereinfachung des Glukose-Insulin-Modells von Cobelli für Typ-1-Diabetes mellitus und seine FPGA-Implementierung

Das Glukose-Insulin-Modell von Cobelli ist der einzige Computersimulator für Glukose-Insulin-Wechselwirkungen, der von der Food Drug Administration als Ersatz für Tierversuche akzeptiert wird. Es besteht jedoch aus mehreren Differentialgleichungen, die eine Implementierung auf einer Hardwareplattform erschweren. In dieser Untersuchung wird das Cobelli-Modell durch die Padé-Approximant-Methode vereinfacht und auf einer feldprogrammierbaren Gate-Array-basierten Plattform als Hardwaremodell zur Vorhersage von Glukoseänderungen bei Patienten mit Typ-1-Diabetes mellitus implementiert. Verglichen mit dem ursprünglichen Cobelli-Modell bietet das implementierte Hardwaremodell eine nahezu perfekte Annäherung bei der Vorhersage von Glukoseänderungen mit eher kleinen quadratischen Fehlern und maximalen Fehlern. Die RMSE-Ergebnisse für 30 Probanden zeigen, dass die Methode zur Vereinfachung und Implementierung des Cobelli-Modells eine gute Robustheit und Anwendbarkeit aufweist. Die erfolgreiche Hardwareimplementierung des Cobelli-Modells wird eine breitere Akzeptanz dieses Modells fördern, das Tierversuche ersetzen, eine schnelle und zuverlässige Glukose- und Insulinschätzung ermöglichen und letztendlich die Weiterentwicklung eines künstlichen Pankreassystems unterstützen kann.

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ERGEBNISSE

GhoT erhöht die Persistenz

Zunächst untersuchten wir die 14 E coli Transkripte, denen GCU-Sites fehlen, um zu bestimmen, ob diese Transkripte mit der Fähigkeit von MqsR in Verbindung stehen, die Persistenz zu erhöhen 6 . Die Wirkung der Produktion von MqsR aus pCA24N-mqsR in jedem der 14 isogenen Einzelgen-Knockouts (ghoT, hisL, kilR, pheL, ralR, tnaC, trpL, yahH, ybfQ, ybht, yciG, ygaQ, yheV, und ymdF) (siehe Ergänzende Ergebnisse, ergänzende Tabelle 1) wurde 2 h nach der Zugabe von Ampicillin (100 µg/ml) untersucht, um zu bestimmen, ob die Fähigkeit von MqsR, die Persistenz zu erhöhen, verändert war Gespenst hatte eine der größten Auswirkungen auf die MqsR-vermittelte Persistenz (Ergänzungstabelle 2). Bei Stämmen, bei denen der Kanamycin-Genersatz einen polaren Effekt hervorrufen könnte, wurde das Resistenzgen entfernt und die Stämme erneut getestet. In keinem Fall konnten die Effekte der Polarität zugeschrieben werden (Ergänzungstabelle 2). Eine Zeitverlaufsstudie bestätigte weiter, dass das Löschen Gespenst signifikant reduzierte MqsR-vermittelte Persistenz (27 ± 2-fache Reduktion für ΔGespenst/pCA24N-mqsR im Vergleich zu BW25113/pCA24N-mqsR) und bewirkte, dass sich die Zelle ähnlich wie der Wildtyp-Stamm ohne MqsR-Produktion verhielt ( 1a ). Bestätigung der Abhängigkeit von MqsR von GhoT zur Erhöhung der Persistenz, Produktion von GhoT in einem ΔGespenst Stamm erhöhte auch die Persistenz um das 48-fache auf das Niveau, das während der Produktion von MqsR beobachtet wurde ( 1b ). In frischem LB-Medium lebten einige dieser Persisterzellen mit einer Verzögerungszeit von ungefähr 4 h wieder auf, was mit den berichteten Werten 24 vergleichbar ist ( 1c ).

Zellüberleben (%) nach Behandlung mit Ampicillin (100 µg/ml) für 2, 4 und 6 h mit MqsR-Produktion mit und ohne Gespenst (ein) oder mit GhoT-Produktion (B). wt bezeichnet den Wildtyp-Wirt (E coli BW25113). (C) Die Wiederbelebung von GhoT-induzierten Persistenzzellen wurde getestet, indem GhoT in BW25113 produziert wurde ΔGespenst/pCA24N-Gespenst während der Behandlung von Zellen mit Ampicillin (100 µg/ml) für 2 Stunden. Das Wachstum in frischem LB-Medium wurde mit Kontrollzellen verglichen, denen die Ampicillin-Behandlung fehlte. Mindestens drei unabhängige Kulturen jedes Stammes wurden für jedes Experiment bewertet, und Fehlerbalken zeigen den Standardfehler des Mittelwerts an.

GhoT beeinflusst die Membran und produziert Geisterzellen

Die Organisation der Geist Operon und der Einfluss von GhoT auf die Persistenz legten nahe, dass es sich um ein TA-Paar handeln könnte (ergänzende Abb. 1a). Daher haben wir getestet, ob GhoT ein Toxin ist oder nicht. Es wird vorhergesagt, dass GhoT ein kleines (57 aa), stark hydrophobes Protein mit zwei Transmembrandomänen (Reste 7 bis 27 und 37 bis 57) ist 25 . Wenn GhoT im Wildtyp-Stamm produziert wurde, der ein chromosomales Gen für das mutmaßliche Antitoxin GhoS enthält, nahm die Trübung der Kultur ab (Abb. 2b). Um diese Ergebnisse zu bestätigen, führte die Produktion von GhoT dazu, dass 60% der Zellen “ghost”-Morphologien annahmen, wie unter Verwendung der Phasenkontrastmikroskopie beobachtet (Abb. 2c). Geisterzellen sind tote oder sterbende Zellen, in denen die beschädigte Membran das Auftreten der Zellpole verursacht dicht und die Mitte transparent erscheinen 26 . Daher ist GhoT ein Toxin, das bei Überproduktion Zellen lysiert, indem es die Zellmembran aufbricht, um Geisterzellen zu bilden.

(ein) Zellwachstum in LB-Medium für Zellen, die GhoT und GhoS produzieren. Beachten Sie die chromosomale Kopie von ghoS im Wildtyp-Stamm ermöglicht ein gewisses Wachstum mit der Toxin-GhoT-Produktion. GhoSX ist verkürztes GhoS mit einem an Tyr16 eingeführten Stopcodon. Drei unabhängige Kulturen von jedem Stamm wurden ausgewertet, und Fehlerbalken zeigen den Standardfehler des Mittelwerts (n = 3). (B) Zellkultur am Ende des Wachstums in (ein) um 20 h, um die Clearance und Lyse aufgrund der Produktion von GhoT zu zeigen. Maßstabsbalken steht für 1 cm. (C) Zellmorphologie nach Inkubation für 8 h bei 37ଌ. Der Maßstabsbalken steht für 5 µm. Zum (ein), (B) und (C), Leer: BW25113/pCA24N/pBS(Kan), GhoT: BW25113/pCA24N-Gespenst/pBS(Kan), GhoS: BW25113/pCA24N/pBS(Kan)-ghoS, GhoT + GhoS: BW25113/pCA24N-Gespenst/pBS(Kan)-ghoSund GhoT + GhoSX: BW25113/pCA24N-Gespenst/pBS(Kan)-ghoSX. Plasmide wurden mit Kanamycin (50 µ g/ml) zurückgehalten und Chloramphenicol (30 µ g/ml) 0,5 mM IPTG wurde zum Zeitpunkt 0 verwendet, um die Plasmid-basierten Proteine ​​herzustellen. Drei unabhängige Kulturen von jedem Stamm wurden ausgewertet. (D) Wachstum auf LB-Platten mit Kanamycin (50 µg/ml), Chloramphenicol (30 µg/ml) und IPTG (1 mM, zur Induktion) Gespenst über pCA24N-Gespenst). In Abwesenheit einer chromosomalen Kopie von ghoS, es gibt kein Wachstum bei der Toxin GhoT-Produktion. ΔghoS ist BW25113 ΔghoS und ΔGespenst ist BW25113 ΔGespenst. p bezieht sich auf pCA24N und p-Gespenst bezieht sich auf pCA24N-Gespenst, bzw. Drei unabhängige Kulturen jedes Stammes wurden ausgewertet. Maßstabsbalken steht für 1 cm.

GhoS ist ein Antitoxin und GhoT/GhoS bilden ein TA-Paar

Wie das Toxin GhoT ist auch GhoS ein kleines Protein (98 aa). Zwischen den beiden Genen liegen 27 bp, zu denen eine mutmaßliche RBS für gehört Gespenst deshalb, Geist Es wird vorhergesagt, dass sie ein einzelnes Operon umfassen. Im Gegensatz zu GhoT war die Produktion von GhoS nicht toxisch und wirkte der Toxizität von GhoT vollständig entgegen ( 2a ). Darüber hinaus reduzierte die Produktion von GhoS mit GhoT die Bildung von Geisterzellen um das 18-fache, basierend auf der mikroskopischen Beobachtung von

500 Zellen ( 2c ), wohingegen die Herstellung von GhoS allein nicht die Bildung von Geisterzellen verursachte.

Ersatz von Antitoxin ghoS mit einer Kanamycin-Kassette 27 ist nicht tödlich, wahrscheinlich aufgrund der polaren Wirkung auf stromabwärts Gespenst. Wenn GhoT jedoch über pCA24N-Gespenst, Löschung von ghoS war tödlich, da das Wachstum im Δ vollständig gehemmt wurdeghoS Mutant, aber nicht in der ΔGespenst Mutante, die eine intakte chromosomale Kopie von ghoS (Abb. 2d). Dies ist ein typisches Merkmal von TA-Systemen 20 , obwohl polare Mutationen diesen Effekt maskieren können, wenn das Antitoxin-Gen dem Toxin-Gen vorausgeht.

Wie durch die reverse Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) gezeigt wurde, Geist bilden ein einzelnes Operon, da sie co-transkribiert werden. Insbesondere ein einzelnes Band von

400 bp wurden mit einem Vorwärtsprimer im ersten Gen nachgewiesen (ghoS-f) und ein reverser Primer im zweiten Gen (Gespenst-r) (Ergänzende Tabelle 3) unter Verwendung von cDNA, die aus Gesamt-RNA synthetisiert wurde, als Matrize (Ergänzende Fig. 1b). Als Kontrollen wurde dieselbe Bande unter Verwendung genomischer DNA als Matrize nachgewiesen, jedoch nicht für Gesamt-RNA. Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass GhoS ein Antitoxin ist, das Gespenst und ghoS mittranskribiert werden und ein TA-System bilden.

GhoS ist ein proteinisches monomeres Antitoxin

Um zu zeigen, dass GhoS als Protein-Antitoxin fungiert, haben wir ein Stoppcodon durch einen einzelnen Nukleotidwechsel in eingeführt ghoS DNA an der entsprechenden Aminosäureposition 16 (Tyr16) und testete deren Einfluss auf das Zellwachstum. We found that the early termination mutation abolished the ability of GhoS to block the toxicity of GhoT for both cell growth ( Fig. 2a ) and ghost cell formation. We also found that antitoxin GhoS is not degraded (Supplementary Fig. 2a) in response to stress 28 , whereas most antitoxins are degraded (Supplementary Fig. 2b), and found that GhoS does not bind its own promoter (Supplementary Fig. 3). In addition, size exclusion chromatography, dynamic light scattering (Supplementary Fig. 4) and biomolecular NMR experiments (see below) demonstrated that GhoS is a monomer in solution. Collectively, these results show that GhoS is a non-canonical antitoxin because it does not regulate its own transcription, it is stable, and it is a monomer in solution.

GhoS adopts a ferredoxin-like fold similar to CAS2

Analysis of the GhoS protein sequence using BLAST revealed that while it is conserved among multiple species of E coli, it is not similar to any protein whose structure or function is known. Because function is more highly conserved than sequence, we used biomolecular NMR spectroscopy to determine the structure of GhoS and, in turn, gain insights into its biological function. In the sequence-specific backbone assignment, 95 of the expected 96 backbone amide NH pairs (3 prolines) are assigned with the missing residue corresponding to the N-terminal cloning artifact His(𢄡) (Supplementary Fig. 5). A total of 2479 Nuclear Overhauser Enhancement (NOE)-derived distance constraints were used for the structure calculation (

25 NOE constraints/residue) using a simulated annealing protocol within the program CYANA 29� and refined in explicit solvent using CNS 32 . The GhoS model has excellent stereochemistry (see Supplementary Methods) and the root-mean-square-deviation value about the mean coordinate positions of the backbone atoms for residues 5 to 95 is 0.36 ± 0.08 Å (20 models in the ensemble Supplementary Fig. 6a). NMR and refinement statistics are reported in Supplementary Table 4. The three-dimensional GhoS structure consists of three α-helices and five β-strands ( Fig. 3a ) and is stabilized by two hydrophobic clusters. The central hydrophobic core consists of residues Tyr10, Val12, Phe14, Tyr16, Phe24, Leu27, Met31, Met34, Phe36, Phe55, Ile57, Ile66, Ile70, Leu77, Ile80, Phe82, Leu84, and Ile86 (Supplementary Fig. 6b). The structure is also stabilized by a second hydrophobic cluster comprised of Val11, Val40, Leu50, Ala56, Met87, Val89, Tyr92, and Phe93 (Supplementary Fig. 6c).

(ein) Ribbon model of the lowest-energy conformer of GhoS, with the secondary structural elements and termini labeled putative catalytically important residues shown as sticks and labeled. Figure prepared with PyMOL (http://www.pymol.org/). (B) Two-micrograms of in vitro synthesized wild-type ghoT transcript (207 nt, lane 1) were incubated without (−) or with 30 µg of purified GhoS and its variants at 37ଌ for 3 h. Two mutants, F14A and F55A, eluted from the size exclusion column as monomers (M) and dimers (D), so both forms were tested (F14A, 40% dimer F55A, 32% dimer). The reduced activity of GhoS with point mutations is shown by the presence of un-cleaved transcript as indicated by an arrow. M indicates low range ssRNA ladder. (C) Circular dichroism (CD) spectra demonstrating that native GhoS (dark blue) and all the GhoS mutants are folded (sample concentrations

20 µM). (D) Co-expression of GhoT with wild-type (WT) GhoS and the GhoS variants via BL21(DE3)/pCA24N-ghoT harboring the pRP1B(Kan)-ghoS constructs (0.1 mM IPTG was used). Scale bar represents 1.1 cm.

A search for structural homologs of GhoS using the structure-based alignment program DALI 33 identified five proteins with Z-scores of 5.8 to 6.3, all of which adopt a ferredoxin-like fold, characterized by a split α-β sandwich (β-α-β-β-α-β Supplementary Table 5). This superfold is highly populated with functionally diverse proteins, such as ribosomal proteins, DNA binding proteins, and ribonucleases 34 . Of the five structures with the best Z-scores, only two were of similar size to GhoS: SSO1404 (PDBID 2I8E, 88 residues Z-score = 6.1) 35 and SSO8090 (PDBID 3EXC, 78 residues Z-score = 5.8). These proteins (and three other family members: TT1823, Z-score = 5.6, PF1117, Z-score=5.1, DvuCAS2, Z-score = 5.0 36 ) belong to the CRISPR-associated (CAS2) family. SSO1404 and SSO8090 are sequence-specific endoribonucleases that preferentially cleave single-stranded RNA 37 . The structures of GhoS and the CAS2 protein SSO1404 monomer (CAS2 proteins are dimers in vitro) overlap well (Supplementary Fig. 6d,e, Supplementary Fig. 7). The primary difference between them is the position of β-strand 㬢. In GhoS, 㬢 and 㬢’ form a short two-stranded β-sheet that interacts with the C-terminal α-helix, 㬓. In contrast, in the CAS2 proteins, 㬢 projects upwards to form the fourth β-strand of the β-sheet in the ferredoxin fold. Thus, GhoS adopts an atypical ferredoxin fold in which the central β-sheet is made up of three and not four β-strands.

GhoS is an endoribonuclease that cleaves ghoT mRNA

The sequence identity between GhoS and the CAS2 proteins is low, between 10�%. However, when the structures of SSO1404 and GhoS are superimposed, five of the six SSO1404 catalytic residues are structurally conserved in GhoS ( Fig. 3a , Supplementary Fig. 6d,e GhoS/SSO1404: Phe14/Tyr9, Asp15/Asp10, Arg26/Arg19, Arg28/Arg31 and Phe55/Phe37). Systematically converting these five GhoS residues to alanines revealed that, in vitro, the Arg28Ala, Phe55Ala and, to a lesser extent, Arg26Ala substitutions reduced the ability of antitoxin GhoS to cleave ghoT mRNA ( Fig. 3b , Supplementary Fig. 8 circular dichroism shows all mutants are folded, Fig. 3c ) this effect was also corroborated for the Arg28Ala variant in vivo ( Fig. 3d ). Thus Arg28 appears to be important for GhoS activity.

Because GhoS production is not toxic but instead increases growth ( Fig. 2a ), these results suggest that GhoS is a sequence-specific endoribonuclease. Thus, we investigated whether GhoS cleaves ghoT mRNA. Using quantitative real-time, reverse-transcription PCR (qRT-PCR), we found that the ghoT Teil der ghoST transcript in the wild-type strain was 21 ± 2-fold less stable than the ghoS portion of the transcript in the stationary phase (see Supplementary Table 6 for all of the qRT-PCR data). Corroborating this result, production of GhoS via pCA24N-ghoS reduced the ghoT portion of the transcript 5 ± 1-fold relative to the empty plasmid. Cleavage by GhoS appears specific since ompA (𢄡.1 ± 0.2), ompF (1.2 ± 0.1), ralR (𢄡.7 ± 0.4), or purA (𢄡.9 ± 0.5) transcript levels were not affected by GhoS production.

In vitro, GhoS cleaved the ghoT portion of the transcript (207 nt, Supplementary Table 7) at multiple sites and generated, after full-digestion, fragments of approximately 52, 65, 87, 91 and 116 nt ( Fig. 4a & Supplementary Fig. 8), whereas there was less degradation of the ghoS portion of the transcript under the same conditions. As expected, heat denaturation of GhoS abolished the ability to cleave the transcripts. Very little degradation of the ATP synthase subunit gene atpE und ompA in vitro was observed. Finally, no degradation was observed of: (i) total RNAs in vitro, (ii) 23S and 16S rRNAs in vivo with GhoS, and (iii) tRNAs in vitro (Supplementary Fig. 9).

(ein) GhoS cleavage reaction with native transcripts of ghoT (207 nt), ghoS (311 nt), atpE (189 nt) and ompA (211 nt). HI indicates heat inactivated GhoS. The blue arrows indicate the main fragments generated after cleavage. M indicates the low range ssRNA ladder. (B) Predicted secondary structure of in vitro synthesized ghoT mRNA. Capital red letters indicate the changed nt for mutations m1, m2, m3, and m4. S1, S2, S3, S4, and S5 indicate the cleavage sites based on RNA sequencing. The four main sections in the structure are indicated with numbers i, ii, iii and iv. The RNA secondary structure was obtained using Mfold software. (C) GhoS cleavage reaction with transcripts of ghoT with mutations m1, m2, m3, and m4 (207 nt). The red arrows indicate the fragments generated or increased in the mutant transcripts after cleavage. (D) Predicted secondary structure of in vitro synthesized ghoTm1m2 mRNA. The mutated ghoTm1m2 cleavage site is indicated by two solid red lines. (e) GhoS cleavage reaction with transcripts of ghoT with mutations m1, m2, and m1m2 (207 nt). The green arrows indicate the reduced fragments after the introduction of the second mutation. For the reactions shown in (ein), (C), and (e), 2 µg of in vitro synthesized transcripts were incubated in with (−) or without 30 µg (+) of purified GhoS at 37ଌ for 3 h and analyzed by gel electrophoresis.

Using RNA sequencing, we found that GhoS cleaves specifically ghoT mRNA at nt positions 30/31, 51/52, 66/68, 115/116, and 154/155 (positions S1 to S5, Fig. 4b ). Analysis of the cleaved products identified a putative cleavage site corresponding to 5’-UNNU(A/C)N(A/G)(A/U)A(A/U)-3’. To corroborate GhoS cleavage at the 51/52 nt site, we altered the ghoT mRNA fragment via mutation m1 (AUAUU to CGCGC at nt position 52�, Fig. 4b ) and found a reduction in overall cleavage and increase in larger fragments (e.g., 87 and 124 nt) as would be expected for loss of this site ( Fig. 4c ). Additional mutations (m2 at nt 125� and m3 at nt 59�) reduced cleavage as expected given their proximity to cleavage sites 66/68 and 115/116, and the m4 change (nt 132�) had little effect since the transcript was completely degraded as with the wild-type ghoT mRNA ( Fig. 4c ).

To investigate the importance of RNA secondary structure on GhoS cleavage, the stems disrupted by mutations m1 or m2 were recovered by the introduction of both mutations into the plasmid carrying single mutant ghoT Allele. The recovery of the cleavage pattern to that of the wild-type ghoT transcript in the double mutant transcript would indicate the importance of RNA secondary structure over sequence recognition in GhoS cleavage, while a reduction in cleavage would indicate that sequence recognition is important. We found that the introduction of both mutations m1m2 to restore the stem of the predicted secondary structure ( Fig. 4d ) generated a unique cleavage pattern distinct from that of the native ghoT mRNA ( Fig. 4e ). A reduction of the fragments accumulated due to the m1 mutation along with an increase in large partially-cleaved or un-cleaved fragments compared to the native transcript suggests the importance of sequence recognition during GhoS cleavage. Therefore, GhoS is a specific RNase that limits translation of toxin GhoT by cleaving ghoT Transkripte.

To provide more evidence of the specificity of the RNase activity of GhoS, we analyzed changes in mRNA levels during production of GhoS compared to the strain with an empty plasmid with a DNA microarray so that we could investigate in vivo which of the cell’s transcripts may be cleaved by GhoS. Under these conditions, only 20 transcripts had altered mRNA levels and all were found to be reduced (Supplementary Table 9) there were no induced genes. These genes down-regulated due to GhoS production were all involved in the biosynthesis/transport of purines and pyrimidines. These results suggest that GhoS selectively cleaves only a few cellular targets.

To further corroborate the findings in the DNA microarray, qRT-PCR was performed with seven genes (purM, purH, purE, pyrI, pyrB, carA und carB) with total RNA isolated under the same culture conditions as the DNA microarray experiment. In each case, the qRT-PCR results showed a decreased RNA abundance upon GhoS production, which matched the microarray results (Supplementary Table 9). Obwohl ghoT expression was unaltered in the microarray analysis, qRT-PCR performed with duplicate samples on three independent occasions, showed that ghoT expression was decreased at least 3-fold upon production of GhoS.

GhoT increases early biofilm formation

Since TA systems affect biofilm formation 4, 5 and since we identified mqsR as one of the highly regulated genes in E coli biofilm cells, when compared to planktonic cells 4 , we investigated the impact of GhoT/GhoS on biofilm formation. Löschung von ghoT decreased biofilm formation at 8 h in LB medium at 30ଌ (4.6-fold) and 37ଌ (4.9-fold), while deletion of ghoS increased biofilm formation significantly (up to 6.1-fold) at 30ଌ and 37ଌ at 8 h (Supplementary Fig. 10a). Swimming motility was also slightly reduced when ghoT was deleted, while the deletion of ghoS increased cell motility

2-fold (Supplementary Fig. 10b). These results show that GhoS and GhoT impact early biofilm formation and swimming motility.


5. Schlussfolgerungen

The conventional BN modelling style fails to integrate with other higher-level cellular descriptive models such as the ODE. Our study is an attempt to bridge the gap between these two paradigms. The multi-bit Boolean encoding of the ODE model developed in this work is similar to a conventional BN in its construction. However, the Boolean vector representing a particular node is designed to provide finer resolution to mimic high-level functional behaviour. We show that our multi-bit Boolean model can simulate the high-level ODE description of the chemotaxis module ofE coli. One limitation of the current model is that the accuracy is dependent upon the number of bits used in the BN modelling. However, the proposed coarse discretisation is very useful for the aforementioned bridging purpose. The chemotaxis response and the drift velocity estimated from our multi-bit BN simulation trajectories are consistent with experimental results published in the literature [ 19 , 21 ]. Taken together, by simulating E coli chemotaxis, we conclude that multi-bit Boolean methodology is ideal for simulating dynamic high-level biological systems. Furthermore, we propose that the multi-bit Boolean model developed in this study can be used for designing of bio-inspired machines such as nanobots. Nanobots are tiny machines that can operate without human interaction, such as nanobotic swimmers [ 41 , 42 ]. These futuristic machines are designed for multiple medical applications including diagnosis and testing of tissues and recording of vital parameters in the bloodstream (e.g. temperature, pressure). One of such nanobots (termed as logibot) based on the Boolean model has been published recently in [ 43 ]. The logibots designed in [ 43 ] propel according to the pH levels in their environment. Similarly, the modelling approach designed in the current study will enable the development of nanobots capable of sensing chemical concentration variations and regulate its movement accordingly. We propose that the multi-bit BN strategy can provide a platform to design nanobots that mimic Brownian-like motion and drift. Such features will enable nanobots to perform sophisticated functions, including distributed sensing and targeted drug delivery.

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