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Wenn Proteine ​​eine Gesamtladung haben, wie durchqueren Membranproteine ​​die hydrophobe Region der Plasmamembran?

Wenn Proteine ​​eine Gesamtladung haben, wie durchqueren Membranproteine ​​die hydrophobe Region der Plasmamembran?


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Diese beiden Konzepte scheinen fast widersprüchlich zu sein, Proteine ​​haben eine negative Nettoladung, da die Aminosäuren in ihnen jeweils eine kleine negative Ladung haben, aber Membranproteine ​​können die Plasmamembran durchqueren, die für geladene Moleküle undurchlässig ist (daher die Notwendigkeit von Membranproteine).

Wie bleiben diese beiden Aussagen gleichzeitig wahr?


Transmembranproteine ​​werden in einem ziemlich komplizierten System in die Membran im ER eingebaut, ein ganzes Kapitel über die Translokation von Proteinen gibt es in "Molekularbiologie der Zelle".

Die Proteine ​​werden durch eine wässrige Pore im Sec61-Komplex bewegt, was erklärt, wie geladene Teile eines Proteins durch die Membran bewegt werden.

Die in der Membran verbleibenden Teile eines Transmembranproteins bestehen normalerweise aus nicht geladenen hydrophoben Aminosäuren.

Ich empfehle Ihnen dringend, sich in einem zellbiologischen Buch wie den Alberts, die ich verlinkt habe, über den gesamten Translokationskram nachzulesen. Es steckt viel mehr dahinter, als ich hier geschrieben habe.


Membranen und Transport

Die Zellmembran ist ein grundlegendes und bestimmendes Merkmal von Zellen. Es besteht aus einer Phospholipid-Doppelschicht, wobei die hydrophilen Phosphatgruppen “head” auf beiden Seiten der wässrigen Umgebung zugewandt sind und die hydrophoben “tails” in der Mitte. Die beiden “Blättchen,” das innere Segel auf der zytoplasmatischen Seite der Membran und das äußere Segel auf der extrazellulären Seite, haben unterschiedliche Lipidzusammensetzungen.

Zellmembranen enthalten auch einen ungefähr gleichen Massenanteil integraler Membranproteine, dh Proteine, die fest in die hydrophobe Lipiddoppelschicht eingebettet sind. Einige integrale Membranproteine ​​haben alpha-helikale Domänen, die die Membran durchqueren (Transmembrandomänen). Andere Proteine, die als periphere Membranproteine ​​bezeichnet werden, sind lose und reversibel mit Membranen verbunden und interagieren mit den polaren Phosphatkopfgruppen. Auch in Zellmembranen sind Kohlenhydrate in Form von Oligosacchariden kovalent an Membranproteine ​​(Glykoproteine) oder an Lipide (Glykolipide) gebunden.

Die Lipide und integralen Membranproteine ​​diffundieren seitlich innerhalb der Membranebene, daher das “Fluidmosaikmodell” der Zellmembranen. Aufgrund des hydrophoben inneren Kerns durchqueren Phospholipide und integrale Membranproteine ​​jedoch nicht spontan die Lipiddoppelschicht oder klappen sie von einer Seite zur anderen um.

Membranlipide unterscheiden sich in den 3 Lebensbereichen

Die 3 Lebensbereiche: Bakterien, Archaea und Eukarya, haben unterschiedliche Membranlipide, die Herausforderungen darstellen und Hinweise zur Rekonstruktion der Evolutionsgeschichte des Lebens auf der Erde bieten.

Alle Zellen haben Phospholipide (Glycerin-Phosphat mit zwei Kohlenwasserstoffketten) in ihren Membranen. Bakterien und Eukarya haben beide Membranphospholipide mit Fettsäureketten, die an D-Glycerin esterverknüpft sind. Archaea haben jedoch völlig andere Membranphospholipide, mit verzweigten Isoprenketten anstelle von Fettsäuren, L-Glycerin anstelle von D-Glycerin und Etherbindungen anstelle von Esterbindungen (siehe https://www.ucmp.berkeley.edu/archaea /archaeamm.html und https://en.wikipedia.org/wiki/Archaea). Die Etherbindungen und Isoprenketten machen Archaeal-Membranen widerstandsfähiger gegen Hitze und pH-Extreme.

Aktuelle Hypothesen legen nahe, dass eukaryotische Zellen aus einer Fusion zwischen einer Archaeenzelle und einer Bakterienzelle entstanden sind. Basierend auf Ähnlichkeiten in der DNA-Sequenz stammen eukaryotische Gene für die Informationsverarbeitung von Archaeen (Allers und Mevarech 2005, Cotton und McInerney 2010), während eukaryotische Membranphospholipid-Synthesegene und Gene für den Energiestoffwechsel von Bakterien abstammen.

Eukaryoten haben auch Membranlipid-Innovationen, die weder in Archaeen noch in Bakterien zu finden sind: Sterole und Sphingolipide. Sterole (wie Cholesterin) und Sphingolipide (Phospholipide mit Fettsäureketten, die an die Aminosäure Serin statt an Glycerin gebunden sind) sind Hauptbestandteile der eukaryotischen Plasmamembranen und können zusammen 50 % der Lipide des äußeren Flugblatts ausmachen (Desmond und Gribaldo, 2009 Sphingolipide werden auf der zytoplasmatischen Seite der Lipiddoppelschicht der Plasmamembran nicht gefunden). Sterole sind in allen eukaryotischen Zellmembranen essentiell. Sterole verringern die Fluidität und Permeabilität der Membran und erhöhen die Steifigkeit und Festigkeit der Membran. Zusammen mit Sphingolipiden tragen sie dazu bei, Regionen der Membran in Lipid-Rafts, Mikrodomänen in der Plasmamembran mit erhöhter Steifigkeit, zu organisieren, die Zellsignalproteine ​​zu funktionellen Komplexen organisieren (siehe Übersicht von Lingwood und Simons, 2010).

Generische Sterolstruktur aus Wikipedia

Cholesterinstruktur, aus Wikipedia

Die Sterolbiosynthese ist ein komplexer Stoffwechselweg, der molekularen Sauerstoff (O2) benötigt. Es werden 11 Sauerstoffmoleküle benötigt, um nur ein Molekül Cholesterin zu synthetisieren (Desmond und Gribaldo, 2009). Daher konnte sich die Steroidbiosynthese nicht vor dem Großen Oxygenierungsereignis vor etwa 2,4-2,5 Milliarden Jahren entwickelt haben, als sich zum ersten Mal freier Sauerstoff in den Ozeanen und der Atmosphäre der Erde ansammelte. Bezeichnenderweise fällt diese Zeit mit dem Ursprung der Eukaryoten im Fossilienbestand zusammen. Die Evolution der Steroidbiosynthesewege scheint daher einer der Schlüssel zur Evolution von Eukaryoten zu sein.
Nicht zu vergessen: Bakterien besitzen in Form von Hopanoiden, dem bakteriellen Äquivalent zu Membransterolen, ihre eigenen speziellen Membrananpassungen. Hopanoide haben 5 Ringe und benötigen keinen Sauerstoff für ihre Biosynthese.

Zellen regulieren die Membranfluidität durch Anpassen der Membranlipidzusammensetzung

Die Fluidität einer Lipiddoppelschicht variiert mit der Temperatur. Bei höheren Temperaturen werden die Lipiddoppelschichten flüssiger (denken Sie an das Schmelzen der Butter an einem heißen Tag) und durchlässiger oder undicht. Bei niedrigeren Temperaturen werden Lipiddoppelschichten steif (wie Butter im Kühlschrank). Damit Zellmembranen richtig funktionieren, müssen sie ein Gleichgewicht zwischen Fluidität, Bewegung von Proteinen und Lipiden innerhalb der Membran sowie Membrankrümmung, Biegung, Knospung und Verschmelzung aufrechterhalten, ohne die Membranintegrität zu beeinträchtigen und Substanzen ein- oder austreten zu lassen die Zelle.
Sterole B. Cholesterin bei Säugern, Ergosterol bei Pilzen und Phytosterine bei Pflanzen, die Fluidität und Permeabilität der Puffermembran über einen breiten Temperaturbereich. Bei Säugern erhöht Cholesterin die Membranpackung, um die Membranfluidität und -permeabilität zu verringern.

Die Fettsäuren Schwänze von Phospholipiden beeinflussen auch die Membranfluidität. Fettsäuren können in Länge und Anzahl der Doppelbindungen in der Kohlenwasserstoffkette variieren. Fettsäuren ohne Doppelbindungen in der Kohlenwasserstoffkette heißen “gesättigt” weil sie die maximale Anzahl von Wasserstoffen haben. “Ungesättigt” Fettsäuren mit einer oder mehreren Doppelbindungen haben weniger Wasserstoffe (2 weniger pro Doppelbindung). Natürlich vorkommende ungesättigte Fettsäuren sind cis-ungesättigt, d. h. die verbleibenden Wasserstoffe befinden sich auf derselben Seite des Moleküls und führen zu einer Krümmung der Kohlenwasserstoffkette. Trans-ungesättigte Fettsäuren mit den Wasserstoffatomen auf gegenüberliegenden Seiten führen immer noch zu einer fast geraden Kohlenwasserstoffkette. Trans-ungesättigte Fettsäuren sind in der Natur selten, werden jedoch hergestellt, wenn Pflanzenöle in der Lebensmittelverarbeitung teilweise hydriert werden.

Die unterschiedlichen Strukturen in verschiedenen Arten von Fettsäuren beeinflussen ihre chemischen Eigenschaften und biologischen Wirkungen:

  • längere Fettsäuren sind steifer, reduzieren die Membranfluidität und -permeabilität
  • cis-ungesättigte Fettsäuren erhöhen die Membranfluidität und -permeabilität, indem sie die dichte Packung der Fettsäureschwänze unterbrechen. Cis-mehrfach ungesättigte (2 oder mehr Doppelbindungen) Fettsäuren sind noch verbogener und störender.
  • Organismen passen sich an kalte Temperaturen an, indem sie die Menge an cis-ungesättigte Fettsäuren, um ihre Membranen flüssig zu halten.
  • tierische Fette, wie Butter, mit relativ geringen Gehalten an cis-ungesättigte Fettsäuren und ein hoher Anteil an gesättigten Fettsäuren, sind bei Raumtemperatur fest
  • Pflanzenöle, mit hohem Gehalt an cis-ungesättigte Fettsäuren, sind bei Raumtemperatur flüssig

Eine Möglichkeit, sich daran zu erinnern, wie unterschiedliche Lipide die Membranfluidität oder -steifigkeit beeinflussen, besteht darin, dass Lipide, die sich enger packen können (wie gesättigte Fettsäuren und Sterole), Membranen steifer und stärker, aber weniger flüssig machen. Alles, was die dichte Packung von Lipiden stört, wie höhere Temperaturen oder ungesättigte Fettsäuren mit Knicken oder Krümmungen, machen Membranen flüssiger.

Membrandurchlässigkeit und Osmose

Die Lipiddoppelschicht ist „semi-permeabel“, was bedeutet, dass einige Moleküle schnell durch die Membran diffundieren können, während andere Moleküle nur sehr langsam oder gar nicht passieren. Im Allgemeinen können kleine ungeladene Moleküle wie O2 und CO2 frei diffundieren, während geladene Moleküle (Na+, H+) oder polare Moleküle (Glukose) dies nicht können. Auch Wassermoleküle diffundieren nur langsam durch Zellmembranen, weil Wassermoleküle hochpolar sind.

Osmose ist die Diffusion von Lösungsmittelmolekülen (Wasser) durch eine Membran. Diffusion führt zu einer Nettobewegung von Molekülen entlang ihres Konzentrationsgradienten, von einem Bereich hoher Konzentration zu einem Bereich niedriger Konzentration. Bei der Osmose wandern Wassermoleküle von der Seite mit niedriger Konzentration an gelösten Stoffen auf die Seite mit höherer Konzentration an gelösten Stoffen. Wenn es einen Unterschied in den Konzentrationen der gelösten Stoffe über die Membran gibt, versuchen die Moleküle der gelösten Stoffe, durch die Membran zu diffundieren, um die Konzentrationen der gelösten Stoffe auszugleichen. Wenn die Membran jedoch für die gelösten Moleküle undurchlässig ist, bewegt sich Wasser, um zu versuchen, die Konzentrationen der gelösten Stoffe auszugleichen.

Zellen sind hinsichtlich ihrer Konzentrationen im Zytoplasma gelöster Stoffe an ihre wässrige Umgebung angepasst. Säugetierzellen haben zytoplasmatische Konzentrationen gelöster Stoffe, die die physiologischen Salzkonzentrationen ausgleichen. In physiologischen Kochsalzlösungen befinden sich Säugerzellen in einem isotonisch Umgebung, was bedeutet, dass die Konzentrationen der gelösten Stoffe innerhalb der Zelle und außerhalb der Zelle im Gleichgewicht sind, so dass es keine Nettobewegung von Wasser durch die Zellmembran gibt. In einem hypotonisch Lösung ist die Konzentration des gelösten Stoffes außerhalb der Zelle niedriger als innerhalb der Zelle, so dass Wasser in die Zelle eindringt, um zu versuchen, die Konzentration des gelösten Stoffes im Inneren zu reduzieren. In einem hypertonisch Lösung ist die Konzentration des gelösten Stoffes außerhalb der Zelle höher als innerhalb der Zelle, so dass Wasser aus der Zelle austritt und die Zelle zusammenschrumpft.

Membranproteine ​​und Transport

Wie transportieren Zellen Moleküle wie Glukose durch die Membran? Membranen haben dedizierte Transportproteine ​​mit Transmembrandomänen. Mehrere Transmembrandomänen gruppieren sich, um Kanäle in der Membran zu bilden, die für verschiedene Moleküle wie Glucose, Phosphat, Na+, H+, Cl- und sogar H2O spezifisch sind. Der Wassertransport wird durch hochkonservierte Proteine, die Aquaporine genannt, vermittelt, die in allen 3 Lebensbereichen vorkommen.

Klicken Sie auf den Link, um den molekularen Film herunterzuladen und anzuzeigen, der den Transport eines markierten Wassermoleküls durch einen Aquaporinkanal zeigt. Der Film umfasst etwa 12 Nanosekunden:

Wasserpermeation (gleicher Film wie im Aquaporin-Video oben)

Die Bewegung von Molekülen durch Proteinkanäle heißt erleichterte Diffusion. Die Proteinkanäle sind für das Molekül hochspezifisch und führen wiederum zu einem Nettotransport entlang eines Konzentrationsgradienten, von einem Bereich hoher Konzentration zu einem Bereich niedriger Konzentration.

Was ist, wenn die Zelle Moleküle bewegen möchte? gegen ein Konzentrationsgradient? Selbst wenn die Phosphatkonzentrationen außerhalb der Zelle sehr niedrig sind, können Zellen Phosphat in die Zelle transportieren, wo die zytoplasmatische Phosphatkonzentration viel höher sein kann. Aktiven Transport von Molekülen gegen ihren Konzentrationsgradienten erfordert einen Energieaufwand, oft in Form einer Hydrolyse von ATP.

Kinetik des Transports

Aktiver Transport ist leicht zu erkennen, da er Energie benötigt und entgegen dem Konzentrationsgradienten transportiert. Aber ist es möglich, erleichterte Diffusion von einfacher Diffusion zu unterscheiden?

Da die erleichterte Diffusion durch Proteinkanäle vermittelt wird und die Anzahl der Proteinkanäle in einer Zellmembran begrenzt ist, zeigt die erleichterte Diffusion eine Sättigungskinetik.

Die Kinetik der einfachen Diffusion und der erleichterten Diffusion. Die Transportgeschwindigkeit (v) wird gegen die Konzentration des gelösten Stoffes ([S]) für die einfache Diffusion eines gelösten Stoffes (in rot dargestellt) und die erleichterte Diffusion eines gelösten Stoffes durch ein Trägerprotein (in grün dargestellt) aufgetragen. Von https://wikispaces.psu.edu/display/Biol230WFall09/Passive+and+Active+Transport

Um Membranen und Transport zusammenzufassen, sehen Sie sich diese Animation an: http://www.johnkyrk.com/cellmembrane.html befindet sich nur auf der äußeren (extrazellulären Seite) Packungsbeilage.

Um Ihr Verständnis von Transportprozessen zu testen, sehen Sie sich diesen Leckerbissen zur Zellmembranpermeabilität an.

Setzen Sie alles zusammen

Die Folien zu den Vorlesungsvideos auf dieser Seite befinden sich in dieser Datei: B1510_module3_2_membranes_transport_f2012

zitierte Werke:
Allers, T, M Mevarech 2005. Archaeengenetik – der dritte Weg, Nature Bewertungen Genetik 6: 58-73 doi :10.1038/nrg1504
Cotton, JA, JO McInerney 2010. Eukaryotische Gene archaebakteriellen Ursprungs sind unabhängig von ihrer Funktion wichtiger als die zahlreicheren eubakteriellen Gene, Proz. Natl. Acad Sci. USA vor dem Druck online veröffentlicht doi: 10.1073/pnas.1000265107
Desmond, E, S Gribaldo 2009. Phylogenomics of Sterolsynthese: Einblicke in den Ursprung, die Evolution und die Diversität eines wichtigen eukaryotischen Merkmals, Genom Biol Evol 1: 364-381 doi: 10.1093/gbe/evp036
Lingwood, D, K Simons 2010. Lipid-Rafts als Membran-organisierendes Prinzip, Wissenschaft 327: 46-50


Determinanten der Membranlipid-Inhomogenität

Lipid-Kohlenwasserstoffketten

Die Lipidkohlenwasserstoffketten können unterschiedlich lang sein und können entweder gesättigt sein oder eine oder mehrere Doppelbindungen enthalten 1 . Bei physiologischen Temperaturen neigen Lipide, die lange und gesättigte Ketten enthalten, dazu, in der Gelphase zu existieren, während Lipide mit cis Doppelbindungen an ihren Schwänzen treten bei ähnlichen Temperaturen bevorzugt in der flüssigen Phase auf 7 . Darüber hinaus scheint eine hydrophobe Fehlpaarung eine Hauptrolle in der Gesamtordnung der Membran zu spielen 25 . Wenn beispielsweise eine Doppelschicht, die aus einem Lipid einer bestimmten Kettenlänge besteht, mit einem kleinen Anteil von Lipiden mit deutlich kürzeren oder längeren Schwänzen dotiert wird, würde dies aufgrund der Kettenlängenfehlanpassung lokale Unordnungsbereiche erzeugen, die eine erhöhte Anzahl von . bevorzugen gauche Konformationen in den Acylketten in dieser Region. Es ist bemerkenswert, dass die meisten Lipide, die in den Raft-Domänen angereichert sind, gesättigte Schwänze enthalten, einschließlich der natürlich vorkommenden Glycosphingolipide und Sphingomyelin sowie der Fettsäuren, die Proteine ​​in diesen Domänen verankern.

Lipidkopfgruppen

Lipide enthalten eine Vielzahl von Kopfgruppen. Die bei weitem häufigste Kopfgruppe in Säugerzellen ist Phosphatidylcholin, das zwitterionisch ist 1 . Viele Lipide enthalten auch Kopfgruppen mit einer negativen Nettoladung, wie Phosphatidylserin, Phosphatidsäure und Phosphatidylglycerol 1 . Vor kurzem wurde ein seltenes negativ geladenes Lipid, Lyso-bis-Phosphatidsäure (LBPA) konzentriert sich nachweislich in den inneren Involutionen der späten Endosomen 26 . Andere Beispiele für Kopfgruppen-spezifische Wechselwirkungen umfassen solche zwischen Sphingolipiden und Cholesterin sowie zwischen Glycosphingolipiden selbst 22 .

Cholesterin

Cholesterin ist ein wesentlicher Bestandteil der Zellmembranen von Säugetieren und wird inhomogen sowohl zwischen verschiedenen Zellmembranen (z und -arme Domänen) 21 . Zu beachten ist jedoch, dass zu den Kompartimenten, die aus den überwiegend biochemischen Studien als „Plasmamembran“ bezeichnet wurden, möglicherweise das endozytische Recyclingkompartiment (ERC) und die trans-Golgi-Netzwerk (TGN) zusätzlich zur eigentlichen Plasmamembran, wie unsere Studien mit dem fluoreszierenden Cholesterin-Analogon Dehydroergosterol sowie dem Cholesterin-bindenden Antibiotikum Filipin 27 zeigten. Wie zuvor diskutiert, hat Cholesterin ausgeprägte Auswirkungen auf das Phasenverhalten einer Lipiddoppelschicht 11 . Darüber hinaus wurde berichtet, dass es spezifisch mit einigen Lipidkopfgruppen (z. B. Sphingomyelin) 28 und Transmembranproteinen (z. B. dem Influenza-Hämagglutinin) 29 interagiert. Cholesterin hat auch eine Tendenz zur Selbstassoziation in lateralen 1- und transdoppelschichtigen 30-Dimeren sowie zur Bildung regelmäßiger hexagonaler Anordnungen 31 .

Membranassoziierte Proteine

Viele membranassoziierte Proteine ​​scheinen bevorzugt mit einer Unterklasse von Lipiden zu interagieren. Zum Beispiel wurde berichtet, dass mehrere Proteine ​​mit einer Schicht aus ringförmigen Lipiden 32 assoziiert sind. Darüber hinaus scheinen sich viele Transmembranproteine ​​nach der Aggregation oder Vernetzung durch einen Liganden in spezifische Membrandomänen aufzuteilen. Zum Beispiel bindet Shiga-Toxin über einen Glycosphingolipid-Rezeptor an die Zelloberfläche, verursacht die Aggregation des Rezeptors in Clathrin-beschichtete Grübchen und wird effizient internalisiert 33 . In ähnlicher Weise wird der GPI-gebundene Urokinase-Rezeptor (uPAR) aufgrund seiner Wechselwirkung mit α . durch Clathrin-beschichtete Vertiefungen internalisiert2-Makroglobulin-Rezeptor oder Glykoprotein 330, die beide Bona-fide-Clathrin-beschichtete Pit-Lokalisierungssignale enthalten 34 . Die bevorzugte Aufteilung einiger Proteine ​​(z. B. vernetzte GPI-verankerte Proteine, Kinasen der Src-Familie usw.) in die Cholesterin-/Sphingolipid-reichen Domänen stellt ein weiteres Beispiel für spezifische Lipid-Protein-Assoziationen dar 35 .

Membrankrümmung

Die Formen aller membrangebundenen Moleküle könnten grob einem Zylinder, einem Kegel oder einem umgekehrten Kegel nachempfunden werden 1 . Im Fall von Lipiden ist ein Zylinder ein Molekül mit ähnlichen Kopfgruppen- und Schwanzquerschnittsflächen (z. B. Phosphatidylcholin mit gesättigten oder einfach ungesättigten Schwänzen). Lysophospholipide mit größerer Kopfgruppe als Schwanzquerschnittsflächen bilden umgekehrte Zapfen, während Moleküle wie Phosphatidsäure oder Phosphatidylserin mit kleinerer Kopfgruppe als Schwanzquerschnittsflächen Lipide mit einer ungefähren Kegelform darstellen. Aus rein geometrischen Überlegungen ist klar, dass ein Zylinder zwar bequem in eine planare Doppelschicht passen würde, ein kegelförmiges und ein umgekehrt kegelförmiges Molekül jedoch bevorzugt in Membranen mit entgegengesetzten Krümmungen residieren. Es ist bemerkenswert, dass viele wichtige zelluläre Transportereignisse (z. B. Vesikulierung, Tubulation, Abschnüren endozytischer Vesikel und Verschmelzung exozytärer Vesikel) von scharfen Veränderungen der Membrankrümmung begleitet werden.


K-Ras-Nanocluster verwenden digitale Signale, um eine analoge Transmembranschaltung aufzubauen

Einblicke in die Verwendung von Ras-Nanoclustern zum Aufbau biologischer Schaltkreise in vivo stammen aus einer Kombination von Computermodellen und zellbiologischen Experimenten [13,27]. Diese Studien haben gezeigt, dass die MAPK-Aktivierung einer strengen räumlichen Regulierung unterliegt. Die Aktivierung des MAPK-Moduls erfolgt nicht aus dem Zytosol, sondern ist auf die Plasmamembran beschränkt [13,27]. Ein wichtiger Akteur ist hier das Raf-Kinase-Inhibitor-Protein (RKIP), das die Aktivierung des MAPK-Moduls blockiert, indem es jegliche Interaktion zwischen Raf und MEK verhindert [28,29]. RKIP ist im Zytosol lokalisiert und fungiert daher als Zytosol-spezifischer Inhibitor des MAPK-Signalwegs [27]. Auf der Plasmamembran ist die MAPK-Aktivierung weiter auf Ras-Nanocluster beschränkt, an die Raf, MEK und ERK, die auf dem Kinasesuppressor des Ras-1-Proteins (KSR1) gerüstet sind, selektiv rekrutiert und aktiviert werden ( Abbildung 1 ) [13]. Ein wichtiges Merkmal einzelner K-Ras-Nanocluster ist, dass sie maximal auf sehr niedrige 𠆎inträge’ der Raf-Kinase-Aktivität reagieren [13]. K-Ras-Nanocluster fungieren daher als Signalverstärker mit hoher Verstärkung, die jede Stärke des Raf-Kinase-Inputs in einen maximalen doppelt phosphorylierten (ERKpp) Output umwandeln (Abbildung 2). Funktionell arbeitet daher jeder Nanocluster als niedrigschwelliger digitaler Schalter. Um den raumzeitlichen Maßstab und die Art der Signalausgabe eines einzelnen K-Ras-Nanoclusters zu erfassen, wurden sie als ‘Nanoschalter’ bezeichnet. Der dominierende Parameter innerhalb dieses Ras-Systems ist die sehr kurze Lebensdauer eines Nanoclusters, jeder Nanoschalter bleibt daher nur ‘on’ für

0,4s vor der Demontage [13]. Das andere entscheidende Systemverhalten ist die beobachtete strikt lineare Beziehung zwischen der Anzahl der auf der Plasmamembran erzeugten Ras-Nanoschalter und der Konzentration des stimulierenden epidermalen Wachstumsfaktors (EGF) ( Abbildung 2 ) [13]. Als Folge dieser linearen Beziehung digitalisiert die Plasmamembran das analoge kontinuierliche EGF-Eingangssignal mit einer geeigneten, angepassten Anzahl von Nanoschaltern, die wiederum diskrete ERKpp-Ausgangsquanten erzeugen [13]. Die Plasmamembran als System fungiert somit als biologischer Analog-Digital-Wandler (ADC) [27]. Im Zytosol werden die digitalen ERKpp-Pulse aller einzelnen Nanoschalter summiert, um eine endgültige analoge Ausgabe zu erzeugen, die dem ursprünglichen analogen EGF-Signal entspricht. Im Wesentlichen fungiert das Zytosol nun als einfacher Digital-Analog-Wandler (DAC) [27], und so arbeitet das gesamte Ras-System als analoges 𠄽igital𠄺nalog-Relais (Abbildung 2).

Die EGF-Signaltransduktion wird über die Plasmamembran digitalisiert. (ein) Ras-Nanocluster arbeiten als Verstärker mit hoher Verstärkung, die hohe oder maximale ERKpp-Ausgangspegel über einen weiten Bereich von Raf-Kinase-Eingängen erzeugen. Die Abbildung zeigt, wie sich die Signalausgabe gegenüber der Eingabe ändert, wenn die Verstärkung des Verstärkers erhöht wird. Bei der höchsten Verstärkungsstufe – der Stufe, bei der Ras-Nanocluster arbeiten – kommt der Nanocluster-Ausgang einem Schalter mit einer sehr niedrigen Aktivierungsschwelle nahe. (B) Da Ras-Nanocluster als Verstärker mit hoher Verstärkung fungieren, erzeugen sie während ihrer kurzen Existenz eine maximale ERKpp-Ausgabe, um einen digitalen ERKpp-Burst zu erzeugen, der in das Zytosol freigesetzt wird. Auf diese Weise fungiert die Plasmamembran als Analog-Digital-Wandler (ADC), wobei die digitalen Bursts von Nanoclustern als diskrete Quanteneinheiten arbeiten. (C) Der in der extrazellulären Matrix (ECM) vorhandene analoge EGF-Eingang aktiviert den EGF-Rezeptor, der die Bildung mehrerer Ras-Nanocluster auslöst. Diese Bildung, die durch einen unbekannten Mechanismus erfolgt, ist direkt proportional zur externen EGF-Konzentration. (D) Wenn die Ausgabe jedes Nanoclusters in das Zytoplasma geleitet wird, werden die digitalen Pulse von jedem Nanocluster summiert, um eine endgültige zelluläre analoge ERKpp-Ausgabe zu ergeben. Auf diese Weise kehrt das Zytoplasma die an der Plasmamembran erfolgte digitale Wandlung um und fungiert somit als Digital-Analog-Wandler (DAC). Dieses lineare, analoge𠄽igital𠄺nalog-Schaltungsrelais erzeugt die robuste, hochpräzise Signalübertragung, die über die Plasmamembran auftritt in vivo.

Ras-Nanocluster sind essentiell für die Signalübertragung. In silico Modellierungen zeigen, dass mit abnehmender Anzahl oder Größe der Ras-Nanocluster die Reaktionsfähigkeit des Systems auf EGF zunehmend versagt [13]. Wenn Ras-Nanocluster ganz verschwinden und Ras-Proteine ​​ausschließlich als einzelne Moleküle funktionieren, sinkt die Systemleistung auf 3% der maximalen ERKpp-Leistung, die mit intakten Nanoclustern erreichbar ist [13]. Wichtig ist, dass diese Computersimulationen genau mit biologischen Experimenten übereinstimmen, bei denen die Ras-Signalausgabe mit abnehmender Ras-Nanoclustering-Bildung zunehmend verloren ging [10]. Eine zusätzliche Modellierung zeigt, dass eine entscheidende Rolle von Nanoclustern darin besteht, die Zielfläche der Membran zu vergrößern, die für die Rekrutierung von Raf und KSR1–MEK𠄾RK verfügbar ist. Dieser Bereich nimmt ab, wenn das Ras-Nanoclustering zunehmend verringert wird und damit die Wahrscheinlichkeit einer erfolgreichen Rekrutierung der Komponenten des MAPK-Moduls sinkt [13]. Diese kombinierten Daten zeigen, dass Zellen ohne funktionelle Nanocluster an der Plasmamembran die MAPK-Kaskade als Reaktion auf EGF nicht aktivieren können.


Wenn Proteine ​​eine Gesamtladung haben, wie durchqueren Membranproteine ​​die hydrophobe Region der Plasmamembran? - Biologie

Die Erzeugung einer Membrankrümmung ist entscheidend für die Bildung von Plasmamembranvorsprüngen und Einstülpungen und für die Formung intrazellulärer Organellen. Zu den zentralen Regulatoren der Membrandynamik zählen die Domänen der BAR-Superfamilie, die Membranen zu röhrenförmigen Strukturen verformen. Im Gegensatz zu den relativ gut charakterisierten BAR- und F-BAR-Domänen, die die Bildung von Plasmamembraneinstülpungen fördern, induzieren I-BAR-Domänen Plasmamembranvorsprünge durch einen kaum verstandenen Mechanismus.

Ergebnisse

Wir zeigen, dass I-BAR-Domänen starke PI(4,5)P . induzieren2 Clusterbildung bei Membranbindung, biegen die Membran durch elektrostatische Wechselwirkungen und bleiben dynamisch mit dem inneren Segel der Membrantubuli verbunden. Somit induzieren I-BAR-Domänen die Bildung dynamischer Membranvorsprünge in die entgegengesetzte Richtung als BAR- und F-BAR-Domänen. Auffallenderweise zeigte der Vergleich verschiedener I-BAR-Domänen, dass sie PI(4,5)P . verformen2-reiche Membranen durch verschiedene Mechanismen. IRSp53- und IRTKS-I-BARs binden Membranen hauptsächlich durch elektrostatische Wechselwirkungen, während MIM- und ABBA-I-BARs zusätzlich eine amphipathische Helix in die Membrandoppelschicht einführen, was zu einem größeren Tubulusdurchmesser in vitro und einer effizienteren Filopodienbildung in vivo führt. Darüber hinaus zeigte die FRAP-Analyse, dass die I-BAR-Domänen von Säugetieren zwar eine dynamische Assoziation mit Filopodien aufweisen, die C. elegans Die I-BAR-Domäne bildet relativ stabile Strukturen innerhalb der Plasmamembranvorsprünge.

Schlussfolgerungen

Diese Daten definieren die I-BAR-Domäne als funktionelles Mitglied der BAR-Domänen-Superfamilie und entschlüsseln die Mechanismen, durch die I-BAR-Domänen Membranen verformen, um Filopodien in Zellen zu induzieren. Darüber hinaus zeigt unsere Arbeit unerwartete Divergenzen in den Mechanismen, durch die evolutionär unterschiedliche Gruppen von I-BAR-Domänen mit PI(4,5)P . interagieren2-reiche Membranen.


Diskussion

Wir finden, dass die zunehmende Verwendung positiver Ladung in der Nähe von Protein-N-Termini, die bei der Mittelung über alle Proteine ​​in einem Proteom beobachtet wird, auf die Transmembran-Proteintopologie in beiden zurückzuführen ist E coli und S. cerevisiae (Siehe Abb. 6 zur Veranschaulichung). Ein solcher Befund stimmt mit positiven Ladungen überein, die verwendet werden, um N-Schwänze im Zytosol im Gegensatz zum Periplasma auszurichten. Die Hypothese, dass die Verwendung positiver Ladungen an N-Termini auf die Membranproteinorientierung zurückzuführen ist, macht korrekte Vorhersagen darüber, welche Proteine ​​positiv geladene N-Termini haben und wo in Proteinen eine Anreicherung positiver Ladung beobachtet wird. Obwohl die Verwendung positiver Ladungen im Durchschnitt bei Annäherung an die N-Termini zunimmt ( Abb. 1–3), wird die positive Ladung tatsächlich näher am Kreuzungspunkt der Membran verwendet als am eigentlichen N-Terminus ( Abb. 4 und 5). Daher wird das insgesamt ansteigende durchschnittliche positive Ladungsmuster bei Proteinstarts durch die Längenverteilung der N-zytosolischen Schwänze von Transmembranproteinen erzeugt ( Abb. 5). Dass ähnliche Phänomene dazu beitragen, die durchschnittliche positive Ladung in der Nähe von C-Termini zu erhöhen, deutet stark darauf hin, dass N-terminale Ladungsmuster einfach eine Folge der strukturellen Bedürfnisse von Proteinen sind, nämlich sich in Membranen gemäß der Positiv-Innen-Regel zu orientieren. Dieses N-terminale durchschnittliche positive Ladungsmuster kann vollständig aus stromabwärts gelegenen positiven Ladungsnutzungsmustern in der Nähe von Membranen rekonstituiert werden (Abb. 7), wo keine Selektion auf entweder Rampen oder andere mögliche Gründe für die Ladungsselektion, die speziell für den N-Terminus sein könnten, weiter bestätigt die proteinstrukturelle Grundlage für dieses positive Ladungsmuster. Wichtig ist, dass wir keine Notwendigkeit finden, eine Translationsrampe zu verwenden, um die N-terminalen positiven Ladungsdichten zu erklären.

Unsere Ergebnisse schließen nicht aus, dass aus anderen physikalisch-chemischen Gründen positive Ladungen an den Enden ausgewählt werden können. Zum Beispiel zeigen zytoplasmatisch lokalisierte Proteine, während sie keine zunehmende Ladung in der Nähe von N-Termini aufweisen, auch keine Abwesenheit positiver Ladung ( Abb. 2). Es ist möglich, dass innerhalb einer Untergruppe von Proteinen (entweder transmembran oder cytosolisch) ein exponierter Schwanz positive Ladungen benötigt, um unter anderem andere Gruppen zu binden, einschließlich negativer Ladungen in Nukleinsäuren ( Moarefi et al. 2000), oder dass positive Ladungen für die exponierten Termini-Reste ausgewählt werden, um die Proteinlöslichkeit zu erhöhen (Islam et al. 2012).

Darüber hinaus sollten unsere Ergebnisse nicht überinterpretiert werden. Unsere Analyse ist nicht darauf ausgelegt zu fragen, ob die Rampe (wie bei Hefe beobachtet) real oder adaptiv ist. Wir möchten lediglich wissen, ob die Zunahme der durchschnittlichen positiven Ladung in der Nähe von N-Termini, die wir als weit verbreitetes, wenn nicht phylogenetisch universelles Muster gezeigt haben, am besten als Teil eines Mechanismus zum Blockieren von Ribosomen erklärt werden kann. Wir können auf der Grundlage unserer Ergebnisse nicht schlussfolgern, dass es in keinem Organismus eine Rampe gibt oder dass eine potenzielle Rampe notwendigerweise nicht adaptiv ist. Wir stellen vielmehr fest, dass das Laden positiver Ladungen an N-Termini kein Beweis dafür ist, dass ein solches Abwürgen adaptiv ist oder dass positive Ladungen an N-Termini zu Genregulationszwecken ausgewählt werden, insbesondere da wir eine sparsamere Erklärung für das Vorhandensein von . finden diese Gebühren. In Übereinstimmung damit, dass die positive Ladung besser durch einen anderen Faktor als einen regulatorischen Anstieg erklärt werden kann, finden wir bei Untersuchung der ribosomalen Footprinting-Daten in E coli (Abb. 8). Dies ist ein überraschendes Ergebnis, da 5′-Aberrationen in der Codon-Nutzung (Eyre-Walker und Bulmer 1993), kodierte positive Ladung (Berezovsky et al. 1999), mRNA-Faltung ( McCarthy und Bokelmann 1988 de Smit und van Duin 1990) oder eine Kombination von den dreien wurde vorhergesagt, dass sie einen 5′-Anstieg der ribosomalen Dichten entlang eines Transkripts verursachen ( Tuller et al. 2011).

Zusammen mit anderen neueren Ergebnissen tragen unsere Ergebnisse jedoch ein wenig zur Literatur bei, die die Gültigkeit der adaptiven Rampenhypothese in Frage stellt. Einige haben sich ebenso wie wir in Frage gestellt, ob die Merkmale der Rampe mit anderen Begriffen besser erklärt werden können. Es wird postuliert, dass die hypothetische Rampe neben einer Folge der Ladung durch zwei weitere Eigenschaften von 5′-Enden von mRNAs verursacht wird: nicht optimale Codonverwendung und starke RNA-Faltung (Mitarai et al. 2008 Tuller et al. 2010). Abgesehen von dem Problem, dass die Analyse von Ribosomenschutzdaten keinen Beweis dafür fand, dass nicht optimale Codons Ribosomen unter normalen Bedingungen verlangsamen (Qian et al. 2012 Charneski und Hurst 2013), gibt es eine alternative und sparsamere Interpretation der Anreicherung seltener Codons bei 5 ′-Enden im Sinne einer Verringerung (nicht Erhöhung) der RNA-Faltungsstabilität, um die Translationsinitiation zu ermöglichen ( Bentele et al. 2013). In Kombination mit unserer Analyse scheint die Schlussfolgerung, dass seltene Codons und positive Ladungen an 5'-Enden/N-Termini angereichert sind, um eine Verlangsamung der Ribosomen zu ermöglichen, nun ein unsparsames Modell zu sein.

An immediate problem for the ramp hypothesis is our observation that any excess ribosomal occupancy is seen only at the very start of transcripts in E coli. Warum könnte das sein? The ramp is defined as a net increase in mean ribosomal occupancy as one moves toward the 5′-end of transcripts. Recently, it has been suggested that high initiation rates on shorter transcripts will give a higher mean occupancy at 5′-ends when averaged over multiple transcripts of all lengths, but need not necessarily be seen in any given transcript ( Shah et al. 2013). In principle, if initiation rates are not biased toward small transcripts in E coli, such a statistical artifact could explain the apparent species differences ( fig. 8). However, our analysis is normalized by mean transcript occupancy before averaging across genes. As we see on average a downward trend in yeast ( fig. 8), a factor other than, or in addition to, short transcripts undergoing more frequent initiation may be required to explain all of the observed 5′ ribosomal densities in this organism.

A further issue for the ramp hypothesis is whether the high ribosomal occupancy seen in both E coli and yeast in close proximity to the start codon (∼4 codons in E coli, ∼6 in yeast fig. 8) need reflect elongating ribosomes, as the ramp model presumes. In both eukaryotes and prokaryotes, it is possible for small subunits that have not yet bound a large subunit or completed initiation to bind the start site ( Kozak 1999). It may be possible that such noninitiated small subunits are detected by general endonuclease footprinting protocols. Indeed, similar to our results ( fig. 8), other footprinting data sets in E coli ( Oh et al. 2011) and a human embryonic kidney cell line ( Reid and Nicchitta 2012) also profiled short spikes in ribosomal density over only a few codons at the most 5′-ends of transcripts. These short occluded distances at the extreme 5′-end are roughly consistent with the 16–17 nt, which are occluded at the start of the coding sequence by a small subunit at the start codon in yeast ( Anthony and Merrick 1992). We suggest that the differences in elevated average relative ribosomal densities (along the first few codons at least) in all plotted protein subgroups may to some extent simply reflect differences in translation initiation rates.

The above interpretation may be consistent with apparently different results, dependent on method ( Ingolia et al. 2011). For example, addition of the nonhydrolyzable guanosine triphosphate (GTP) analog Guanylyl imidodiphosphate (GMP-PNP) prevents full (GTP-dependent) ribosome initiation complex formation, leading to an accumulation of small ribosomal subunits positioned at start codons which occlude about 16–17 nt of the start of the coding sequence ( Anthony and Merrick 1992). The use of an initiation inhibitor in making the E coli data set under consideration ( Li et al. 2012) could then potentially exacerbate the problem of enriched footprints in this region that in fact correspond to nonelongating ribosomes. Additionally, the 5′ charge density may also arise from the fact that GMP-PNP should not have an effect on already-formed initiation complexes that are ready to immediately start translating. Such preformed complexes might be able to translate a couple of codons before the elongation inhibitor chloramphenicol ( Li et al. 2012) or cyclohexamide ( Ingolia et al. 2009) are able to act. Such a mechanism is consistent with the slight upswing in ribosomal density in the 1–2 codons in E coli or 4 codons in S. cerevisiae after the translational start ( fig. 8). It is also consistent with the wider initial ribosomal excess (over ∼6 codons) in yeast compared with E coli, which might result from fewer codons being strictly stalled over the start codon by the initiation inhibitor.

We must emphasize that we do not wish to claim it is necessarily the case that at least some of the increased ribosomal density at 5′ transcript ends is an artifact of the method used to suppress translation, merely that it is a possibility. There might be true taxon-specific differences in initiation or elongation that cause the observed differences in 5′ ribosomal densities in either E coli or yeast, or both. Nor has the potentially confounding issue of ribosomal drop off yet been addressed. Understanding to what extent a 5′ excess of ribosomes is a result of true taxonomic differences versus a methodological and/or statistical artifact must be a high priority. It remains to be discovered whether positive charges have been under selection to modulate ribosome velocity.


Abstrakt

Membrane protein folding and topogenesis are tuned to a given lipid profile since lipids and proteins have co-evolved to follow a set of interdependent rules governing final protein topological organization. Transmembrane domain (TMD) topology is determined via a dynamic process in which topogenic signals in the nascent protein are recognized and interpreted initially by the translocon followed by a given lipid profile in accordance with the Positive Inside Rule. The net zero charged phospholipid phosphatidylethanolamine and other neutral lipids dampen the translocation potential of negatively charged residues in favor of the cytoplasmic retention potential of positively charged residues (Charge Balance Rule). This explains why positively charged residues are more potent topological signals than negatively charged residues. Dynamic changes in orientation of TMDs during or after membrane insertion are attributed to non-sequential cooperative and collective lipid–protein charge interactions as well as long-term interactions within a protein. The proportion of dual topological conformers of a membrane protein varies in a dose responsive manner with changes in the membrane lipid composition not only in vivo but also in vitro and therefore is determined by the membrane lipid composition. Switching between two opposite TMD topologies can occur in either direction in vivo and also in liposomes (designated as fliposomes) independent of any other cellular factors. Such lipid-dependent post-insertional reversibility of TMD orientation indicates a thermodynamically driven process that can occur at any time and in any cell membrane driven by changes in the lipid composition. This dynamic view of protein topological organization influenced by the lipid environment reveals previously unrecognized possibilities for cellular regulation and understanding of disease states resulting from mis-folded proteins. This article is part of a Special Issue entitled: Protein trafficking and secretion in bacteria. Guest Editors: Anastassios Economou and Ross Dalbey.


Resultate und Diskussionen

In this study, we performed an ‘acute slice biotinylation assay’ (ASBA) on mouse coronal brain slices (Fig. 1a–d) followed by streptavidin pull-down to separate cell surface-associated proteins in a subfraction termed the ‘PMP enriched fraction’, from the rest of the proteome termed the ‘wash-through fraction’ (Fig. 1e). Traditionally, biotinylation of acute slices and affinity purification is used in combination with immunoblotting to investigate trafficking of receptors and transporters in and out the PM in anatomically or functionally delineated regions of interest in a tissue 16 such as mouse visual cortex in the forebrain 17 . With the intention to verify the applicability of ASBA in combination with proteomic analysis independent of a priori assumptions about the identity of PMPs of potential biological interest and to a lot smaller tissue samples, we also isolated mouse visual cortex tissue (Fig. 1c red), but on mm 3 -scale as study sample.

Workflow for plasma membrane proteomic analysis of small tissue samples.

(ein) Dissect organ of interest, like mouse brain, in artificial cerebrospinal fluid (aCSF). (B) Make slices, allow recovery, label with EZ-Link Sulfo-NHS-SS-Biotin. After quenching, dissect region of interest like the visual cortex (C, red) and mechanically homogenize (D). (e) Separate the plasma membrane protein (PMP) enriched fraction (P) from the rest of the proteome (wash-through, W) by streptavidin pull-down. Panel (F) illustrates SDS-PAGE for P and W. After digestion (g) analyse the protein samples and annotate (h). c adapted from 30 . Scale bar: 1 mm.

To judge the reproducibility of ASBA and streptavidin pull-down, a total protein stain was performed on 1 μg of proteins separated on SDS-PAGE belonging to the PMP enriched fractions and the wash-through fractions (Fig. 1f) derived from 5 different brain samples. The resulting pattern of protein bands, with a predominant location in the higher Mw regions, appeared identical for each of the 5 PMP enriched fractions and differed markedly from the pattern of protein bands, identical between all 5 wash-through fractions. For each of these protein samples we calculated the relative proportion of protein quantity in its PMP enriched fraction to the initial total protein content, that is the sum of the wash-through and PMP enriched fraction. The percentage of proteins in the PMP enriched fraction from each of the extracts ranged between 6.0 and 7.2%.

The clear dissimilarity in band pattern between a PMP enriched fraction and wash-through of one and the same ASBA extract (Fig. 1f), is indicative of a clear difference between the proteins retained on the Streptavidin agarose resin versus those in the eluent. This prompted us to identify the proteins present in the two fractions of each of the 5 brain samples using shotgun proteomics (Table 1 and Supplementary Data 1 and 2). An intermediate step of tube-gel digestion on 25 μg proteins per fraction improved solubilisation and digestion efficiency of membrane proteins 21 and facilitated the removal of detergents prior to mass spectrometric analysis of 1 μg samples (Fig. 1g,h). Next, we used IPA to categorize each identified protein present in the 5 PMP enriched fractions into their subcellular compartment, as an extra validation of the capability of the ASBA method to truly enrich PMPs from a proteomic sample. The percentage of proteins categorised as PMPs by IPA in the 5 separate PMP enriched fractions ranged between 26.8 and 28.8%, illustrating enrichment in and reproducibility of our workflow (Table 1).

For a more detailed analysis of the plasma membrane proteome, we then merged all identifications of the 5 PMP enriched fractions together into 1 protein list. We also merged the identification lists of the 5 wash-through fractions. This resulted in respectively 1,698 and 2,872 discrete proteins that were identified in that PMP enriched fraction and wash-through fraction (Table 1). Of these 1,698 proteins identified in this PMP enriched fraction, IPA successfully annotated 1,625 proteins. Out of these 1,625, 417 proteins or 25.7% were classified as PMP (Table 1 and 2). Because IPA only provides one subcellular localization per protein and does not consider the additional cellular compartments in which a protein can occur 15 , secondary annotations were also checked in IPA and DAVID, in combination with an intensive literature search 6 . As such, a large number of proteins (372) could be additionally assigned to potentially reside in association with (peripheral proteins) or even be fully embedded within the plasma membrane (integral proteins), leading to a total of 789 or 48.6% of PMPs in the PMP enriched fraction (Table 2, Supplementary Table 1, Fig. 1h). Of note, this additional analysis classified an even larger subset of PMPs as ion channel, transmembrane receptor, transporter or G-protein coupled receptor (Table 2 and Supplementary Table 1). Together with these 789 annotated PMPs, another 8 proteins located at the cell surface (0.5%), 163 at the cellular membrane (10.0%) and 51 proteins in the extracellular space (3.1%) (Supplementary Table 2), this accounts for 1,011 or 62.2% proteins in the PMP enriched fraction that have been reported to reside in or near the cell surface (Fig. 1h). The remaining 37.8% proteins in the PMP enriched fraction might be the result of co-purification of large intracellular complexes, with the biotinylated proteins still associated to the plasma membrane or with the readily releasable vesicle pools. These proteins deserve attention in future research to either confirm or exclude their capacity to potentially reside at the PM. In sum, our yields are in agreement with or even higher than recent PMP enrichment studies based on aqueous two-phase affinity partitioning of a much larger tissue sample, a complete rat or mouse cerebellum 13,22 , or on biotinylation and affinity purification of cell surface proteins of cultured mouse cortical neurons 14 .

The efficiency of the presented workflow for the enrichment of PMPs was further validated using the DAVID web tool. This tool allows visualization of the specific protein enrichment in the PMP enriched and wash-through fractions by a gene ontology enrichment analysis on all protein identifications of each fraction relative to a background. The background was built by merging all proteins identified in the PMP enriched with those from the wash-through fraction into one background data set. We used the functional annotation charts of the DAVID web tool based on cellular component ontology and visualized the results in ReViGO treemaps (Supplementary Fig. 1 and 2). The treemap adapted from ReViGO for the PMP enriched fraction (Supplementary Fig. 1) is summarized in Table 3, illustrating an enrichment of proteins associated to the cell surface specific for neuronal cells in the clusters ‘plasma membrane’, ‘plasma membrane part’, ‘ion channel complex’, ‘intrinsic’ and ‘integral component of PM’ and the clusters ‘synapse’, ‘synapse part’, ‘neuron projection’, ‘dendritic spine’ and ‘cell junction’. The treemap adapted from ReViGO resulting from our wash-through data set (Supplementary Fig. 2) summarized in Table 4 shows clusters of proteins associated with different intracellular organelles, especially with mitochondrial function and the ‘respiratory chain’. This reflects the high energy demand and oxygen consumption of neurons and thus the high metabolic rate of the tissue under study 23,24,25,26,27 . Other clusters contain proteins with a role at the envelope, within the endomembrane system and within the membrane-enclosed lumen. Importantly, no clear cluster was suggested for cell surface-associated proteins for the wash-through fraction.

In conclusion, in this report we present the new combination of a procedure for the specific extraction of cell surface-associated proteins including PMPs originating from mm 3 -scale tissue derived from acute tissue slice preparations, with proteomic analysis. This reproducible and efficient enrichment methodology is undoubtedly applicable to many different tissue types and can significantly contribute to future differential plasma membrane proteomics research in many fields of application ranging from neuroscience, cancer and immunology, to stem cell research.


Abstrakt

Protein design is a powerful tool for elucidating mechanisms of function and engineering new therapeutics and nanotechnologies. Although soluble protein design has advanced, membrane protein design remains challenging because of difficulties in modeling the lipid bilayer. In this work, we developed an implicit approach that captures the anisotropic structure, shape of water-filled pores, and nanoscale dimensions of membranes with different lipid compositions. The model improves performance in computational benchmarks against experimental targets, including prediction of protein orientations in the bilayer, G calculations, native structure discrimination, and native sequence recovery. When applied to de novo protein design, this approach designs sequences with an amino acid distribution near the native amino acid distribution in membrane proteins, overcoming a critical flaw in previous membrane models that were prone to generating leucine-rich designs. Furthermore, the proteins designed in the new membrane model exhibit native-like features including interfacial aromatic side chains, hydrophobic lengths compatible with bilayer thickness, and polar pores. Our method advances high-resolution membrane protein structure prediction and design toward tackling key biological questions and engineering challenges.


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