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Was sind Expressed Sequence Tags (EST)?

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Ich habe in einem Artikel gelesen, dass ESTs Teil- oder Untersequenzen von cDNA sind. Was sind ESTs genau? Welcher Teil der cDNA wird geschnitten, um ESTs herzustellen? Warum sind sie so wichtig für die Genomforschung?


Die Frage zitiert nicht die Quelle der Informationen des Posters, aber es könnte sich durchaus um den Wikipedia-Artikel zu ESTs handeln. Ich vermute, dass der Grund, der die erste Frage („Was sind ESTs“) nicht beantwortet, die Verwirrung bei der Erzeugung von ESTs aus cDNAs ist, die in der zweiten Frage „Welcher Teil der cDNA wird geschnitten…“ impliziert ist. Ich beginne daher damit, mich mit der Quelle der Verwirrung zu befassen.

Erläuterung 1: Eine Sequenz muss nicht sequenziert worden sein

Eine Quelle der Verwirrung liegt im Wort 'Reihenfolge'. Eine Bedeutung davon (nur Substantiv) ist „ein spezifisches lineares zusammenhängendes Fragment oder eine Nukleinsäureregion“. Bei dieser Verwendung bedeutet dies nicht, dass selbst die Länge genau bekannt ist, ganz abgesehen von der Identität und linearen Anordnung der Nukleotide. Die zweite Verwendung des Wortes Sequenz (Substantiv) ist die Identität und Reihenfolge von Nukleotiden in einer (linearen) Nukleinsäure, wobei das entsprechende Verb dies zu bestimmen bedeutet. Da es heute so billig und schnell ist, die Sequenz eines Nukleinsäurefragments zu bestimmen, ist dem Studenten vielleicht nicht bewusst, was für ein relativ langsames und teures Unterfangen dies im letzten Jahrhundert war. Ich werde im Rest dieser Antwort ein DNA-Fragment oder eine Region anstelle der ersten Verwendung von "Sequenz" verwenden.

Klarstellung 2: Es gibt cDNAs und dann gibt es cDNA-Klone

Die zweite Quelle der Verwirrung scheinen die cDNA-Klone zu sein. In der Frage wird nicht das Wort „Klon“ verwendet, sondern „welcher Teil der cDNA wird geschnitten…“. Dies impliziert, dass der Poster in Bezug auf einzelne cDNA-Klone denkt, in denen das eingefügte cDNA-Fragment charakterisiert wurde – restriktionskartiert, vielleicht sequenziert und das Proteinprodukt sogar identifiziert. Dies ist der Ansatz, der gewählt wird, wenn das wissenschaftliche Problem darin besteht, die mRNA oder das Gen zu identifizieren, das für ein bestimmtes Protein - Aktin, Beta-Globin usw. - kodiert. Dies ist bei ESTs nicht der Fall. Hier ist die einzige an einem cDNA-Klon durchgeführte Charakterisierung eine einzelne DNA-Sequenz, die (historisch durch das Sanger-Verfahren) von einer Primerposition im Klonierungsvektor bestimmt wurde. Dies liegt daran, dass der Fokus auf der Herstellung einer Massenbibliothek von DNA-Sequenzen liegt.

Was sind also ESTs und wie werden sie generiert?

Alternativ zur Standarddefinition könnte man sagen:

Ein EST ist eine einzelne DNA-Sequenz, die nur von einem Teil einer mRNA abgelesen wird. Trotz seiner nicht charakterisierten Natur, möglicher Redundanz, begrenzten Größe (vielleicht 100-200 nt) und Fehlerwahrscheinlichkeit ist es nützlich in Kombination mit vielen anderen aus dem gleichen Gewebe als einen Verweis auf Gene bereitzustellen, die in diesem Gewebe exprimiert werden.

Um es noch einmal zu wiederholen, die Antwort auf „welcher Teil der cDNA wird geschnitten…“ lautet „keine“. Man isolierte (vermutlich) einfach die Gesamt-DNA aus den Rekombinanten in den M13-Plaques und führte eine Einzelsequenzbestimmung von der Primerstelle aus durch. Und das lag daran, dass man nicht wusste, welches EST nützlich sein würde, aber eine Sammlung oder Bibliothek von ESTs würde wahrscheinlich einige enthalten, die nützlich wären.

Das Wort 'Schild' drückt die Tatsache aus, dass sie als Griff oder Verweis auf das Gen oder die mRNA fungieren, anstatt an sich vollständig zu sein.

Warum sind/waren ESTs wichtig/nützlich?

Die Worte, die das Poster ursprünglich verwendet hat, waren „Warum sind sie so wichtig für die Genomforschung? Beispiele für die Verwendung von ESTs finden sich in dem bereits zitierten Wikipedia-Artikel, daher werde ich Peter Goodfellow zitieren, der 1995 in Nature schrieb.

Nur 3 Prozent des menschlichen Genoms kodieren für Proteine… der wichtigste Teil des Genoms sind die proteinkodierenden Gene und dass deren Sequenzierung die größte Ausbeute an biologischen Informationen liefert…

Nachdem er auf seine eigene Skepsis gegenüber dem Ansatz hingewiesen hatte, erwähnte er kurz eine wichtige historische Frage:

Warum wurden in Anbetracht dieser Fehlanreize zig Millionen Dollar für ESTs ausgegeben? Nach einer kurzen Erkundungsphase… war die Hoffnung und die Befürchtung, dass ESTs verwendet werden könnten, um jedes markierte Gen zu patentieren, eine wichtige treibende Kraft. Versuche, Gene über ESTs zu patentieren, ließen das Gespenst eines internationalen Handelskrieges aufkommen, und die Echos hallten immer noch vor Gerichten in den Vereinigten Staaten wider.

Nicht mehr, hoffe ich. Goodfellow wandte sich dann der Wissenschaft zu:

Man hoffte, dass groß angelegte EST-Projekte die weiten Grenzen der Anzahl der Gene und der Gentypen im Genom definieren und eine Momentaufnahme ihrer Expressionsmuster liefern würden. Es wurde auch erwartet, dass genügend Sequenzinformationen generiert werden, um neue Mitglieder von Genfamilien von biologischem und kommerziellem Interesse erkennen zu können.

Coda: Gestern und Heute

Die derzeit am häufigsten verwendete Methode zur Untersuchung der Expression von Genen als mRNA ist natürlich RNAseq, die schneller, billiger und im Gegensatz zu ESTs umfassender ist.


Ausgedrücktes Sequenz-Tag

Ein ausgedrückter Sequenztag oder Europäische Sommerzeit ist eine kurze Untersequenz einer transkribierten gespleißten Nukleotidsequenz (entweder Protein-kodierend oder nicht). Sie können zur Identifizierung von Gentranskripten verwendet werden und sind bei der Genentdeckung und Gensequenzbestimmung von Bedeutung. [1] Die Identifizierung von ESTs ist schnell vorangekommen, wobei jetzt etwa 43 Millionen ESTs in öffentlichen Datenbanken verfügbar sind (z. B. GenBank 6/2007, alle Arten).

Ein EST wird durch einmaliges Sequenzieren einer klonierten mRNA (d. h. Sequenzieren von mehreren hundert Basenpaaren von einem Ende eines cDNA-Klons aus einer cDNA-Bibliothek) hergestellt. Die resultierende Sequenz ist ein Fragment von relativ geringer Qualität, dessen Länge durch die derzeitige Technologie auf ungefähr 500 bis 800 Nukleotide begrenzt ist. Da diese Klone aus DNA bestehen, die zur mRNA komplementär ist, repräsentieren die ESTs Teile exprimierter Gene. Sie können in der Datenbank entweder als cDNA/mRNA-Sequenz oder als umgekehrtes Komplement der mRNA, dem Matrizenstrang, vorliegen.

ESTs können mithilfe von physikalischen Kartierungstechniken, wie z. B. Strahlungshybridkartierung oder FISH, bestimmten Chromosomenorten zugeordnet werden. Alternativ kann, wenn das Genom des Organismus, der den EST hervorgebracht hat, sequenziert wurde, die EST-Sequenz an diesem Genom ausgerichtet werden.

Das gegenwärtige Verständnis des menschlichen Gensatzes (2006) umfasst die Existenz von Tausenden von Genen, die ausschließlich auf EST-Beweisen beruhen. In dieser Hinsicht werden ESTs zu einem Werkzeug, um die vorhergesagten Transkripte für diese Gene zu verfeinern, was zur Vorhersage ihrer Proteinprodukte und schließlich ihrer Funktion führt. Darüber hinaus gibt die Situation, in der diese ESTs gewonnen werden (Gewebe, Organ, Krankheitszustand – z. B. Krebs), Aufschluss über die Bedingungen, unter denen das entsprechende Gen wirkt. ESTs enthalten genügend Informationen, um das Design präziser Sonden für DNA-Mikroarrays zu ermöglichen, die dann verwendet werden können, um die Genexpression zu bestimmen.

Einige Autoren verwenden den Begriff "EST", um Gene zu beschreiben, für die neben dem Tag nur wenige oder keine weiteren Informationen existieren. [2]

In diesem Artikel wurde ein Überblick über die Bedeutung von ESTs, ihre Eigenschaften, Methoden zur Analyse von EST-Datensätzen und ihre Anwendungen in verschiedenen Bereichen der Biologie gegeben. [3]

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Was sind Expressed Sequence Tags (EST)? - Biologie

Ein ausgedrückter Sequenztag oder EST ist eine kurze Unter-Reihenfolge einer transkribierten cDNA Reihenfolge . Sie können zur Identifizierung von Gentranskripten verwendet werden und sind maßgeblich an der Entdeckung von Genen und Genen beteiligt Reihenfolge Festlegung. Die Identifizierung von ESTs ist schnell vorangekommen.
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Die Ausgedrückt Reihenfolge Stichworte Datenbank enthält Reihenfolge Daten und andere Informationen zu Single-Pass-cDNA-Sequenzen und ist eine Abteilung der GenBank.
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Ein Ausgedrückt Reihenfolge Schild ist ein winziger Teil eines ganzen Gens, der verwendet werden kann. eine Technologie zur Erzeugung von sogenannten Ausgedrückt Reihenfolge Stichworte, oder ESTs. .
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Ausgedrückt Reihenfolge Schild Ein ausgedrückt Reihenfolge Schild oder EST ist eine kurze Unter-Reihenfolge einer transkribierten cDNA Reihenfolge [1] . Reihenfolge: ausgedrückt Reihenfolge Stichworte und .
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Medizinisches Online-Wörterbuch und Glossar mit medizinischen Definitionen. EUROPÄISCHE SOMMERZEIT (ausgedrückt Reihenfolge Schild): Ein einzigartiger DNA-Abschnitt innerhalb einer kodierenden Region von .
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Also auch wenn das komplett ist Reihenfolge eines Genoms bekannt ist, ist es oft schwierig. Ausgedrückt Reihenfolge Stichworte (EST) . Genom, um ein passendes zu finden Reihenfolge. .
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. teilautomatisiertes Verfahren für den Bergbau ausgedrückt Reihenfolge Schild (EST) Daten für Gen. Green P. Analyse von ausgedrückt Reihenfolge Stichworte zeigt 35.000 Menschen an.
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Ausgedrückt Reihenfolge Schild Projekte. Von BDGP EST eingereichte Sammlungen. CK EST-Projekt . Diese ESTs wurden dann geclustert nach Reihenfolge Ähnlichkeit, um die .
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EST steht für Ausgedrückt Reihenfolge Schild. . sind viel länger, also das Reihenfolge ist nur a Schild für die cDNA (und die Ausgangs-mRNA) .
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1996: 280,000 Ausgedrückt Reihenfolge Stichworte (EST) . wie sie 280.000 . generiert und analysiert haben ausgedrückt Reihenfolge Stichworte (oder ESTs) .
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Ausgedrückt Reihenfolge Schild Das Behandlungs- und Untersuchungskit ist ein Werkzeug für . R. N., Souza M. T. Jr. Analyse von ausgedrückt Reihenfolge Stichworte von Musa acuminata ssp. .
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Schweinehoden Ausgedrückt Reihenfolge Stichworte (PtEST)-Datenbank ist die Sammlung von ESTs. organisiert in diese Fachdatenbanken: Expession Reihenfolge Schild (EST) Datenbank .
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Britannica Online-Enzyklopädie-Artikel über ausgedrückt Reihenfolge Schild (Biochemie), Während er am NIH war, wurde Venter mit traditionellen Methoden der Gentechnik frustriert.
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Ausgedrückt Reihenfolge Schild Analyse des Dinoflagellaten Lingulodinium polyedrum während der Dunkelphase¶ aus Photochemistry and Photobiology zur Verfügung gestellt von Find Articles at BNET
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Ausgedrückt Reihenfolge Stichworte, oder ESTs, sind eine Art von sequenzierten Stellen Schild (STS): ein DNA-Segment. der Exons – das Basenpaar Reihenfolge das ist ausgedrückt– eines Gens. .
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Ausgedrückter Sequenztag

exprimierter Sequenz-Tag (Europäische Sommerzeit) Eine kurze Teilsequenz, typischerweise 200� bp lang, eines komplementären DNA-Klons (cDNA). Da cDNAs durch reverse Transkription von Messenger-RNA-Molekülen hergestellt werden, fungieren ESTs als Marker für Gene, die in bestimmten Geweben oder Organen exprimiert werden. EST-Sequenzdaten werden in Datenbanken gespeichert, und Forscher verwenden Computerprogramme, um nach Sequenzen zu suchen, die beispielsweise einer partiellen Aminosäuresequenz für ein zu untersuchendes Protein entsprechen. Die EST-Sequenz kann dann verwendet werden, um eine DNA-Sonde zu konstruieren, um den entsprechenden Klon aus einer DNA-Bibliothek zu lokalisieren.

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Ausgedrückter Sequenztag

Physische Karten und Integration mit genetischen Karten

  • Physische Karten zeigen die physische Distanz zwischen den Genen und können mithilfe von Zytogenetik, Strahlungshybrid oder . erstellt werden Reihenfolge Kartierung.
  • Es gibt drei Methoden, die verwendet werden, um eine physikalische Karte zu erstellen: zytogenetische Kartierung, Strahlungshybridkartierung und Reihenfolge Kartierung.
  • Reihenfolge Kartierung resultiert aus DNA Sequenzierung Technologie, die es ermöglichte, detaillierte physikalische Karten mit Entfernungen zu erstellen, die in Bezug auf die Anzahl der Basenpaare gemessen wurden.
  • Eine genetische Site, die verwendet wird, um eine physische Karte mit zu erstellen Sequenzierung Technologie (a Reihenfolge-markiert site oder STS) ist ein einzigartiges Reihenfolge im Genom mit bekannter genauer chromosomaler Lage.
  • Ein ausgedrücktReihenfolgeSchild (EST) und eine einzelne Reihenfolge Längenpolymorphismus (SSLP) sind häufige STSs.

DNA-Sequenzierungstechniken

  • Wenn jedes Fragment unterschiedlicher Größe die Kapillarsäule verlässt, regt ein Laser die Leuchtstoffröhre an Schild an seinem terminalen Nukleotid.
  • Jeder Sequenzierung Reaktion ist eine modifizierte Replikationsreaktion mit fluoreszierend-markiert Nukleotide, aber es werden keine kettenabbrechenden Didesoxynukleotide benötigt.
  • Sänger Reihenfolge kann nur mehrere hundert Nukleotide von Reihenfolge pro Reaktion.
  • Die meisten der nächsten Generation Sequenzierung Techniken erzeugen noch kleinere Blöcke von Reihenfolge.
  • Die kleinsten Fragmente wurden am frühesten abgebrochen und kommen zuerst aus der Säule, also die Reihenfolge, in der verschiedene fluoreszierende Stichworte Verlassen der Spalte ist auch die Reihenfolge des Stranges.

Epigenetische Kontrolle: Regulierung des Zugangs zu Genen innerhalb des Chromosoms

  • Diese Stichworte sind nicht permanent, können aber nach Bedarf hinzugefügt oder entfernt werden.
  • Die Stichworte die DNA-Base nicht verändern Reihenfolge, aber sie verändern, wie eng die DNA um die Histonproteine ​​gewunden ist.
  • Diese DNA-Änderungen werden von den Eltern an die Nachkommen vererbt, so dass, während die DNA Reihenfolge wird nicht verändert, das Genmuster Ausdruck wird an die nächste Generation weitergegeben.
  • Transkriptionsfaktoren können binden, sodass Gene Ausdruck passieren.
  • Modifikationen beeinflussen Nukleosomenabstand und Gene Ausdruck.

Verwendungen von Genomsequenzen

  • Genom Sequenzen und Ausdruck können mit DNA-Mikroarrays analysiert werden, was zur Erkennung von Krankheiten und genetischen Störungen beitragen kann.
  • DNA-Mikroarrays sind Methoden zum Nachweis von Genen Ausdruck durch Analyse eines Arrays von DNA-Fragmenten, die auf einem Objektträger oder einem Siliziumchip fixiert sind, um aktive Gene zu identifizieren und zu identifizieren Sequenzen .
  • Obwohl das Studium der medizinischen Anwendungen des Genoms Sequenzierung interessant ist, neigt diese Disziplin dazu, sich mit abnormen Genfunktionen zu befassen.
  • Es klingt großartig, all das Wissen zu haben, das wir aus dem gesamten Genom gewinnen können Sequenzierung Der Mensch hat jedoch die Verantwortung, dieses Wissen mit Bedacht einzusetzen.
  • DNA-Mikroarrays können verwendet werden, um Gene zu analysieren Ausdruck innerhalb des Genoms.

Regulierung der Proteinaktivität und Langlebigkeit

  • Diese Veränderungen können die Proteinfunktion, die epigenetische Zugänglichkeit, die Transkription, die mRNA-Stabilität oder die Translation verändern, was alle zu Veränderungen in führt Ausdruck verschiedener Gene.
  • Eine Möglichkeit, das Gen zu kontrollieren Ausdruck besteht darin, die Lebensdauer des Proteins zu verändern: Ubiquitinierung verkürzt die Lebensdauer eines Proteins.
  • Proteine ​​mit Ubiquitin Stichworte sind für den Abbau innerhalb des Proteasoms markiert.

Das trp-Operon: Ein Repressor-Operon

  • Wenn jedoch die Tryptophanverfügbarkeit gering ist, wird der Schalter, der das Operon kontrolliert, eingeschaltet, die Transkription wird initiiert, die Gene sind ausgedrückt, und Tryptophan wird synthetisiert.
  • Eine DNA Reihenfolge die für Proteine ​​kodiert, wird als kodierende Region bezeichnet.
  • Der Promoter Reihenfolge liegt stromaufwärts der Transkriptionsstartstelle.
  • Eine DNA Reihenfolge nannte den Betreiber Reihenfolge wird zwischen der Promotorregion und dem ersten trp-kodierenden Gen kodiert.
  • Erklären Sie die Beziehung zwischen Struktur und Funktion eines Operons und die Art und Weise, wie Repressoren Gene regulieren Ausdruck

Transkriptionelle Enhancer und Repressoren

  • Enhancer-Regionen binden Sequenzenoder Stellen für Transkriptionsfaktoren.
  • Daher ist ein Nukleotid Reihenfolge Tausende von Nukleotiden entfernt können sich umklappen und mit einem bestimmten Promotor interagieren.
  • Ein Corepressor ist ein Protein, das die Gene verringert Ausdruck durch Bindung an einen Transkriptionsfaktor, der eine DNA-bindende Domäne enthält.
  • Ein Enhancer ist eine DNA Reihenfolge das fördert die Transkription.
  • Jeder Enhancer besteht aus kurzer DNA Sequenzen als distale Bedienelemente bezeichnet.

MRNA-Verarbeitung

  • Während die RNA-Polymerase II noch stromabwärts des richtigen Endes eines Gens transkribiert, wird die prä-mRNA durch einen Endonuklease-haltigen Proteinkomplex zwischen einem AAUAAA-Konsens gespalten Reihenfolge und ein GU-reiches Reihenfolge.
  • Eukaryotische Gene bestehen aus Exons, die der Proteincodierung entsprechen Sequenzen (ex-on bedeutet, dass sie ausgedrückt) und intervenieren Sequenzen Introns genannt (int-ron bezeichnet ihre intervenierende Rolle), die an der Genregulation beteiligt sein können, aber während der Verarbeitung aus der Prä-mRNA entfernt werden.
  • Intron Sequenzen in mRNA kodieren keine funktionellen Proteine.
  • Es ist möglich, dass Introns Gene verlangsamen Ausdruck weil es länger dauert, prä-mRNAs mit vielen Introns zu transkribieren.
  • Diese Spaltung erfolgt durch einen Endonuklease enthaltenden Proteinkomplex, der an ein AAUAAA . bindet Reihenfolge stromaufwärts der Spaltstelle und zu einem GU-reichen Reihenfolge stromabwärts der Schnittstelle.

Der Prozess und Zweck der Genexpressionsregulierung

  • Während jede Zelle das gleiche Genom und die gleiche DNA teilt Reihenfolge, jede Zelle schaltet sich nicht ein, oder ausdrücken, der gleiche Satz von Genen.
  • Daher ist nur eine kleine Untermenge von Proteinen ausgedrückt in einer Zelle, die ihr Proteom bildet.
  • Spezialisierte Proteine, aus denen das Auge besteht (Iris, Linse und Hornhaut) sind nur ausgedrückt im Auge, während die spezialisierten Proteine ​​im Herzen (Schrittmacherzellen, Herzmuskel und Klappen) nur ausgedrückt im Herzen.
  • Diese Komplexität sorgt für die richtige Ausdruck in der richtigen Zelle zur richtigen Zeit.
  • In diesem Abschnitt erfahren Sie mehr über die verschiedenen Methoden der Genregulation und die Mechanismen zur Kontrolle von Genen Ausdruck, wie: epigenetische, transkriptionelle, posttranskriptionelle, translationale und posttranslationale Kontrollen in eukaryotischen Genen Ausdruckund transkriptionelle Kontrolle in prokaryontischen Genen Ausdruck.

Das zentrale Dogma: DNA kodiert RNA und RNA kodiert Protein

  • Das Stopcodon UGA wird manchmal verwendet, um eine 21. Aminosäure namens Selenocystein (Sec) zu kodieren, jedoch nur, wenn die mRNA zusätzlich eine spezifische . enthält Reihenfolge von Nukleotiden, die als Selenocystein-Insertion bezeichnet werden Reihenfolge (SECIS).
  • Es besagt, dass Gene die Reihenfolge von mRNA-Molekülen, die wiederum die Reihenfolge von Proteinen.
  • Transkription ist der Prozess der Erstellung einer komplementären RNA-Kopie von a Reihenfolge der DNA.
  • Transkription ist der erste Schritt im Gen Ausdruck.
  • Transfer-RNA oder tRNA übersetzt die Reihenfolge Codons auf dem mRNA-Strang.
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Datenquellen und Anmerkungen

DbEST

dbEST ist eine 1992 gegründete Abteilung der Genbank. Wie bei der GenBank werden die Daten in dbEST direkt von Labors weltweit übermittelt und nicht kuratiert.

EST-Contigs

Aufgrund der Art und Weise, wie ESTs sequenziert werden, sind viele verschiedene exprimierte Sequenz-Tags oft Teilsequenzen, die derselben mRNA eines Organismus entsprechen. In dem Bemühen, die Anzahl der exprimierten Sequenz-Tags für Downstream-Gen-Entdeckungsanalysen zu reduzieren, bauten mehrere Gruppen exprimierte Sequenz-Tags zu EST-Contigs zusammen. Beispiele für Ressourcen, die EST-Contigs bereitstellen, sind:

Die Konstruktion von EST-Contigs ist nicht trivial und kann zu Artefakten führen (Contigs, die zwei unterschiedliche Genprodukte enthalten). Wenn die vollständige Genomsequenz eines Organismus verfügbar ist und Transkripte annotiert sind, ist es möglich, die Contig-Assemblierung zu umgehen und Transkripte direkt mit ESTs abzugleichen. Dieser Ansatz wird im TissueInfo-System (siehe unten) verwendet und macht es einfach, Annotationen in der Genomdatenbank mit Gewebeinformationen aus EST-Daten zu verknüpfen.


Abstrakt

Wir haben ein umfassendes Suchverfahren für Tag-Datenbanken mit exprimierten Sequenzen entwickelt und zur Identifizierung neuer Mitglieder der Superfamilie der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren verwendet. Unser Ansatz erwies sich als besonders nützlich für den Nachweis von exprimierten Sequenz-Tag-Sequenzen, die keine konservierten Teile eines Proteins kodieren, was ihn zu einem idealen Werkzeug zur Identifizierung von Mitgliedern divergenter Proteinfamilien oder von Proteinteilen ohne konservierte Domänenstrukturen in den exprimierten Sequenz-Tag-Datenbank. Mindestens 14 der mit dieser Strategie gefundenen exprimierten Sequenz-Tags sind vielversprechende Kandidaten für neue mutmaßliche G-Protein-gekoppelte Rezeptoren. Hier beschreiben wir die Sequenz- und Expressionsanalyse von fünf neuen Mitgliedern dieser Rezeptor-Superfamilie, nämlich GPR84, GPR86, GPR87, GPR90 und GPR91. Wir untersuchten auch die genomische Struktur und die chromosomale Lokalisation der jeweiligen Gene unter Anwendung von in silico Methoden. Auf dem menschlichen Chromosom 3q24-3q25 wurde ein Cluster von sechs eng verwandten G-Protein-gekoppelten Rezeptoren gefunden. Es besteht aus vier Orphan-Rezeptoren (GPR86, GPR87, GPR91 und H963), dem purinergen Rezeptor P2Y1 und dem Uridin-5′-Diphosphoglucose-Rezeptor KIAA0001. Es ist wahrscheinlich, dass diese Rezeptoren aus einem gemeinsamen Vorfahren hervorgegangen sind und daher verwandte Liganden haben könnten. Abschließend beschreiben wir ein Data-Mining-Verfahren, das sich für die Identifizierung und erste Charakterisierung neuer Gene bewährt hat und auch für andere Genfamilien gut anwendbar ist.


Was sind Expressed Sequence Tags (EST)? - Biologie

ESTs: GENENTDECKUNG LEICHTER GEMACHT

Die Ermittler arbeiten aus mehreren wichtigen Gründen fleißig daran, die Genome verschiedener Organismen, einschließlich der Maus und des Menschen, zu sequenzieren und zusammenzusetzen. Obwohl wichtige Ziele eines jeden Sequenzierungsprojekts darin bestehen können, eine genomische Sequenz zu erhalten und einen vollständigen Satz von Genen zu identifizieren, besteht das ultimative Ziel darin, zu verstehen, wann, wo und wie ein Gen aktiviert wird, ein Prozess, der allgemein als . bezeichnet wird Genexpression. Sobald wir verstehen, wo und wie ein Gen unter normalen Umständen exprimiert wird, können wir untersuchen, was in einem veränderten Zustand, beispielsweise bei einer Krankheit, passiert. Um das letztere Ziel zu erreichen, müssen Forscher jedoch das Protein oder die Proteine, für die ein Gen kodiert, identifizieren und untersuchen.

Wie man sich vorstellen kann, ist es nicht einfach, ein Gen zu finden, das für ein oder mehrere Proteine ​​kodiert. Traditionell begannen Wissenschaftler ihre Suche mit der Definition eines biologischen Problems und der Entwicklung einer Strategie zur Erforschung des Problems. Oftmals lieferte eine Recherche in der wissenschaftlichen Literatur verschiedene Anhaltspunkte für das weitere Vorgehen. Zum Beispiel können andere Laboratorien Daten veröffentlicht haben, die eine Verbindung zwischen einem bestimmten Protein und einer interessierenden Krankheit hergestellt haben. Die Forscher würden dann daran arbeiten, dieses Protein zu isolieren, seine Funktion zu bestimmen und das Gen zu lokalisieren, das für das Protein kodiert. Alternativ könnten Wissenschaftler das durchführen, was als Verknüpfungsstudien um die chromosomale Position eines bestimmten Gens zu bestimmen. Sobald die chromosomale Position bestimmt war, würden die Wissenschaftler biochemische Methoden verwenden, um das Gen und das entsprechende Protein zu isolieren. In jedem Fall brauchten diese Methoden viel Zeit – in einigen Fällen Jahre – und lieferten nur die Lokalisierung und Beschreibung eines kleinen Prozentsatzes der im menschlichen Genom gefundenen Gene.

Jetzt jedoch nimmt die Zeit, die benötigt wird, um ein Gen zu lokalisieren und vollständig zu beschreiben, rapide ab, dank der Entwicklung und des Zugangs zu einer Technologie, die verwendet wird, um sogenannte . zu generieren Ausgedrückte Sequenz-Tags, oder ESTs. ESTs bieten Forschern einen schnellen und kostengünstigen Weg, um neue Gene zu entdecken, Daten zur Genexpression und -regulation zu erhalten und Genomkarten zu erstellen. Heute reiten Forscher, die ESTs verwenden, um das menschliche Genom zu untersuchen, auf dem Gipfel einer Welle wissenschaftlicher Entdeckungen, wie sie noch nie zuvor gesehen wurde.

Was sind ESTs und wie werden sie hergestellt?

Expressed Ssequenz Tags sind kleine DNA-Sequenzstücke (normalerweise 200 bis 500 Nukleotide lang), die durch Sequenzieren entweder eines oder beider Enden eines exprimierten Gens erzeugt werden. Die Idee ist, DNA-Bits zu sequenzieren, die Gene darstellen, die in bestimmten Zellen, Geweben oder Organen von verschiedenen Organismen exprimiert werden, und diese zu verwenden.Stichworte" ein Gen aus einem Teil der chromosomalen DNA herauszufischen, indem Basenpaare übereinstimmen. Die Herausforderung, die mit der Identifizierung von Genen aus genomischen Sequenzen verbunden ist, variiert zwischen den Organismen und hängt von der Genomgröße sowie dem Vorhandensein oder Fehlen von Introns--die dazwischenliegenden DNA-Sequenzen, die die Protein-kodierende Sequenz eines Gens unterbrechen.

Die Spreu vom Weizen trennen: cDNA mit mRNA erzeugen

Die Genidentifizierung ist beim Menschen sehr schwierig, da der größte Teil unseres Genoms aus Introns besteht, die mit relativ wenigen DNA-kodierenden Sequenzen oder Genen durchsetzt sind. Diese Gene werden als Proteine ​​exprimiert, ein komplexer Prozess, der aus zwei Hauptschritten besteht. Zuerst muss jedes Gen (DNA) umgewandelt werden, oder transkribiert, hinein Boten-RNA (mRNA) – RNA, die als Matrize für die Proteinsynthese dient. Die resultierende mRNA leitet dann die Synthese eines Proteins durch einen Prozess namens Übersetzung. Interessanterweise enthalten mRNAs in einer Zelle weder Sequenzen aus den Regionen zwischen den Genen noch aus den nicht-kodierenden Introns, die in vielen Genen vorhanden sind. Daher ist die Isolierung von mRNA der Schlüssel zum Auffinden exprimierter Gene in der weiten Ausdehnung des menschlichen Genoms.

Abbildung 1. Ein Überblick über den Prozess der Proteinsynthese.
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Proteinsynthese ist der Prozess, bei dem DNA für die Produktion von Aminosäuren und Proteinen kodiert. Der Prozess gliedert sich in zwei Teile: Transkription und Übersetzung. Während der Transkription wird ein Strang einer DNA-Doppelhelix von der mRNA-Polymerase als Matrize verwendet, um eine mRNA zu synthetisieren. Während dieses Schrittes durchläuft die mRNA verschiedene Phasen, einschließlich einer sogenannten Spleißen, in der die nicht-kodierenden Sequenzen eliminiert werden. Im nächsten Schritt, der Translation, steuert die mRNA die Synthese des Proteins durch Hinzufügen von Aminosäuren – eine nach der anderen – wie von der DNA vorgegeben und durch die mRNA repräsentiert.
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Das Problem ist jedoch, dass mRNA außerhalb einer Zelle sehr instabil ist, daher verwenden Wissenschaftler spezielle Enzyme, um sie in cDNA umzuwandeln, oder komplementäre DNA. cDNA ist eine viel stabilere Verbindung und, was wichtig ist, da sie aus einer mRNA erzeugt wurde, bei der die Introns entfernt wurden, repräsentiert cDNA nur die exprimierte DNA-Sequenz.

Sobald die cDNA, die ein exprimiertes Gen repräsentiert, isoliert wurde, können Wissenschaftler einige hundert Nukleotide von jedem Ende des Moleküls sequenzieren, um zwei verschiedene Arten von ESTs zu erzeugen. Die Sequenzierung nur des Anfangsteils der cDNA erzeugt das sogenannte a 5' EST. Ein 5'-EST, das aus dem Teil eines Transkripts erhalten wird, das normalerweise für ein Protein kodiert. Diese Regionen sind in der Regel artenübergreifend erhalten und ändern sich innerhalb eines Zeitraums nicht wesentlich Genfamilie. Die Sequenzierung des Endabschnitts des cDNA-Moleküls erzeugt das sogenannte a 3' EST. Da diese ESTs vom 3'-Ende eines Transkripts generiert werden, fallen sie wahrscheinlich unter nicht-kodierend, oder unübersetzte Regionen (UTR), und neigen daher dazu, weniger artenübergreifende Konservierung zu zeigen als kodierende Sequenzen.

Abbildung 2. Eine Übersicht über die Generierung von Expressed Sequence Tags.
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ESTs werden durch Sequenzieren von cDNA erzeugt, die selbst aus den mRNA-Molekülen in einer Zelle synthetisiert wird. Die mRNA in einer Zelle sind Kopien der Gene, die exprimiert werden. mRNA enthält weder Sequenzen aus den Regionen zwischen den Genen noch aus den nicht-kodierenden Introns, die in vielen interessanten Teilen des Genoms vorhanden sind.
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ESTs: Werkzeuge für die Genkartierung und Entdeckung

So wie ein Autofahrer eine Karte braucht, um ein Ziel zu finden, brauchen auch Wissenschaftler, die nach Genen suchen, Genomkarten um ihnen zu helfen, durch die Milliarden von Nukleotiden zu navigieren, aus denen das menschliche Genom besteht. Damit eine Karte für die Navigation sinnvoll ist, muss sie zuverlässige Orientierungspunkte oder "Markierungen" enthalten. Derzeit beruht die leistungsstärkste Kartierungstechnik, die zur Erstellung vieler Genomkarten verwendet wurde, auf der STS-Kartierung. Eine Sequence Tagged Site (STS) ist eine kurze DNA-Sequenz, die leicht erkennbar ist und nur einmal in einem Genom (oder Chromosom) vorkommt. Die 3'-ESTs dienen aufgrund ihrer Wahrscheinlichkeit, für eine bestimmte Spezies einzigartig zu sein, als eine gemeinsame Quelle von STSs und bieten das zusätzliche Merkmal, dass sie direkt auf ein exprimiertes Gen zeigen.

ESTs als Gene Discovery Resources

Da ESTs nur eine Kopie des interessanten Teils eines Genoms darstellen, also des exprimierten, haben sie sich immer wieder als mächtige Werkzeuge bei der Suche nach Genen erwiesen, die an Erbkrankheiten beteiligt sind. ESTs haben auch eine Reihe praktischer Vorteile, da ihre Sequenzen schnell und kostengünstig generiert werden können die EST wurde abgeleitet.

Um mit diesem Ansatz ein Krankheitsgen zu finden, verwenden Wissenschaftler zunächst beobachtbare biologische Hinweise, um ESTs zu identifizieren, die den Kandidaten für Krankheitsgene entsprechen könnten. Wissenschaftler untersuchen dann die DNA von Krankheitspatienten auf Mutationen in einem oder mehreren dieser Kandidatengene, um die Genidentität zu bestätigen. Mit dieser Methode haben Wissenschaftler bereits Gene isoliert, die an Alzheimer, Dickdarmkrebs und vielen anderen Krankheiten beteiligt sind. Es ist also leicht zu erkennen, warum ESTs den Weg zu neuen Horizonten in der Genforschung ebnen werden.

Aufgrund ihrer Nützlichkeit, Geschwindigkeit, mit der sie erzeugt werden können, und der geringen Kosten, die mit dieser Technologie verbunden sind, haben viele einzelne Wissenschaftler sowie große Genomsequenzierungszentren Hunderttausende von ESTs für die öffentliche Verwendung erzeugt. Sobald ein EST generiert wurde, übermittelten die Wissenschaftler ihre Tags an GenBank, die vom NCBI betriebene NIH-Sequenzdatenbank. Bei der schnellen Einreichung so vieler ESTs wurde es schwierig, eine Sequenz zu identifizieren, die bereits in der Datenbank hinterlegt war. Für NCBI-Forscher wurde immer deutlicher, dass ESTs, wenn sie leicht zugänglich und als Genforschungswerkzeuge nützlich sein sollen, in einer durchsuchbaren Datenbank organisiert werden mussten, die auch Zugang zu anderen Genomdaten bietet. Daher entwickelten Wissenschaftler des NCBI 1992 eine neue Datenbank, die als Sammelstelle für ESTs dienen sollte. Nachdem ein bei GenBank eingereichter EST gescreent und mit Anmerkungen versehen wurde, wurde er in dieser neuen Datenbank namens dbEST hinterlegt.

dbEST: ein beschreibender Katalog von ESTs

Wissenschaftler des NCBI haben dbEST entwickelt, um die große Masse öffentlicher EST-Daten zu organisieren, zu speichern und zugänglich zu machen, die sich bereits angesammelt hat und die täglich weiter wächst. Mit dbEST kann ein Wissenschaftler nicht nur auf Daten zu menschlichen ESTs zugreifen, sondern auch auf Informationen zu ESTs von über 300 anderen Organismen. Wann immer möglich, kommentieren die NCBI-Wissenschaftler den EST-Datensatz mit allen bekannten Informationen. Wenn beispielsweise ein EST mit einer DNA-Sequenz übereinstimmt, die für ein bekanntes Gen mit einer bekannten Funktion kodiert, werden der Name und die Funktion dieses Gens in den EST-Datensatz aufgenommen. Das Annotieren von EST-Datensätzen ermöglicht es öffentlichen Wissenschaftlern, dbEST als Weg zur Genentdeckung zu verwenden. Durch den Einsatz eines Datenbanksuchtools wie BLAST von NCBI kann jede interessierte Partei Sequenzähnlichkeitssuchen gegen dbEST durchführen.

UniGene: ein nicht redundanter Satz genorientierter Cluster

Da ein Gen viele Male als mRNA exprimiert werden kann, können ESTs, die letztendlich von dieser mRNA abgeleitet sind, redundant. Das heißt, es kann viele identische oder ähnliche Kopien desselben EST geben. Eine solche Redundanz und Überlappung bedeutet, dass jemand, wenn er dbEST nach einem bestimmten EST durchsucht, eine lange Liste von Tags abrufen kann, von denen viele das gleiche Gen repräsentieren können. Das Durchsuchen all dieser identischen ESTs kann sehr zeitaufwendig sein. Um das Redundanz- und Überlappungsproblem zu lösen, entwickelten die Ermittler des NCBI die UniGene-Datenbank.


Inhalt

DbEST

dbEST ist eine 1992 gegründete Abteilung der Genbank. Wie bei der GenBank werden die Daten in dbEST direkt von Labors weltweit übermittelt und nicht kuratiert.

EST-Contigs

Aufgrund der Art und Weise, wie ESTs sequenziert werden, sind viele verschiedene exprimierte Sequenz-Tags oft Teilsequenzen, die derselben mRNA eines Organismus entsprechen. In dem Bemühen, die Anzahl der exprimierten Sequenz-Tags für Downstream-Gen-Entdeckungsanalysen zu reduzieren, bauten mehrere Gruppen exprimierte Sequenz-Tags zu EST-Contigs zusammen. Beispiele für Ressourcen, die EST-Contigs bereitstellen, sind:

Die Konstruktion von EST-Contigs ist nicht trivial und kann zu Artefakten führen (Contigs, die zwei unterschiedliche Genprodukte enthalten). Wenn die vollständige Genomsequenz eines Organismus verfügbar ist und Transkripte annotiert sind, ist es möglich, die Contig-Assemblierung zu umgehen und Transkripte direkt mit ESTs abzugleichen. Dieser Ansatz wird im TissueInfo-System (siehe unten) verwendet und macht es einfach, Annotationen in der Genomdatenbank mit Gewebeinformationen aus EST-Daten zu verknüpfen.


Exprimierter Sequenz-Tag (EST)

Eine kurze Teilsequenz, typischerweise 200–400 bp lang, eines *komplementären DNA-Klons (cDNA). Da cDNAs durch reverse Transkription von Messenger-RNA-Molekülen hergestellt werden, fungieren ESTs als Marker für Gene, die in bestimmten Geweben oder Organen exprimiert werden. EST-Sequenzdaten werden in Datenbanken gespeichert, und Forscher verwenden Computerprogramme, um nach Sequenzen zu suchen, die beispielsweise einer partiellen Aminosäuresequenz für ein zu untersuchendes Protein entsprechen. The EST sequence can then be used to construct a DNA probe to locate the respective clone from a . .

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How to submit data

Beginning in 2019, you may submit to dbEST using tbl2asn. Only input data files 1 and 2 under REQUIRED are necessary to generate an EST submission.

    containing a text ASN.1 Submit-block object (suffix .sbt) in FASTA format (suffix .fsa). Each sequence in the FASTA file should include [organism=Genus species] [tech=EST] [moltype=mRNA]. The SeqID will be used as the clone value. You may use other relevant source modifiers as well, including tissue-type, dev-stage, etc., as in [tissue-type=cardiac muscle], [dev-stage=adult], [strain=ABC123], etc.
  1. Features are not required, but you may include a feature table with no more than a single misc_feat for each sequence with "similar to . " in the note. No other features may be applied to ESTs.

Once you have generated your template.sbt and ESTs.fsa files, the command line for running tbl2asn will look something like this:

tbl2asn -t template.sbt -i ESTs.fsa -a s -V v

The submission file generated in this example would be ESTs.sqn

A more thorough description of the possible command line arguments is available on the tbl2asn page.

You may also include BioProject or BioSample information, if the ESTs are part of a larger, ongoing project.

Please send your EST submission (.sqn file) to [email protected]
Any questions may be sent to [email protected] or [email protected]


Schau das Video: Expressed sequence tag (Juli 2022).


Bemerkungen:

  1. Cyris

    Ganz klar, die ausgezeichnete Antwort

  2. Tagore

    Guten Tag!

  3. Kazrajas

    Mir ist aufgefallen, dass einige Blogger gerne Leser provozieren. Einige lassen selbst provokative Kommentare selbst in ihrem Blog.

  4. Diji

    Du hast nicht recht. Ich bin sicher. Ich kann es beweisen. Senden Sie mir eine E -Mail an PM, wir werden reden.

  5. Vojinn

    All dies ist dynamisch und sehr positiv

  6. Ames

    Kognitiver Thema



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