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Wie kann die ortsgerichtete Mutagenese genutzt werden, um die Produktion von Anti-Antikörpern zu unterdrücken?

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In einem früheren Beitrag von mir habe ich gefragt, wie man die Bildung von Anti-Antikörpern in vivo unterdrücken kann. In der Antwort wurde erwähnt, dass eine ortsgerichtete Mutagenese verwendet werden könnte. Derzeit kann ich mcuh nicht finden, wie das geht ... Wie funktioniert das?

Update: Da die Leute wissen wollen, woher diese Idee kommt, hier ist der Link zu meiner vorherigen Frage dazu… Weitere Informationen finden Sie in der Antwort:

Wie hemmt man die Bildung spezifischer Antikörper (gegen Antiseren)?


Grenzen in der Pflanzenwissenschaft

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Einführung

Reis (Oryza sativa L.) hat unter allen Nutzpflanzen in den letzten Jahrzehnten die höchsten Fortschritte in der funktionellen Genomik gezeigt. Es handelt sich um eine diploide Art mit einem kleinen Genom im Vergleich zu anderen Kulturgetreide (Moin et al., 2017). Darüber hinaus trägt der breite Einsatz genetischer Transformationstechniken, die Syntenie mit anderen Kulturpflanzenarten und eine diversifizierte Quelle verwandten und eng verwandten Keimplasmas enorm zu den Vorteilen bei, Reis als genetisches System für Funktionsanalysen zu verwenden (Lo et al., 2016 ). Elite-Reissorten weisen jedoch aufgrund der wiederholten Verwendung ähnlicher Genotypen, d. h. mit demselben Ideotyp in Kreuzungsblöcken, eine geringe genetische Variabilität auf. Das Verständnis der genetischen Basis und der Funktion eines bestimmten Gens kann Züchtern helfen, neue, produktivere und stresstolerantere Sorten zu entwickeln. Man muss bedenken, dass die meisten der agronomisch wichtigen Merkmale komplex vererbt und daher schwieriger zu verbessern sind. In diesem Fall kann das mutierte oder varianten Allel durch Durchführung von Genome Wide Association Studies (GWAS) in Populationen mit mutierten Genotypen nachgewiesen und leicht introgressiert werden.

Mutationen können als Werkzeug für Genfunktionsstudien und zur Erzeugung genetischer Variabilität verwendet werden. Die Analyse von Mutanten durch Vorwärtsgenetik, d. h. von Phänotyp zu Gen, oder durch reverse Genetik, d. h. von Gen zu Phänotyp, kann verwendet werden, um die Genfunktion zu verstehen (Lo et al., 2016). Allerdings sind die spontanen Mutationsraten bei höheren Pflanzen gering und reichen von 10 𢄥 bis 10 𢄨 (Jiang und Ramachandran, 2010). Somit ist die Mutagenese eine wichtige Strategie zur Erhöhung der Mutationshäufigkeit (Maluszynski et al., 2000 Da Luz et al., 2016), die Studien zur funktionellen Genomik und die Entwicklung neuer Genotypen ermöglicht.

Mutationen können durch genotoxische Mittel oder durch DNA-Insertionen zufällig induziert werden, und beides kann zu Gengewinn oder Funktionsverlust führen. Eine andere Form besteht darin, direkte Mutationen zu induzieren, um die Struktur eines Zielgens zu verändern. Bei Reis wurde über einige wichtige Mutantensammlungen berichtet, die mit dem Ziel funktioneller Studien erstellt wurden, und eine Liste der Mutantenbibliotheken wurde von Hirochika et al. (2004). Innerhalb der Bibliothek findet man Mutantensammlungen für zufällig induzierte Mutationen (Maluszynski et al., 2000) und Insertionsmutationen durch Transposons (van Enckevort et al., 2005), Retrotransposon (Übersicht in Hirochika, 2010), T-DNA-Insertionen ( Zhang et al., 2006 Hsing et al., 2007 Piffanelli et al., 2007) und sogar mutierte Arabidopsis-Linien, die Reis-Volllängen-cDNA exprimieren (Sakurai et al., 2011). Die entwickelten Mutanten können dabei helfen, einen Stoffwechselweg zu definieren oder direkt in der Landwirtschaft eingesetzt werden, ein klassisches Beispiel sind die Imidazolinon-Herbizid-resistenten Reissorten (Sudianto et al., 2013).

Angesichts der Bedeutung der Entwicklung von Reismutanten für das Verständnis der Genfunktion und die Schaffung genetischer Variabilität berichtet dieser Review über die neuesten Fortschritte bei der Identifizierung der Genfunktion und erschließt das genetische Reservoir, das durch Mutationen im Reisgenom gewonnen wird.


Inhalt

1984 untersuchte das Hart-Labor nach terminalen GlcNAc-Resten auf den Oberflächen von Thymozyten und Lymphozyten. Rindermilch-β-1,4-Galactosyltransferase, die mit terminalen GlcNAc-Resten reagiert, wurde verwendet, um eine Radiomarkierung mit UDP-[ 3 H]Galactose durchzuführen. Die β-Eliminierung von Serin- und Threoninresten zeigte, dass der größte Teil der [ 3 H]Galactose an Proteine ​​gebunden war Ö-glykosidische Chromatographie zeigte, dass das Hauptprodukt der β-Eliminierung Galβ1-4GlcNAcitol war. Unempfindlichkeit gegen Peptid n-Glykosidase-Behandlung lieferte zusätzliche Beweise für Ö-verknüpftes GlcNAc. Die Permeabilisierung der Zellen mit Detergens vor der radioaktiven Markierung erhöhte die Menge der in Galβ1-4GlcNAcitol eingebauten [ 3 H]Galactose stark, was die Autoren zu dem Schluss brachte, dass die meisten der Ö-gebundene GlcNAc-Monosaccharidreste waren intrazellulär. [11]

Ö-GlcNAc ist im Allgemeinen eine dynamische Modifikation, die an und von verschiedenen Proteinen zyklisiert werden kann. Es wird angenommen, dass einige Reste konstitutiv modifiziert werden durch Ö-GlcNAc. [12] [13] Die Ö-GlcNAc-Modifikation wird von OGT in einem sequentiellen bi-bi-Mechanismus installiert, bei dem der Donorzucker, UDP-GlcNAc, zuerst an OGT bindet, gefolgt von dem Substratprotein. [14] Die Ö-GlcNAc-Modifikation wird durch OGA in einem Hydrolysemechanismus entfernt, der anchimere Unterstützung (substratunterstützte Katalyse) beinhaltet, um das unmodifizierte Protein und GlcNAc zu ergeben. [15] Während sowohl für OGT [14] als auch für OGA über Kristallstrukturen berichtet wurde, [16] [17] sind die genauen Mechanismen, mit denen OGT und OGA Substrate erkennen, noch nicht vollständig aufgeklärt. nicht wie n-verknüpfte Glykosylierung, bei der die Glykosylierung in einer spezifischen Konsensussequenz auftritt (Asn-X-Ser/Thr, wobei X eine beliebige Aminosäure außer Pro ist), wurde keine definitive Konsensussequenz identifiziert für Ö-GlcNAc,. Folglich kann die Vorhersage von Standorten von Ö-GlcNAc-Modifikation ist eine Herausforderung, und die Identifizierung von Modifikationsstellen erfordert im Allgemeinen massenspektrometrische Methoden. Für OGT haben Studien gezeigt, dass die Substraterkennung durch eine Reihe von Faktoren reguliert wird, darunter Aspartat [18] und Asparagin [19] Leitermotive im Lumen der superhelikalen TPR-Domäne, Reste des aktiven Zentrums [20] und Adapterproteine. [21] Da Kristallstrukturen gezeigt haben, dass OGT sein Substrat in einer ausgedehnten Konformation benötigt, wurde vorgeschlagen, dass OGT flexible Substrate bevorzugt. [20] In in vitro Bei kinetischen Experimenten, bei denen die OGT- und OGA-Aktivität an einer Reihe von Proteinsubstraten gemessen wurde, wurde gezeigt, dass die kinetischen Parameter für OGT zwischen verschiedenen Proteinen variabel waren, während die kinetischen Parameter für OGA zwischen verschiedenen Proteinen relativ konstant waren. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass OGT der "senior Partner" bei der Regulierung ist Ö-GlcNAc und OGA erkennen Substrate hauptsächlich über die Anwesenheit von Ö-GlcNAc statt der Identität des modifizierten Proteins. [12]

Es gibt mehrere Methoden, um das Vorhandensein von Ö-GlcNAc und charakterisieren die spezifischen modifizierten Reste.

Lektine Bearbeiten

Weizenkeimagglutinin, ein Pflanzenlektin, ist in der Lage, terminale GlcNAc-Reste zu erkennen und wird daher häufig zum Nachweis von Ö-GlcNAc. Dieses Lektin wurde in der Lektin-Affinitätschromatographie zur Anreicherung und Detektion von Ö-GlcNAc. [22]

Antikörper Bearbeiten

Pfanne-Ö-GlcNAc-Antikörper, die das . erkennen Ö-GlcNAc-Modifikationen, weitgehend unabhängig von der Identität des modifizierten Proteins, werden häufig verwendet. Dazu gehören RL2, [23] ein IgG-Antikörper, der gegen Ö-GlcNAcylierte Kernporenkomplexproteine ​​und CTD110.6, [24] ein IgM-Antikörper, der gegen ein immunogenes Peptid mit einem einzelnen Serin gebildet wurde Ö-GlcNAc-Modifikation. Sonstiges Ö-GlcNAc-spezifische Antikörper wurden berichtet und haben eine gewisse Abhängigkeit von der Identität des modifizierten Proteins. [25]

Metabolische Kennzeichnung Bearbeiten

Viele metabolische chemische Reporter wurden entwickelt, um Ö-GlcNAc. Metabolische chemische Reporter sind im Allgemeinen Zuckeranaloga, die eine zusätzliche chemische Einheit tragen, die eine zusätzliche Reaktivität ermöglicht. Zum Beispiel peracetyliertes GlcNAc (Ac4GlcNAz) ist ein zelldurchlässiger Azidozucker, der intrazellulär durch Esterasen zu GlcNAz entestert und im Hexosamin-Salvage-Weg in UDP-GlcNAz umgewandelt wird. UDP-GlcNAz kann von OGT als Zuckerspender verwendet werden, um die Ö-GlcNAz-Modifikation. [26] Die Anwesenheit des Azidozuckers kann dann über alkinhaltige bioorthogonale chemische Sonden in einer Azid-Alkin-Cycloaddition sichtbar gemacht werden. Diese Sonden können leicht identifizierbare Markierungen wie das FLAG-Peptid, Biotin und Farbstoffmoleküle enthalten. [26] [27] Mass Tags auf Basis von Polyethylenglykol (PEG) wurden auch zur Messung von Ö-GlcNAc-Stöchiometrie. Konjugation von 5 kDa PEG-Molekülen führt zu einer Massenverschiebung für modifizierte Proteine ​​- stärker Ö-GlcNAcylierte Proteine ​​haben mehrere PEG-Moleküle und wandern daher bei der Gelelektrophorese langsamer. [28] Andere metabolische chemische Reporter mit Aziden oder Alkinen (im Allgemeinen an den Positionen 2 oder 6) wurden beschrieben. [29] Anstelle von GlcNAc-Analoga können auch GalNAc-Analoga verwendet werden, da UDP-GalNAc in Zellen aufgrund der Wirkung von UDP-Galactose-4'-Epimerase (GALE) im Gleichgewicht mit UDP-GlcNAc steht. Behandlung mit Ac4Es wurde festgestellt, dass GalNAz zu einer verbesserten Markierung von Ö-GlcNAc relativ zu Ac4GlcNAz, möglicherweise aufgrund eines Engpasses bei der UDP-GlcNAc-Pyrophosphorylase-Prozessierung von GlcNAz-1-P zu UDP-GlcNAz. [30] Ak3GlcN-β-Ala-NBD-α-1-P(Ac-SATE)2, einem metabolischen chemischen Reporter, der intrazellulär zu einem Fluorophor-markierten UDP-GlcNAc-Analogon prozessiert wird, erreicht nachweislich eine einstufige Fluoreszenzmarkierung von Ö-GlcNAc in lebenden Zellen. [31]

Metabolische Markierung kann auch verwendet werden, um Bindungspartner von . zu identifizieren Ö-GlcNAcylierte Proteine. Die n-Acetylgruppe kann verlängert werden, um eine Diazirineinheit einzubauen. Behandlung von Zellen mit peracetyliertem, phosphatgeschütztem Ac3GlcNDAz-1-P(Ac-SATE)2 führt zur Modifikation von Proteinen mit Ö-GlcNDaz. Die UV-Bestrahlung induziert dann eine Photovernetzung zwischen Proteinen, die die Ö-GlcNDaz-Modifikation und interagierende Proteine. [32]

Bei verschiedenen metabolischen chemischen Reportern wurden einige Probleme identifiziert, z Ö-GlcNAc-Cycling, [33] oder sie können neben anderen in Glycosylierungsmodifikationen eingebaut werden Ö-GlcNAc, wie in sekretierten Proteinen gesehen. [34] Metabolische chemische Reporter mit chemischen Griffen am n-Acetylposition kann auch acetylierte Proteine ​​markieren, da die Acetylgruppe zu Acetatanaloga hydrolysiert werden kann, die für die Proteinacetylierung verwendet werden können. [35]

Chemoenzymatische Markierung Bearbeiten

Chemoenzymatische Markierung bietet eine alternative Strategie, um Griffe für die Klickchemie zu integrieren. Das Click-IT Ö-GlcNAc Enzymatic Labeling System, das von der Hsieh-Wilson-Gruppe entwickelt und anschließend von Invitrogen kommerzialisiert wurde, verwendet ein mutiertes GalT Y289L-Enzym, das in der Lage ist, Azidogalactose (GalNAz) auf Ö-GlcNAc. [27] [36] Das Vorhandensein von GalNAz (und damit auch Ö-GlcNAc) kann mit verschiedenen alkinhaltigen Sonden mit identifizierbaren Tags wie Biotin, [36] Farbstoffmolekülen [27] und PEG nachgewiesen werden. [28]

Förster Resonanz-Energieübertragungs-Biosensor Bearbeiten

Es wurde ein technisch hergestellter Proteinbiosensor entwickelt, der Veränderungen in Ö-GlcNAc-Niveaus unter Verwendung des Förster-Resonanzenergietransfers. Dieser Sensor besteht aus vier Komponenten, die in der folgenden Reihenfolge miteinander verbunden sind: Cyan fluoreszierendes Protein (CFP), und Ö-GlcNAc-Bindungsdomäne (basierend auf GafD, einem Lektin, das für terminale β-Ö-GlcNAc), ein CKII-Peptid, das ein bekanntes OGT-Substrat ist, und gelb fluoreszierendes Protein (YFP). Auf Ö-GlcNAcylierung des CKII-Peptids, die GafD-Domäne bindet die Ö-GlcNAc-Einheit, die die CFP- und YFP-Domänen in enge Nachbarschaft bringt und ein FRET-Signal erzeugt. Die Erzeugung dieses Signals ist reversibel und kann zur Überwachung verwendet werden Ö-GlcNAc-Dynamik als Reaktion auf verschiedene Behandlungen. Dieser Sensor kann genetisch kodiert und in Zellen verwendet werden. [37] Das Hinzufügen einer Lokalisierungssequenz ermöglicht das Targeting dieser Ö-GlcNAc-Sensor zum Kern, Zytoplasma oder Plasmamembran. [38]

Massenspektrometrie Bearbeiten

Biochemische Ansätze wie Western Blotting können unterstützende Beweise dafür liefern, dass ein Protein durch Ö-GlcNAc-Massenspektrometrie (MS) ist in der Lage, definitive Beweise für das Vorhandensein von Ö-GlcNAc. Glykoproteomische Studien mit MS haben zur Identifizierung von Proteinen beigetragen, die durch Ö-GlcNAc.

Wie Ö-GlcNAc ist unterstöchiometrisch und die Ionensuppression tritt in Gegenwart von unmodifizierten Peptiden auf, ein Anreicherungsschritt wird normalerweise vor der massenspektrometrischen Analyse durchgeführt. Dies kann unter Verwendung von Lektinen, Antikörpern oder chemischer Markierung erreicht werden. Die Ö-GlcNAc-Modifikation ist unter kollisionsinduzierten Fragmentierungsmethoden wie der kollisionsinduzierten Dissoziation (CID) und der hochenergetischen Kollisionsdissoziation (HCD) labil, sodass diese Methoden isoliert nicht ohne weiteres anwendbar sind für Ö-GlcNAc-Site-Mapping. HCD erzeugt Fragmentionen, die für charakteristisch sind n-Acetylhexosamine, die zur Bestimmung verwendet werden können Ö-GlcNAcylierungsstatus. [39] Um die Standortkartierung mit HCD zu erleichtern, kann eine β-Eliminierung gefolgt von einer Michael-Addition mit Dithiothreitol (BEMAD) verwendet werden, um das labile Ö-GlcNAc-Modifikation in ein stabileres Massen-Tag. Für BEMAD-Mapping von Ö-GlcNAc muss die Probe mit Phosphatase behandelt werden, sonst können andere posttranslationale Serin/Threonin-Modifikationen wie Phosphorylierung nachgewiesen werden. [40] Die Elektronentransferdissoziation (ETD) wird für die Standortkartierung verwendet, da ETD die Spaltung des Peptidrückgrats verursacht, während posttranslationale Modifikationen wie Ö-GlcNAc intakt. [41]

Herkömmliche proteomische Studien führen eine Tandem-MS an den am häufigsten vorkommenden Spezies in den Full-Scan-Massenspektren durch, wodurch eine vollständige Charakterisierung von Spezies mit geringerer Häufigkeit verhindert wird. Eine moderne Strategie für gezielte Proteomik verwendet Isotopenmarker, z. B. Dibromid, um Ö-GlcNAcylierte Proteine. Dieses Verfahren ermöglicht den algorithmischen Nachweis von Spezies mit geringer Häufigkeit, die dann durch Tandem-MS sequenziert werden. [42] Gezielte Tandem-MS und gezielte Glycopeptidzuordnung ermöglichen die Identifizierung von Ö-GlcNAcylierte Peptidsequenzen. Eine Beispielsonde besteht aus einem Biotin-Affinitätsmarker, einem säurespaltbaren Silan, einem Isotopen-Umkodierungsmotiv und einem Alkin. [43] [44] [45] Ein eindeutiges Site-Mapping ist für Peptide mit nur einem Serin/Threonin-Rest möglich. [46]

Das allgemeine Verfahren für diese isotopen-targeted Glycoproteomics (IsoTaG)-Methode ist wie folgt:

  1. Metabolisch kennzeichnen Ö-GlcNAc zu installieren Ö-GlcNAz auf Proteine
  2. Verwenden Sie die Klickchemie, um die IsoTaG-Sonde mit . zu verknüpfen Ö-GlcNAz
  3. Verwenden Sie Streptavidin-Kügelchen, um markierte Proteine ​​anzureichern
  4. Behandeln Sie Perlen mit Trypsin, um nicht modifizierte Peptide freizusetzen
  5. Isotopisch umkodierte Glykopeptide von Kügelchen mit milder Säure abspalten
  6. Erhalten Sie ein Full-Scan-Massenspektrum von isotopen rekodierten Glykopeptiden
  7. Wenden Sie den Algorithmus an, um die einzigartige Isotopensignatur der Sonde zu erkennen
  8. Führen Sie eine Tandem-MS an den isotopencodierten Spezies durch, um Glycopeptid-Aminosäuresequenzen zu erhalten
  9. Proteindatenbank nach identifizierten Sequenzen durchsuchen

Für die quantitative Profilerstellung wurden andere Methoden entwickelt Ö-GlcNAc mit differentieller Isotopenmarkierung. [47] Beispielsonden bestehen im Allgemeinen aus einem Biotin-Affinitäts-Tag, einem spaltbaren Linker (durch Säure oder Photo spaltbar), einem schweren oder leichten Isotopen-Tag und einem Alkin. [48] ​​[49]

Zur Manipulation wurden verschiedene chemische und genetische Strategien entwickelt Ö-GlcNAc, sowohl auf proteomweiter Basis als auch auf spezifischen Proteinen.

Chemische Methoden Bearbeiten

Sowohl für OGT [50] [51] als auch für OGA [52] [53] wurden niedermolekulare Inhibitoren berichtet, die in Zellen wirken oder in vivo. OGT-Inhibitoren führen zu einer globalen Abnahme von Ö-GlcNAc, während OGA-Hemmer zu einem globalen Anstieg von . führen Ö-GlcNAc diese Inhibitoren können nicht modulieren Ö-GlcNAc auf spezifischen Proteinen.

Auch die Hemmung des Hexosamin-Biosyntheseweges kann abnehmen Ö-GlcNAc-Spiegel. Beispielsweise können die Glutaminanaloga Azaserin und 6-Diazo-5-oxo-L-norleucin (DON) GFAT hemmen, obwohl diese Moleküle auch andere Stoffwechselwege unspezifisch beeinflussen können. [54]

Proteinsynthese Bearbeiten

Exprimierte Proteinligation wurde zur Herstellung von Ö-GlcNAc-modifizierte Proteine ​​auf ortsspezifische Weise. Es gibt Verfahren für den Einbau von GlcNAc-modifiziertem Serin, Threonin oder Cystein in der Festphasen-Peptidsynthese. [55] [56]

Genetische Methoden Bearbeiten

Ortsgerichtete Mutagenese Bearbeiten

Ortsgerichtete Mutagenese von Ö-GlcNAc-modifizierte Serin- oder Threoninreste für Alanin können verwendet werden, um die Funktion von Ö-GlcNAc an spezifischen Resten. Da die Seitenkette von Alanin eine Methylgruppe ist und somit nicht als Ö-GlcNAc-Stelle entfernt diese Mutation effektiv dauerhaft Ö-GlcNAc an einem spezifischen Rest. Während die Serin/Threonin-Phosphorylierung durch Mutagenese zu Aspartat oder Glutamat modelliert werden kann, die negativ geladene Carboxylat-Seitenketten haben, rekapituliert keine der 20 kanonischen Aminosäuren ausreichend die Eigenschaften von Ö-GlcNAc. [57] Die Mutagenese zu Tryptophan wurde verwendet, um den sterischen Anspruch von . nachzuahmen Ö-GlcNAc, obwohl Tryptophan viel hydrophober ist als Ö-GlcNAc. [58] [59] Mutagenese kann auch andere posttranslationale Modifikationen stören, z. B. wenn ein Serin alternativ phosphoryliert oder Ö-GlcNAcylierte Alanin-Mutagenese eliminiert dauerhaft die Möglichkeiten sowohl der Phosphorylierung als auch Ö-GlcNAcylierung.

S-GlcNAc Bearbeiten

Massenspektrometrie identifiziert S-GlcNAc als posttranslationale Modifikation, die an Cysteinresten gefunden wird. In vitro Experimente zeigten, dass OGT die Bildung von . katalysieren kann S-GlcNAc und dass OGA nicht hydrolysieren kann S-GlcNAc. [60] Obwohl ein früherer Bericht darauf hinwies, dass OGA in der Lage ist, Thioglykoside zu hydrolysieren, wurde dies nur am Arylthioglykosid nachgewiesen para-Nitrophenol-S-GlcNAc para-Nitrothiophenol ist eine stärker aktivierte Abgangsgruppe als ein Cysteinrest. [61] Neuere Studien haben die Verwendung von S-GlcNAc als enzymatisch stabiles Strukturmodell von Ö-GlcNAc, das durch Festphasen-Peptidsynthese oder ortsgerichtete Mutagenese eingebaut werden kann. [62] [57] [55] [63]

Engineered OGT Bearbeiten

Fusionskonstrukte aus Nanobody und TPR-verkürztem OGT ermöglichen Proximity-induzierte proteinspezifische Ö-GlcNAcylierung in Zellen. Der Nanobody kann auf Protein-Tags gerichtet sein, z. B. GFP, die an das Zielprotein fusioniert sind, oder der Nanobody kann auf endogene Proteine ​​gerichtet sein. Zum Beispiel kann ein Nanobody, der eine C-terminale EPEA-Sequenz erkennt, die enzymatische Aktivität von OGT auf α-Synuclein lenken. [64]

Apoptose Bearbeiten

Es wird vermutet, dass Apoptose, eine Form des kontrollierten Zelltods, reguliert wird durch Ö-GlcNAc. Bei verschiedenen Krebsarten erhöht ÖEs wurde berichtet, dass -GlcNAc-Spiegel die Apoptose unterdrücken. [65] [66] Es wurde berichtet, dass Caspase-3, Caspase-8 und Caspase-9 modifiziert werden durch Ö-GlcNAc. Caspase-8 ist in der Nähe seiner Spaltungs-/Aktivierungsstellen modifiziert Ö-GlcNAc-Modifikation kann die Spaltung und Aktivierung von Caspase-8 durch sterische Hinderung blockieren. Pharmakologische Senkung von Ö-GlcNAc mit 5S-GlcNAc beschleunigte die Caspase-Aktivierung bei gleichzeitiger pharmakologischer Erhöhung von Ö-GlcNAc mit Thiamet-G inhibierte die Caspase-Aktivierung. [59]

Epigenetik Bearbeiten

Schriftsteller und Radierer Bearbeiten

Die Proteine, die die Genetik regulieren, werden oft als Writer, Reader und Radiergummi kategorisiert, d. h. Enzyme, die epigenetische Modifikationen installieren, Proteine, die diese Modifikationen erkennen, und Enzyme, die diese Modifikationen entfernen. [67] Bis heute Ö-GlcNAc wurde auf Writer- und Radiergummi-Enzymen identifiziert. Ö-GlcNAc wird an mehreren Stellen auf EZH2, der katalytischen Methyltransferase-Untereinheit von PRC2, gefunden und soll EZH2 vor der PRC2-Komplexbildung stabilisieren und die Di- und Trimethyltransferase-Aktivität regulieren. [68] [69] Von allen drei Mitgliedern der Ten-Eleven Translokation (TET)-Familie von Dioxygenasen (TET1, TET2 und TET3) ist bekannt, dass sie durch Ö-GlcNAc. [70] Ö-GlcNAc soll den Kernexport von TET3 verursachen, wodurch seine enzymatische Aktivität reduziert wird, indem es aus dem Kern entfernt wird. [71] Ö-GlcNAcylierung von HDAC1 ist mit einer erhöhten aktivierenden Phosphorylierung von HDAC1 verbunden. [72]

Histon Ö-GlcNAcylierung Bearbeiten

Histonproteine, die Hauptproteinkomponente von Chromatin, werden bekanntermaßen durch Ö-GlcNAc. [7] Ö-GlcNAc wurde auf allen Kernhistonen (H2A, [7] H2B, [7] H3, [73] und H4 [7] ) identifiziert. Das Vorhandensein von ÖEs wurde vermutet, dass -GlcNAc auf Histonen die Gentranskription sowie andere Histonmarkierungen wie Acetylierung [7] und Monoubiquitinierung beeinflusst. [74] Es wurde berichtet, dass TET2 mit der TPR-Domäne von OGT interagiert und die Rekrutierung von OGT an Histone erleichtert. [75] Diese Wechselwirkung ist mit H2B S112 Ö-GlcNAc, das wiederum mit der H2B-K120-Monoubiquitinierung verbunden ist. [74] Es wurde festgestellt, dass die Phosphorylierung von OGT T444 über AMPK die OGT-Chromatin-Assoziation hemmt und H2B S112 . herunterreguliert Ö-GlcNAc. [76]

Nährstoffsensor Bearbeiten

Das Produkt des Hexosamin-Biosynthesewegs, UDP-GlcNAc, wird von OGT verwendet, um die Addition von Ö-GlcNAc. Dieser Weg integriert Informationen über die Konzentrationen verschiedener Metaboliten, einschließlich Aminosäuren, Kohlenhydrate, Fettsäuren und Nukleotide. Folglich sind die UDP-GlcNAc-Spiegel empfindlich gegenüber den zellulären Metabolit-Spiegeln. Die OGT-Aktivität wird teilweise durch die UDP-GlcNAc-Konzentration reguliert, wodurch eine Verbindung zwischen dem zellulären Nährstoffstatus und Ö-GlcNAc. [77]

Glukosemangel verursacht eine Abnahme der UDP-GlcNAc-Spiegel und eine anfängliche Abnahme der Ö-GlcNAc, aber kontraintuitiv, Ö-GlcNAc wird später deutlich hochreguliert. Es wurde gezeigt, dass dieser spätere Anstieg von der AMPK- und p38-MAPK-Aktivierung abhängt, und dieser Effekt ist teilweise auf den Anstieg der OGT-mRNA- und Proteinspiegel zurückzuführen. [78] Es wurde auch vermutet, dass dieser Effekt von Calcium und CaMKII abhängt. [79] Aktiviertes p38 ist in der Lage, OGT für spezifische Proteinziele zu rekrutieren, einschließlich Neurofilament H Ö-GlcNAc-Modifikation von Neurofilament H erhöht seine Löslichkeit. [78] Während des Glukoseentzugs wird die Glykogensynthase durch Ö-GlcNAc, das seine Aktivität hemmt. [80]

Oxidativer Stress Bearbeiten

Es wurde festgestellt, dass NRF2, ein Transkriptionsfaktor, der mit der zellulären Reaktion auf oxidativen Stress verbunden ist, indirekt reguliert wird durch Ö-GlcNAc. KEAP1, ein Adapterprotein für den Cullin 3-abhängigen E3-Ubiquitin-Ligase-Komplex, vermittelt den Abbau von NRF2. oxidativer Stress führt zu Konformationsänderungen in KEAP1, die den Abbau von NRF2 unterdrücken. Ö-GlcNAc-Modifikation von KEAP1 an S104 ist für eine effiziente Ubiquitinierung und den anschließenden Abbau von NRF2 erforderlich, Verknüpfung Ö-GlcNAc gegen oxidativen Stress. Glukosemangel führt zu einer Verringerung der Ö-GlcNAc und reduziert den Abbau von NRF2. Zellen, die eine KEAP1-S104A-Mutante exprimieren, sind resistent gegen Erastin-induzierte Ferroptose, was mit höheren NRF2-Spiegeln nach Entfernung von S104 . übereinstimmt Ö-GlcNAc. [81]

Erhöht Ö-GlcNAc-Spiegel wurden mit einer verminderten Synthese von hepatischem Glutathion in Verbindung gebracht, einem wichtigen zellulären Antioxidans. Eine Überdosierung von Acetaminophen führt zur Akkumulation des stark oxidierenden Metaboliten NAPQI in der Leber, der durch Glutathion entgiftet wird. Bei Mäusen hat OGT-Knockout eine schützende Wirkung gegen Paracetamol-induzierte Leberschäden, während OGA-Hemmung mit Thiamet-G Paracetamol-induzierte Leberschäden verschlimmert. [82]

Proteinaggregation Bearbeiten

ÖEs wurde festgestellt, dass -GlcNAc die Proteinaggregation verlangsamt, obwohl die Allgemeingültigkeit dieses Phänomens unbekannt ist.

Die Festphasen-Peptidsynthese wurde verwendet, um α-Synuclein in voller Länge mit einem herzustellen Ö-GlcNAc-Modifikation bei T72. Thioflavin-T-Aggregationsassays und Transmissionselektronenmikroskopie zeigten, dass dieses modifizierte α-Synuclein nicht leicht Aggregate bildet. [56]

Es wurde gezeigt, dass die Behandlung von JNPL3-Tau-transgenen Mäusen mit einem OGA-Inhibitor das Mikrotubuli-assoziierte Protein tau . erhöht Ö-GlcNAcylierung. Die immunhistochemische Analyse des Hirnstamms zeigte eine verminderte Bildung von neurofibrillären Knäueln. Rekombinant Ö-GlcNAcyliertes Tau aggregiert langsamer als unmodifiziertes Tau in an in vitro Thioflavin-S-Aggregationsassay. Ähnliche Ergebnisse wurden für ein rekombinant hergestelltes Ö-GlcNAcyliertes TAB1-Konstrukt gegenüber seiner unmodifizierten Form. [83]

Proteinphosphorylierung Bearbeiten

Übersprechen Bearbeiten

Viele bekannte Phosphorylierungsstellen und Ö-GlcNAcylierungsstellen liegen nahe beieinander oder überlappen sich. [46] Als Protein Ö-GlcNAcylierung und Phosphorylierung treten beide an Serin- und Threoninresten auf, diese posttranslationalen Modifikationen können sich gegenseitig regulieren. Zum Beispiel in CKIIα, S347 Ö-GlcNAc antagonisiert die T344-Phosphorylierung. [55] Reziproke Hemmung, d. h. Phosphorylierungshemmung von Ö-GlcNAcylierung und Ö-GlcNAcylierung der Phosphorylierung, wurde bei anderen Proteinen beobachtet, einschließlich Maus-Östrogenrezeptor β, [84] RNA Pol II, [85] Tau, [86] p53, [87] CaMKIV, [88] p65, [89] β-Catenin , [90] und α-Synuclein. [56] Auch zwischen diesen beiden posttranslationalen Modifikationen wurde eine positive Kooperativität beobachtet, d. h. die Phosphorylierung induziert Ö-GlcNAcylierung oder Ö-GlcNAcylierung induziert Phosphorylierung. Dies wurde an MeCP2 [28] und HDAC1 gezeigt. [72] In anderen Proteinen, z. B. Cofilin, Phosphorylierung und Ö-GlcNAcylierung scheint unabhängig voneinander zu erfolgen. [91]

In einigen Fällen werden therapeutische Strategien untersucht, um zu modulieren Ö-GlcNAcylierung, um einen nachgeschalteten Effekt auf die Phosphorylierung zu haben. Zum Beispiel das Erhöhen von tau Ö-GlcNAcylierung kann einen therapeutischen Nutzen bieten, indem sie die pathologische Tau-Hyperphosphorylierung hemmt. [92]

Neben der Phosphorylierung Ö-GlcNAc beeinflusst andere posttranslationale Modifikationen wie Lysinacetylierung [89] und Monoubiquitinierung. [74]

Kinasen Bearbeiten

Proteinkinasen sind die Enzyme, die für die Phosphorylierung von Serin- und Threoninresten verantwortlich sind. Ö-GlcNAc wurde auf über 100 (

20% des menschlichen Kinos) Kinasen, und diese Modifikation ist oft mit Veränderungen der Kinaseaktivität oder des Kinasesubstratumfangs verbunden. [93]

Der erste Bericht über eine Kinase, die direkt reguliert wird durch Ö-GlcNAc wurde 2009 veröffentlicht. CaMKIV ist an mehreren Stellen glykosyliert, wobei S189 als Hauptstelle gefunden wurde. Eine S189A-Mutante wurde leichter durch CaMKIV T200-Phosphorylierung aktiviert, was darauf hindeutet, dass Ö-GlcNAc bei S189 hemmt die CaMKIV-Aktivität. Homologiemodellierung zeigte, dass S189 Ö-GlcNAc kann die ATP-Bindung stören. [88]

AMPK und OGT sind dafür bekannt, sich gegenseitig zu modifizieren, d. h. AMPK phosphoryliert OGT und OGT Ö-GlcNAcylate AMPK. Die AMPK-Aktivierung durch AICA-Ribonukleotid ist mit der Kernlokalisation von OGT in differenzierten C2C12-Muskelmuskel-Myotuben verbunden, was zu einer erhöhten nukleären Ö-GlcNAc. Dieser Effekt wurde bei proliferierenden Zellen und undifferenzierten myoblastischen Zellen nicht beobachtet. [94] Es wurde festgestellt, dass die AMPK-Phosphorylierung von OGT T444 die OGT-Assoziation mit Chromatin blockiert und H2B S112 . verringert Ö-GlcNAc. [76] Es wurde festgestellt, dass die Überexpression von GFAT, dem Enzym, das den Glukosefluss in den Hexosamin-Biosyntheseweg steuert, im Fettgewebe der Maus zu einer AMPK-Aktivierung und einer nachgeschalteten ACC-Hemmung und einer erhöhten Fettsäureoxidation führt. Eine Glucosamin-Behandlung in kultivierten 3T3L1-Adipozyten zeigte einen ähnlichen Effekt. [95] Die genaue Beziehung zwischen Ö-GlcNAc und AMPK sind nicht vollständig aufgeklärt, da verschiedene Studien berichtet haben, dass die OGA-Hemmung die AMPK-Aktivierung hemmt, [94] die OGT-Hemmung auch die AMPK-Aktivierung hemmt, [76] hochregulierend Ö-GlcNAc durch Glucosamin-Behandlung aktiviert AMPK, [95] und OGT-Knockdown aktiviert AMPK [96] Diese Ergebnisse legen nahe, dass eine zusätzliche indirekte Kommunikation zwischen AMPK-Signalwegen und Ö-GlcNAc oder zelltypspezifische Effekte.

Es wurde gezeigt, dass die CKIIα-Substraterkennung durch S347 . verändert wird Ö-GlcNAcylierung. [55]

Phosphatasen Bearbeiten

Es wurde gezeigt, dass die Proteinphosphatase-1-Untereinheiten PP1β und PP1γ funktionelle Komplexe mit OGT bilden. Ein synthetisches Phosphopeptid konnte dephosphoryliert werden und Ö-GlcNAcyliert durch ein OGT-Immunpräzipitat. Dieser Komplex wurde als "Yin-Yang-Komplex" bezeichnet, da er eine Phosphatmodifikation durch ein ersetzt Ö-GlcNAc-Modifikation. [97]

MYPT1 ist eine weitere Proteinphosphatase-Untereinheit, die mit OGT Komplexe bildet und selbst Ö-GlcNAcyliert. MYPT1 scheint eine Rolle dabei zu spielen, OGT auf bestimmte Substrate zu lenken. [98]

Protein-Protein-Wechselwirkungen Bearbeiten

Ö-GlcNAcylierung eines Proteins kann sein Interaktom verändern. Wie Ö-GlcNAc ist stark hydrophil, seine Anwesenheit kann hydrophobe Protein-Protein-Wechselwirkungen stören. Zum Beispiel, Ö-GlcNAc stört die Sp1-Interaktion mit TAFII110, [99] und Ö-GlcNAc stört die CREB-Interaktion mit TAFII130 und CRTC. [100] [101]

Einige Studien haben auch Fälle identifiziert, in denen Protein-Protein-Wechselwirkungen durch . induziert werden Ö-GlcNAc. Metabolische Markierung mit dem Diazirin-haltigen Ö-GlcNDAz wurde angewendet, um Protein-Protein-Wechselwirkungen zu identifizieren, die durch Ö-GlcNAc. [32] Unter Verwendung eines Köder-Glycopeptids, das grob auf einer Konsensussequenz für Ö-GlcNAc, α-Enolase, EBP1 und 14-3-3 wurden als potenzielle identifiziert Ö-GlcNAc-Leser. Röntgenkristallographie zeigte, dass 14-3-3 erkannte Ö-GlcNAc durch eine amphipathische Furche, die auch phosphorylierte Liganden bindet. [102] Es wurde auch vorgeschlagen, dass Hsp70 als Lektin zur Erkennung von Ö-GlcNAc. [103] Es wurde vorgeschlagen, dass Ö-GlcNAc spielt eine Rolle bei der Interaktion von α-Catenin und β-Catenin. [90]

Proteinstabilität und -abbau Bearbeiten

Co-Übersetzung Ö-GlcNAc wurde auf Sp1 und Nup62 identifiziert. Diese Modifikation unterdrückt die cotranslationale Ubiquitinierung und schützt somit naszierende Polypeptide vor dem proteasomalen Abbau. Ähnliche Schutzwirkungen von Ö-GlcNAc auf Sp1 voller Länge wurden beobachtet. Es ist nicht bekannt, ob dieses Muster universell ist oder nur auf bestimmte Proteine ​​anwendbar ist. [13]

Proteinphosphorylierung wird oft als Markierung für den anschließenden Abbau verwendet. Das Tumorsuppressorprotein p53 ist für den proteasomalen Abbau über die COP9-Signalosomen-vermittelte Phosphorylierung von T155 bestimmt. Ö-GlcNAcylierung von p53 S149 wurde mit einer verringerten T155-Phosphorylierung und einem Schutz von p53 vor Abbau in Verbindung gebracht. [87] β-Catenin Ö-GlcNAcylierung konkurriert mit der T41-Phosphorylierung, die β-Catenin für den Abbau signalisiert und das Protein stabilisiert. [90]

Ö-GlcNAcylierung der Rpt2-ATPase-Untereinheit des 26S-Proteasoms hemmt die Proteasom-Aktivität. Das Testen verschiedener Peptidsequenzen ergab, dass diese Modifikation den proteasomalen Abbau von hydrophoben Peptiden verlangsamt, der Abbau von hydrophilen Peptiden scheint nicht beeinflusst zu werden. [104] Es wurde gezeigt, dass diese Modifikation andere Stoffwechselwege unterdrückt, die das Proteasom aktivieren, wie die Rpt6-Phosphorylierung durch cAMP-abhängige Proteinkinase. [105]

OGA-S lokalisiert an Lipidtröpfchen und es wurde vorgeschlagen, das Proteasom lokal zu aktivieren, um die Remodellierung von Lipidtröpfchen-Oberflächenproteinen zu fördern. [106]

Stressreaktion Bearbeiten

Verschiedene zelluläre Stressreize wurden mit Veränderungen der Ö-GlcNAc. Die Behandlung mit Wasserstoffperoxid, Kobalt(II)-chlorid, UVB-Licht, Ethanol, Natriumchlorid, Hitzeschock und Natriumarsenit führt zu erhöhten Ö-GlcNAc. Knockout von OGT sensibilisiert Zellen für thermischen Stress. Erhöht Ö-GlcNAc wurde mit der Expression von Hsp40 und Hsp70 in Verbindung gebracht. [107]

Alzheimer-Krankheit Bearbeiten

Zahlreiche Studien haben eine abweichende Phosphorylierung von Tau als Kennzeichen der Alzheimer-Krankheit identifiziert. [108] Ö-GlcNAcylierung von Rinder-Tau wurde erstmals 1996 charakterisiert. [109] Ein nachfolgender Bericht aus dem Jahr 2004 zeigte, dass menschliches Gehirn-Tau auch durch . verändert wird Ö-GlcNAc. ÖEs wurde gezeigt, dass -GlcNAcylierung von Tau die Tau-Phosphorylierung reguliert, wobei die Hyperphosphorylierung von Tau im Gehirn von Mäusen ohne OGT beobachtet wurde, [110] die mit der Bildung von neurofibrillären Knäueln in Verbindung gebracht wurde. Die Analyse von Gehirnproben zeigte, dass Protein Ö-GlcNAcylierung ist bei der Alzheimer-Krankheit beeinträchtigt und das gepaarte helikale Fragment-Tau wurde von traditionellen . nicht erkannt Ö-GlcNAc-Nachweisverfahren, die darauf hindeuten, dass pathologisches Tau beeinträchtigt ist Ö-GlcNAcylierung relativ zu Tau, isoliert aus Kontrollhirnproben. Erhebendes Tau Ö-GlcNAcylierung wurde als therapeutische Strategie zur Verringerung der Tau-Phosphorylierung vorgeschlagen. [86]

Um diese therapeutische Hypothese zu testen, wurde ein selektiver und für die Blut-Hirn-Schranke durchlässiger OGA-Inhibitor, Thiamet-G, entwickelt. Thiamet-G-Behandlung konnte tau erhöhen Ö-GlcNAcylierung und unterdrücken der Tau-Phosphorylierung in Zellkulturen und in vivo bei gesunden Sprague-Dawley-Ratten. [53] Eine nachfolgende Studie zeigte, dass die Behandlung mit Thiamet-G auch die Tau Ö-GlcNAcylierung in einem JNPL3-Tau-transgenen Mausmodell. In diesem Modell wurde die Tau-Phosphorylierung durch die Thiamet-G-Behandlung nicht signifikant beeinflusst, obwohl eine verringerte Anzahl von neurofibrillären Tangles und ein langsamerer Verlust von Motoneuronen beobachtet wurden. Zusätzlich, ÖEs wurde festgestellt, dass die GlcNAcylierung von Tau die Tau-Aggregation verlangsamt in vitro. [83]

Die OGA-Hemmung mit MK-8719 wird in klinischen Studien als potenzielle Behandlungsstrategie für die Alzheimer-Krankheit und andere Tauopathien einschließlich progressiver supranukleärer Lähmung untersucht. [92] [111] [112]

Krebs Bearbeiten

Dysregulation von Ö-GlcNAc ist mit der Proliferation von Krebszellen und dem Tumorwachstum verbunden.

Ö-GlcNAcylierung des glykolytischen Enzyms PFK1 an S529 hemmt die enzymatische Aktivität von PFK1, reduziert den glykolytischen Fluss und leitet Glukose zum Pentosephosphatweg um. Strukturmodellierung und biochemische Experimente legten nahe, dass Ö-GlcNAc an S529 würde die allosterische Aktivierung von PFK1 durch Fructose-2,6-bisphosphat und die Oligomerisierung in aktive Formen hemmen. In einem Mausmodell zeigten Mäuse, denen Zellen, die PFK1 S529A-Mutante exprimieren, injiziert wurden, ein geringeres Tumorwachstum als Mäuse, denen Zellen injiziert wurden, die PFK1-Wildtyp exprimieren. Außerdem verstärkte die OGT-Überexpression das Tumorwachstum im letzteren System, hatte jedoch keine signifikante Wirkung auf das System mit mutiertem PFK1. Hypoxie induziert PFK1 S529 Ö-GlcNAc und erhöht den Fluss durch den Pentosephosphatweg, um mehr NADPH zu erzeugen, das den Glutathionspiegel aufrechterhält und reaktive Sauerstoffspezies entgiftet, was Krebszellen einen Wachstumsvorteil verleiht. Es wurde festgestellt, dass PFK1 in menschlichen Brust- und Lungentumorgeweben glykosyliert ist. [113] Es wurde auch berichtet, dass OGT HIF-1α positiv reguliert. HIF-1α wird normalerweise unter normoxischen Bedingungen durch Prolylhydroxylasen abgebaut, die α-Ketoglutarat als Co-Substrat verwenden. OGT unterdrückt den α-Ketoglutarat-Spiegel, schützt HIF-1α vor dem proteasomalen Abbau durch pVHL und fördert die aerobe Glykolyse. Im Gegensatz zu der vorherigen Studie zu PFK1 ergab diese Studie, dass eine Erhöhung der OGT oder Ö-GlcNAc hochreguliert PFK1, obwohl die beiden Studien übereinstimmend feststellen, dass Ö-GlcNAc-Spiegel sind positiv mit dem Fluss durch den Pentosephosphatweg verbunden. Diese Studie ergab auch, dass abnehmende Ö-GlcNAc tötete selektiv Krebszellen durch ER-Stress-induzierte Apoptose. [65]

Humane duktale Adenokarzinom-(PDAC)-Zelllinien des Pankreas haben höhere Ö-GlcNAc-Spiegel als humane Epithelzellen des Pankreasgangs (HPDE). PDAC-Zellen haben eine gewisse Abhängigkeit von Ö-GlcNAc für das Überleben, da OGT-Knockdown selektiv die PDAC-Zellproliferation hemmte (OGT-Knockdown hatte keinen signifikanten Einfluss auf die HPDE-Zellproliferation) und Hemmung von OGT mit 5S-GlcNAc zeigte das gleiche Ergebnis. Hyper-Ö-GlcNAcylierung in PDAC-Zellen schien anti-apoptotisch zu sein, indem sie die Spaltung und Aktivierung von Caspase-3 und Caspase-9 hemmte. Es wurde festgestellt, dass zahlreiche Stellen auf der p65-Untereinheit von NF-κB durch . modifiziert sind Ö-GlcNAc auf dynamische Weise Ö-GlcNAc an p65 T305 und S319 wiederum regulieren positiv andere Modifikationen, die mit der NF-κB-Aktivierung verbunden sind, wie z. B. p300-vermittelte K310-Acetylierung und IKK-vermittelte S536-Phosphorylierung. Diese Ergebnisse legen nahe, dass NF-κB konstitutiv durch . aktiviert wird Ö-GlcNAc bei Bauchspeicheldrüsenkrebs. [66] [89]

Es wurde festgestellt, dass die OGT-Stabilisierung von EZH2 in verschiedenen Brustkrebszelllinien die Expression von Tumorsuppressorgenen hemmt. [68] In hepatozellulären Karzinommodellen Ö-GlcNAc ist mit der Aktivierung der Phosphorylierung von HDAC1 verbunden, die wiederum die Expression des Zellzyklusregulators p21 Waf1/Cip1 und des Zellmotilitätsregulators E-Cadherin reguliert. [72]

Es wurde festgestellt, dass OGT SREBP-1 stabilisiert und die Lipogenese in Brustkrebszelllinien aktiviert. Diese Stabilisierung war vom Proteasom und AMPK abhängig. Der OGT-Knockdown führte zu einem verringerten nuklearen SREBP-1, aber die proteasomale Hemmung mit MG132 blockierte diesen Effekt. Der OGT-Knockdown erhöhte auch die Interaktion zwischen SREBP-1 und der E3-Ubiquitin-Ligase FBW7. AMPK wird durch T172-Phosphorylierung beim OGT-Knockdown aktiviert, und AMPK phosphoryliert SREBP-1 S372, um dessen Spaltung und Reifung zu hemmen. Der OGT-Knockdown hatte eine verminderte Wirkung auf die SREBP-1-Spiegel in AMPK-Null-Zelllinien. In einem Mausmodell hemmte der OGT-Knockdown das Tumorwachstum, aber die Überexpression von SREBP-1 rettete diesen Effekt teilweise. [96] Diese Ergebnisse stehen im Gegensatz zu denen einer früheren Studie, in der festgestellt wurde, dass OGT Knockdown/Hemmung die Phosphorylierung von AMPK T172 hemmt und die Lipogenese erhöht. [76]

In Brust- und Prostatakrebszelllinien sind hohe OGT- und Ö-GlcNAc wurden mit beiden assoziiert in vitro und in vivo mit Prozessen, die mit der Krankheitsprogression verbunden sind, z. B. Angiogenese, Invasion und Metastasierung. Es wurde festgestellt, dass OGT-Knockdown oder -Hemmung den Transkriptionsfaktor FoxM1 herunterreguliert und den Zellzyklus-Inhibitor p27 Kip1 (der durch FoxM1-abhängige Expression der E3-Ubiquitin-Ligase-Komponente Skp2 reguliert wird) hochreguliert, was einen G1-Zellzyklusarrest verursacht. Dies schien vom proteasomalen Abbau von FoxM1 abhängig zu sein, da die Expression einer FoxM1-Mutante ohne Degron die Auswirkungen des OGT-Knockdowns rettete. Es wurde festgestellt, dass FoxM1 nicht direkt modifiziert wurde von Ö-GlcNAc, was darauf hindeutet, dass Hyper-Ö-GlcNAcylierung von FoxM1-Regulatoren beeinträchtigt den FoxM1-Abbau. Das Targeting von OGT senkte auch die Spiegel von FoxM1-regulierten Proteinen, die mit der Krebsinvasion und -metastasierung (MMP-2 und MMP-9) und der Angiogenese (VEGF) verbunden sind. [114] [115] Ö-GlcNAc-Modifikation von Cofilin S108 wurde auch als wichtig für die Invasion von Brustkrebszellen beschrieben, indem sie die subzelluläre Lokalisation von Cofilin in Invadopodien reguliert. [91]

Diabetes Bearbeiten

Erhöht Ö-GlcNAc wurde mit Diabetes in Verbindung gebracht.

Pankreas-β-Zellen synthetisieren und sezernieren Insulin, um den Blutzuckerspiegel zu regulieren. Eine Studie ergab, dass die Hemmung von OGA mit Streptozotocin gefolgt von einer Glucosamin-Behandlung zu Ö-GlcNAc-Akkumulation und Apoptose in β-Zellen [116] Eine nachfolgende Studie zeigte, dass ein Galactose-basiertes Analogon von Streptozotocin OGA nicht hemmen konnte, aber dennoch zu Apoptose führte, was darauf hindeutet, dass die apoptotischen Wirkungen von Streptozotocin nicht direkt auf die OGA-Hemmung zurückzuführen sind. [117]

Ö-GlcNAc soll die Insulinsignalisierung abschwächen. In 3T3-L1-Adipozyten hemmte die OGA-Hemmung mit PUGNAc die insulinvermittelte Glukoseaufnahme. Die PUGNAc-Behandlung hemmte auch die insulinstimulierte Akt T308-Phosphorylierung und die nachgeschaltete GSK3β-S9-Phosphorylierung. [118] In einer späteren Studie bewirkte die Insulinstimulation von COS-7-Zellen, dass sich OGT an der Plasmamembran ansiedelte. Die Hemmung von PI3K mit Wortmannin kehrte diesen Effekt um, was auf eine Abhängigkeit von Phosphatidylinositol(3,4,5)-triphosphat hindeutet. Zunehmend Ö-GlcNAc-Spiegel, indem die Zellen hohen Glukosebedingungen oder einer PUGNAc-Behandlung ausgesetzt wurden, hemmten die insulinstimulierte Phosphorylierung von Akt T308 und die Akt-Aktivität. Die IRS1-Phosphorylierung an S307 und S632/S635, die mit einer abgeschwächten Insulinsignalisierung verbunden ist, wurde verstärkt. Nachfolgende Experimente an Mäusen mit adenoviraler Abgabe von OGT zeigten, dass die OGT-Überexpression die Insulinsignalisierung negativ regulierte in vivo. Es wurde festgestellt, dass viele Komponenten des Insulin-Signalwegs, einschließlich β-Catenin, [118] IR-β, IRS1, Akt, PDK1 und die p110α-Untereinheit von PI3K direkt durch Ö-GlcNAc. [119] Es wurde auch berichtet, dass Insulinsignalisierung zu OGT-Tyrosinphosphorylierung und OGT-Aktivierung führt, was zu einer erhöhten Ö-GlcNAc-Spiegel. [120]

Da PUGNAc auch lysosomale β-Hexosaminidase hemmt, wurde der OGA-selektive Inhibitor NButGT entwickelt, um die Beziehung zwischen Ö-GlcNAc und Insulinsignalisierung in 3T3-L1-Adipozyten. Diese Studie ergab auch, dass PUGNAc zu einer beeinträchtigten Insulinsignalisierung führte, NButGT jedoch nicht, wie anhand von Veränderungen der Phosphorylierung von Akt T308 gemessen wurde, was darauf hindeutet, dass die mit PUGNAc beobachteten Wirkungen neben der OGA-Hemmung auf Off-Target-Effekte zurückzuführen sein könnten. [121]

Parkinson-Krankheit Bearbeiten

Die Parkinson-Krankheit ist mit einer Aggregation von α-Synuclein verbunden. [122] Wie Ö-GlcNAc-Modifikation von α-Synuclein hemmt seine Aggregation und erhöht α-Synuclein Ö-GlcNAc wird als therapeutische Strategie zur Behandlung der Parkinson-Krankheit untersucht. [56] [123]

Infektionskrankheit Bearbeiten

Bakterien Bearbeiten

Die Behandlung von Makrophagen mit Lipopolysaccharid (LPS), einem Hauptbestandteil der äußeren Membran gramnegativer Bakterien, führt zu erhöhten Ö-GlcNAc in Zell- und Mausmodellen. Während der Infektion wurde zytosolischer OGT de-S-nitrosyliert und aktiviert. Unterdrücken Ö-GlcNAc mit DON hemmte die Ö-GlcNAcylierung und nukleäre Translokation von NF-κB sowie nachgeschaltete Induktion der induzierbaren Stickoxid-Synthase und IL-1β-Produktion. Die DON-Behandlung verbesserte auch das Zellüberleben während der LPS-Behandlung. [124]

Virales Bearbeiten

Ö-GlcNAc wurde mit dem durch das Influenza-A-Virus (IAV) induzierten Zytokinsturm in Verbindung gebracht. Speziell, Ö-GlcNAcylierung von S430 am Interferon-Regulationsfaktor-5 (IRF5) fördert seine Interaktion mit dem TNF-Rezeptor-assoziierten Faktor 6 (TRAF6) in Zell- und Mausmodellen. TRAF6 vermittelt die K63-gebundene Ubiquitinierung von IRF5, die für die IRF5-Aktivität und die anschließende Zytokinproduktion notwendig ist. Die Analyse klinischer Proben zeigte, dass der Blutzuckerspiegel bei IAV-infizierten Patienten im Vergleich zu gesunden Personen erhöht war. Bei IAV-infizierten Patienten korrelierten die Blutzuckerspiegel positiv mit den IL-6- und IL-8-Spiegeln. Ö-GlcNAcylierung von IRF5 war auch in mononuklearen Zellen des peripheren Bluts von IAV-infizierten Patienten relativ höher. [125]

Andere Anwendungen Bearbeiten

Peptidtherapeutika wie diese sind wegen ihrer hohen Spezifität und Wirksamkeit attraktiv, aber sie haben aufgrund ihres Abbaus durch Serumproteasen oft schlechte pharmakokinetische Profile. [126] Obwohl Ö-GlcNAc ist im Allgemeinen mit intrazellulären Proteinen assoziiert, es wurde festgestellt, dass modifizierte Peptidtherapeutika, die durch Ö-GlcNAc weisen eine verbesserte Serumstabilität in einem Mausmodell auf und haben eine ähnliche Struktur und Aktivität im Vergleich zu den entsprechenden unmodifizierten Peptiden. Dieses Verfahren wurde angewendet, um GLP-1- und PTH-Peptide zu konstruieren. [127]


CRISPR/Cas9-vermittelte Genombearbeitung bei ausgewählten Geflügelarten

Viele Forscher untersuchen den möglichen Einsatz von CRISPR/Cas9 für die Genom-Editierung bei Vogelarten. Beim Einsatz der CRISPR/Cas9-Technologie bei Hühnern und Wachteln wurden erhebliche Fortschritte erzielt, wobei Hühner die Führung in der Geflügelindustrie übernehmen. Véron et al. (2015) veröffentlichten vor 5 Jahren die ersten CRISPR/Cas9-vermittelten Hühner. Diese Studie koppelte die Verwendung von elektroporierten Hühnerembryonen mit Cas9- und Leit-RNAs-kodierten Plasmiden gegen die Transkriptionsfaktor-gepaarte Box 7 (PAX7). In einer anderen kürzlich durchgeführten Studie wurde das CRISPR/Cas9-System verwendet, um Hühner unter Verwendung von Ovalbumin- und Ovomucoid (OVM)-Genen zu produzieren. In dieser Studie wurden Puromycin-selektierte CRISPR-induzierte mutierte Ovomukoid-PGCs vorübergehend in Empfänger-Hühnerembryonen mit Gammastrahlen-Bestrahlung transplantiert (Oishi et al., 2016). Ihre Ergebnisse zeigten, dass das CRISPR/Cas9-System verwendet wurde, um eine OVM-Mutation zu induzieren, die eine hohe Effizienz (93%) in den meisten Spender-PGCs mit einer durchschnittlichen mutierten Sameneffizienz von 93% erreichte. Eine weitere Studie an Hühnchen von Dimitrov et al. (2016) zeigt eine erfolgreiche Keimbahn-Gen-Editierung durch effiziente CRISPR-vermittelte homologe Rekombination in primordialen Keimzellen. In dieser Studie wird ein zusätzlicher loxP Die Stelle wurde in das Segment der variablen Region von a . eingefügt loxP durch Homologie-gerichtete Reparatur (HDR). Dieses Segment war zuvor in das Gen für die schwere Kette des Hühner-Immunglobulins (IgH) eingefügt worden. Ihre Ergebnisse zeigten variable Keimbahnübertragungsraten (0�% Effizienz) für die verschiedenen verwendeten PGC-Linien.

Als Studien zeigen PGC-Linien unterschiedliche Keimbahnkompetenzen für genetische Modifikation und Gen-Editierung mit der CRISPR/Cas9-Technologie (Naito et al., 2015). In jüngerer Zeit haben Cooper et al. (2017) berichteten auch über eine sehr erfolgreiche Methode zur Genom-Editierung von Vögeln, die als “sperm Transfection-assisted Gene Editing bekannt ist. Diese Methode konnte eine Targeting-Effizienz von 26,6% und etwa 3% Mutation im grün fluoreszierenden Protein (GFP) bzw. im doppelgeschlechtlichen und mab-3-verwandten Transkriptionsfaktor 1 (DMRT1)-Gen erreichen. Morinet al. (2017) haben kürzlich eine Technik beschrieben, die das CRISPR/Cas9-System mit in vivo Elektroporation, wodurch die Genfunktionen von Zielgenen in den somatischen Zellen von sich entwickelnden Hühnerembryonen gehemmt werden.

Abu Bonsrah et al. (2016) arbeiteten an Projekten, die auf Gene in den Zelllinien DF-1 und DT-40 abzielten. Die gezielten Gene sind für die Embryonalprogression für die gezielte genetische Manipulation des Hühnergenoms mit dem CRISPR/Cas9-System von großer Bedeutung. Zu diesen Genen gehörten unter anderem EZH2, CDKN1B, DROSHA, MBD3, KIAA1279, HIRA, TYRP1. Viele Methoden für CRISPR/Cas9-vermittelte Genmodifikationen bei Vogelarten basieren auf der Genommodifikation von PGCs in vitro gefolgt von einer in-ovo-Injektion von modifizierten PGCs in die embryonalen Blutgefäße. Es besteht jedoch die Möglichkeit, adenovirale Vektoren zur Abgabe von CRISPR/Cas9 in das Vogelblastoderm in Eiern zu verwenden, was zu Chimären führt, die Nachkommen mit gezielten Mutationen erzeugen (Lee et al., 2019c). Diese Technik zur Generierung von genomeditiertem Geflügel könnte viele Vogelforschungsstudien mit potenziellen Anwendungen in der Geflügelproduktion beschleunigen. Die Verwendung von geflügelspezifischen CRISPR/Cas9-entwickelten Vektoren, die inserierte vogelspezifische Promotoren für die Expression von Leit-RNA und Cas9-Protein enthalten, kann effizient gezielte Genmodifikationen in Geflügelarten einführen (Ahn et al., 2017). Diese Art von CRISPR-Vektor kann bei vielen Geflügelarten angewendet werden, um effiziente Knockout-Vogelzelllinien und Knockout-Vögel für verschiedene Zwecke zu erzeugen.

Wachteln sind aufgrund ihres Wertes in der Geflügelfutterindustrie und ihrer Verwendung als Forschungsmodell für verschiedene Forschungsbereiche, insbesondere die Vogeltransgenese und Genom-Editierung, eine wichtige Vogelart. Derzeit wird die CRISPR/Cas9-Technologie zur Genom-Editierung häufiger bei Hühnern als bei Wachteln eingesetzt, da Hühner das wertvollste Vogelmodell in der Entwicklungsbiologie und Immunologie sind. Wachteln gewinnen jedoch aufgrund ihrer kurzen Generationszeit, ihrer hohen Eierproduktion und ihrer geringen Größe als alternatives Modell zu Hühnern in Genom-Editing-Studien an Bedeutung (Poynter et al., 2009 Lee et al., 2019c). Ahn et al. (2017) ein geflügelspezifisches CRISPR/Cas9-System entwickelt, das unter Verwendung eines angepassten Wachtel-CRISPR-Vektors gezielte Deletionsmutationen in Chromosomen der Wachtelmuskelzelllinien einführt. In dieser Studie wurden Wachtel-7SK-Promotor und CBh-Promotor in einen CRISPR-Vektor für die Expression von gRNA und Cas9-Protein kloniert. Die gRNA wurde entwickelt, um auf den Wachtel-Melanophilin (MLPH)-Locus abzuzielen. Leeet al. (2019c) berichteten über CRISPR/Cas9-vermittelte Gen-Knockouts bei Wachteln, die auf das MLPH-Gen abzielen. In dieser Studie wurde der adenovirale Vektor CRISPR/Cas9 direkt in das Wachtelblastoderm injiziert. Bei den Nachkommen der Wachtelchimären wurden Mutationen im MLPH-Gen festgestellt. Leeet al. (2020) zielten auf das Myostatin (MSTN)-Gen ab, um Mutationen in Wachteln zu erzeugen in vivo unter Verwendung einer adenoviralen CRISPR/Cas9-System-vermittelten Methode. Diese Studie zeigte, dass die Mutation in MSTN zur Deletion von Cystein 42 in der MSTN-Propeptidregion führte und die homozygote mutierte Wachtel ein signifikant erhöhtes Körpergewicht und eine signifikant erhöhte Muskelmasse aufwies Wachtel.


4 EXPERIMENTELLE VERFAHREN

4.1 RXLR-Genidentifikation, Motiv- und Orthologie-Vorhersagen

RXLR-Effektorgen-Kandidaten wurden aus der Genomsequenz von P. agathidicida Stamm NZFS3770 (Studholme et al., 2016 ) (GenBank: GCA_001314445.1). Genmodelle wurden mit Augustus v. 2.5.5 (Stake & Morgenstern, 2005) berechnet, aus denen 78 RXLR-Effektorgen-Kandidaten durch Kombination von drei Vorhersagemethoden identifiziert wurden (Bhattacharjee et al., 2006 Whisson et al., 2007 Gewinn et al., 2007 ) (Abbildung S1), unter Verwendung von HMMER v. 3.0 (Finn et al., 2011 ) und SignalP v. 3.0 zur Signalpeptidvorhersage (Bendtsen et al., 2004). Die vorhergesagten Nukleotid- und Aminosäuresequenzen für diese RXLRs sind in Tabelle S1 und auf GenBank (Zugangsnummern MT503101–MT503178) aufgeführt. Die phylogenetische Analyse mit maximaler Wahrscheinlichkeit wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt (Ozturk et al., 2019). Überrepräsentierte Aminosäuremotive in den 78 RXLR-Effektorkandidaten wurden unter Verwendung von Standardparameterwerten im MEME-Suite-Motiv-Alignment-Suchwerkzeug (MAST) (Bailey .) identifiziert et al., 2009 ).

4.2 A. tumefaciens-vermittelte transiente Transformationsassays

RXLR-Effektorgen-Kandidaten und PaINF1-1 wurden PCR-amplifiziert aus genomischer (g)DNA von P. agathidicida isolieren Sie NZFS3616 (die verwendeten Primer sind in Tabelle S2 aufgeführt). Einzel-, Doppel- und Dreifachmutantenversionen von PaRXLR24 wurden mit einem QuickChange II Site-directed Mutagenesis Kit (Agilent) unter Verwendung der Wildtyp-(WT)-PaRXLR24-Matrize, die in kloniert wurde, hergestellt SmaI-verdautes pICH41021 (Yanisch-Perron et al., 1985). Die RXLR-PCR-Produkte, PaRXLR24 WT und mutierte Plasmide, wurden zusammen mit dem Signalpeptid PR1α (apoplastisch) oder dem N-3 × FLAG-Tag (zytoplasmatisch) (Integrated DNA Technologies) als Einstiegsmodule für die Golden Gate-Assemblierung verwendet (Engler et al., 2008 ) in die Agrobakterium Expressionsvektor pICH86988 (Weber et al., 2011 ).

Verifizierte Plasmidkonstrukte wurden transformiert in A. tumefaciens GV3101 (Holster et al., 1980). Drei der PaRXLRs konnten nicht kloniert werden, daher wurden nur 75 auf ihre Fähigkeit untersucht, den Zelltod zu induzieren. Für diese Zelltod-Screening-Assays werden Übernachtkulturen von transformierten A. tumefaciens GV3101 wurden in Puffer (10 mM MgCl .) resuspendiert2, 10 mM MES-KOH pH 5,6, 100 μM Acetosyringon) und infiltriert in N. Benthamiana oder N. tabacum verlässt bei einer endgültigen OD600 von 1,0 (Ma et al., 2012). Die 73 PaRXLRs, die keinen Zelltod auslösten N. Benthamiana wurden auf Unterdrückung des Zelltods getestet. Für Suppressionsassays, A. tumefaciens die Zelltod-Auslöser-Gene tragen, wurden 24 Stunden später infiltriert P. agathidicida RXLR-Effektoren bei OD600 von 0,4 für alle Konstrukte (Wang et al., 2011). Die Symptome wurden 7 Tage nach der Infiltration bewertet.

4.3 Protein-Immunoblotting und RT-PCR

Um die Proteinproduktion in Suppressionsassays zu verifizieren, N. Benthamiana Blätter wurden wie für das Suppressionsscreening beschrieben infiltriert, nach 3 Tagen geerntet und dann in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Gesamtproteine ​​wurden mit GTEN-Proteinextraktionspuffer (Choi et al., 2018). Zwanzig Mikroliter Gesamtproteinextrakt wurden durch SDS-PAGE (10%–12% Polyacrylamid) aufgetrennt. Die Gelelektrophorese wurde bei 110 V für 2–3 Stunden in Laufpuffer (25 mM Tris-HCl, 192 mM Glycin, 0,1% SDS) durchgeführt (Laemmli, 1970). Die Proteine ​​wurden über Nacht bei 30 V auf eine PVDF-Membran (Sigma-Aldrich) in Transferpuffer (25 mM Tris-HCl, 192 mM Glycin, 20 % (Vol./Vol.) Methanol) übertragen. Die Proteine ​​wurden mit Maus-Anti-GFP (1/ 200), -HA (1/1000) (Santa Cruz Biotechnology) oder -FLAG (1/5000) (Sigma-Aldrich) Primärantikörper und Hühner-Anti-Maus-IgG-HRP (1/20.000) (Santa Cruz Biotechnology) Sekundärantikörper . Die Membranen wurden mit chemilumineszierendem Substrat (SuperSignal West Dura Extended Duration Thermo Fisher Scientific) behandelt und die Proteinbanden wurden unter Verwendung eines C600 Gel Imaging Systems (Azure Biosystem) nachgewiesen.

Da R3a-HA2 auf einem Western Blot nicht nachgewiesen werden konnte, wurde die Genexpression durch RT-PCR verifiziert. RNA wurde unter Verwendung eines Spectrum Plant Total RNA Kit (Sigma-Aldrich) extrahiert und cDNA unter Verwendung von Zufallsprimern (QuantiTect Reverse Transcription Kit, Qiagen) synthetisiert. Genspezifische Primer wurden verwendet, um R3a-HA2 und GFP-Avr3a aus cDNA-Proben unter Verwendung von Phusion Flash High-Fidelity PCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific) zu amplifizieren.

4.4 Ausdruck von P. agathidicida RXLR-Gene in Planta

Quantitative RT-PCR wurde verwendet, um die Expression von PaRXLRs in Kauri-Gewebe zu bestimmen. Verwenden von P. agathidicida isolieren 3813 (Herewini et al., 2018 ), angebaut in Karottenbrühe und V8-Saft (Horner & Hough, 2014 Herewini et al., 2018 ) wurden kleine Myzelstücke auf feine Wurzelspitzen von 8 Monate alten anfälligen Kauri-Keimlingen (HTHF-2017-MW8-G) platziert. Bei Blättern wurde vor der Inokulation eine kleine Oberflächenwunde 0,5 cm von der Basis jedes Blattes entfernt gemacht. Die Wurzeln wurden dann zwischen nassen Papiertüchern in einer Plastikkassette versiegelt und bei 17°C mit 14,5 Stunden Licht:9,5 Stunden Dunkelheit inkubiert. Blatt- und Wurzelproben wurden von drei infizierten Sämlingen 6, 24, 48 und 72 Stunden nach der Inokulation entnommen, mit einem Blatt oder zwei Wurzelspitzen von jedem Sämling (bis zu 2 cm vom Infektionspunkt). Die Proben wurden in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei –80°C gelagert. Das gesamte Kauri-Pflanzenmaterial wurde nach Abschluss der experimentellen Arbeiten respektvoll vernichtet.

RNA wurde aus den Proben extrahiert und cDNA wie oben synthetisiert. Ein Mikroliter 2-fach verdünnter cDNA wurde mit 5 µl 2 x SensiFAST SYBR No-ROX (Bioline) und 0,5 mM Vorwärts- und Rückwärtsprimer in einem Gesamtvolumen von 10 µl gemischt. Zwei technische Replikate für jedes der drei biologischen Replikate wurden einer RT-PCR unterzogen, wobei 40 Zyklen bei 95 °C für 5 s, 60 °C für 10 s und 72 °C für 20 s verwendet wurden. Relativer Ausdruck von P. agathidicida RXLR-Genkandidaten wurden mit der Q-Gene-Methode (Müller et al., 2002 ), unter Verwendung des geometrischen Mittels von drei P. agathidicida Haushaltsgene, β-Tubulin, handelnd, und Übersetzungsdehnungsfaktor 2, als Referenz (Tabelle S1).

4.5 Genomsequenzierung und SNP-Analyse von 12 P. agathidicida isoliert

Zwölf Isolate von P. agathidicida (Tabelle 1) wurden in geklärter Karottenbrühe (Herewini et al., 2018 ) für 7 Tage bei 17°C, mit gDNA extrahiert aus gefriergetrocknetem Myzel (Moller et al., 1992 ). P. agathidicida gDNA wurde auf einem Illumina HiSeq 2500 an der Australian Genome Research Facility sequenziert, wobei die Illumina-gDNA-Shotgun-Bibliotheksvorbereitung und die HiSeq HT-Chemie mit 125 bp Paired-End-Reads (Illumina) verwendet wurden.

Rohe DNA-Sequenzdaten wurden mit fastq-mcf verarbeitet, um Primer- und Sequenzierungsadaptersequenzen zu entfernen (Aronesty, 2011), dann wurde die Qualität mit SolexaQA v. 3.1.4 auf einen Phred-Score von >20 getrimmt (Cox et al., 2010). Die Datenqualität wurde mit FastQC v. 0.11.5 (Bioinformatics, 2015) analysiert. Sequenzdaten sind vom Sequence Read Archive (SRA) erhältlich: BioProject PRJNA486676.

Paired-End-Reads wurden auf das NZFS3770-Referenzgenom (Studholme et al., 2016) mit Bowtie 2 v. 2.2.6 (Langmead & Salzberg, 2012). SNPs in den 12 Genomen wurden unter Verwendung von FreeBayes v. 1.1.0-46 (Garrison & Marth, 2012) mit dem Referenzgenom verglichen, wobei die Ploidie auf 2 (diploid) gesetzt wurde. Die FreeBayes-VCF-Dateien wurden basierend auf P. agathidicida NZFS3770-Genmodelle mit SnpEff v. 4.3t, mit Standardparametern und Qualitätsfilterung bei Q > 30 (Cingolani et al., 2012). Die Anzahl der SNPs in kodierenden Sequenzen wurde unter Verwendung von Bedtools bestimmt (Quinlan & Hall, 2010) (Tabelle S3). Homozygote SNPs wurden aus VCF-Dateien extrahiert und ein Alignment erstellt, indem alle 5.851 SNPs verkettet wurden. Eine Phylogenie wurde mit dem poppr R-Paket (Kamvar et al., 2014 ).

4.6 Screening auf N. Benthamiana Rezeptoren

Screening auf N. Benthamiana NBS-LRR-Rezeptoren, die an der Erkennung von PaRXLR24 beteiligt sind, wurden durch RNA-Silencing (Brendolise et al., 2017 ). A. tumefaciens GV3101-Zellen, die die Konstrukte trugen, wurden in 5 Wochen alte N. Benthamiana Blätter mit endgültigem OD600 von 0,2 für Hairpin-Konstrukte und 0,4 für PaRXLR24. Die 48 gepoolten Haarnadeln (Brendolise et al., 2017 ) wurden in der ersten Screeningrunde verwendet. Haarnadeln, die auf einzelne NBS-LRR-Gene aus zwei positiven Pools (Tabelle S4) abzielen, wurden dann im abschließenden Screening verwendet. Die Symptome wurden 7 Tage nach der Infiltration beurteilt. Die besten einzelnen NBS-LRR-Kandidaten wurden mit VIGS (Tabelle S4) weiter bewertet, wie zuvor beschrieben (Wang et al., 2018), mit Silencing-Konstrukten, die unter Verwendung von PCR-Primern entwickelt wurden (Tabelle S2). Der Zelltod wurde wie zuvor beschrieben durch Ionenleckage quantifiziert (Jing et al., 2016). Die Stummschaltungseffizienzen einzelner Haarnadeln wurden unter Verwendung von quantitativer RT-PCR bestimmt, wobei RNA und cDNA wie oben hergestellt wurden. NBS-LRR-Genexpression in Haarnadel-infiltrierten N. Benthamiana Blätter wird als Prozentsatz von nicht infiltrierten Blättern (n = 3) mit Ausdruck des Dehnungsfaktors 1-α (EF1a) zur Normalisierung verwendet.


Wie kann die ortsgerichtete Mutagenese genutzt werden, um die Produktion von Anti-Antikörpern zu unterdrücken? - Biologie

a Loschmidt Laboratories, Abteilung für Experimentelle Biologie und RECETOX, Fakultät für Naturwissenschaften, Masaryk-Universität, Kamenice 5/A13, 625 00 Brno, Tschechische Republik
Email: [email protected], [email protected]

b International Clinical Research Center, St. Anne's University Hospital Brno, Pekarska 53, 656 91 Brno, Tschechien

Abstrakt

Die Substrathemmung ist die häufigste Abweichung von der Michaelis-Menten-Kinetik und tritt bei etwa 25 % der bekannten Enzyme auf. Sie wird im Allgemeinen der Bildung eines unproduktiven Enzym-Substrat-Komplexes nach gleichzeitiger Bindung von zwei oder mehr Substratmolekülen an das aktive Zentrum zugeschrieben. Hier zeigen wir, dass eine einzelne Punktmutation (L177W) in der Haloalkan-Dehalogenase LinB eine starke Substrathemmung verursacht. Überraschenderweise legte eine globale kinetische Analyse nahe, dass diese Hemmung durch die Bindung des Substrats an den Enzym-Produkt-Komplex verursacht wird. Molekulardynamiksimulationen klärten die Details dieses ungewöhnlichen Mechanismus der Substrathemmung: Markov-Zustandsmodelle zeigten, dass das Substrat den Austritt des Halogenidprodukts durch direkte Blockierung und/oder Einschränkung der Konformationsflexibilität verhindert. Die Beiträge von drei Resten, die die mögliche Substratinhibitionsstelle bilden (W140A, F143L und I211L) zur beobachteten Hemmung wurden durch Mutagenese untersucht. Zwischen den Resten L177W und I211L, die sich in verschiedenen Zugangstunneln des Proteins befinden, wurde eine ungewöhnliche Synergie beobachtet, die zu einer hohen katalytischen Effizienz und einer reduzierten Substrathemmung führt. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Substrathemmung durch die Substratbindung an den Enzym-Produkt-Komplex verursacht und durch gezielte Aminosäuresubstitutionen in Enzymzugangstunneln rational gesteuert werden kann.


1. Einleitung

Das Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus (PRRSV) ist der Erreger einer Schweinekrankheit, die erstmals 1987 in den Vereinigten Staaten (USA) und dann 1990 in Europa berichtet wurde [1]. Das Virus zirkuliert jetzt in den meisten Schweine produzierenden Ländern und ist die Hauptursache für wirtschaftliche Verluste für die Schweineindustrie. PRRSV infiziert Schweine jeden Alters, die klinischen Manifestationen sind jedoch bei tragenden Sauen und jungen Schweinen ausgeprägter. Trächtige Sauen, die während des letzten Trimesters der Trächtigkeit mit PRRSV infiziert wurden, können bei totgeborenen, teilweise autolysierten und mumifizierten Föten zum Abort führen, während mit PRRSV infizierte junge Schweine klinische Symptome wie Fieber, schwere Dyspnoe, Anorexie, Lethargie, Ödeme der Augenlider und blaue oder rote Verfärbung der Ohren oder Hinterhand (überprüft in [2]).

PRRSV ist ein behülltes RNA-Virus, das zur Familie gehört Arteriviridae, und die bestellung Nidovirales [3,4]. Basierend auf ihrer genomischen und antigenen Vielfalt werden PRRSV-Isolate in zwei Genotypen eingeteilt: Nordamerika (NA) oder PRRSV-2 und Europäische (EU) oder PRRSV-1, die nur etwa 65 % Sequenzidentität teilen [5,6]. Das virale Genom ist ein lineares, positives und einzelsträngiges RNA-Molekül von etwa 15 kb Größe, das an seinen 5′ bzw. 3′ Termini mit einer Kappe versehen und polyadenyliert ist. Das PRRSV-Genom kodiert für 11 offene Leserahmen (ORFs). ORFs 1a und ORF1b besetzen die 5′ proximalen 75% des Genoms und kodieren zwei Polyproteine: pp1a und pp1ab. Die pp1a- und pp1b-Polyproteine ​​werden von viral kodierten Proteasen prozessiert, um mindestens 13 nichtstrukturelle Proteine ​​(nsps) zu erzeugen, die für die Replikation und Transkription der viralen RNA-Genome verantwortlich sind (Übersicht in [7]). Kürzlich wurde ein neuer ORF entdeckt, der in die nsp2-Region eingebettet ist (als ORF-Trans-Frame (TF) bezeichnet) [8]. Der ORF2TF wird sowohl durch 𢄡 als auch durch 𢄢 ribosomales Leserastersprung exprimiert, um zwei zusätzliche nsps zu produzieren: nsp2N𠅊 verkürzte Version von nsp2 und nsp2TF𠅊 Trans-Rahmen-Fusionsprotein bestehend aus den N-terminalen zwei Dritteln von nsp2 fusioniert mit eine 169-aa C-terminale Region, die vom ORF TF kodiert wird [8,9]. Die restlichen 25 % des proximalen viralen Genoms 3′ bestehen aus acht überlappenden ORFs: ORFs 2a, 2b, 3, 4, 5, 5a, 6 und 7, die für acht Strukturproteine ​​kodieren, nämlich: Glykoprotein 2 (GP2), Hülle ( E), GP3, GP4, GP5, ORF5a-Protein, Membran-(M)- bzw. Nukleokapsid-(N)-Protein. Die Strukturproteine ​​werden von einem verschachtelten Satz subgenomischer (sg) mRNAs exprimiert, von denen jede eine gemeinsame 5′-End-Leader-Sequenz trägt, die als Transkriptionsregulationssequenz (TRS) bezeichnet wird und mit der 5′- identisch ist. proximalen Teil des Genoms und wird an seinem 3′ Ende co-terminiert. Detaillierte Informationen zur Virusreplikation wurden an anderer Stelle ausführlich überprüft [10]

Wie bei anderen Positiv-Sense-RNA-Viren ist das PRRSV-Genom vollständig infektiös, sobald es in Zellen eingeführt wird. Dies bildet die Grundlage für die Konstruktion des reversen Genetiksystems für PRRSV. In diesem Review beschreiben wir die Ansätze zum Aufbau eines reversen Genetiksystems für PRRSV und seine Anwendungen zur Untersuchung der Virusbiologie, der Virus-Wirt-Interaktion und zur Entwicklung einer neuen Generation von Impfstoffen mit verbesserter Sicherheit und Wirksamkeit (Tabelle 1).

Tabelle 1

Zehn wichtige Anwendungen der reversen Genetik von PRRSV.

Bedeutung/Wichtige Erkenntnisse/Entdeckung/ForschungsergebnisVerweise
1. Die Regulation der viralen RNA-Synthese verstehen
Differentielle Regulation der viralen Genom- und sg-mRNA-Synthese durch nsp1α, nsp1β und nsp12.[11,12]
5′ und 3′ UTR enthält sekundäre RNA-Strukturen, die für die virale Genom- und sg-RNA-Synthese entscheidend sind.[13,14,15,16,17]
5′ und 3′UTR von PRRSV-1 und PRRSV-2 sind funktional kompatibel.[15,18]
Überlappende kodierende Sequenzen in der viralen Strukturregion können getrennt werden.[19,20]
2. Identifizierung von essentiellen und nicht-essentiellen viralen Genomregionen
GP5- und M-Proteine ​​sind für die Virion-Assemblierung unverzichtbar.[21]
Kleine GPs sind für die Viruspartikelbildung entbehrlich, aber entscheidend für die Infektiosität.[21,22]
E-Protein besitzt Ionenkanalaktivitäten, die für die Enthüllung des Virus erforderlich sind.[23]
Cys-Reste und Myristylierungsmotiv im E-Protein sind für die virale Infektiosität nicht essentiell.[24,25]
ORF5a ist für die Lebensfähigkeit des Virus unentbehrlich und Cys-Reste in ORF5a sind für die virale Infektiosität nicht wesentlich.[26,27]
N-Protein-Disulfid-Bindung und NLS sind für die virale Replikationsfitness essentiell.[24,28,29,30]
Essentielle und nicht-essentielle Region des nsp2-Replicase-Proteins.[31,32]
Entdeckung des neuartigen nsp2 TF und seine Rolle bei der Virusinfektiosität.[8]
3. Die Bedeutung der N-verknüpften Glykosylierung viraler Glykoproteine ​​verstehen
Einzelne N-gebundene Glykosylierungsstellen in GP2, GP3 und GP4 sind für die Bildung infektiöser Viruspartikel nicht essentiell.[33,34,35,36]
Die N-gebundene Glykosylierungsstelle in GP5 an der Stelle 44 ist für die virale Infektiosität kritisch.[36,37]
Die N-gebundene Glykosylierung in GP3 und GP5 beeinflusst die Empfindlichkeit des Virus gegenüber Antikörperneutralisation.[35,37,38]
4. Entdecken Sie virale Determinanten des Zelltropismus
Die kleineren Hüllproteine, aber nicht GP5 und die M-Ektodomäne, sind die Hauptdeterminanten für die PRRSV-Infektiosität in PAMs.[39,40,41,42]
Nsp2 könnte zur viralen Infektiosität von PAMs beitragen.[43]
Mutationen in GP2 und GP3 sind mit der verstärkten viralen Replikation in MARC-145-Zellen verbunden.[40,41,42,44]
5. Charakterisieren Sie virale Ziele für die Antikörpererkennung und -neutralisation
Diese antigenen Stellen in GP5 könnten als genetische Marker dienen, um den Grad der Anfälligkeit für Antikörperneutralisation vorherzusagen.[45]
Kleine GPs sind Ziele von neutralisierenden Antikörpern.[46,47]
Tyr10 in M ist mit dem Entweichen der Antikörperneutralisation verbunden.[48,49]
Thr90 im N-Protein ist ein aa des Epitops, das von mAb SDOW17 erkannt wird.[50]
6. Identifizieren Sie virale Determinanten der Virulenz
Die Virulenz von PRRSV ist multigen.[51,52]
Nsp9 und 10 sind mit der hochvirulenten Natur von HP-PRRSV verbunden.[53,54]
7. Eliminieren Sie die virale Immunsuppression
Erzeugung von nsp1β-Mutanten, die signifikant höhere Niveaus von Typ-I-IFNs induzieren.[55,56,57]
Deletionen verschiedener Regionen von nsp2 des HP-PRRSV-Stammes verbessern die Fähigkeit des Virus, Typ-I-IFNs zu induzieren, während die Induktion von inflammatorischen Zytokinen reduziert wird.[58,59]
Identifizierung von viralen Genomregionen, die mit einigen PRRSV-Stämmen assoziiert sind, die auf natürliche Weise IFNs induzieren.[60,61]
aa-Reste 33� des N-Proteins, das mit der viralen Induktion von IL-10 assoziiert ist.[62]
Erzeugung von PRRSV-Mutanten, die hohe TNF-α induzieren.[63]
8. Verbessern Sie die Sicherheit und Wirksamkeit von Impfstoffen
Molekulare Abschwächung des PRRSV-Stammes durch DNA-Shuffling und Codon-Paar-Deoptimierung.[64,65,66,67]
Verbessern Sie den heterologen Schutz durch DNA-Shuffling und durch de novo-Synthese eines neuen PRRSV-Stamms, der ein Konsensus-Genom trägt.[64,68,69,70]
Verbessern Sie die Immunantwort durch Einfügen von Immunmodulatoren.[71,72,73,74]
Entwicklung von DIVA-Impfstoffen durch Entfernung dominanter B-Zell-Epitope, die sich in den nsp2- und M-Proteinen befinden.[75,76,77]
9. Viraler Vektor
Verwenden Sie PRRSV als viralen Vektor, um PCV2-Capsid zu exprimieren oder PCV2-Cap und Schweineinfluenza-HA-Protein dual zu exprimieren.[78,79,80]
10. Markerproteine ​​einfügen, um virale Proteintranslokation und virale Infektion zu verfolgen
Die Insertion einer myc-tag-Sequenz in nsp2, um dieses nsp zu demonstrieren, wird in das virale Partikel eingebaut.[81]
Insertion von GFP in nsp2, um die intrazelluläre Bewegung dieses Proteins zu verfolgen.[82]

Inhalt

Cystein-302 ist einer von drei aufeinanderfolgenden Cys-Resten und ist entscheidend für die katalytische Funktion des Enzyms. Der Rest wird sowohl in den cytosolischen als auch in den mitochondrialen Isozymen durch Iodacetamid alkyliert, wobei Modifikationen an Cys-302 auf eine katalytische Aktivität mit anderen Resten hinweisen. Darüber hinaus ist die vorangehende Sequenz Gln-Gly-Gln-Cys in beiden Isozymen sowohl für Mensch als auch für Pferd konserviert, was damit übereinstimmt, dass Cys-302 für die katalytische Funktion entscheidend ist. [2]

Wie durch ortsgerichtete Mutagenese entdeckt wurde, ist Glutamat-268 eine Schlüsselkomponente der Leber-Acetaldehyd-Dehydrogenase und auch entscheidend für die katalytische Aktivität. Da die Aktivität in Mutanten durch Zugabe allgemeiner Basen nicht wiederhergestellt werden konnte, wird vorgeschlagen, dass der Rest als allgemeine Base für die Aktivierung des essentiellen Cys-302-Rests fungiert. [3]

In Bakterien bildet die acylierende Acetaldehyd-Dehydrogenase mit der metallabhängigen 4-Hydroxy-2-Ketovalerat-Aldolase ein bifunktionelles Heterodimer. Die Kristallstruktur des Enzyms, die beim bakteriellen Abbau toxischer aromatischer Verbindungen verwendet wird, zeigt an, dass Zwischenprodukte direkt zwischen den aktiven Zentren durch einen hydrophoben Zwischenkanal transportiert werden, wodurch eine unreaktive Umgebung geschaffen wird, in der das reaktive Acetaldehyd-Zwischenprodukt vom aktiven Zentrum der Aldolase zur Acetaldehyd-Dehydrogenase transportiert werden kann aktive Seite. Eine solche Kommunikation zwischen Proteinen ermöglicht den effizienten Transfer von Substraten von einem aktiven Zentrum zum nächsten. [1]

Obwohl die beiden Isozyme (ALDH1 und ALDH2) keine gemeinsame Untereinheit teilen, beträgt die Homologie zwischen den humanen ALDH1- und ALDH2-Proteinen 66 % auf der Ebene der kodierenden Nukleotide und 69 % auf der Aminosäureebene, was niedriger als die der 91% Homologie zwischen Human-ALDH1 und Pferde-ALDH1. Ein solcher Befund stimmt mit Beweisen überein, die auf eine frühe evolutionäre Divergenz zwischen zytosolischen und mitochondrialen Isozymen schließen lassen, wie in der 50%-Homologie zwischen mitochondrialen und zytosolischen Asparatat-Aminotransferasen vom Schwein zu sehen ist. [4]

In der Leber wird Ethanol in einem zweistufigen Prozess in harmlose Essigsäure (die Hauptsäure im Essig) umgewandelt. Im ersten Schritt wird Ethanol durch die Alkoholdehydrogenase in Acetaldehyd umgewandelt. Im zweiten Schritt wird der Acetaldehyd durch die Acetaldehyd-Dehydrogenase in Essigsäure umgewandelt. Acetaldehyd ist giftiger als Alkohol und für viele Katersymptome verantwortlich. [5]

Etwa 50% der Menschen nordostasiatischer Abstammung haben eine dominante Mutation in ihrem Acetaldehyd-Dehydrogenase-Gen, [6] was dieses Enzym weniger wirksam macht. Eine ähnliche Mutation findet sich bei etwa 5–10% der blondhaarigen blauäugigen Menschen nordeuropäischer Abstammung. [7] Bei diesen Menschen reichert sich Acetaldehyd nach dem Trinken von Alkohol an, was zu Symptomen einer Acetaldehyd-Vergiftung führt, einschließlich der charakteristischen Hautrötung und erhöhter Herz- und Atemfrequenz. [7] Andere Symptome können schwere Krämpfe im Bauch- und Harntrakt, Hitze- und Kältewallungen, starkes Schwitzen und tiefes Unwohlsein sein. [7] Personen mit mangelhafter Acetaldehyd-Dehydrogenase-Aktivität werden viel seltener Alkoholiker, scheinen jedoch einem größeren Risiko für Leberschäden, alkoholinduziertes Asthma und Krebserkrankungen des Oropharynx und der Speiseröhre aufgrund einer Acetaldehyd-Überexposition ausgesetzt zu sein. [7]

Dies zeigt, dass viele der toxischen Wirkungen von Ethanol über den Acetaldehyd-Metaboliten vermittelt werden und daher durch Substanzen wie Fomepizol abgeschwächt werden können, das die Umwandlungsrate von Ethanol zu Acetaldehyd effektiv reduziert in vivo.

ALDH2 mit einem niedrigeren Km für Acetaldehyd als ALDH1 und wirkt überwiegend in der mitochondrialen Matrix, ist das Hauptenzym im Acetaldehyd-Stoffwechsel und hat drei Genotypen. Eine einzelne Punktmutation (G → A) am Exon 12 des ALDH2-Gens verursacht einen Ersatz von Glutamin durch Lysin am Rest 487, was zum ALDH2K-Enzym führt. [8] ALDH2K hat einen erhöhten Km für NAD + , was es bei zellulären Konzentrationen von NAD + praktisch inaktiv macht . [6] Da ALDH2 ein randomisiertes Tetramer ist, ist der heteromutierte Genotyp im Vergleich zum Wildtyp auf nur 6% Aktivität reduziert, während homomutierte Genotypen praktisch keine Enzymaktivität aufweisen. [9] Die ALDH2-defiziente Untereinheit ist dominant bei der Hybridisierung mit einer Wildtyp-Untereinheit, was zur Inaktivierung des Isozyms durch Störung der katalytischen Aktivität und Erhöhung des Umsatzes führt. [10] Die genetische Variation von ALDH2 wurde eng mit der Alkoholabhängigkeit korreliert, wobei Heterozygoten im Vergleich zu Wildtyp-Homozygoten ein reduziertes Risiko aufweisen und einzelne Homozygoten für den ALDH2-Mangel ein sehr geringes Risiko für Alkoholismus aufweisen. [11]

Das Medikament Disulfiram (Antabus) verhindert die Oxidation von Acetaldehyd zu Essigsäure und wird zur Behandlung von Alkoholismus eingesetzt. ALDH1 wird durch Disulfiram stark gehemmt, während ALDH2 gegen seine Wirkung resistent ist. Der Cysteinrest bei 302 in ALDH1 und 200 in ALDH2 ist als Disulfiram-Bindungsstelle am Enzym impliziert und dient als Disfulfiram-empfindliche Thiolstelle. [12] Die kovalente Bindung von Disulfiram an das Thiol blockiert die Bindung eines der Cysteinreste an Iodacetamid, wodurch das Enzym inaktiviert und die katalytische Aktivität signifikant verringert wird. Die Aktivität kann durch Behandlung mit 2-Mercaptoethanol wiederhergestellt werden, jedoch nicht mit Glutathion. [13]

Metronidazol (Flagyl), das zur Behandlung bestimmter parasitärer Infektionen sowie pseudomembranöser Kolitis angewendet wird, verursacht ähnliche Wirkungen wie Disulfiram. Coprin (eine Aminosäure, die in bestimmten Coprinoid-Pilzen vorkommt) wird in vivo zu 1-Aminocyclopropanol metabolisiert, was ebenfalls ähnliche Wirkungen hervorruft.

ALDH1 ist am Metabolismus von Vitamin A beteiligt. Tiermodelle legen nahe, dass das Fehlen des Gens mit einem Schutz vor viszeraler Adipositas einhergeht (PMC 2233696).


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