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3.2: Ortsgerichtete Mutagenese - Biologie

3.2: Ortsgerichtete Mutagenese - Biologie



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Einführung

Beim letzten Mal haben Sie viele Informationen durchsucht, um mutagenisierte inverse Perikams zu entwerfen – schöne Arbeit! Heute werden Sie Ihre Entwürfe in die Tat umsetzen.

Die von Ihnen verwendete Strategie der ortsgerichteten Mutagenese (SDM) teilt einige Funktionen mit der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) für die DNA-Amplifikation. Erinnern Sie sich an Modul 1, dass die PCR-Amplifikation mehrere Zyklen des Schmelzens, Anlagerns und Verlängerns umfasst. Um eine oder mehrere Basenpaar-Mutationen in der Produkt-DNA zu erzeugen, können Primer verwendet werden, die eine leichte Fehlpaarung zur ursprünglichen Matrize aufweisen. Bei einer ausreichend niedrigen Annealing-Temperatur (~25 °C unter der Primer-Schmelztemperatur) werden diese nahezu komplementären Primer immer noch an die Template-DNA anlagern, aber die während der Extensionsphase erzeugten Kopien enthalten die Mutation.

Heute beginnen Sie damit, Plasmid-DNA, die für inverses Pericam vom Wildtyp kodiert, mit den von Ihnen entwickelten mutagenen Primern zu kombinieren. Auf diese wird eine DNA-Polymerase einwirken, um ein mutiertes Plasmid zu erzeugen. Noch mehr Kopien des mutierten Plasmids können hergestellt werden, indem es in Bakterien in einem Prozess namens Transformation eingeführt wird, den wir beim nächsten Mal besprechen (und tun!) Denken Sie daran, dass in Ihrer SDM-Reaktionsmischung noch elterliche – d. h. nicht mutierte – DNA vorhanden ist. Um sich zu verbreiten nur das mutierte Plasmid nach Einschleusung in Bakterien wird die Eltern-DNA spezifisch verdaut unter Verwendung der DpnI Enzym vor der bakteriellen Transformation. (Weil DpnI verdaut nur methylierte DNA, die synthetisch hergestellte und damit nicht methylierte mutierte DNA wird nicht verdaut.) Die resultierenden kleinen linearen Stücke der elterlichen DNA werden von den Bakterien einfach abgebaut, während die weitgehend intakte (aber geknickte) mutierte DNA von diesen tatsächlich repariert wird genau die gleichen Bakterien.

Die Thermocycling-Reaktion wird heute etwas mehr als zwei Stunden dauern. Während dieser Inkubationszeit werden wir zwei Artikel aus der Primärliteratur diskutieren. Wir werden uns „aufwärmen“, indem wir das Papier von Heim, Prasher und Tsien (1994) diskutieren. Dies ist ein kurzer Artikel, der den allerersten Versuch zur Mutagenisierung von GFP beschreibt und eine gute Einführung in einige der in diesem Modul verwendeten Konzepte und Methoden gibt. Als nächstes werden wir den Artikel von Nagai et al (2001) genauer lesen, der das inverse Pericam einführte. Wir werden den Aufbau und die Analyse des Mehrkomponenten-Calciumsensors inverser Perikam (IPC) genauer untersuchen.

Jetzt könnte ein guter Zeitpunkt sein, um zu erwähnen, warum wir uns überhaupt darum kümmern, intrazelluläres Kalzium zu messen. Calcium ist an vielen Signaltransduktionskaskaden beteiligt, die alles von der Immunzellaktivierung bis zur Muskelkontraktion, von der Adhäsion bis zur Apoptose regulieren – siehe zum Beispiel die Übersichtsartikel von David Clapham in Cell (2007) oder Ernesto Carafoli in PNAS (2002). Intrazelluläres Kalzium (Ca2+) wird normalerweise bei ~100 nM gehalten, Größenordnungen weniger als die ~mM-Konzentration außerhalb der Zelle. ATPase-Pumpen halten die Basalkonzentration von zytoplasmatischem Calcium niedrig. Calcium fungiert oft als sekundärer Botenstoff, d. h. es leitet eine Nachricht von der Zelloberfläche an ihr Zytoplasma weiter. Beispielsweise kann ein bestimmter Ligand einen Zelloberflächenrezeptor binden, wodurch eine Flut von Calciumionen aus den intrazellulären Kompartimenten freigesetzt wird, in denen sie normalerweise sequestriert sind. Diese freien Ionen können ihrerseits die Phosphorylierung oder andere nachgeschaltete Signalübertragung fördern.

Die Proteine, die Calcium binden, tun dies mit einer großen Vielfalt von Affinitäten und haben Funktionen, die von der Sequestrierung bis zur Wahrnehmung reichen. Einige Calciumreaktionen können Langzeitwirkungen haben, insbesondere im Fall von Transkriptionsfaktoren, die Calcium binden können. Wie Sie letztes Mal erfahren haben, funktioniert Calmodulin als Calciumsensor, indem es bei der Calciumbindung eine Konformationsänderung durchmacht. Ihr heutiges Ziel ist es, mutierte Calmodulin- (im Zusammenhang mit inversem Pericam) DNA herzustellen, um die Affinität des resultierenden Proteins für Kalzium zu verändern.

Verweise

Heim, R., D.C. Prasher und R.Y. Tsien. "Wellenlängenmutationen und posttranslationale Autoxidation von grün fluoreszierendem Protein." PNAS 91, Nr. 26 (20. Dezember 1994): 12501-4. [Voller Text]

Nagai, T., et al. "Zirkular permutierte grün fluoreszierende Proteine, die entwickelt wurden, um Ca2+ . zu erkennen." PNAS 98, Nr. 6 (6. März 2001): 3197-3202. [Voller Text]

Clapham, D.E."Kalziumsignalisierung." Zelle 131, Nr. 6 (14. Dezember 2007): 1047-1058.

Carafoli, E."Kalziumsignalisierung: Eine Geschichte für alle Jahreszeiten." PNAS 99, nein. 3 (5. Februar 2002): 1115-22. [Voller Text]

Protokolle

Teil 1: Primer-Vorbereitung

  1. Berechnen Sie die benötigte Wassermenge für jede Grundierung (vorwärts und rückwärts), um eine Konzentration von 1 mg/ml zu erhalten.
  2. Schleudern Sie Ihre Primer durch Berührung, resuspendieren Sie sie jeweils in der entsprechenden Menge Wasser und drehen Sie sie erneut.
    • Um Spin zu berühren, halten Sie die "kurze" Taste 3-5 Sekunden lang gedrückt und lassen Sie sie dann los.
  3. Berechnen Sie die Verdünnung der Primer, die Sie benötigen, um 125 ng zu erhalten jede einzelne Primer vorhanden pro 5 μL von gesamt Lösung (enthält beide Primer). Bereiten Sie 100-200 µl dieser Verdünnung vor und halten Sie sie auf Eis. Achten Sie darauf, die Spitzen zwischen den Grundierungen zu wechseln.

Teil 2: Ortsgerichtete Mutagenese

Wir werden den QuickChange verwenden® Kit von Stratagene zur Durchführung unserer ortsgerichteten Mutagenesen. Jede Gruppe wird eine Reaktion für ihre ausgewählte X#Z-Mutation erstellen. In der Zwischenzeit wird das Lehrpersonal eine einzige positive Kontrollreaktion einrichten, um sicherzustellen, dass alle Reagenzien richtig funktionieren. Sie sollten schnell, aber vorsichtig arbeiten und Ihre Tube immer in einem gekühlten Behälter aufbewahren. Bitte geben Sie geteilte Reagenzien in die Eiskübel auf der vorderen Bank zurück, wenn Sie damit fertig sind.

  1. Lesen Sie das folgende Protokoll durch und bereiten Sie alle Berechnungen vor, bevor Sie mit der physikalischen Manipulation Ihrer Proben beginnen.
  2. Besorgen Sie sich ein PCR-Röhrchen und beschriften Sie die Oberseite mit Ihrer Mutation und Ihrem Laborabschnitt (klein schreiben!). Fügen Sie Ihrem Röhrchen 43 μl "Master Mix" - enthaltend Puffer und dNTPs - hinzu. Achten Sie darauf, eine frische Pipettenspitze zu verwenden, da sich mehrere Gruppen jedes Aliquot des Master Mix teilen!
  3. Fügen Sie 2 ul Template-DNA ("IPC-Plasmid") in das Reaktionsröhrchen hinzu.
    • Hinweis: Es wird erwartet, dass Mutagenesereaktionen mit 5-50 ng Plasmid-DNA reibungslos verlaufen. Sie haben eine 1:200-Verdünnung von Miniprep-DNA erhalten.
  4. Fügen Sie dem Röhrchen 5 ul verdünnte Primerlösung (die sowohl Vorwärts- als auch Rückwärtsprimer enthält) hinzu. Das Reaktionsvolumen sollte nun 50 µL betragen.
  5. Schließlich fügen Sie 1 μL hinzu PfuTurbo DNA-Polymerase (mischen Sie die Enzymvorräte nicht, wenn Sie daraus entnehmen) mit Ihrem P20 zu der Reaktion und mischen Sie die Reaktion gründlich durch Pipettieren mit Ihrem P200-Set auf 40 μL.
  6. Sobald jede Gruppe bereit ist, starten wir den Thermocycler unter den folgenden Bedingungen:
SEGMENTFAHRRÄDERTEMPRATUR (°C)ZEIT
119530 Sekunden
2189530 Sekunden
551 Minute
685 Minuten
314unbestimmt
  1. Legen Sie nach Abschluss des Zyklus 10 µl Ihrer Reaktion in einem gut beschrifteten Eppendorf-Röhrchen (Mutation, Laborschnitt, Teamfarbe) beiseite. Sie werden diese unverdaute Probe beim nächsten Mal benötigen.
  2. Fügen Sie 1 μl hinzu DpnI zur restlichen Reaktionsmischung im PCR-Röhrchen geben und zum Mischen pipettieren. Die Proben werden eine Stunde bei 37 °C inkubiert.
  3. Dieser letzte Inkubationsschritt führt uns über die Schließzeit des Labors hinaus, an dem Ihre verdaute (und unverdaute) DNA bis zum nächsten Mal eingefroren wird.

Teil 3: Diskussion von Zeitschriftenartikeln

Bei der Herstellung der mutagenisierten DNA werden wir die beiden in der Einleitung zitierten Zeitschriftenartikel diskutieren. Der Zweck dieser Diskussion wird zweierlei sein: 1) uns mit der Geschichte des Proteindesigns vertraut zu machen und 2) weiterhin Wege zu erforschen, um über die wissenschaftliche Literatur zu sprechen. (Wahrscheinlich sind Sie alle Profis nach den Modul-1-Journalclubs!)

Denken Sie beim Lesen des Artikels von Heim, Prasher und Tsien über die folgenden Fragen nach.

  • Was sind die Vorteile von GFP im Vergleich zu synthetischen Fluoreszenzfarbstoffen und wo liegen seine Grenzen? Welche dieser Einschränkungen sind Heim et al. versuchen anzusprechen?
  • Welche Methoden haben die Autoren für die Mutagenese verwendet und wie schneiden sie im Vergleich zu der von uns verwendeten Methode ab?
  • Wie wurden mutagene Proteine ​​ursprünglich ausgewählt und wie wurden die ausgewählten weiter analysiert?
  • Welche Bedeutung haben die verschiedenen Wildtyp-Proteinfraktionen, die in Abbildung 1 dargestellt sind?
  • Wenn die GFP-Reifung keine Cofaktoren für eine chemische Reaktion benötigt, warum dauert sie dann vier Stunden? Welche Beweise sprechen für das Fehlen von Cofaktoren?
  • In welchen Teilen des Proteins wurden nützliche Aminosäuresubstitutionen gefunden?

Wenn Sie heute im Labor ankommen, wird jeder Gruppe eines der folgenden nummerierten Themen zugewiesen, die sie dem Rest der Klasse präsentieren und mit ihnen diskutieren können. Die gleiche Gruppe wird die Themen 1 und 8 behandeln. Sie sollten inzwischen mit der gesamten Arbeit von Nagai et al. einigermaßen vertraut sein, haben aber im Unterricht etwas Zeit, um Ihr Gedächtnis aufzufrischen und der ansässige Experte in einem der folgenden Bereiche zu werden (beachten Sie, dass manchmal der Ergebnis-/Diskussionstext zu a bestimmte Zahl kann außerhalb der numerischen Reihenfolge liegen - z. B. wird Abb. 4 nach Abb. 5 geschrieben):

  1. Einführung, Methoden (Genkonstruktion) und Abbildung 1
    • Überlegen Sie: Was ist ein chimäres Protein? Eine zirkulär permutierte?
    • Wie funktioniert das chimäre Protein Perikam als Sensor? (Noch keine Details zu den verschiedenen Perikam-Typen erforderlich.)
    • Fassen Sie kurz zusammen, wie Perikam auf Genebene konstruiert wurde. Welche Änderungen mussten vorgenommen werden, um Perikam in Säugetier- und nicht in Bakterienzellen zu exprimieren?
  2. Figur 2
    • Was lernen die Autoren aus den Absorptionsspektren über die cpEYFP-Struktur?
    • Vergleichen Sie die zum Testen von Pericam verwendete Wellenlänge mit dem Anregungsmaximum von cpEYFP. Warum könnten sie etwas anders sein?
    • Was mussten die Autoren neben den in Tabelle 1 gezeigten Mutationen tun, um ein funktionierendes (fluoreszierendes, kalziumempfindliches) Perikam herzustellen?
    • Was war der dynamische Bereich (Intensitätsänderung mit Calciumzugabe) des ersten funktionierenden cpEYFP?
  3. Tabelle 1 (Mutationen) und Abbildung 3, A-I (Fokus auf D-F)
    • Beschreiben Sie die drei Perikam-Typen, die ursprünglich konstruiert und getestet wurden, und wie sie auf Kalzium reagieren.
    • Welche Arten von Aminosäuresubstitutionen wurden vorgenommen und warum könnten sie die beschriebenen Effekte verursachen?
  4. Tabelle 1 (Kd) und Abbildung 3, J-L
    • Dieses Zahlenwerk ist dem, das Sie später für Ihre Laborberichte erstellen werden, sehr ähnlich. Es wird im Text nicht ausführlich beschrieben, also nehmen Sie sich einen Moment Zeit, um die Achsen und Ergebnisse so gut wie möglich zu entschlüsseln und gegebenenfalls externe Ressourcen zu verwenden.
  5. Figur 4
    • Wie verbessert Flash-Pericam die bisherigen Einschränkungen bei der Bildgebung von Kalzium im Zellkern und im Zytosol?
    • Welche Chemikalien können verwendet werden, um stufenweise Veränderungen im intrazellulären Kalzium zu bewirken, und wie könnten sie funktionieren?
  6. Abbildung 5
    • Wie haben die Autoren den Kalziumspiegel kalibriert?
    • Was ist das Besondere an der Funktionsweise der Split-Perikam im Vergleich zu den anderen Perikams?
    • Welche Einschränkungen gibt es bei der Verwendung von Split-Pericam als Kalziumsensor?
  7. Abbildung 6
    • Welche Änderungen wurden an Perikam für Studien auf Organellenebene vorgenommen und wie verbessert sich die Verwendung von Perikam gegenüber früheren Verfahren?
    • Was konnten die Autoren über Calciumtransienten in verschiedenen Organellen lernen?
  8. Einpacken
    • Beschreiben Sie einige andere (nicht perikambasierte) Kalziumindikatoren.
    • Wie funktioniert FRET und was sind die Vor- und Nachteile der Verwendung von FRET-basierten Sensoren?

Schließlich sollten Sie alle die Ähnlichkeiten und Unterschiede zwischen der in den obigen Artikeln beschriebenen Forschung und der Forschung, die Sie in diesem Modul durchführen, berücksichtigen.

Für nächstes Mal

  1. Berechnen Sie, wie viel (Gewicht) Plasmid-DNA Sie in Ihrer Mutagenesereaktion verwendet haben, unter der Annahme, dass das Miniprep-Verfahren zu typischen Konzentrationen von 1 μg/μl führt.
  2. Nehmen wir uns einen Moment Zeit, um die kleinste Komponente des inversen Perikam-Konstrukts zu untersuchen. Von welchem ​​Protein stammt das M13-Peptid und was macht dieses Protein normalerweise? Insbesondere sollten Sie seine molekulare und makroskopische Funktion in ein oder zwei Sätzen beschreiben.
  3. Im Gegensatz zur PCR zur Amplifikation, die ein exponentielles Wachstum zeigt, verursacht die ortsgerichtete Mutagenese einen linearen Anstieg der Menge des gewünschten DNA-Produkts. Dies liegt daran, dass die DNA-Amplifikation nur von der ursprünglichen Matrize in SDM erfolgen kann, niemals von einer Kopie dieser Matrize. Warum sollte das sein? Denken Sie daran, dass DNA nur in 5'-3'-Richtung synthetisiert werden kann. Darüber hinaus existiert die DNA, die von der Matrize kopiert wird, in Nickform, nicht als intakter Kreis. Denken Sie schließlich daran, dass Ihre Vorwärts- und Rückwärtsprimer direkt komplementär sind. Verwenden Sie diese drei Fakten, um ein Bild zu zeichnen, das zeigt, warum SDM nur Kopien der ursprünglichen Template-DNA produziert, und erklären Sie es kurz. Stellen Sie sicher, dass Ihr Diagramm/Ihre Erklärung die gestellte Frage explizit beantwortet.

Reagenzienliste

QuikChange II Kit für ortsspezifische Mutagenese von Stratagene

  • 10X Reaktionspuffer (100 mM KCl, 100 mM (NH4)2SO4, 200 mM Tris-HCl, 20 mM MgSO4, 1% Triton® X-100, 1 mg/ml BSA)
  • PfuUltra® DNA-Polymerase (2,5 U/μl, 1 μl pro rxn)
  • dNTP-Mix (proprietärer Mix, 1 μL pro rxn)
  • Dpn I (10 U/μL)

Überexpression, Immundetektion und ortsgerichtete Mutagenese von Anabaena sp. PCC 7120 Flavodoxin: Eine umfassende Laborpraxis zur Molekularbiologie

Rekombinante Proteinexpression und ortsgerichtete Mutagenese von Zielgenen haben in den Bereichen Molekularbiologie, Biochemie, Biotechnologie und Medizin eine zunehmende Bedeutung gezeigt. Durch die Verwendung des Flavodoxins des Modell-Cyanobakteriums Anabaena sp. PCC 7120 als Laborwerkzeug haben wir eine umfassende Laborpraxis entwickelt, die mehrere gut etablierte molekularbiologische Techniken und Verfahren umfasst, um zwei Hauptziele zu erreichen: (1) Überexpression und Immundetektion von Anabaena-Flavodoxin in rekombinanten Escherichia coli-Zellextrakten und (2 ) ortsgerichtete Mutagenese des Anabaena-Flavodoxin-Gens isiB. Diese Laborpraxis bietet Studenten im Grundstudium die Möglichkeit, mehrere wesentliche Techniken in diesem Bereich selbst durchzuführen. Mit Hilfe von Professorinnen und Professoren werden die Studierenden zum Nachdenken, zur Interpretation und zur Diskussion der Ergebnisse auf der Grundlage des Erlernten aus den vorangegangenen theoretischen Lehrveranstaltungen angeregt. © 2018 von The International Union of Biochemistry and Molecular Biology, 46(5):493-501, 2018.

Schlüsselwörter: Anabaena flavodoxin Rekombinante Proteinexpressionsprotein-Immunodetektion ortsgerichtete Mutagenese.


Bedeutung:

Zur Mutagenese werden verschiedene Wege, zum Beispiel Nested-PCR, inverse PCR oder konventionelle PCR-Amplifikation, verwendet. Hier sind keine ausgefallenen Methoden oder Fluoreszenzchemie erforderlich.

Aber warum müssen wir ortsgerichtete Mutagenese durchführen? Welche Bedeutung hat es, es zu tun? Sehen wir uns einige wichtige Anwendungen der gegenwärtigen Methoden an.

Die ortsgerichtete Mutagenese wird verwendet, um die Restriktionsstellen zu entfernen. Restriktionsverdau ist ein Verfahren, bei dem die DNA mit der Erkennungsstelle für eine bestimmte Restriktionsendonuklease in Fragmente gespalten wird.

Als nächstes wird die modifizierte Sequenz in ein Plasmid übertragen und dann wird erneut ein Restriktionsverdau durchgeführt, um zu validieren, ob die Erkennungsstelle entfernt wurde oder nicht.

Wenn jedoch die DNA von unserem Interesse die Restriktionsstelle enthält, spaltet die Restriktionsendonuklease die Ziel-DNA sowie den Rest der Plasmid-DNA, was ein experimentelles Scheitern anzeigt.

Die Funda ist einfach: Wenn wir eine Mutation an einer RE-Erkennungsstelle einführen, kann das Enzym sie nicht identifizieren und kann sie nicht schneiden. Dies kann nur unter Verwendung der ortsgerichteten Mutagenese erfolgen.

Als nächstes wird geübt, die Struktur und Funktion des Proteins zu analysieren. Die Methode ist leistungsfähig genug, um die Funktion eines von einem Gen gebildeten Proteins zu untersuchen.

Angenommen, ein Gen kodiert für ein Wildtyp-Protein und es wird im Stoffwechselweg eines Organismus benötigt. Durch Mutation dieses Protein-kodierenden Gens kann die Auswirkung der Abwesenheit dieses Proteins im Stoffwechselweg eines Organismus untersucht werden.

Eine wichtige Funktion der ortsgerichteten Mutagenese ist auch das Studium der Gen-Editierung oder Gen-Manipulation. Durch Genmanipulation kann auch die Aktivität eines bestimmten Proteins bestimmt werden.

Neben diesen wichtigen Anwendungen wird das Verfahren häufig praktiziert, um Protein-Protein-Interaktionen, Enzymveränderungen und Enzym-Silencing-Studien zu untersuchen.


Ortsspezifische Mutagenese des D1 Untereinheit des Photosystems II in Wildtyp-Chlamydomonas.

E Przibilla, S Heiss, U Johanningmeier, A Trebst, Ortsspezifische Mutagenese des D1 Untereinheit des Photosystems II in Wildtyp-Chlamydomonas., Die Pflanzenzelle, Band 3, Ausgabe 2, Februar 1991, Seiten 169–174, https://doi.org/10.1105/tpc.3.2.169

Die Struktur und Funktionsweise des Proteins D1 des Reaktionszentrums des Photosystems II kann untersucht werden, indem die Auswirkungen von Aminosäuresubstitutionen innerhalb der Bindungsnische für QB, den zweiten stabilen Elektronenakzeptor des Photosystems II, auf die Herbizidbindung analysiert werden. Hier berichten wir über die ortsgerichtete Mutagenese des psbA-Gens, das für das D1-Protein in der einzelligen Alge Chlamydomonas reinhardtii kodiert. Die Chloroplasten von Wildtyp-Zellen wurden unter Verwendung der Partikelkanone transformiert. Die eingeführten Plasmide trugen ein in vitro mutiertes Fragment des psbA-Gens. Wir erhielten eine Doppelmutante mit Ersatz der Aminosäuren 264 und 266 und eine Dreifachmutante mit einer zusätzlichen Substitution an Position 259. Die Sensitivitäten beider Mutanten gegenüber verschiedenen Arten von Herbiziden sind angegeben und mit denen einer Mutante mit nur einer Substitution an Position . verglichen 264.


Oligonukleotid-gerichtete Mutagenese: eine einfache Methode mit zwei Oligonukleotid-Primern und einer einzelsträngigen DNA-Matrize

Dieses Papier präsentiert eine einfache und effiziente Methode zur Oligonukleotid-gerichteten Mutagenese unter Verwendung von Vektoren, die von einzelsträngigen Phagen abgeleitet sind. Diese Modifikation unseres früher veröffentlichten Verfahrens (Zoller und Smith, 1982) zeichnet sich durch die Verwendung von zwei Primern aus, von denen einer ein Standard-M13-Sequenzierungsprimer und der andere das mutagene Oligonukleotid ist. Beide Primer werden gleichzeitig an einzelsträngige Matrizen-DNA angelagert, durch DNA-Polymerase I (großes Fragment) verlängert und miteinander ligiert, um einen mutierten Wildtyp-Heteroduplex mit Lücke zu bilden. Escherichia coli direkt mit dieser DNA transformiert wird, ist die Isolierung von kovalent geschlossener zirkulärer DNA wie in unserem vorherigen Bericht nicht erforderlich. Mutanten werden durch Plaque-Lift-Hybridisierung unter Verwendung des mutagenen Oligonukleotids als Sonde identifiziert. Als Beispiel für die Methode wurde ein Heptadecanukleotid verwendet, um eine T → G-Transversion im zu erzeugen MATTEein Gen von Saccharomyces cerevisiae in den Vektor M13mp5 kloniert. Die Effizienz der Mutagenese betrug ungefähr 50 %. Die Produktion der gewünschten Mutation wurde durch DNA-Sequenzierung verifiziert. Das gleiche Verfahren wurde ohne Modifikation verwendet, um Insertionen von Restriktionsstellen sowie spezifische Deletionen von 500 Basen zu erzeugen.


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