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Nukleosidanaloga, die Mutationen verursachen


Ich bin verwirrt mit dieser Erklärung in meinem Buch: 2-Aminopurin wird anstelle von Adenin in die DNA eingebaut, kann sich aber mit Cytosin paaren, sodass ein AT-Paar zu einem CG-Paar wird.

Dieser Satz kommt mir seltsam vor. Es besagt, dass Adenin durch 2-Aminopurin ersetzt wird, sich aber mit Cytosin paaren kann. Und das AT-Paar wird zu einem CG-Paar. Bedeutet das, dass 2-Aminopurin Adenin ersetzt und dann wie Cytosin an Guanin bindet?? Denn aus 'AT-Paar wird CG'. Aber es sagt "aber kann sich mit Cytosin paaren", welches wird sich mit Cytosin binden??

Ich habe dazu gegoogelt, konnte aber keine klare Erklärung dazu finden. Kann mir bitte jemand erklären, wie dieses Analog funktioniert oder den Satz in meinem Buch umformulieren? Dankeschön.

Das Buch, auf das ich mich beziehe, ist Mikrobiologie: eine Einführung 10. Aufl. Von Tortora, Funke und Fall. Seite 229.


Wenn Sie Bakterien 2-Aminopurin füttern, wird es während der DNA-Replikation in geringer Geschwindigkeit anstelle von Adenin in die DNA eingebaut. Mit anderen Worten, es wird ein Basenpaar zwischen Thymidin und 2-Aminopurin geben.

Zwei Dinge könnten passieren:

  1. Die DNA-Reparatur könnte die ungewöhnliche Base erkennen und versuchen, sie zu korrigieren. Wenn das 2-Aminopurin ausgeschnitten wird, wird Adenin eingefügt - keine Mutation. Wenn jedoch das Thymidin herausgeschnitten wird, wird manchmal ein Cytidin eingefügt. Dies wird unten gelöst.
  2. Während der nächsten Zellteilung baut die Replikationsmaschinerie manchmal ein dC gegenüber dem 2-Aminopurin ein. Dann wird in der folgenden Zellteilung ein dG gegenüber dem C eingebaut, so dass aus dem, was früher ein A-T-Basenpaar war, ein G-C-Basenpaar (eventuell) geworden ist.

SARS-CoV-2 und Influenza: ein vergleichender Überblick und Behandlungsimplikationen

Das schwere akute respiratorische Syndrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) und das Alphainfluenzavirus sind RNA-Viren, die die Coronavirus-Krankheit 19 bzw. Influenza verursachen. Beide Viren infizieren die Atemwege, zeigen ähnliche Symptome und verwenden Oberflächenproteine, um den Wirt zu infizieren. Influenza benötigt Hämagglutinin und Neuraminidase, um sich zu infizieren, während SARS-CoV-2 Protein S verwendet. Beide Viren sind auf eine virale RNA-Polymerase angewiesen, um ihre Proteine ​​zu exprimieren, aber nur SARS-CoV-2 hat einen Korrekturlesemechanismus, was zu einer niedrigen Mutationsrate führt im Vergleich zur Grippe. E1KC4 und Camostat-Mesylat sind potenzielle Inhibitoren des SARS-CoV-2 S-Proteins, die eine ähnliche Wirkung wie Oseltamivir erzielen. Aufgrund der niedrigen Mutationsrate von SARS-CoV-2 wurden Nukleosidanaloga entwickelt (wie EIDD-2801), die tödliche Mutationen in die virale RNA einbringen. Darüber hinaus deutet die niedrige Mutationsrate von SARS-CoV-2 darauf hin, dass ein Impfstoff sowie die bei genesenen Patienten entwickelte Immunität im Vergleich zu Impfstoffen gegen Influenza, die durch die Mutation des Virus obsolet werden, einen lang anhaltenden Schutz bieten könnte.

La enfermedad por Coronavirus de 2019 y la Influenza son causadas por virus ARN: Coronavirus tipo 2 del síndrome respiratorio agudo grave (SARS-CoV-2) y Alphainfluenzavirus, respektivamente. Ambos virus infectan el tracto respiratorio, Presentan síntomas similares y emplean proteínas de superficie para infectar al huésped. El virus de la influenza requiere de la infectar, mientras que el SARS-CoV-2 utiliza la proteína mecanismo de corrección de errores, por lo que presenta una baja tasa de mutaciones en comparación con el virus de la influenza. E1KC4 y el mesilato de camostat son inhibidores potenciales de la proteína S del SARS-CoV-2, obteniendo un efecto ähnlich al de Oseltamivir. Aprovechando la baja tasa de mutación del SARS-CoV-2, se han Desarrollado análogos de nucleósidos (como el fármaco EIDD-2801) que Insertan mutaciones letales und el ARN viral. Además, la baja tasa de mutación del SARS-CoV-2, obteniendo un efecto ähnlich al de oseltamivir sugiere que las vacunas desarrolladas, así como la inmunidad generada en contra pacientes recuperados, podrían brindarada proteccilas , que resultan obsoletas frente a una cepa mutada.

Schlüsselwörter: COVID-19 Coronavirus-Krankheit-19 Influenza SARS-CoV-2 Schweres akutes respiratorisches Syndrom Coronavirus 2.


Die weitreichenden Wirkungen von Nukleosidanaloga

25.09.1999: Eine Gruppe französischer Ärzte berichtet über fünf Fälle eines seltenen Syndroms von zerebralen, neurologischen und/oder Netzhautschäden bei 8 von 2.000 Babys, die von HIV-positiven Müttern geboren wurden. Diese große Mutter-Kind-Kohorte hatte AZT (Retrovir) oder AZT/3TC (Epivir) erhalten, um eine HIV-Übertragung während der Schwangerschaft und Entbindung zu verhindern. Die Babys zeigten auch eine Vielzahl anderer Anomalien in der Muskel-, Herz-, Bauchspeicheldrüsen- und Knochenmarkaktivität. Auch die zugrunde liegenden Mängel in der Energieerzeugung waren offensichtlich. Zwei der Babys starben nach etwa einem Jahr. Alle waren HIV-negativ.

**14. Oktober 1999:**USA Bioscience gibt den Abbruch einer Studie mit ihrem experimentellen Nukleosid-Analogon oder Nukleosid-Reverse-Transkriptase-Inhibitor (NRTI) Lodenosin wegen „schwerwiegender Nebenwirkungen“ bekannt einen Monat nachdem er Lodenosin abgesetzt hatte. Drei ähnliche Todesfälle traten in den sieben Wochen auf, nachdem den verbleibenden Studienteilnehmern Lodenosin abgesetzt wurde. Weitere neun Personen mussten zur Überwachung und Behandlung ins Krankenhaus eingeliefert werden. Insgesamt wiesen 75 Studienteilnehmer bei Bluttests Anzeichen einer Leberschädigung auf.

11.11.1999: Auf Drängen der US-amerikanischen Food and Drug Administration (FDA) sendet Bristol-Myers Squibb Ärzten einen Brief, in dem sie vor den Gefahren der Kombination von drei ihrer HIV-Behandlungen warnt: d4T (Zerit), ddI (Videx) und Hydroxyharnstoff (Hydrea). Die FDA verlangt auch, dass Bristol-Myers die Warnungen vor Pankreatitis (Entzündung der Bauchspeicheldrüse) in der ddI-Beipackzettel hervorhebt.

Diese Mitteilungen folgten zwei Fällen tödlicher Pankreatitis in der von den National Institutes of Health (NIH) gesponserten Studie ACTG (AIDS Clinical Trials Group) 5025 sowie zwei anderen Todesfällen im Zusammenhang mit Pankreatitis in zwei separaten von der Industrie gesponserten Studien. Alle vier Verstorbenen hatten ddI plus d4T eingenommen, aber nur die ACTG 5025-Freiwilligen nahmen auch Hydroxyharnstoff ein. Eine gelegentlich schwerwiegende Nebenwirkung von ddI ist eine Entzündung der Bauchspeicheldrüse, die neben fettverdauenden Enzymen auch das Hormon Insulin ausschüttet. Wie bei der Neuropathie (Nervenerkrankung, die durch Taubheitsgefühl, Kribbeln und/oder Schmerzen in den Händen oder Füßen gekennzeichnet ist), eine weitere, aber weniger schwerwiegende Nebenwirkung von ddI, erhöht die Kombination von ddI mit bestimmten anderen Arzneimitteln die Häufigkeit von Pankreatitis. D4T und ddI haben ähnliche, verstärkende Nebenwirkungen, während Hydroxyurea wirkt, indem es die Potenz von ddI in den Zellen erhöht.

3. Dezember 1999: Gilead Sciences gibt bekannt, dass sie die Entwicklung von Adefovir beenden, a Nukleotidanalogon -- die erste HIV-Behandlung, die von der FDA abgelehnt wurde. Die Dosierung von Adefovir führt bei vielen Menschen nach sechsmonatiger Behandlung zu progressivem Nierenversagen. Nierenschäden werden zuerst durch das Auftreten von Protein im Urin angezeigt. Etwa die Hälfte der Personen, die das Medikament ein Jahr lang einnehmen, zeigt einen schwerwiegenden Verlust der Nierenfunktion, der durch einen hohen Serumkreatininspiegel (ein Stoffwechselabfallprodukt der Muskelaktivität) und einen niedrigen Serumphosphat- und Bicarbonatspiegel gekennzeichnet ist. Das Fanconi-Syndrom, gekennzeichnet durch niedriges Kalium, kann lebensbedrohlich sein. Trotz dieser Probleme wird Adefovir noch heute als mögliche Behandlung einer Hepatitis B (HBV)-Infektion untersucht, aber bei einer viel niedrigeren Dosis von 10 mg wurden in den Anti-HIV-Studien Dosen von 120 mg und 60 mg verwendet.

Mitochondriale Biologie

Diese Vorfälle sind nur die letzten Kapitel einer langen Geschichte. Fast seit der Einführung von AZT im Jahr 1987 haben Wissenschaftler erkannt, dass mehrere Medikamente der NRTI-Klasse nicht sehr spezifisch sind. Sie blockieren das Wachstum von HIV, können aber auch für menschliche Zellen toxisch sein, manchmal mit lebensbedrohlichen Folgen.

NRTIs wie ddI, d4T, Lodenosin und Adefovir wirken gegen HIV, indem sie die Funktion des Reverse-Transkriptase-Enzyms des Virus stören, das den HIV-Gensatz in eine DNA-Form umwandelt, die sich in menschliche Zellgenome einfügt. Nukleosidanaloge Medikamente sind im Wesentlichen fehlerhafte Versionen natürlicher Nukleoside (Vorläuferverbindungen). Natürliche Nukleoside werden zunächst zu Nukleotiden phosphoryliert (chemisch umkonfiguriert) und dann zu DNA verkettet. Dies geschieht sowohl durch die reverse Transkriptase als auch durch die zelleigenen Enzyme während der Genreplikation. Den chemischen Strukturen von NRTIs fehlen die notwendigen molekularen Haken, um diesen Prozess fortzusetzen, sie beenden die durch Reverse Transkriptase aufgebaute Kette und blockieren die Infektion neuer Zellen.

NRTIs haben im Allgemeinen keinen Einfluss auf die Konstruktion neuer DNA in den Kernen (Mitte) von somatischen (Körper-)Zellen, da die Enzyme, die diesen Prozess in den Zellen antreiben, über einen "Korrekturlese"-Mechanismus verfügen, der die Nukleosidanaloga herausschneidet, wenn sie in eine neue DNA-Kette eingefügt werden . Eine Ausnahme von dieser Regel gibt es jedoch: Die Schwachstelle der Zellen liegt in den Mitochondrien, den energieproduzierenden Bausteinen der Zelle.

Vor Äonen, zu Beginn der Evolution, waren Mitochondrien anscheinend unabhängige bakterienähnliche Zellen. Irgendwann siedelten sie sich in größeren, fortgeschritteneren Zellen mit Kernen an und gingen eine symbiotische Beziehung ein. Heute behalten Mitochondrien innerhalb fast aller nichtbakteriellen Zellen eine gewisse Autonomie. Diese Organellen, kleine Beutel mit tief gefalteten Membranen, bauen Zucker und Fett ab, um Energie zu erzeugen, die die Zelle für ihre unzähligen chemischen Prozesse nutzen kann.

Hunderte von Mitochondrien existieren in jeder Zelle und replizieren sich unabhängig von der zelleigenen Proliferation. Die vorhandenen Mitochondrien werden während der Mitose (Zellteilung) an die Tochterzellen verteilt, die Mitochondrien replizieren sich dann in jeder Zelle entsprechend dem Energiebedarf der Zelle. Doch trotz ihrer integralen Rolle innerhalb der Zellen behalten Mitochondrien bestimmte einzigartige Gene, die die Produktion einer sehr kleinen Menge an Proteinen und Enzymen steuern. In jedem Mitochondrium existieren zwei bis zehn redundante Kopien des mitochondrialen Genoms in Form von zirkulärer doppelsträngiger DNA.

Mitochondriale Gene sind besonders anfällig für Schäden. Die DNA-Polymerase Gamma, das Enzym, das die Replikation der mitochondrialen Gene steuert, ist primitiver als die im Zellkern vorkommenden DNA-Polymerase-Enzyme. Polymerase-gamma hat keine "Korrekturlese"-Funktion, so dass beim Aneinanderreihen von Nukleotiden nur wenig Fehler repariert werden. Nukleosidanaloga hemmen daher die DNA-Polymerase-gamma auf die gleiche Weise wie die reverse Transkriptase.

Mitochondrien verlassen sich auf ihre genetische Redundanz, um vor Fehlern in ihren Genen zu schützen. Defekte DNA koexistiert und repliziert neben korrekter DNA, die den Defekt deckt. Ebenso können funktionelle Mitochondrien defekte Mitochondrien innerhalb derselben Zelle kompensieren.

Das System bricht erst zusammen, wenn die beschädigte mitochondriale DNA einen Schwellenwert von über 70 % erreicht. Zellen beginnen dann an Energiemangel zu leiden und wenden sich zunehmend anaeroben Prozessen (d. h. ohne Sauerstoffverbrauch) außerhalb der Mitochondrien zu. Anaerobe Atmung ist viel weniger effizient als die oxidative Phosphorylierung der Mitochondrien (Verwendung von Sauerstoff zum Abbau von Zucker und Fett). Außerdem verursacht sie die Produktion von Milchsäure, einer Substanz, die den normalen pH-Wert des Blutes senkt.

Der oxidative Prozess in Mitochondrien führt auch zu toxischen Nebenprodukten. Dies sind reaktive Sauerstoffspezies (ROS), die hochreaktive Formen von Sauerstoff (O2-, H2O2 und OH-) sind. ROS schädigen DNA und andere Moleküle, die sie produzieren, wenn die Energieproduktion im mittleren Stadium gehemmt wird. Antioxidative Moleküle (Superoxiddismutase und Glutathion) in den Mitochondrien sollen ROS eliminieren, indem sie sie zu Wasser reduzieren, während sie ihre zusätzlichen Elektronen auf Metalle übertragen. Dieser Prozess ist jedoch nicht immer effektiv genug, um oxidativen Stress zu verhindern (erhöhte Mengen an freien Radikalen und anderen Molekülen, was zu Zellschäden führt). Ein allmählicher Aufbau dysfunktionaler Mitochondrien aufgrund von ROS-Reaktionen mit mitochondrialer DNA wird als einer der zentralen Prozesse des Alterns angesehen.

Mitochondriale Toxizität von NRTIs

Spezifische Krankheitssyndrome sind auch mit seltenen erblichen mitochondrialen Mutationen verbunden. Mitochondrienbedingte Erkrankungen variieren in ihrem Schweregrad von Person zu Person, und die Symptome treten häufig erst mit zunehmendem Alter auf. Am häufigsten sind Gewebe wie Muskeln und Nerven betroffen, die viel Energie benötigen. Einige der spezifischen Zustände im Zusammenhang mit einer unzureichend niedrigen mitochondrialen Aktivität sind Muskelschwund (Myopathie) Herzinsuffizienz (Kardiomyopathie) peripheres Taubheitsgefühl und Schmerzen (Neuropathie) generalisierter Verlust der Fähigkeit der Niere, das Blut zu filtern (proximale renale tubuläre Dysfunktion oder Fanconi-ähnliches Syndrom) niedrige Anzahl von Blutkörperchen (Anämie, Leukopenie, Thrombozytopenie oder Panzytopenie), Schwellung und Verfettung der Leber (Hepatomegalie mit Steatose) und Bauchspeicheldrüsenentzündung (Pankreatitis). Müdigkeit, psychische Depression und hohe Milchsäurewerte (Laktatazidose) sind allgemeinere Anzeichen.

Forscher berichteten 1990 über einen Zusammenhang zwischen Myopathie und AZT. Ein Jahr später wurde ein Artikel veröffentlicht, der AZT insbesondere mit Herzmuskelschäden in Verbindung brachte. Andere Anzeichen einer mitochondrialen Toxizität wurden in den folgenden Jahren mit NRTIs in Verbindung gebracht. Warum verschiedene NRTIs unterschiedliche Wirkungen haben und warum verschiedene Personen unterschiedliche Empfindlichkeiten gegenüber diesen Wirkungen haben, ist derzeit nicht bekannt. Die Unterschiede zwischen den Individuen können sich auf die bereits vorhandenen mitochondrialen Mutationen und auf ihre Verteilung in verschiedenen Organen beziehen, die nicht unbedingt einheitlich ist.

Die unterschiedliche Empfindlichkeit verschiedener Gewebe gegenüber spezifischen NRTIs ergibt sich vermutlich aus der unterschiedlichen Penetration dieser Medikamente in verschiedene Zellen und dem Energiebedarf dieser Zellen. Adefovir wirkt beispielsweise selektiv und stark auf Nierenzellen, weil es an ein Nierenzelltransportermolekül (hOAT1) bindet. Diese Bindung bewirkt, dass sich Adefovir in den Zellen ansammelt, die die Wände der Nierentubuli auskleiden, wo unerwünschte Verbindungen aus dem Blut in den Urin übertragen werden.

D4T und ddC stellen zwei kritische Fälle dar, in denen die mitochondrial-assoziierte Toxizität – in diesen Fällen Neuropathie – als so schwerwiegend festgestellt wurde, dass die Dosis während der Forschung und Entwicklung stark eingeschränkt werden musste. Beide Verbindungen wurden ursprünglich als hochwirksame antiretrovirale Wirkstoffe getestet. Im Fall von d4T umfassten die Studien ursprünglich Tagesdosen von bis zu 900 mg. Die Studienteilnehmer berichteten von einer sofortigen Verbesserung ihres Gesundheitszustands, aber zwei Drittel mussten das Medikament aufgrund einer schweren Neuropathie schnell absetzen.

Am Ende stellte der Ausschuss, der das große d4T-Parallel-Track-Programm überwachte, fest, dass selbst 40 mg zweimal täglich zu viel waren, etwa ein Viertel der Personen, die diese Dosis einnahmen, das Parallel-Track-Programm wegen Neuropathie abbrachen. Es wurde festgestellt, dass die Entwicklung einer Neuropathie durch die CD4-Zellzahl vermittelt wird, d. h. die Erkrankung trat häufiger bei Menschen mit niedrigeren CD4-Zellzahlen auf. Eine periphere Neuropathie entwickelte sich auch nach einer durchschnittlichen Nachbeobachtungszeit von 79 Wochen bei der Hälfte der Teilnehmer einer d4T-Monotherapiestudie, die 40 mg zweimal täglich einnahmen. Nichtsdestotrotz wurden 40 mg zweimal täglich die Standarddosis.

FDA-zugelassene Packungsbeilagen für alle NRTIs tragen einen prominenten Warnhinweis, der die mögliche Nebenwirkung der Leberdegeneration beschreibt. Insbesondere warnen die Beilagen: „Laktatazidose und schwere Hepatomegalie mit Steatose, einschließlich tödlicher Fälle, wurden bei der Anwendung von Nukleosidanaloga allein oder in Kombination berichtet. Ein Großteil dieser Fälle betraf Frauen. Fettleibigkeit und verlängerte Nukleosidexposition können Risikofaktoren sein.“ Diese Leberdegeneration ähnelt der „akuten Fettleber“ einer Schwangerschaft, einem mütterlichen Syndrom, das sowohl Mutter als auch Fötus bedroht und aus einer erblichen Unfähigkeit des Fötus resultiert, Fettsäuren in den Mitochondrien zu oxidieren.

Diese Warnungen vor Leberdegeneration basieren auf vereinzelten Vorfällen, von denen berichtet wurde, dass sie aufgetreten sind nach Arzneimittelzulassung. Es ist schwer zu sagen, wie häufig sie jetzt sind. Eine Untersuchung von 1989-1994 von Personen, die in der HIV-Klinik von Johns Hopkins behandelt wurden, ergab eine Inzidenz schwerer Fälle von Hepatomegalie mit Steatose und Laktatazidose von 1,3 pro 1.000 Personenjahre. (Die Anzahl der Personen multipliziert mit der Anzahl der Jahre entspricht Personenjahren, zB eine Person, die zehn Jahre lang verfolgt wurde, entspricht zehn Personenjahren und zehn Personen, die ein Jahr lang verfolgt wurden, entspricht ebenfalls zehn Personenjahren.) Eine neuere französische Studie ergab a Häufigkeit von 8,4 pro 1.000 Personenjahre bei symptomatischen hohen Milchsäurewerten.

Im Fall von ddI ist die Inzidenz schwerer Pankreatitis in den letzten Jahren zurückgegangen, da sich der allgemeine Gesundheitszustand der Menschen mit dem Erfolg wirksamer Anti-HIV-Therapien verbessert hat. Eine regelmäßige Überwachung sollte durchgeführt werden, um das Vorhandensein von Pankreasenzymen im Blut zu erkennen – ein frühes Anzeichen für eine mögliche Entwicklung einer Pankreatitis. Manchmal entwickelt sich dieser Zustand jedoch schnell und ohne Vorwarnung, daher sollten Ärzte nicht auf der Hut sein. Etwas alarmierend sind die genauen Risikofaktoren, die eine Person für ddI für Pankreatitis prädisponieren, wie bei anderen mitochondrialen Toxizitäten, noch unerforscht. Die Wirkung der Kombination von ddI mit anderen Medikamenten wie d4T und Hydroxyharnstoff war ebenfalls überraschend. Noch überraschender ist, dass diese Situation entstanden ist nach ein Jahrzehnt des Testens und Vermarktens von ddI. Insgesamt werden mehr Nebenwirkungen bei Alkoholmissbrauch beobachtet.

NRTIs verursachen selten schwere mitochondriale Schäden – mit wenigen Ausnahmen, insbesondere der Beeinträchtigung der Nieren durch Adefovir ddI, d4T und ddC-Neuropathie und hochdosierter AZT-Anämie. Eine häufige Überwachung der Organfunktion durch Labortests (insbesondere Leberfunktions-, Phosphor- und Kohlendioxidtests sowie ein vollständiges Blutbild) kann in der Regel schwerwiegende Folgen verhindern. Die Überwachung des Serumlaktats ist zwar etwas schwierig, da der Test unmittelbar nach der Blutabnahme durchgeführt werden muss, kann aber auch nützlich sein, wie aus einem kürzlich veröffentlichten vorläufigen Bericht von Marianne Harris, MD, vom British Columbia Center for Excellence in HIV/AIDS hervorgeht. Außerdem führt das Absetzen der Medikamente häufig zu einer allmählichen Erholung, wahrscheinlich weil die mitochondriale Replikation die Energieproduktion wiederherstellt. Die FDA erhält jedoch weiterhin Berichte über Todesfälle durch Laktatazidose, obwohl ein leichter Anstieg des Milchsäurespiegels, der zu Müdigkeit führt, viel häufiger auftreten kann als lebensbedrohliche Fälle.

Neue langfristige mitochondriale Toxizitäten

Nach einer jahrzehntelangen Erfahrung mit dem einen oder anderen NRTI gibt es jetzt drei oder vier wirksame, gut etablierte Wirkstoffkombinationen, die Protease-Inhibitoren (PIs) oder nicht-nukleosidische Reverse-Transkriptase-Inhibitoren (NNRTIs) umfassen. Die Kombination dieser Medikamente kombiniert auch ihre Toxizitäten auf neue und ungewohnte Weise. Noch wichtiger ist, dass antivirale Medikamente heute viel länger als in der Vergangenheit eingenommen werden. Mit einer dauerhaften Unterdrückung von HIV durch hochaktive antiretrovirale Therapie (HAART) hat sich die Gesundheit des Individuums stabilisiert, aber das restliche HIV überlebt (siehe HIV Persists trotz HAART, Frühjahr 2000 BETA). Dies ist nicht nur eine neue Ära in der HIV-Therapie, sondern auch eine neue Ära in Bezug auf Langzeittoxizitäten.

Es ist seit langem bekannt, dass eine chronische, nicht unterdrückte HIV-Infektion ein Auszehrungssyndrom auslöst, bei dem Menschen mit HIV fettfreie Gewebemasse (hauptsächlich Muskeln) verlieren, manchmal in lebensbedrohlichem Ausmaß. Einige Forscher haben festgestellt, dass subkutaner Fettabbau (unter der Haut) mit dem Verlust von magerem Gewebe einhergeht, insbesondere bei Frauen und übergewichtigen Männern. Das schlimmste Defizit, so scheint es, war die Unfähigkeit, die bei schweren opportunistischen Infektionen (OIs) verloren gegangene fettfreie Masse wiederzugewinnen.

Heutzutage haben einige Menschen, die HAART einnehmen, Schwierigkeiten, die richtige Fettverteilung aufrechtzuerhalten oder wiederherzustellen. Fett neigt dazu, sich im Laufe der Zeit um die zentralen Organe und manchmal um den Rücken oder die Vorderseite des Halses anzusammeln. Unterdessen geht die Lipoatrophie – die Erschöpfung der subkutanen Fettspeicher, insbesondere in den Gliedmaßen und Wangen – weiter.

Diese weit verbreitete Körperfettumlagerung, von der bis zu zwei Drittel der Teilnehmer in verschiedenen Studien betroffen waren, war ein merkwürdiges Phänomen (siehe Body Fat Changes: More than Lipodystrophy, Januar 1999). BETA, und HAART Attack: Metabolic Disorders during Long-Term Antiretroviral Therapy, April 1999 BETA). Es wurde zunächst angenommen, dass die neuen PIs für diese "Lipodystrophie" (heute manchmal auch als HARS, HIV-Associated Adipose Redistribution Syndrome) verantwortlich sind.

Nach der ersten Flut von Berichten begannen sich Ärzte daran zu erinnern, dass sie in den Tagen vor der HAART einige Fälle von Fettansammlungen am Halsansatz und zwischen den Schulterblättern (dorsozervikale Fettpolster, allgemein als "Büffelhöcker" bezeichnet) gesehen hatten. Dieser Aufbau wurde manchmal von einer Lipoatrophie begleitet. Darüber hinaus besteht eine deutliche Ähnlichkeit zwischen der HAART-assoziierten Lipodystrophie und einer Form der multiplen symmetrischen Lipomatose (abnorme Fettansammlungen), auch bekannt als MSL oder Madelungs-Krankheit. Beide Syndrome beinhalten peripheren Fettabbau und Büffelhöcker. Personen mit MSL haben keine Fettdepots im Rumpf, aber sie weisen eine Neuropathie auf. Mehrere Berichte weisen darauf hin, dass Mutationen an einem bestimmten Punkt in der mitochondrialen DNA MSL begleiten.

Eine kürzlich durchgeführte Umfrage zu Körperfettanomalien bei der HIV-positiven Bevölkerung Australiens ergab eine Gesamtprävalenz von 54 %, darunter 63 % der Personen, die PIs eingenommen hatten, und 32 % der Personen, die Behandlungen ohne PIs ausgesetzt waren. Dieselbe Forschungsgruppe unter der Leitung von Andrew Carr, MD, und David Cooper, MD, vom St. Vincent's Hospital in Sydney, verglich 14 Männer, die nur NRTIs erhielten und bei denen ein peripherer Fettabbau mit oder ohne Fettansammlung auftrat, mit drei verschiedenen Kontrollen Gruppen ohne Lipodystrophie. Diese drei Kontrollgruppen bestanden aus 32 behandlungsnaiven Männern, 28 Männern, die nur NRTIs erhielten, und 44 Männern, die NRTIs plus PIs erhielten. Eine vierte Vergleichsgruppe enthielt 102 Männer mit Lipodystrophie, die sowohl NRTIs als auch PIs einnahmen.

Die nur NRTI-Fälle von Lipodystrophie zeichneten sich durch höhere Milchsäurewerte aus, die mit Körpergewichtsverlusten und Anzeichen einer Leberfunktionsstörung korrelierten. Zu diesen Anzeichen gehörten geschwollene Lebern und erhöhte Leberenzyme im Blut, die alle auf eine mitochondriale Toxizität hindeuten.

Lebertoxizität hat besondere Auswirkungen auf die Verschlimmerung der mitochondrialen Toxizität, da eine der Aufgaben der Leber darin besteht, Milchsäure aus dem Blut zu entfernen. Die Leberfunktion ist auch für den Fettstoffwechsel von entscheidender Bedeutung, da dieses Organ eine zentrale Rolle bei der Umwandlung von überschüssigen Blutfetten (Fetten) in Glukose (Zucker) oder umgekehrt spielt, je nach Aktivitätsniveau des Körpers und Nahrungsaufnahme. PIs können zu hohen Lipid- und Insulinspiegeln führen.

Kürzlicher Gewichtsverlust, Müdigkeit und Übelkeit traten in der NRTI-Lipodystrophie-Gruppe der Australier signifikant häufiger auf als in der Lipodystrophie-Gruppe mit kombinierter Therapie. Die Männer mit Lipodystrophie, die PIs erhielten, hatten höhere Blutspiegel von Lipiden (Cholesterin und Triglyceriden), Glukose und Insulin als ihre Gegenstücke, die nur NRTIs erhielten.

Die Veränderungen der Körperform waren in den beiden Gruppen ähnlich. In einer in Frankreich von L. Maulin, MD, und Kollegen durchgeführten Studie war dies jedoch nicht der Fall. Die französischen Forscher fanden heraus, dass diejenigen, die PI-haltige Therapien erhielten, deutlich mehr viszerales (Bauch-)Fett hatten als diejenigen, die entweder nur NRTIs erhielten oder keine Anti-HIV-Medikamente einnahmen. Sowohl die Protease- als auch die Nukleosidgruppe wiesen etwa die gleiche Menge an subkutanem Fett auf, die wesentlich geringer war als in der behandlungsnaiven Gruppe.

Risikofaktoren

Zu den signifikanten Risikofaktoren für Lipodystrophie in der australischen Studie gehörten die aktuelle Anwendung von d4T und die Anzahl der Jahre bei jedem NRTI. Jedes Jahr der NRTI-Anwendung erhöhte das Risiko einer Lipoatrophie um das 1,26-fache. Im Gegensatz dazu verdreifachte sich jedes Jahr der Einnahme von PI das Risiko jeder Form von Lipodystrophie. Das Absetzen von NRTIs führte zu einer Verringerung der Blutmilchsäure und der Leberenzyme, Übelkeit und Müdigkeit, aber das verlorene Gewicht wurde nicht wiederhergestellt (über eine durchschnittliche Nachbeobachtungszeit von vier Monaten).

Die französische Studie zeigte auch einen starken Zusammenhang zwischen Lipoatrophie und d4T. Im Jahr 1999 berichteten die gleichen Forscher darüber, was passierte, als 29 Personen mit peripherem Fettabbau von d4T abgesetzt und auf ein anderes Medikament (oder andere Medikamente) umgestellt wurden. Vierzehn, die auch einen PI erhielten, wechselten von d4T zu AZT oder Abacavir (Ziagen). Der Rest ersetzte ihr d4T-haltiges NRTI-Regime durch AZT/3TC/Nevirapin (Viramune). Nach sechs Monaten sanken die Triglyceridspiegel im Blut in beiden Gruppen um etwa 40 %, während das subkutane Fett um 40 % anstieg.

Probleme beim Ranking der NRTIs

Glaxo Wellcome, der Hersteller von AZT, 3TC und Abacavir, weist schnell auf solche Studien hin. Ob d4T besonders schuldhaft an der Lipoatrophie ist, muss jedoch noch endgültig dokumentiert werden. Die meisten Personen, die d4T erhalten, haben zuvor AZT eingenommen und leben länger mit einer HIV-Infektion.

Ebenso sind Laborstudien, die versuchen, die jeweilige mitochondriale Toxizität der verschiedenen NRTIs einzustufen, fragwürdig, da sie möglicherweise nicht widerspiegeln, was in lebenden Zellen im Körper passiert. Dort wird die Toxizität nicht nur durch die chemische Hemmung des DNA-Polymerase-Gamma durch die Medikamente bestimmt, sondern auch durch die Konzentration jeder Verbindung in den Mitochondrien und die Leichtigkeit, mit der sie durch Phosphorylierung (Addition einer Phosphatgruppe) aktiviert wird, bevor die DNA-Polymerase verarbeitet werden kann es.

Der Energiebedarf der Zellen im Körper, für den sie auf ihre Mitochondrien angewiesen sind, ist ein weiterer entscheidender Faktor, um die Hemmung der mitochondrialen Aktivität durch die NRTIs hervorzurufen. Das Geschlecht und die HIV-Infektion selbst sind wichtige Faktoren, die den Stoffwechsel und damit das Energieprofil der Zellen im ganzen Körper beeinflussen.

Jenseits der DNA

NRTIs können neben der Störung der DNA-Replikation auch andere Auswirkungen auf den mitochondrialen Stoffwechsel haben. Während Lodenosin beispielsweise in Labortests eine geringe Wirkung auf die mitochondriale DNA zu haben schien, verursacht es bei Mäusen eine schwere Herztoxizität und beim Menschen eine tödliche Lebertoxizität, die einem mitochondrialen Versagen ähnelt. Dieser NRTI stört tatsächlich die mitochondriale Funktion, wie die erhöhten Milchsäurespiegel und den Tod in Laborzelllinien zeigen, die ihm ausgesetzt waren. Laut Yung-chi Cheng, einem Forscher der Yale University, der die ursprünglichen mitochondrialen Tests von Lodenosin durchgeführt hat, resultiert seine toxische Wirkung wahrscheinlich aus der Hemmung der Milchsäuredehydrogenase, einem Enzym, das Milchsäure in eine Verbindung umwandelt, die die Mitochondrien oxidieren können.

Eine parallele Situation gibt es für AZT, behauptet eine kürzlich von Jean-Pierre Sommadossi, PharmD, und Kollegen von der University of Alabama in einer Labor-Leberzelllinie durchgeführte Studie. Im Gegensatz zu ddC und ddI hemmte AZT in diesem Fall die mitochondriale DNA-Synthese nicht, aber AZT erhöhte die Milchsäureproduktion in Zellkulturen, während andere NRTIs dies nicht taten. Die Forscher fanden heraus, dass die Exposition gegenüber AZT die Aktivität mehrerer der wichtigsten energieproduzierenden Enzyme der Mitochondrien direkt reduziert. Dies wurde als Grund für die widersprüchlichen Ergebnisse angesehen.

Beitragende Toxizitäten

Auf dem Keystone Symposium on New Biological Approaches to HIV-1-Infection im vergangenen Frühjahr zeigte Scott Raidel vom Department of Pathology der Emory University beeindruckende Fotos von Mitochondrien im Herzmuskel von Mäusen, die biotechnologisch ein Gen für das Tat-Protein von HIV, die Mitochondrien, enthalten waren extrem langgestreckt und ihre inneren Strukturen zerstört. Das heißt, dass Mäuse, denen genetische Implantate verabreicht wurden, damit sie höhere Mengen des Tat-Proteins entwickelten, dann einen signifikanten mitochondrialen Schaden aufwiesen. Ihr DNA-Gehalt war etwa 30% niedriger als bei normalen Mäusen.

Wenn NRTIs in den Körper gelangen, treffen sie auf eine Umgebung, die möglicherweise bereits anfällig für die Art von mitochondrialer Schädigung ist, die diese Medikamente fördern. Tat ist ein Protein, das hilft, das HIV-DNA-Genom in den Zellen wieder in RNA umzuwandeln, um es in eine neue Generation von Virionen (komplette Viruspartikel) zu verpacken. Es unterdrückt unter anderem das antioxidative Schutzsystem der Zellen und macht sie empfindlicher gegenüber einer Entzündungsaktivierung durch Zytokine wie den Tumornekrosefaktor (TNF). (Zytokine sind Hormone oder Botenproteine, die die Reaktionen des Immunsystems koordinieren.) Nicht infizierte Zellen in Lymphknoten sind chronisch Tat ausgesetzt und leiden unter oxidativem Stress. Viele sterben mit geschwollenen Folgen.

Ein weithin beworbener Wirkstoff, der eine gewisse Wirkung bei der Bekämpfung der mit bestimmten NRTIs verbundenen Anämie hat, ist Erythropoietin (Procrit), ein Wachstumsfaktor, der die Produktion roter Blutkörperchen stimuliert. Erythropoietin hilft, die durch AZT verursachte Anämie umzukehren, hat jedoch keine Wirkung auf andere Ursachen von Müdigkeit, einschließlich Muskelschwäche oder hoher Milchsäurespiegel im Zusammenhang mit mitochondrialer Dysfunktion. Personen, die Erythropoietin einnehmen, müssen weiterhin auf solche Wirkungen überwacht werden, und in einigen Fällen muss das betreffende Medikament immer noch abgesetzt oder geändert werden.

Umkehr oder Vorbeugung von mitochondrialen Toxizitäten

Es gibt einige potenzielle, aber wenig erforschte Möglichkeiten, mitochondrialen Toxizitäten entgegenzuwirken. Die beteiligten Wirkstoffe sind natürliche Cofaktoren für die mitochondriale Energieproduktion, und ihre Bereitstellung könnte die Effizienz dieses Prozesses erhöhen. In drei Einzelfällen wurde beispielsweise eine schwere Laktatazidose mit großen Mengen an Riboflavin (Vitamin B .) behandelt2), ein Mikronährstoff, der bei Menschen mit HIV häufig mangelhaft ist. Andere vorgeschlagene Behandlungen in dieser Richtung waren Coenzym Q10 (ein Antioxidans) und die Vitamine B1 (Thiamin), B12, und K.

Ein weiteres Mittel, das die mitochondriale Toxizität reduzieren könnte, ist der Ersatz von L-Acetylcarnitin, das selbst durch die mitochondriale Toxizität reduziert wird. L-Carnitin ist ein Produkt des Proteinabbaus, das verwendet wird, um Fettbestandteile zur Oxidation in die Mitochondrien zu transportieren. L-Acetyl-Carnitin, eine Variante von L-Carnitin, teilt diese Funktion und hilft auch geschädigten Nervenzellen, sich zu regenerieren. Eine Vier-Personen-Studie hat nun gezeigt, dass L-Acetyl-Carnitin das Nervenwachstum fördert und die Symptome bei Menschen mit arzneimittelbedingter Neuropathie reduziert. (Beachten Sie, dass L-Acetyl-Carnitin nicht das L-Carnitin ist, das in Reformhäusern verkauft wird.)

Eine frühere italienische Studie unter der Leitung von Andrea Cossarizza von der Universität Modena über T-Zellen, die Menschen mit einer primären (frühen) HIV-Infektion entnommen wurden, fand elektrische Ladungsänderungen in mitochondrialen Membranen und stellte eine starke Tendenz dieser Zellen zum spontanen Zelltod fest. Im Reagenzglas konnten L-Acetylcarnitin sowie N-Acetylcystein und Nicotinamid (Niacin, ein B-Vitamin) die Zellen retten, was mit den HIV- und TNF-Werten im Blut der Probanden korrelierte. Diese Assoziation mit TNF deutet darauf hin, dass die Zellrettung einen Prozess beinhaltet, der oxidativen Stress umkehrt.

Eine spanische Studie unter der Leitung von José Garcia de la Asunción und Kollegen von der Universität Valencia hat eine ähnliche Strategie mit hohen Dosen der antioxidativen Vitamine C (1 g pro Tag) und E (0,6 g pro Tag) ausprobiert. Chemische Marker für Muskelschäden und oxidativen Stress nahmen bei acht HIV-positiven Personen, die AZT plus Vitamine erhielten, im Vergleich zu einer Kontrollgruppe, die nur AZT erhielt, ab. Das gleiche galt für eine Gruppe von Studienmäusen. Die Untersuchung der Mitochondrien in den Muskelzellen der Mäuse zeigte ferner, dass die Mäuse, die AZT plus die Vitamine erhielten, normal organisierte Mitochondrien behielten, während die Mäuse, die nur AZT erhielten, geschwollene, zerstörte Mitochondrien aufwiesen.

Das große Bild

Mitochondrien spielen eine wichtige Rolle im Stoffwechsel des Körpers. Der Schutz der Mitochondrien ist für die Erhaltung des Lebens unerlässlich. Obwohl eine Fülle von Forschungsergebnissen darauf hindeutet, dass bestimmte NRTIs spezifische Mitochondrien ernsthaft stören, müssen die genaue Bedeutung und Art dieser Toxizität weiter aufgeklärt werden. Die Entwicklung ungiftiger Behandlungen zur Unterstützung der Energieproduktion und sichererer NRTIs ist von entscheidender Bedeutung. Diese Forschung befindet sich jedoch noch in einem rudimentären Stadium und es fehlt an erheblicher Unterstützung durch die Industrie oder die Regierung. Schlimmer noch, die kommerziellen Auswirkungen der mitochondrialen Toxizität der gegenwärtigen NRTIs drohen den objektiven wissenschaftlichen Prozess zu stören.

Dennoch sollte beachtet werden, dass die mitochondriale Toxizität zumindest teilweise aus der Verwendung antiretroviraler Medikamente resultiert – und die Verwendung der meisten, wenn nicht aller Medikamente, nicht nur Anti-HIV-Medikamente, birgt Risiken und Vorteile. Einfach ausgedrückt, wenn die Risiken den Nutzen überwiegen, wird das fragliche Medikament nicht verwendet, wenn der Nutzen die Risiken überwiegt, wird das Medikament verwendet. Während weitere Forschungen und Daten das Nutzen-Risiko-Verhältnis verändern können, überwiegen die Vorteile für die überwiegende Mehrheit der Menschen mit HIV, deren Leben durch die Anwendung einer antiretroviralen Therapie verbessert und verlängert wurde, immer noch bei weitem die Risiken.

Dave Gilden ist Direktor für Behandlungsinformationsdienste bei amfAR.

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  • Nukleosid- und Nukleotidinhibitoren sind kompetitive Substratinhibitoren, die die Struktur eines normalen Nukleotids nachahmen, denen jedoch die 3&prime-Hydroxylgruppe fehlt, die für die Addition des nächsten Nukleotids zur DNA-Verlängerung benötigt wird.
  • Nicht-Nukleotid-Inhibitoren binden an eine andere Stelle als die aktive und verursachen Umlagerungen der Proteindomänen, die für die DNA-Polymerisation benötigt werden.
  • Mutationen im Reverse-Transkriptase-Gen können Resistenzen gegen beide Arten von Medikamenten verursachen.
  • kompetitive Substratinhibitoren: Moleküle, die an das aktive Zentrum eines Enzyms binden und die Bindung des echten Substrats daran verhindern.
  • nicht kompetitive Inhibitoren: Moleküle, die an andere Stellen als das aktive Zentrum eines Enzyms binden und dennoch seine Funktion indirekt hemmen können.
  • Nukleotid: das Monomer, das DNA- oder RNA-Biopolymermoleküle umfasst, bestehend aus einer stickstoffhaltigen heterocyclischen Base, einem Pentosezucker mit fünf Kohlenstoffatomen und einer Phosphatgruppe

Reverse Transkriptase ist ein Enzym, das die Fähigkeit besitzt, einzelsträngige DNA von einer einzelsträngigen RNA-Kette zu transkribieren. Dies ist die Umkehrung des üblichen Informationsflusses, wenn RNA aus DNA synthetisiert wird. Viren, die mithilfe von reverser Transkriptase ihr genetisches Material (RNA) in DNA umwandeln, werden Retroviren genannt. Einer der prominentesten Vertreter eines Retrovirus ist HIV. Aufgrund der hohen Prävalenz von HIV/AIDS in der Welt ist es wichtig, Medikamente zu haben, die die Infektion verhindern oder heilen. Dieses Enzym kommt auch in Tumoren und Krebszellen vor.

Abbildung: Schätzung der Erwachsenen mit HIV/AIDS nach Ländern: Die Daten zeigen die Menschen zwischen 18 und 49 Jahren nach Ländern, die von HIV/AIDS betroffen sind. Die Informationen werden von UNAIDS bereitgestellt, basierend auf einem Bericht vom Juli 2008

Medikamente, die die Funktion dieses Enzyms hemmen, werden in drei Gruppen eingeteilt:

  • Nukleosidanaloge Reverse-Transkriptase-Inhibitoren
  • Nukleotidanaloge Reverse-Transkriptase-Inhibitoren
  • nicht-nukleosidische Reverse-Transkriptase-Inhibitoren

Die ersten beiden Inhibitoren wirken nach dem gleichen Prinzip. Sie ahmen Nukleoside bzw. Nukleotide nach, es fehlt ihnen jedoch eine freie Hydroxylgruppe am 3&prim;-Ende. Der Hauptunterschied zwischen ihnen besteht darin, dass die Nukleoside durch zelluläre Kinasen phosphoryliert werden müssen. Das Enzym Reverse Transkriptase erkennt sie als reguläre Nukleotide und fügt sie in die neu synthetisierte DNA-Kette ein. Aber einmal eingefügt, stoppt die Elongation an ihnen, weil aufgrund des Fehlens der 3&prime-Hydroxylgruppe und der Unfähigkeit zur Bildung einer 5&prime-3&prime-Phosphodiesterbindung keine weiteren Nukleotide hinzugefügt werden können. Dieser Vorgang wird als Kettenabbruch bezeichnet. Nukleosid- und Nukleotidinhibitoren werden auch als kompetitive Substratinhibitoren bezeichnet. Beispiele für solche Medikamente sind Zidovudin (AZT) und Lamivudin. AZT war das erste von der FDA zugelassene Medikament zur Behandlung von HIV. Lamivudin wird sowohl zur Behandlung von HIV als auch von Hepatitis B verwendet. Da einige Viren wie Hepatitis B RNA-abhängige DNA-Polymerasen tragen, können auch Reverse-Transkriptase-Inhibitoren zur Behandlung dieser Infektionen eingesetzt werden.

Nicht-Nukleotid-Reverse-Transkriptase-Inhibitoren binden an eine andere Stelle, nicht an die aktive, des Reverse-Transkriptase-Enzyms. Dies führt zu Konformationsänderungen, die die Position der DNA-Bindungsstellen im Enzym verzerren und die DNA-Polymerisation zum Stillstand bringen. Nicht-Nukleotid-Inhibitoren sind nicht-kompetitive Inhibitoren der reversen Transkriptase. Solche Medikamente sind Efavirenz und Nevirapin.

Resistenzen treten gegen alle Wirkstoffgruppen auf. Es gibt zwei Mechanismen für die Resistenz gegen die Nukleosid-(Nukleotid-)Inhibitoren. Der erste ist auf Mutationen in der N-terminalen Polymerasedomäne der Reversen Transkriptase zurückzuführen, die es weniger wahrscheinlich macht, dass die Analoga eingebaut werden. Der zweite Mechanismus wird durch Mutationen in der Transkriptase verursacht, die die Entfernung des eingebauten Inhibitors und damit den Neustart der DNA-Replikation ermöglichen.

Die Resistenz gegen die Nicht-Nukleotid-Inhibitoren wird durch Mutationen in der Inhibitor-Bindungsstelle des Enzyms verursacht. Solche Mutationen verhindern die Bindung des Inhibitors an das Enzym.


Diskussion

Frühere Studien an knospenden Hefen zeigten, dass der Einbau von BrdU das Wachstum von Hefezellen nicht stört (Lengronne et al. 2001), obwohl bestimmte Mutanten während der Replikation empfindlicher gegenüber BrdU sein können (Hodgson et al. 2007). Wir schlagen vor, dass BrdU, EdU und Thymidin alle dNTP-Pools verzerren hsv-tk + hENT + Spalthefe. Das zeigen unsere Daten S. cerevisiae und S. pombe unterscheiden sich in ihrer Reaktion auf Nukleotidanaloga und auf ein dNTP-Ungleichgewicht. Dies stimmt mit einem 10-fachen Unterschied in den HU-Sensitivitäten zwischen den Hefen überein. HU wirkt auch durch Abreicherung von dNTPs.

Studien an Metazoen ergaben, dass die BrdU-Behandlung RNR hemmt und einen �TP-less”-Zustand verursacht (Meuth und Green 1974b) (Abbildung 7G, Teil 1). Die BrdU-induzierte Mutagenese wird auf niedrige dCTP-Spiegel zurückgeführt (Hopkins und Goodman 1980, Meuth 1989), die durch Kokultur mit exogenem Cytidin unterdrückt werden (Meuth und Green 1974b, Davidson und Kaufman 1978). Thymidin-Arrest in Säugerzellen (Harper 2005) wird auch durch verringerte dCTP-Spiegel verursacht, die wiederhergestellt werden, sobald überschüssiges Thymidin aus dem Medium entfernt wird (Meuth 1989 Kunz und Kohalmi 1991). Im Gegensatz zu BrdU ist Thymidin über kurze Zeiträume minimal toxisch (Lockshin et al. 1985), obwohl hohe Dosen (Ϣ mM) Mutationen (Phear und Meuth 1989), Polyploidie und Chromosomenaberrationen (Potter 1971) induzieren. Interessanterweise sind niedrigere BrdU-Konzentrationen (z.B., 32,6 µM) verzerren dNTP-Pools ähnlich wie viel höhere Thymidin-Dosen (2 mM) (Meuth und Green 1974a Meuth .) et al. 1976).

Wir gehen davon aus, dass die Exposition gegenüber exogenen Nukleosiden zu einem Ungleichgewicht des dNTP-Pools führt S. pombe. Während der Thymidin-Inkubation hsv-tk + hENT + Zellen arretieren mit 1C-DNA-Gehalt und geben innerhalb von 45 min in die S-Phase frei. Frühere Arbeiten von Mitchison und Creanor (1971) stellten fest, dass Thymidin keine Wirkung auf S. pombe, im Einklang mit dem Fehlen eines Thymidin-Salvage-Wegs in Wildtyp-Zellen. Unsere Einbaustämme haben jedoch einen rekonstituierten Thymidin-Salvage-Weg und sind in der Lage, exogenes Thymidin, BrdU oder EdU in Nukleotide umzuwandeln.

Mitchison und Creanor (1971) zeigten auch, dass eine Behandlung mit Desoxyadenosin eine kurzfristige G . induziert1 Arrest in Wildtypzellen (Mitchison und Creanor 1971). Dies stimmt mit unseren Daten überein und legt nahe, dass dNTP-Pools durch exogene Nukleoside in verzerrt werden S. pombe wenn sie in brauchbare Nukleotide umgewandelt werden, um ein transientes G . zu erzeugen1 Festnahme. Wir schlagen vor, dass Br- und Ethinyl-dUTP (BrdU bzw. EdU) oder Thymidin in a hsv-tk + Stamm, einen offensichtlichen Anstieg von dTTP verursachen. Überschüssiges Thymidin oder Analogon kann auch RNR hemmen, wie in menschlichen Zellen (Meuth und Green 1974a, b), wodurch der dCTP-Pool erschöpft wird ( 7G , Teile 1 und 2). Wenn dies der Fall ist, wird die gleichzeitige Behandlung mit BrdU und Cytidin die Toxizität und Mutagenese wie bei Metazoen unterdrücken (Davidson und Kaufman 1978 Popescu 1999).

Zukünftige Arbeiten werden bestimmen, wie dNTP-Pools mit diesen Nukleosiden verändert werden, aber wir sagen voraus, dass Thymidin, BrdU und EdU alle einen dCTP-losen Zustand wie in menschlichen Zellen verursachen. Interessanterweise ist die dCMP-Deaminase-Mutante der Spalthefe (dcd1Δ) hat einen gegenteiligen Effekt: Die Konzentrationen von CTP-Pools werden hoch, während die von dTTP niedrig sind. Die Auswirkungen auf die Zellfitness sind denen ähnlich, die wir beobachtet haben. Passend zu unserem Modell, dcd1Δ Zellen exprimieren hsv-tk + erhöhen dTTP-Pools, lindern Wachstumsdefekte und dcd1Δ Empfindlichkeiten gegenüber UV, HU und Bleomycin (Sanchez et al. 2012).

Eine zweite Beobachtung unterstützt das Ungleichgewicht des dNTP-Pools als Ursache für beobachtete Phänotypen in S. pombe hsv-tk + hENT + Zellen: Während BrdU 㸲.6 µM die BrdU-Substitution in der DNA nicht erhöht, nimmt die Lebensfähigkeit der Zellen oberhalb dieser Dosis deutlich ab. Wir beobachten keine Hinweise auf eine zusätzliche BrdU-Substitution, was weitere T^C-Punktmutationen als Quelle der Hochdosis-Sensitivität ausschließt. Stattdessen schlagen wir vor, dass diese Dosissensitivität erhöhte Veränderungen in zellulären dNTP-Pools widerspiegelt, möglicherweise über eine negative allosterische Hemmung von RNR durch Analoga/Thymidin (Meuth und Green 1974b). Um diese Hypothese zu bestätigen, sind Messungen der zellulären dNTPs und der RNR-Aktivität während BrdU und EdU erforderlich.

Veränderungen der dNTP-Pools verursachen Punktmutationen bei Metazoen (Meuth 1989, Phear und Meuth 1989), indem das überschüssige Nukleotid während der Replikation ersetzt wird (Phear und Meuth 1989). Wir stellen fest, dass die BrdU-Behandlung zunimmt can1 Vorwärtsmutationen im Wildtyp, spd1Δ, und cds1Δ hsv-tk + hENT + Zellen. Die Mutageneserate ändert sich jedoch nicht signifikant in chk1Δ, während rad3Δ und mrc1Δ erfahren weniger Mutation. Wir schlagen vor, dass der Replikations-Checkpoint BrdU-abhängige Mutationen nicht aktiv verhindert, während ein aktiver G2/M Prüfpunkt (chk1 + ) fördert die Mutagenese. Dies kann das erhöhte Überleben von Checkpoint-intakten Zellen oder Checkpoint-Effekte auf Spd1 und den Nukleotidstoffwechsel widerspiegeln (siehe unten). Wir nehmen an, dass can1 − Mutationen sind A•T ^G𠈬-Übergänge, die durch Br-dUTP-Substitution für das erniedrigte dCTP-Analogon verursacht werden, oder G𠈬 ^A•T-Übergänge durch verstärkte Br-dUTP-Paarung mit Guanin in der Template-DNA (Hopkins und Goodman 1980 Lasken und Goodman 1984 Guter Mann et al. 1985) (Abbildung 7G, Teil 3). Dies bestätigt unsere RFLP-Analyse von can1 Mutanten, die keine groben strukturellen Veränderungen zeigten.

Der dNTP-Stoffwechsel der Spalthefe wird durch RNR gesteuert, das durch Spd1 (Holmberg .) gehemmt wird et al. 2005 Hakansson et al. 2006 Nestoras et al. 2010). Spd1 wird bei Stress ubiquitiniert, so dass der dNTP-Pool erweitert wird, der den Nukleotidstoffwechsel an den Zellzyklus und DDR (Moss et al. 2010 Nestoras et al. 2010). Wir haben das gefunden spd1Δ Zellen sind weniger empfindlich gegenüber chronischer Nukleosid-Exposition, aber ihre relative Lebensfähigkeit bei akuter BrdU ist schlechter. Faszinierend, spd1Δ Zellen zeigten einen 10-fachen Anstieg der Mutationen von can1 + oder hsv-tk + und häufige Sektorierung, was darauf hinweist, dass spd1Δ Zellen sind instabil und anfällig für Mutationen. Vorherige Arbeit zeigte spd1Δ unterdrückt Mutation in ddb1Δ Zellen, die nicht in der Lage sind, RNR zu aktivieren (Holmberg et al. 2005). Das zeigen wir jedoch spd1Δ Zellen sind intrinsische Mutatoren, ein Effekt, der sich nach der Behandlung mit BrdU verschlechtert.

Erhöhte basale dNTP-Pools in spd1Δ (Holmberg) et al. 2005) konnte diese Mutagenese fördern, indem sie die Replikation während der exogenen Thymidin/dUTP-Behandlung erleichtert und einen zusätzlichen Br-dUTP-Einbau gegenüber G ermöglicht (Lasken und Goodman 1984 1985). Alternativ können vorübergehende Änderungen in einem dNTP während spd1Δ Replikation führt möglicherweise nicht zur Verhaftung. Unsere Daten stimmen mit Modellen überein, die die dNTP-Regulierung mit der Genomstabilität in verbinden S. pombe (Holmberg et al. 2005 Moos et al. 2010 Nestoras et al. 2010). Während chk1Δ hsv-tk + hENT + Zellen zeigen keine erhöhte Mutation nach BrdU, wir vermuten, dass a spd1Δ chk1Δ Doppelmutanten können aufgrund von zusätzlichem Schaden und größeren dNTP-Pools eine sehr hohe Mutationsrate aufweisen.

Rad3 wird benötigt, um BrdU zu überleben, wie in Hua und Kearsey (2011) berichtet. Wir zeigen, dass dies durch die Chk1 G . geschieht2-DDR-Pfad stromabwärts von Rad3, was zu Cdc2-Phosphorylierung und Rad52-Fokusbildung führt. BrdU erhöht auch Phospho-Histon H2A, ein Signal von DSBs und/oder Replikationsgabel-Stress (z.B., Bailis et al. 2008 Rozenzhak et al. 2010). Unser Modell legt nahe, dass halogeniertes dUTP DNA-Schäden verursacht (Abbildung 7G, Teil 4), möglicherweise durch Entfernung substituierter Basen durch Basenexzisionsreparatur (BER) (Krych et al. 1979 Szyszko et al. 1983 Morgan et al. 2007). BER unter dNTP-Depletion könnte zusätzlich Einzelstrang-DNA-Brüche (SSBs) verursachen, die Replikationsgabeln blockieren und/oder während der S-Phase in DSBs umwandeln. Dies würde die Zellakkumulation in der S-Phase fördern und eine bescheidene Voraussetzung für den Cds1-Weg darstellen.

Alternativ hat Topoisomerase I RNaseH-Aktivität auf einer doppelsträngigen DNA-Matrize mit nur einer dUTP-Substitution (Sekiguchi und Shuman 1997) und könnte zur SSB- und DSB-Akkumulation beitragen. Während BrdU-induzierte DNA-Schäden in menschlichen Zellen dokumentiert sind, ist die Ursache nicht bekannt (Dillehay et al. 1984 Ackland et al. 1988). Die Rolle der Reparatur nach der Replikation beim Überleben von BrdU kann sich als wesentlich erweisen.

Wie bei Säugetieren beobachten wir, dass nach BrdU-Substitution ein zweiter DNA-schädigender Wirkstoff gefährlicher ist. Empfindlichkeit von chk1Δ Zellen zu anderen Medikamenten nach dem Einbau von BrdU legt nahe, dass die BrdU-Substitution die DNA-Schädigung “load” in behandelten Zellen erhöht. In Säugerzellen verursacht UV-Exposition nach BrdU-Substitution DSBs und Querverbindungen zwischen den Strängen (Murray und Martin 1989 Cecchini et al. 2005) und erhöhte Empfindlichkeit gegenüber Bleomycin (Ackland et al. 1988) und Cisplatin (Russo et al. 1986). Angehende Hefe ist auch nach BrdU-Exposition UV-empfindlich (Sclafani und Fangman 1986). Ein Teil dieser Empfindlichkeit kann auf eine Verlangsamung der S-Phase bei BrdU zurückzuführen sein, eine anfälligere Zeit für DNA-Schäden. Wir zeigen eine erhöhte Sensibilität in cds1Δ-Stämme, was darauf hindeutet, dass die Stabilität der Replikationsgabel verringert ist, möglicherweise aufgrund einer unvollkommenen BrdU-Basenpaarung (Lasken und Goodman 1985). Wir glauben, dass rad3Δ Reaktion auf CPT, UV, MMS oder HU ist bei der BrdU-Vorbehandlung unverändert, wahrscheinlich aufgrund eines katastrophalen Versagens von rad3Δ in diesen Medikamenten.

Unsere Ergebnisse weisen auf Herausforderungen bei der Verwendung von Nukleosidanaloga zur Analyse der DNA-Replikation hin. Obwohl wir die beiden Analoga nicht direkt vergleichen, zeigen unsere Ergebnisse, dass Spalthefe gegenüber den Nukleosid-Analoga BrdU und EdU extrem empfindlich ist, wenn sie mit ähnlichen Dosierungen wie in menschlichen Zellen behandelt werden. In Übereinstimmung mit Replikationsstabilitätsproblemen können die erhöhte Toxizität von EdU und Zellzykluseffekte bei niedrigeren Dosen eine größere Ethinyl-Seitengruppe und somit eine größere sterische Interferenz während der Replikation widerspiegeln. Die mit der BrdU- und EdU-Exposition verbundenen Langzeitwirkungen bedeuten, dass diese Analoga für die Analyse in einem einzelnen Zellzyklus am nützlichsten sind. Darüber hinaus kann Thymidin ein potenzieller reversibler Blocker bei sein S. pombe, jedoch müssen ihre Auswirkungen genauer beschrieben werden. In allen Fällen muss angemessene Sorgfalt aufgewendet werden, um analoge Effekte abzuschwächen, damit keine Unterbrechung der Nukleotidspiegel den zu untersuchenden Prozess selbst stört.


Vorbei am Korrekturleser

In den frühen 2000er Jahren, als Experten glaubten, dass eine menschliche Coronavirus-Infektion nichts Schlimmeres als eine Erkältung verursacht, kämpfte Mark Denison darum, angemessene Bundeszuschüsse zu erhalten, um sein Labor am Vanderbilt University Medical Center zu unterstützen.

Denison, Virologe und Kliniker, untersuchte seit 1984 Coronaviren, als nur zwei der sieben Coronaviren bekannt waren, von denen derzeit bekannt ist, dass sie beim Menschen Krankheiten verursachen. Diese beiden verursachen zusammen mit mehreren anderen Coronaviren Erkältungen.

Denison fand zunächst das von ihm untersuchte Virus, das nur Mäuse befällt, interessant, da es zu einer Maus-Version von Multipler Sklerose führt. Unterwegs interessierte er sich dafür, wie sich das Virus replizierte, aber es war eine echte Herausforderung, Geldgeber davon zu überzeugen, seine Arbeit zu unterstützen.

Anfang 2003 waren er und seine Frau Laura im Urlaub in Florida und führten ein schwieriges Gespräch. &bdquoIch finde die Arbeit wichtig. Ich denke, die Modelle sind wichtig&rdquo, erinnerte er sich. &bdquo(Aber) ich weiß nicht, ob ich eine Karriere aufrechterhalten kann&rdquo

An diesem Tag erfuhr er von dem Erreger der tödlichen Atemwegserkrankung SARS, die Schlagzeilen gemacht hatte.

&bdquoIch&rsquom buchstäblich mit meiner Frau am Strand, und jemand kam aus dem Hotel und sagte mir, dass ich einen Anruf hätte&rdquo, sagte er. Der Anruf kam von einem Kollegen, der die Nachricht teilte, dass der für die Krankheit verantwortliche Erreger identifiziert worden sei und es sich um ein Coronavirus handele.

In den Jahren 2002 und 2003 breitete sich das schwere akute Atemwegssyndrom aus Südchina in 26 Ländern aus und tötete etwa 10 % der etwa 8.000 infizierten Menschen. Obwohl der Ausbruch eingedämmt wurde, wurden Coronaviren plötzlich als ernstes Problem von potenziell pandemischem Ausmaß erkannt.

Fast zwei Jahrzehnte später hat sich die Arbeit im Labor von Denison als entscheidend für die Entwicklung eines Moleküls namens Remdesivir erwiesen, das nur wenige Wochen nach SARS-CoV-2 in groß angelegte klinische Studien aufgenommen wurde, das Coronavirus, das COVID-19 verursacht, identifiziert wurde.

Das Molekül, so scheint es, kann die Superkraft von Coronaviren überwinden: ihre Fähigkeit, das Genom zu korrigieren. Diese Fähigkeit ist bei anderen RNA-Viren nicht zu finden und macht Coronaviren resistent gegen die meisten Medikamente, die gegen andere RNA-Viren eingesetzt werden.

Forscher erwarten, in den nächsten Wochen zu erfahren, ob Remdesivir eine wirksame Behandlung für Patienten mit COVID-19 ist. In der Zwischenzeit hat das Labor von Denison weiter daran gearbeitet, andere Moleküle zu identifizieren, die die Virusresistenz umgehen könnten.

&bdquoDies ist eine wirklich wichtige Frage für uns: Ist dies eine neue Medikamentenklasse, die es uns ermöglicht, mehr Medikamente besser zu entwickeln, die die Korrekturlesefunktion umgehen und das Virus hemmen können?&rdquo, sagte Denison, der jetzt die Abteilung für pädiatrische Infektionskrankheiten bei Vanderbilt leitet .

Nicht Ihre durchschnittlichen RNA-Viren

Wie viele Viren, die menschliche Krankheiten verursachen, haben Coronaviren ein Genom, das aus RNA besteht.

Als das Virus hinter SARS identifiziert wurde, war eine der vielen experimentellen Behandlungen, die Kliniker versuchten, ein Molekül namens Ribavirin. Zu dieser Zeit war Ribavirin das Medikament der ersten Wahl für viele RNA-Viren.

Ribavirin zielt auf ein virales Protein namens RNA-abhängige RNA-Polymerase oder RdRp ab, das für die Replikation des Coronavirus-Genoms verantwortlich ist.

Craig Cameron ist Virologe an der University of North Carolina in Chapel Hill, der die molekularen Mechanismen von RdRP in Picornaviren untersucht. &ldquo(RdRp) ist ein sehr gut validiertes Wirkstoffziel&rdquo, sagte Cameron. &bdquoUnd es ist eines dieser Ziele, die tatsächlich das Potenzial haben, eine panvirale antivirale Aktivität zu haben.&rdquo

Ribavirin gehört zu einer Klasse von antiviralen Arzneimitteln, die als Nukleotid- oder Nukleosidanaloga bezeichnet werden.

Die genaue Wirkungsweise von Ribavirin scheint von Virus zu Virus zu variieren, was die vielen möglichen Wirkungsweisen von Nukleotidanaloga gut veranschaulicht. Einige funktionieren, indem sie die virale Polymerase blockieren und einen wachsenden RNA-Strang beenden. Einige sind Mutagene, die in das wachsende virale Genom schlüpfen und die Polymerase weiterlaufen lassen, aber einige molekulare Mehrdeutigkeiten in die nächste Replikationsrunde einbringen, die in späteren Generationen eine Kaskade von Fehlern verursachen. Einige blockieren Stoffwechselenzyme, verhindern die Synthese oder Verarbeitung echter Ribonukleotide und verlangsamen dadurch die Replikation.

Eine systematische Überprüfung der Daten aus 30 klinischen Studien, die nach der SARS-Epidemie durchgeführt wurde, zeigte keinen schlüssigen Nutzen von Ribavirin &ndash oder einer anderen getesteten Behandlung &ndash und einige Hinweise darauf, dass Ribavirin Patienten Schaden zugefügt hatte.

Ribavirin war das erste Beispiel. Seitdem waren die meisten Nukleotidanaloga, die gegen Coronaviren getestet wurden, die SARS und das Atemwegssyndrom im Nahen Osten oder MERS verursachen, keine wirksamen Behandlungen. In Bezug auf Ribavirin und das klassische Nukleosid-Analogon 5-Fluorouracil, das als Mutagen wirkt, sagte Denison: „Coronaviren sind gegen diese Medikamente vollständig resistent. Sie können sie darin einweichen, und sie haben keine Wirkung.&rdquo

Kräftiges virales Korrekturlesen

Bruno Canard ist leitender Forscher einer Virusreplikationsgruppe am französischen Nationalen Zentrum für wissenschaftliche Forschung. Vor dem SARS-Ausbruch hatte sich Canard auf die Struktur- und Aktivitätsbeziehungen von Nukleotidanaloga konzentriert, die zur Behandlung von HIV und anderen Viren verwendet werden. Wie viele Virologen wurde er durch das Beinahe-Misserfolg von SARS dazu inspiriert, neue Forschungsprogramme zu starten.

&bdquoWir waren überrascht, dass Ribavirin ziemlich giftig und (gegen) Coronaviren nicht sehr wirksam ist“ sagte Canard.

Sowohl das CNRS-Team in Marseille als auch die Denison-Gruppe in Tennessee wollten mehr über das Virus erfahren, das SARS verursacht hat, und eine ihrer Hauptfragen war, warum Ribavirin, das gegen andere RNA-Viren weitgehend wirksam ist, gegen dieses versagt hatte.

Die Antwort lag im großen Genom der Virusfamilie und wie es sich entwickelt hat, um sich selbst zu schützen.

&bdquoDer Grund, warum (RNA-Viren) so erfolgreich sind, liegt darin, dass ihre Polymerasen Fehler machen&ldquo, sagte Denison. &ldquoIhnen fehlt die Fähigkeit, Fehler zu korrigieren, daher erzeugen sie mutierte Virenschwärme, die bereit sind, sich an verschiedene Umgebungen anzupassen.&ldquo

Strukturbiologen beschreiben RNA-abhängige RNA-Polymerasen als eine hohle Hand, bei der Finger und Daumen das aktive Zentrum des Enzyms schützen. Wenn jede neue Nukleobase im Matrizenstrang in das aktive Zentrum eintritt, koordiniert die Polymerase ein neu ankommendes Ribonukleotid, indem sie es mit seinem Gegenstück im bestehenden Strang abgleicht. Stimmt der Fit, katalysiert das Enzym eine Bindungsbildung im RNA-Rückgrat. Wenn die Passung eng genug ist, katalysieren viele virale RNA-Polymerasen ohnehin eine Bindung. Eine Fehlerrate, die bis zu einem Fehler pro 10.000 Basen betragen kann, lässt diese Mutantenschwärme entstehen. Bei Coronaviren ist die Replikationsfehlerrate jedoch geringer.

Coronaviren haben einige der längsten Genome in der RNA-Viruswelt. Während ihre engsten Verwandten Genome von durchschnittlich 10 Kilobasen haben, sind die Genome von Coronaviren dreimal so lang. Bei so viel zu kopierendem genetischem Material würden Coronaviren, wenn sie mit der gleichen Rate wie andere RNA-Viren mutierten, so viele Mutationen anhäufen, dass sie kaum lebensfähige Nachkommen hervorbringen würden.

Als Forscher auf diesem Gebiet das Coronavirus RdRp besser verstanden, stellten sie fest, dass die Polymerase allein die Trennung nicht erklären konnte. Der Virologe François Ferron, ein wissenschaftlicher Mitarbeiter am CNRS, arbeitet seit dem SARS-Ausbruch an der Replikation des Coronavirus. &bdquoDie virale RNA-Polymerase ist ziemlich locker, was bedeutet, dass sie dazu neigt, viele Fehler zu machen&rdquo, sagte er. &ldquoVielleicht ein bisschen mehr als die normale (zelluläre) RNA-Polymerase.&rdquo

Dies führte dazu, dass Forscher vermuten, dass Coronaviren eine Möglichkeit haben könnten, Fehler zu erkennen und zu korrigieren.

Ein internationales Team, das eine Studie des viralen Genoms von SARS durchführte, identifizierte eine Reihe potenzieller RNA-verarbeitender Enzyme basierend auf ihrer Homologie zu anderen bekannten Enzymen. Im Jahr 2006 arbeitete die Gruppe von Canard mit Mitgliedern dieses internationalen Bioinformatikteams zusammen, um zu zeigen, dass eines dieser Enzyme wie seine Homologen doppelsträngige RNA spalten kann und für eine erfolgreiche Virusreplikation erforderlich ist.

&bdquoEs gab Spekulationen, dass (Coronaviren) eine Korrekturlesefunktion codieren könnten, die es ihnen ermöglichen würde, ein großes Genom zu stabilisieren, und es gab eine vorhergesagte Stelle im Genom, an der dies passieren könnte&ldquo erklärte Denison. &ldquoDas hat uns wirklich dazu gebracht, die genetischen Experimente auszuprobieren.&rdquo

Im Jahr 2007 fand seine Gruppe heraus, dass Coronaviren eines Mausmodellvirus in Viren, denen das an derselben Stelle kodierte Protein, ein Protein namens nsp14, fehlt, Mutationen mit einer ähnlichen Rate wie bei anderen RNA-Viren anhäuften. Und sie fanden heraus, dass Virenstämme ohne nsp14 empfindlich auf Ribavirin reagierten.

Im Anschluss an diese Arbeit untersuchte die französische Gruppe, wie nsp14 in einem Reagenzglas funktioniert. &bdquoWir haben an dem Virus gearbeitet, wie Mark Denison es wunderbar gemacht hat&rdquo, sagte Canard. &bdquoWir haben uns nur auf das Enzym &hellip konzentriert und herausgefunden, dass es tatsächlich Ribavirin ausschneiden kann.&rdquo

Das CNRS-Team veröffentlichte 2018 eine enzymologische Studie, die bestätigte, dass nsp14 Fehlpaarungen zwischen Basen am Ende einer wachsenden Kopie viraler RNA identifizieren und beseitigen kann es aus dem ins Stocken geratenen Strang, so dass die Replikation wieder aufgenommen werden kann.

Als die Forscher die Enzymologie ausarbeiteten, stellte sich eine drängende Frage: Bedeuteten ihre Ergebnisse, dass alle Nukleotidanaloga gegen Coronaviren nutzlos wären?

&bdquoDiese Frage ist gerade jetzt der Schlüssel zur Entwicklung von nukleosidanalogen Inhibitoren&ldquo, sagte Canard.

Anatomie eines Moleküls: Was macht Remdesivir einzigartig?

Umgehung des viralen Korrekturlesens

Hier kommt Remdesivir ins Spiel.

&bdquoAus meiner Sicht begann die (Remdesivir-)Geschichte im Jahr 2013&rdquo, sagte Denison. &bdquoWir hatten entdeckt, dass Coronaviren das einzige bekannte RNA-Korrekturlesesystem codieren &hellip (und) ich wollte testen, ob es irgendwelche Nukleoside gibt, die beim Korrektorat-Korrekturlesen aktiv sein könnten.&rdquo

Denison hörte von Cameron über eine Forschungszusammenarbeit mit Gilead Sciences. Cameron arbeitete daran, den genauen Wirkmechanismus einer Gruppe von Nukleotidanaloga zu verstehen, die das Unternehmen zur Behandlung von Hepatitis C einsetzt, einem RNA-Virus, das jedes Jahr Zehntausende von Menschen infiziert.

Vor dem Wettlauf um Hepatitis C, so Adrian Ray, ein Medizinchemiker, der früher bei Gilead arbeitete, &bdquo.Der Nuk-Raum für RNA-Polymerasen und für RNA-Viren wurde wirklich nicht intensiv erforscht.&rdquo

Um die Konkurrenten auf dem lukrativen Hepatitis-C-Markt zu schlagen, hatte Gilead eine große Bibliothek von RNA-abhängigen RNA-Polymerase-Inhibitoren entwickelt, einschließlich des Moleküls, das als Remdesivir bekannt werden sollte. Ein mit Remdesivir eng verwandter Wirkstoff hatte es in frühe klinische Tests für Hepatitis C geschafft, war jedoch ins Stocken geraten, zum Teil, weil es wie Remdesivir per Injektion verabreicht werden musste. Gilead änderte seine Strategien und kaufte ein Biotech-Startup, um Zugang zu dem oral erhältlichen Nukleotid-Analogon des Start-ups zu erhalten, das zu einem Schlüsselbestandteil von Gileads Hepatitis-C-Cocktail wurde.

Cameron hatte mit der RNA-abhängigen RNA-Polymerase aus Polioviren begonnen, die zeigen sollte, dass das Molekül ein nicht-obligatorischer Kettenterminator ist, eine Art Nukleotidanalogon, das die Polymerase in einen wachsenden Strang einbauen und weitermachen sollte &ndash konnte aber nicht.

Fasziniert kontaktierte Denison Gilead, um um Erlaubnis zu bitten, dieses zugelassene Medikament namens Sofosbuvir gegen Maus-Coronaviren auszuprobieren.

&bdquoDas war ihr weltveränderndes Medikament, das Hepatitis C heilte„, sagte Denison. &bdquoSie wollten ihre Medikamente von einem wenig bekannten Virologen, der an einem Coronavirus arbeitet, verwenden lassen.&rdquo Aber nach einer Reihe von Einführungen durch Cameron und mehreren Diskussionen stimmte Gilead zu, sein Labor mit einer anderen Reihe von Molekülen arbeiten zu lassen, denjenigen, die zuvor verwendet worden waren intern entwickelt und gegen Hepatitis C auf Eis gelegt. Sie hatten in frühen Studien vielversprechende Ergebnisse als Behandlungskandidat für andere Virusinfektionen gezeigt, unter anderem gegen das Ebola-Virus.

Die Kandidatenmoleküle sind angekommen. Denison und seine Auszubildenden hatten keine Ahnung, was sie waren. Aber sie gingen voran und testeten sie. Was sie herausfanden, war spannend: In der Zellkultur von Mäusen könnten die Medikamente die Replikation des Coronavirus blockieren.

&bdquoAlso haben wir unsere Gilead-Mitarbeiter gefragt: &lsquoWas ist das (Verbindung)?&rsquo Sie sagten: &lsquoWir werden es Ihnen nicht sagen, aber wir werden Ihnen 60 Prodrugs, chemische Modifikationen derselben Verbindung, schicken&ldquo, sagte Denison.

Eines dieser zweiten Molekülchargen erwies sich als Remdesivir. Die Doktorandin Maria Agostini, die kürzlich dem Denison-Labor beigetreten war, war eine der Forscherinnen, die daran arbeiteten, seine starke Aktivität zu verstehen.

&bdquoWir haben mit einigen potenten Wirkstoffen gearbeitet, aber Remdesivir war wirklich einer der ersten, mit denen ich gearbeitet hatte&ldquo, sagte Agostini. &ldquoWenn Sie sich die Zellen ansahen, konnten Sie visuell weniger Hinweise auf eine Virusreplikation erkennen.&ldquo

Während Zellen in ihren Kontrollschalen sichtbar infiziert waren und schlechte zytopathische Wirkungen hatten, überlebten die mit Remdesivir behandelten Zellen nach der Infektion gut. Durch die Züchtung vieler Generationen des Virus in Zellen, die mit subtherapeutischen Konzentrationen von Remdesivir behandelt wurden, und durch die Auswahl von Mutationen, die es dem Virus ermöglichen würden, das Medikament zu umgehen, zeigten Agostini und seine Kollegen Erica Andres und Clint Smith, dass es Mutationen in der viralen Polymerase bedarf, um eine Resistenz gegen . zu verleihen Remdesivir &ndash und dass diese mutierten Viren weniger in der Lage waren, Wirte zu infizieren als der Wildtyp.

Gilead stellte das Medikament kostenlos zur Verfügung, und die National Institutes of Health finanzierten die Forscher durch ein Programm zur Entwicklung von Behandlungen für neu auftretende Infektionskrankheiten.< /p>

&bdquoDies unterstreicht den Wert der kollaborativen Wissenschaft&ldquo, sagte Denison. &bdquoDies war ein Unternehmen, das sich verpflichtet hat, uns dabei zu helfen, als sich niemand für Coronaviren interessierte, und ein Zuschussmechanismus, der eine gewisse Flexibilität bei der Erweiterung ermöglicht.&ldquo

Kürzlich hat das Enzymologielabor von Mathias Götte in Kanada untersucht, wie Remdesivir auf Polymeraseenzyme aus dem Coronavirus wirkt, das MERS verursacht. Forscher in Göttes Gruppe stellten fest, dass die Verbindung die Polymerase stoppt und als Kettenabbrecher fungiert – aber nicht sofort.

Andrea Pruijssers, ein Virologe, der das antivirale Forschungsprogramm in Denisons Gruppe leitet, sagte: &ldquo(Remdesivir) entzieht sich irgendwie der Erkennung durch das Korrekturleseenzym.&rdquo

Anstatt die Polymerase zu stoppen, sobald sie eingebaut ist, scheint Remdesivir das Enzym noch einige Zyklen weiterlaufen zu lassen, dann aber zum Stillstand zu bringen. Forscher vermuten, dass das molekulare Stolpern durch eine ungewöhnliche Struktur in der RNA-Matrix-Kopie-Duplex verursacht werden könnte.

&bdquoSie glauben, dass das bereits eingebaute Nukleosid-Analogon zu diesem Zeitpunkt vom Korrekturleseenzym abgeschirmt ist&rdquo, sagte Pruijssers.

Im Labor von Denisons langjährigem Mitarbeiter Ralph Baric an der University of North Carolina, Chapel Hill, fanden Forscher heraus, dass Remdesivir eine wirksame Behandlung für mit SARS infizierte Mäuse ist. Diese Ergebnisse waren vielversprechend genug, um Remdesivir in eine Studie über MERS bei Affen einzuführen, die im Februar von Forschern des Rocky Mountain Laboratory des NIH veröffentlicht wurde. Das Medikament zeigte einen gewissen Nutzen bei der Verringerung der Schwere der Krankheit, vorausgesetzt, die Affen wurden prophylaktisch behandelt.

In Bezug auf die Medikamentenentwicklung hat Remdesivir &ldquo aus unserer Sicht jeden Meilenstein auf dem Weg erreicht&rdquo, sagte Denison.

Ähnliche Wirkstoffklasse, anderes Ergebnis

Als Pruijssers 2017 im Denison-Labor anfing, hatten sie ein weiteres Molekül zu untersuchen, Beta-D-N4-Hydroxycytidin, kurz NHC, das am Emory Institute for Drug Development als potenzielles antivirales Breitbandmedikament getestet wurde.

Agostini leitete auch die erste Studie dieses Medikaments und zeigte seine Aktivität in Gewebekulturen. Im März veröffentlichten Forscher der Baric- und Denison-Labors ein Follow-up in Science Translational Medicine, das zeigt, dass NHC die Replikation bei den Viren blockieren kann, die MERS und SARS &mdash verursachen, sowie bei dem Coronavirus, das COVID-19 verursacht.

&bdquoEs ist interessant&rdquo, sagte Pruijssers. &ldquo(NHC) fungiert als Kettenabbrecher. Es integriert sich in das Genom und verursacht dann tödliche Mutagenese.&rdquo

Durch seine Fähigkeit zur Basenpaarung mit mehr als einem Nukleotid im komplementären Strang führt NHC in aufeinanderfolgenden Replikationsrunden eine Kaskade von Fehlern ein. Schließlich verfügen virale Nachkommen nicht über die Informationen, die sie benötigen, um ein neues Virus zu erzeugen.

Während Remdesivir die Polymerase in ihren Bahnen stoppt und nur wenige neue Mutationen verursacht, zeigten Deep-Sequencing-Experimente bei den wenigen Viren, die nach der NHC-Behandlung auftauchten, dass das Medikament zahlreiche Mutationen verursacht.

&bdquoWir haben zwei Verbindungen identifiziert, die strukturell in die gleiche Klasse von Nukleosidanaloga fallen, aber sehr unterschiedlich auf Coronaviren wirken&rdquo, sagte Agostini.

Sie waren besonders ermutigt, weil die Arbeit zeigte, dass NHC im Mausmodell von MERS &mdash eine gewisse therapeutische Wirksamkeit hat und sogar Remdesivir-resistente Coronavirus-Stämme blockieren kann.

In einem Interview Anfang März sagte Pruijssers, NHC sei als Therapeutikum noch relativ ungetestet. &bdquoEs ist schwierig, ein Mutagen zu entwickeln, weil die FDA normalerweise die Idee einer Mutation mag, es sei denn, es handelt sich um eine lebensbedrohliche Krankheit.&rdquo

Aber die Pandemie hat die Dinge verändert. Emory hat sich mit dem Biotechnologieunternehmen Ridgeback Biotherapeutics aus Miami zusammengetan, um das Molekül zu entwickeln, und Emory hat bei der U.S. Food and Drug Administration einen Antrag auf Erlaubnis gestellt, erste Versuche am Menschen zu beginnen, um die Sicherheit des Moleküls zu testen.

Denison beschrieb die entscheidende Rolle, die Agostini spielte: &bdquoIn fünf Jahren an der Graduiertenschule testete und entwickelte Maria die detaillierte In-vitro-Analyse von zwei potenziellen Medikamenten zur Behandlung dieses pandemischen Coronavirus &ndash und führte sie durch die präklinische In-vitro-Entwicklung.&rdquo

Es ist eine bemerkenswerte und höchst ungewöhnliche Leistung. Die Arzneimittelentwicklung ist für ihre hohe Ausfallrate bekannt. Natürlich scheitern viele Wirkstoffkandidaten, die in präklinischen Studien vielversprechend erscheinen, in großen Humanstudien.

Angesichts der Pandemie

Nachdem er ein Jahrzehnt lang argumentiert hatte, dass die Welt auf eine Pandemie vorbereitet sein muss, sagte Denison Anfang März, es sei seltsam, sich ihr zu stellen.

&bdquoEs ist wirklich seltsam, dass wir die letzten sechs Jahre daran gearbeitet haben und die Drogen waren nur durchkommen, und sie waren gerade bereit zu gehen&rdquo, sagte er. &ldquoWir&rsquoll sehen, was das Ergebnis ist.&rdquo

Er hat einige Bedenken, wie Daten aus klinischen Studien zu interpretieren sind, in denen getestet wird, wie gut Remdesivir bei COVID-19 beim Menschen wirkt. (Andere Studien, die von Gilead, dem NIH und der Weltgesundheitsorganisation gesponsert wurden, wurden später gestartet.)

Erstens deuten Tierdaten von anderen Coronaviren darauf hin, dass das Medikament am wirksamsten ist, wenn es prophylaktisch verabreicht wird, nachdem die Tiere der Exposition ausgesetzt wurden, aber bevor sie beginnen, Symptome zu entwickeln. Im Kontext einer globalen Pandemie wäre dies beim Menschen schwer zu erreichen. Irgendwann im Verlauf der Infektion beginnt eine extrem starke Immunantwort, mehr Schaden anzurichten als das Virus zu diesem Zeitpunkt, sagte Denison, es könnte zu spät für ein antivirales Mittel sein, um zu helfen.

Zweitens sind die Daten aus den ersten Studien wahrscheinlich nuanciert und erfordern eine sorgfältige Interpretation – worauf Denison befürchtet, dass der öffentliche Diskurs nicht gut vorbereitet ist. Frühe Humanstudien mit Remdesivirs Schwesterwirkstoff bei Hepatitis-Patienten zeigten dramatische Unterschiede zwischen den einzelnen Personen beim antiviralen Ansprechen, und Remdesivir selbst zeigte in einer klinischen Studie bei Ebola-Patienten einen begrenzten Nutzen im Vergleich zu anderen Therapiekandidaten. &bdquoMenschen neigen dazu, eine Gewinner- oder Verlierermentalität zu haben&ldquo, sagte er. &bdquoSie„Sie nannten Remdesivir „das versagte Ebola-Medikament&rsquo, richtig? Es scheiterte in der Ebola-Studie, es war nur fortgeschritten, weil es genauso viel Nutzen zeigte wie die anderen beiden Präparate

Unabhängig von den Ergebnissen klinischer Studien mit Remdesivir und NHC hofft Denison, dass diese Krise die Bedeutung der Finanzierung der Forschung zu potenziell pandemischen Viren vor Ausbruch von Ausbrüchen unterstreichen wird.

&bdquoDer Versuch, grundlegende Untersuchungen und die Entwicklung von Medikamenten gegen etwas aufrechtzuerhalten, das eine hohe, hohe, hohe Auswirkung, aber eine geringe, niedrige, niedrige Wahrscheinlichkeit hat, ist in unserer Welt wirklich schwierig. Wirklich schwer&rdquo, sagte er. &bdquoWir &rsquo haben diese Idee einfach nie aufgegeben, dass wir diese Dinge bereithalten und im Eimer haben müssen.&ldquo


Umkehrstrategien

Es ist mittlerweile allgemein anerkannt, dass die antileukämische Wirkung von NA ausreichend hohe intrazelluläre Konzentrationen von Triphosphat-Analoga in Tumorzellen erfordert. 38,82,189 Ein Ansatz bestand darin, Verbindungen zu entwickeln, die gegenüber Abbau unempfindlich sind.Fludarabin und Cladribin sind resistent gegen die Wirkung von ADA. Ein anderer Ansatz könnte in der Verwendung spezifischer Inhibitoren abbauender Enzyme wie 5'-NU bestehen. Es könnte erwartet werden, dass Kombinationen eines 5'-NU-Inhibitors mit einer NA die Zytotoxizität der NA verstärken. Es besteht jedoch noch Unsicherheit bezüglich des/der relevanten 5′-NU-Enzym(e), das/die NA-Resistenz vermittelt/vermitteln, und derzeit gibt es keine klinisch verfügbaren Inhibitoren der 5′-NU-Aktivität. Da viele potenzielle Inhibitoren von 5'-NU selbst Nukleosidanaloga sind, kann die Konkurrenz mit zytotoxischer NA um Membrantransporterstellen problematisch sein. Die Regulierung der dCK-Aktivität könnte auch ein Ziel für die Modulation sein. Es wurde gezeigt, dass die dCK-Aktivität nach Behandlung mit 2-CdA sowie mit Fludarabin und ara-C in normalen menschlichen Lymphozyten und verschiedenen leukämischen Zelllinien stimuliert wird. 190,191 Es wurde angenommen, dass die durch NA induzierte Zunahme der dCK-Aktivität auf posttranslationale Modifikationen von dCK während der Hemmung der DNA-Synthese zurückzuführen ist. 192.193

Die Bedeutung des Verhältnisses von Nukleosidanaloga zu normalen Nukleosiden wurde in jüngerer Zeit erkannt. Die Verringerung der intrazellulären Pools normaler Nukleotide scheint daher eine therapeutische Alternative zur Erhöhung der Konzentrationen von zytotoxischen NA-Triphosphaten zu sein. In der Praxis können diese beiden Ziele angesichts der rückkopplungshemmenden Wirkung von dNTPs auf die NA-Aktivierung gleichzeitig erreicht werden. Verschiedene biochemische Modulationsstrategien, basierend auf NA-Kombinationen, wurden vorgeschlagen, um die Konzentration von NA-Triphosphat in Leukämiezellen zu erhöhen.

Hemmung der Ribonukleotidreduktase

Große Mengen an dNTPs, die durch RR erzeugt werden, werden in replizierende DNA geleitet, ein Prozess, der NA effektiv von der replizierenden DNA-Synthese ausschließt. 194 Darüber hinaus hemmen intrazelluläre dNTP-Pools die dCK-Aktivität und reduzieren dadurch die NA-Aktivierung. Somit kann erwartet werden, dass Arzneimittel, die normale dNTPs durch Hemmung von RR abbauen oder reduzieren können, die Zytotoxizität verschiedener NA verstärken. Sequentielle Inkubation von menschlichen K562-Leukämiezellen mit F-ara-A gefolgt von ara-C verstärkte die ara-CTP-Akkumulation, was auf einen möglichen therapeutischen Synergismus zwischen ara-C und Fludarabin hindeutet. 86 Nachfolgende klinische Studien haben die Wirksamkeit dieser Strategie gezeigt. 195,196 Lymphozyten, isoliert von Patienten mit CLL und inkubiert mit ara-C nach in vitro Eine F-ara-A-Inkubation oder eine therapeutische Infusion von Fludarabin (25 oder 30 mg/m 2 ) zeigte eine Zunahme der ara-CTP-Akkumulation. 197 Das gleiche Phänomen wurde bei leukämischen Lymphozyten und AML-Blasten beobachtet. 198,199 Dieser Anstieg wurde eher durch eine höhere Anabolismusrate als durch eine langsamere Katabolisierungsrate von ara-CTP verursacht. In jüngerer Zeit, Seymour et al 200 haben gezeigt, dass F-ara-ATP-Konzentrationen (30–50 μM, erreicht mit üblichen klinischen Dosen von Fludarabin) sowohl die intrazelluläre Akkumulation von ara-CTP als auch den Einbau in die zelluläre DNA bei klinisch erreichbaren ara-C-Konzentrationen verbessern. Solche Arzneimittelkombinationen haben bei unbehandelten und refraktären Patienten mit akuten Leukämien Reaktionen hervorgerufen. 201.202

Diese modulatorische Wirkung von Fludarabin kann auf andere NA wie 9-β-D-Arabinofuranosylguanin (ara-G) ausgedehnt werden. 203 In vitro Studien mit humanen Leukämiezelllinien und primären Leukämiezellen von Patienten ergaben, dass die Wirksamkeit von ara-G auf der intrazellulären Akkumulation von ara-GTP beruht. Der geschwindigkeitsbestimmende Schritt der ara-GTP-Akkumulation ist die anfängliche Phosphorylierung, die sowohl von dGK als auch von dCK durchgeführt wird. In vivo, Gandhi und Mitarbeiter zeigten in einer klinischen Phase-I-Studie, dass Patienten, die auf eine Therapie mit dem wasserlöslichen ara-G-Prodrug GW506U ansprachen, eine signifikant höhere Konzentration von ara-GTP in ihren zirkulierenden Zellen erreichten als Patienten, die nicht ansprachen. 204,205 In dieser Situation könnte die Kombination mit Fludarabin die intrazelluläre Akkumulation von ara-GTP in Zielzellen erhöhen und die Ansprechraten bei Patienten verbessern. 205

Andere Inhibitoren von RR können zur Modulation des ara-C-Stoffwechsels verwendet werden. Iwasaki und Mitarbeiter 194 zeigten, dass die Hemmung von RR mit Gemcitabin und die daraus resultierende Abnahme der zellulären dCTP-Pools den Einbau von ara-C in die replizierende DNA begünstigten. Colly et al 206 und Bhalla et al 207 testete die Fähigkeit des RR-Inhibitors Hydroxyharnstoff, den ara-C-Metabolismus und die Zytotoxizität in arzneimittelempfindlichen und -resistenten Zelllinien zu verbessern. Diese Kombination reduzierte signifikant die dCTP-Pools, erhöhte den DNA-Einbau von ara-C und erhöhte die Zytotoxizität des Arzneimittels, sogar in dCK-defizienten ara-C-resistenten Zelllinien.

Da 2-CdA die Reduktion von CDP und ADP hemmt, wird eine Abnahme der dCTP- und dATP-Pools erwartet, wenn Zellen dieser Verbindung ausgesetzt werden. Die Verringerung dieser Pools würde die Verhältnisse von 2-CdATP zu dATP und ara-CTP zu dCTP erhöhen. In vitro Inkubation von AML-Blasten mit 2-CdA gefolgt von ara-C erzeugte eine höhere Rate der ara-CTP-Akkumulation als ara-C allein. 208 Gandhi und Mitarbeiter 209 untersuchten 17 Patienten mit refraktärer AML, die eine Kombinationschemotherapie mit ara-C und 2-CdA erhielten. Sieben von neun während der Therapie untersuchten Patienten wiesen eine erhöhte Rate der ara-CTP-Bildung und Spitzenkonzentrationen von ara-CTP in leukämischen Blasten auf. Diese Modulationsstrategie erhöhte die effektive Dosisintensität des aktiven Metaboliten von ara-C in den Tumorzellen um 40%. Die gleichzeitige Verabreichung von 2-CdA und ara-C führte zu einer maximalen Hemmung der DNA-Synthese, einer Akkumulation höherer Konzentrationen von ara-CTP, einem größeren Verhältnis von analogen Triphosphaten zu normalen dNTPs und einer gleichzeitigen Aufnahme von 2-Cl-dATP und ara-CTP in wachsenden DNA-Strängen.

Obwohl potenziell interessant, muss die Nützlichkeit von NA-Kombinationen in der Klinik noch bestimmt werden. Insbesondere die Toxizität für normale Zellen aufgrund der erhöhten NA-Akkumulation scheint signifikant zu sein, was eine Verbesserung des therapeutischen Index im Vergleich zur NA-Einzeltherapie in Frage stellt. Eine mögliche Folge im Zusammenhang mit der NA-Modulationstherapie kann das erhöhte Risiko für sekundäre Malignome bei einer Gruppe von Patienten sein, deren Krankheit bereits ein hohes Risiko für zweite Krebserkrankungen darstellt, sowie dosisabhängige Effekte wie schwere Neurotoxizität. 210,211 Offensichtlich können Häufigkeit und Schwere der Neurotoxizität bei der Kombinationstherapie höher sein als bei der alleinigen Anwendung beider Arzneimittel.

Modulation der dCK- und 5′-NU-Aktivität mit Bryostatin

Bryostatin, ein makrozyklisches Lacton und Proteinkinase C-Aktivator, erhöht nachweislich das Verhältnis der dCK/5′-NU-Aktivität und erhöht dadurch die Empfindlichkeit gegenüber Fludarabin und Cladribin in CLL-Zellen, beides in vitro und in vivo. 212.213 Phase-I-Studien mit dem Einzelwirkstoff Bryostatin wurden abgeschlossen und dieser Wirkstoff befindet sich jetzt in klinischen Studien in Kombination mit NA. 214

Verwendung von hämatopoetischen Wachstumsfaktoren

Unterschiedlich in vitro Studien haben gezeigt, dass die Vorbehandlung von AML-Blasten durch Wachstumsfaktoren (GF) die ara-C-vermittelte Zytotoxizität gegenüber Leukämiezellen verstärkt, möglicherweise durch deren proliferationsinduzierende Wirkung. 215.216 GF kann auch die Zytotoxizität von ara-C durch Erhöhung der hENT1-Expression verstärken. Hohe zelluläre Proliferationsraten sind mit einer hohen hENT1-vermittelten Aktivität verbunden, die die Aufnahme von Nukleosiden erhöht. 217,218 Wiley et al 219 haben festgestellt, dass in vitro Behandlung isolierter humaner Leukämiezellen mit GM-CSF führte zu einer Erhöhung der hENT1-Expression. Reuter et al 220 stellten fest, dass Blasten von AML-Patienten, die mit GM-CSF behandelt wurden, nach niedrigen oder SDAC-Dosen eine erhöhte Wirkstoffaufnahme zeigten. In dieser Studie erhöhte GM-CSF auch die intrazellulären ara-CTP/dCTP-Pool-Verhältnisse und verstärkte den ara-C-Einbau in die DNA durch Aktivierung von DNA-Polymerasen. In vivo, GM-CSF-Priming von leukämischen Blasten vor der Induktionstherapie führt zu einer höheren antileukämischen Aktivität, wie durch ein verlängertes Überleben von behandelten Mäusen mit fortgeschrittener AML und eine hohe Rate der vollständigen Remission bei Patienten mit AML angezeigt. 221,222 Verschiedene randomisierte klinische Studien konnten jedoch die Wirksamkeit der GF-Priming-Strategie nicht belegen und kamen zu dem Schluss, dass die Verabreichung von GF während und nach der Induktionschemotherapie das klinische Ergebnis von mit ara-C behandelten AML-Patienten nicht verbessert. 223,224

Induktion der DNA-Reparatur

Eine andere Möglichkeit, den Einbau von NA in DNA zu verbessern, besteht darin, den DNA-Reparaturweg zu verwenden, nachdem Tumorzellen kombiniert mit NA und DNA-schädigenden Mitteln ausgesetzt wurden. 225 Die Erkennung und Reparatur des beschädigten Strangs durch das DNA-schädigende Agens ermöglicht die Resynthese unter Verwendung des Gegenstrangs als Matrize. Dies schafft die Möglichkeit, die NA anstelle ihres normalen Gegenstücks in das DNA-Reparaturpflaster einzufügen. Die eingebaute NA ist relativ resistent gegen Reparaturexzision und verursacht irreversible Schäden, die von der Zelle erkannt werden. Alternativ kann die Hemmung der DNA-Reparatur durch NA die Akkumulation erhöhen und die Entfernung von DNA-Läsionen, die durch DNA-schädigende Mittel induziert werden, verlangsamen, wodurch die Zytotoxizität dieser letzteren Verbindungen potenziert wird. In vitro, die Kombination von Gemcitabin und Fludarabin mit Cisplatin erzeugte eine synergistische Zytotoxizität. 225 Van Den Neste et al 226 hat kürzlich berichtet, dass in vitro synergistische Zytotoxizität von 2-CdA und Cyclophosphamid in B-CLL-Zellen, die von Patienten isoliert wurden, die mit Alkylierungsmitteln vorbehandelt wurden.

In vivo, kann sich die Kombination eines DNA-schädigenden Mittels und einer NA als besonders nützlich erweisen, um Krebszellen ohne signifikante DNA-Replikationsaktivität wie CLL und indolente Lymphome zu zerstören. Die Kombination von Fludarabin mit Doxorubicin und Prednison ist klinisch wirksam gegen CLL. 227 Fludarabin und ara-C mit oder ohne Cisplatin wurden Patienten mit CLL mit zytoreduktiver Aktivität verabreicht. 228 Ergebnisse klinischer Studien mit Mitoxantron (das proteinassoziierte DNA-Strangbrüche induziert), Fludarabin und Dexamethason zeigten eine hohe Ansprechrate, insbesondere bei follikulären Lymphomen, wobei eine Reihe von Patienten eine vollständige Remission erreichten. 229.230 Eine Kombination von Mitoxantron und ara-C zur Behandlung akuter Leukämie war ermutigend. 231.232 Darüber hinaus haben klinische Studien zur Bewertung von NA in Kombination mit DNA-schädigenden Mitteln eine Wirksamkeit gegen solide Tumoren mit geringen Wachstumsanteilen gezeigt. 233,234


Tabelle 1: Leitfaden zur Auswahl von Nukleotiden für zufällige Mutagenese-Ansätze.

Taq: Thermus aquaticus Überleitung: Austausch von Purin gegen Purin (A G) oder Pyrimidin gegen Pyrimidin (C ↔ T) Umsetzung: Austausch von Purin gegen Pyrimidin oder umgekehrt (C/T ↔ A/G).

NukleotidEinarbeitungsmethodePrimärer MutationstypPrimär induzierte Mutation(en)Referenz
8-Oxo-dGTPPCR (Taq Pol)TransversionEIN:T → C:G und T:A → g:C[1]
Kombination aus fehleranfälliger PCR (Mn 2+ ) und PCR (Taq Pol) mit 8-Oxo-dGTPTransversion
Übergang
EIN:T → T:A und A:T → C:G
EIN:T → g:C und g:C → EIN:T
[2]
dPTPPCR (Taq Pol)ÜbergangEIN:T → g:C und g:C → EIN:T[1]
8-Oxo-dGTP & dPTPPCR (Taq Pol)Transversion
Übergang
Mischung von Mutationen, die durch einzelne Nukleotide induziert werden[1,3]
5Br-dUTPPCR (Taq Pol)Transversion
Übergang
EIN:T → g:C
T:A → C:G
[4]
2OH-dATPPCR (Taq Pol)Transversion
Übergang
EIN:T → C:G und g:C → T:EIN
EIN:T → g:C
[5]
dITPPCR (Taq Pol)ÜbergangEIN:T → g:C und g:C → EIN:T[6,7,8]

Eine ähnliche Einschränkung findet sich bei der PANTHER-Datenbank

akkumulieren neue Mutationen. Auch wenn hypoxische Zustände im Allgemeinen eine glykolytische Aktivierung begünstigen könnten, ist Hypoxie keine wesentliche Komponente dafür, dass ein Tumor glykolytisch wird, wie in diesem System, bei dem Hif durch alternative Mittel in einer normoxischen Umgebung stabilisiert wird. Pvract löst in Abhängigkeit von Ras zwei parallele Pfade aus. Der erste ist der PI3K/Akt-Weg, der auf das S6K-Protein abzielt, das für die translationale Initiation wichtig ist. Die zweite ist die von Raf/ERK Wang et al. eLife 20165:e18126. DOI: 10.7554/eLife.18126 11 von 21 Forschungsartikel Zellbiologie Entwicklungsbiologie und Stammzellen Wang et al. eLife 20165:e18126. DOI: 10.7554/eLife.18126 12 von 21 Forschungsartikel Zellbiologie Entwicklungsbiologie und Stammzellen-Weg, der auf das L6K-Protein abzielt, das auch unabhängig für die translationale Initiation benötigt wird. Jeder dieser Wege kann allein ein Tumorwachstum verursachen, vermutlich aufgrund unabhängiger nachgeschalteter Transkriptionsereignisse. Aber beide Wege müssen gleichzeitig wirken, um die translationale Kontrolle von sowohl Hifa als auch PDHK zu etablieren. Interessanterweise verursacht das Zusammenwirken der PI3K- und ERK-Wege zwar erhebliche Mengen an PDHK-Translation, das so hergestellte Protein ist jedoch inaktiv. Im Gegensatz dazu ist das in einen Pvract-Hintergrund translatierte PDHK enzymatisch aktiv und in der Lage, PDH zu inaktivieren. Unsere Daten zeigen, dass ein weiterer von Pvract initiierter paralleler Weg, der Src und JNK umfasst, dazu beiträgt, die aktive Form von PDHK zu erzeugen. Daher sind alle drei nachgeschalteten Effektoren von aktiviertem Pvr für die Erzeugung einer aktiven Form des PDHK-Proteins zur Herunterregulierung der oxidativen Phosphorylierung essentiell, während nur die letzten beiden dieser Wege für die LDH-Produktion und Glykolyse benötigt werden. Es ist leicht vorstellbar, dass im Zusammenhang mit dem auslösenden Onkogen der verursachte Tumor entweder nicht glykolytisch oder glykolytisch sein könnte Wang et al. eLife 20165:e18126. DOI: 10.7554/eLife.18126 13 von 21 Forschungsartikel Zellbiologie Entwicklungsbiologie und Stammzellen, aber nicht ohne Mangel an oxidativer Phosphorylierung. In dem in diesem Artikel beschriebenen System ist es unvermeidlich, dass die Umwandlung von Pyruvat in Acetyl-CoA innerhalb des Mitochondriums und daher der TCA-Fluss abgeschwächt wird, da die PDH-Funktion durch PDHK in den Tumorzellen gehemmt wird. Wir haben jedoch keine direkten Beweise für oder gegen Bypass-Mechanismen, wie sie Glutamin als Hauptantrieb für anabole Prozesse verwenden, die im Zusammenhang mit den durch Drosophila Pvract induzierten Tumoren funktionieren, wie dies bei vielen Krebsarten der Fall ist. Dieses Problem erfordert in naher Zukunft weitere direkte Messungen der Stoffwechselaktivität des Tumorgewebes. Während diese Abfolge von Ereignissen einen Wechsel im Stoffwechselprofil der Zelle auslösen kann, ist ein zusätzlicher Mechanismus erforderlich, um diesen Übergang über einen langen Zeitraum aufrechtzuerhalten. Der zentrale Akteur in diesem Lebensunterhalt ist ROS. Das Niveau dieser freien Radikale der CF-101-Stelle steigt, wenn das Mitochondrium dysfunktional wird. Wichtig ist, dass dieses überschüssige ROS als Rückkopplungssignal fungiert, das mindestens zwei wichtige Konsequenzen hat. Erstens stabilisiert ROS Hif mithilfe des gleichen Mechanismus, der bei Hypoxie verwendet wird, und verstärkt so die glykolytischen Wege. Die zweite ist, dass ROS den JNK-Pfad aktivieren kann. Somit wird der Übergang nach der anfänglichen Umprogrammierung im Stoffwechsel im Laufe der Zeit stabil gemacht, da das erzeugte ROS die stromaufwärts liegenden Mitglieder verstärkt. Alle hier gezeigten Ergebnisse stimmen mit diesem positiven Rückkopplungsmodell überein, das den Warburg-Effekt verstärkt und su


Anti-Herpes-Nukleosid-Analoga

Antivirale Mittel können in Viruzide, antivirale Chemotherapeutika und Immunmodulatoren eingeteilt werden.

Nukleosidanaloga sind antivirale Chemotherapeutika, die ihre "antivirale Wirkung" hauptsächlich zeigen, während die virale Replikation auf Wirtszellebene aktiv ist.

Nukleosidanaloga sind die Hauptklasse antiviraler Mittel, die zur Behandlung von Herpes-Simplex-Virus-Infektionen verwendet werden. Dazu gehören Aciclovir und Penciclovir mit ihren jeweiligen Prodrugs Valaciclovir und Famciclovir. Nukleosidanaloga sind in ihrer chemischen Struktur ziemlich ähnlich.

Antivirale Herpes-Medikamente beseitigen das Virus nicht, das rezidivierend und lebenslang auftritt. Eine antivirale Chemotherapie hilft, indem sie die Symptome und Anzeichen einer Herpesinfektion kontrolliert und den Verlauf von Ausbrüchen verkürzt. Wenn die Medikamente abgesetzt werden, haben sie keinen Einfluss auf die Häufigkeit oder Schwere von Rezidiven.

Anti-Herpes-Medikamente stören den Prozess, durch den das Virus Kopien von sich selbst erstellt und sich auf neue Zellen ausbreitet. Sie wirken, indem sie ein Enzym hemmen, das das Virus besitzt, aber menschliche Zellen nicht haben, und dann die Fähigkeit der Viren, DNA zu synthetisieren, unterbrechen.

Nukleosidanaloga sind hochwirksame und selektive Inhibitoren des viralen Enzyms Thymidinkinase (TK). Sie hängen von der Aktivität der viralen Thymidinkinase ab, den Wirkstoff in eine Monophosphatform umzuwandeln und anschließend die virale DNA-Replikation zu stören.

Das Prinzip der antiviralen Aktivität der Nukleosidanaloga Aciclovir und Penciclovir beruht auf der Tatsache, dass Herpesviren (Herpes-Simplex-Virus, Varicella-Zoster-Virus und Cytomegalovirus) ihre eigenen Nukleosidkinasen kodieren, die eine viel geringere Substratspezifität aufweisen als ihre zellulären Gegenstücke. Daher sind sie in der Lage, bestimmte Nukleosid-Analoga zu monophosphorylieren, während zelluläre Nukleosid-Kinasen dies nicht oder nur sehr eingeschränkt können.

Die resultierenden analogen Monophosphate werden durch zelluläre Kinasen zu den entsprechenden Triphosphaten metabolisiert, die für Herpesvirus-kodierte DNA-Polymerasen deutlich niedrigere molare Hemmkonstanten (Ki-Werte) aufweisen als für zelluläre DNA-Polymerasen. Dieser Schritt der antiviralen Selektivität bewirkt im Fall von Aciclovir einen obligaten Kettenabbruch und damit den Stopp der Virusproduktion. Andererseits besitzt Penciclovir im Gegensatz zu Acyclovir, das nur eine Hydroxylgruppe in seiner acyclischen "Zucker"-Einheit aufweist, zwei Hydroxylgruppen und kann intern in die wachsende DNA-Kette eingebaut werden. Seine antivirale Wirkungsweise ist bisher weniger gut verstanden.

Aciclovir, ein synthetisches azyklisches Guanosin-Analogon, wurde als Beginn einer neuen Ära in der antiviralen Therapie angesehen. Es ist ein prototypisches antivirales Mittel. Aciclovir selbst ist polar und daher ist die orale Bioverfügbarkeit gering.

Die pharmakologisch aktive Form der Verbindung ist ACV-Triphosphat. Es ist hochpotent und hat eine spezifische Aktivität gegen Herpes-simplex-Virus Typ 1 und 2.

Acyclovir unterliegt einer Monophosphorylierung (fügt eine Phosphatgruppe hinzu), katalysiert durch ein Virus-kodiertes Enzym Thymidinkinase. Die Bildung des Monophosphats kann nur in Gegenwart des Virus erfolgen, daher reichert sich der Wirkstoff als Monophosphat nur in infizierten Zellen an. Es wird dann durch „normale&rdquo Wirtsenzyme in der Zelle in ein Diphosphat und Triphosphat umgewandelt. ACV-Triphosphat hemmt den Einbau von Guanosintriphosphat durch die virale DNA-Polymerase und wird selbst eingebaut. Die DNA kann nicht weiter wachsen, weitere Gruppen hinzufügen und die Kette endet.

Der Wirkmechanismus ist somit zweifach: Hemmung der viralen DNA-Polymerase und Kettenabbruch der DNA, sobald sie in die Nukleinsäure eingebaut wurde.

Aciclovir ist am aktivsten gegen Herpes-simplex-Viren Typ 1 und 2. Die Aktivität gegen Varicella-Zoster-Virus (VZV) ist ebenfalls beträchtlich, aber ungefähr zehnmal geringer. Das Epstein-Barr-Virus (EBV) ist nur mäßig anfällig, da EBV eine minimale Thymidinkinase-Aktivität aufweist. Die Aktivität gegen Cytomegalovirus (CMV) ist gering, da CMV keine einzigartige Thymidinkinase besitzt, und so wird die CMV-DNA-Polymerase durch Acyclovirtriphosphat nur schwach gehemmt.

Widerstandsmechanismus: Resistente HSV-Stämme weisen Mutationen entweder im viralen Thymidinkinase-Gen oder der viralen DNA-Polymerase auf. Eine Resistenz tritt auf, wenn Mutationen der viralen Thymidinkinase zu einem Enzym führen, das Aciclovir nicht mehr phosphoryliert. Oder wenn die virale DNA-Polymerase zu einer Form mutiert, die das aktivierte Medikament nicht mehr erkennt.

Daher zeigen virale Mutanten eine Kreuzresistenz gegen andere antivirale Mittel, die eine Thymidinkinase-Aktivierung erfordern, wie Famciclovir, Ganciclovir und Valacyclovir. Aciclovir-resistente HSV-Stämme, die einen Thymidinkinase-Mangel aufweisen, sind auch resistent gegen Famciclovir und Penciclovir.

Valaciclovir ist ein Valinester von Aciclovir. Es wurde entwickelt, um die orale Bioverfügbarkeit der Muttersubstanz zu verbessern. Das Prodrug wird im Darm und in der Leber zu Aciclovir umgewandelt. Es hat eine drei- bis fünfmal höhere orale Bioverfügbarkeit als Aciclovir, eine höhere Plasmakonzentration und eine längere Halbwertszeit.

Valaciclovir hat den gleichen Wirkmechanismus, das gleiche antivirale Spektrum und die gleichen Resistenzprofile wie seine Muttersubstanz.

Valaciclovir ist wirksam gegen Herpes-simplex-Viren Typ 1 und 2, Varicella-Zoster-Virus und Epstein-Barr-Virus. Cytomegalovirus, das keine Thymidinkinase kodiert, ist in klinisch erreichbaren oralen Dosen resistent.

Famciclovir ist das inaktive Diacetylester-Prodrug von Penciclovir, einem azyklischen Nukleosidanalogon von Guanosin. Famciclovir wird durch Deacetylierung und Oxidation schnell in seine aktive Form Penciclovir umgewandelt.

Die Muttersubstanz Penciclovir hat praktisch keine orale Bioverfügbarkeit (weniger als 5 %). Im Gegensatz dazu hat Famciclovir eine sehr hohe Bioverfügbarkeit von 77 %.

Penciclovir wird in HSV- und VZV-infizierten Zellen effizienter phosphoryliert als Aciclovir. Es hat einen ähnlichen Wirkmechanismus, außer dass es kein obligatorischer Kettenabbrecher ist.

Penciclovir wird in seine Triphosphatform (Penciclovirtriphosphat) umgewandelt, die durch Konkurrenz mit Desoxyguanosintriphosphat selektiv die virale DNA-Polymerase hemmt. Es hemmt die DNA-Polymerase um das 100-fache weniger stark als Aciclovir, ist jedoch in infizierten Zellen in höheren Konzentrationen und über längere Zeiträume vorhanden.

Penciclovir ist gegen Mitglieder der Herpesvirusfamilie aktiv, mit der größten Aktivität gegen HSV-1, etwas geringerer Aktivität gegen HSV-2 und weniger Aktivität gegen VZV. CMV ist relativ resistent und EBV weist eine mittlere Anfälligkeit auf.

Widerstandsmechanismus: Penciclovir-resistente Stämme treten auf, wenn Mutationen eine mangelhafte oder veränderte Thymidinkinase oder veränderte DNA-Polymerase erzeugen. Einige Aciclovir-resistente Stämme können jedoch gegenüber Penciclovir empfindlich bleiben.

Ganciclovir ist ein Nukleosidanalogon, das sich von Acyclovir dadurch unterscheidet, dass es eine zusätzliche Hydroxymethylgruppe an der azyklischen Seitenkette aufweist. Seine aktive Form ist Ganciclovirtriphosphat, das eher ein Inhibitor der viralen als der zellulären DNA-Polymerase ist. Ganciclovir ist jedoch für menschliche Zellen toxischer als Aciclovir.

Intrazelluläres Ganciclovir wird durch viruskodierte Enzyme zum Phosphatderivat phosphoryliert. Zelluläre Enzyme wandeln es weiter in die Diphosphat- und Triphosphatform um. Ganciclovirtriphosphat ist ein kompetitiver Inhibitor viraler DNA-Polymerasen. Der Einbau von Ganciclovir-Triphosphat in die virale DNA bewirkt eine Verlangsamung und anschließende Beendigung der viralen DNA-Kettenverlängerung.

Ganciclovir hat die größte Aktivität gegen CMV, obwohl es gegen andere Herpesviren aktiv ist. Ganciclovir ist auch gegen HSV und gegen einige gegen Aciclovir resistente Mutanten wirksam.