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Warum werden Hfr-Zellen als Hochfrequenz-Rekombinationszellen bezeichnet?

Warum werden Hfr-Zellen als Hochfrequenz-Rekombinationszellen bezeichnet?



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Ich verstehe, dass Hfr-Zellen gebildet werden, wenn sich ein Fragment eines bakteriellen Plasmids durch homologe Rekombination in das Genom eines anderen Bakteriums (Wirts) integriert, aber meine Frage ist, warum wir diese Zellen als "Hochfrequenz-Rekombinationszellen" bezeichnen. Woher kommt der Begriff Hochfrequenz?


Laut Luca Cavalli-Sforza, dem Wissenschaftler, der das Akronym geprägt hat Hfr:

Die am Anfang beobachtete Rekombination hatte eine sehr niedrig Frequenz. Es hörte auf, selten zu sein, als ich eine mutierte Sorte fand, die ich Hfr nannte für „hoch Häufigkeit der Rekombination.“ Ich fand es zufällig 1949, als ich Mutationen auswählte, die gegen Stickstoffsenf und Strahlung resistent waren. Die ersten beiden resistenten Mutanten, die bei der Selektion auf Senfresistenz ziemlich stark behandelt worden waren, erwiesen sich in ihrem Paarungsverhalten als außergewöhnlich. Einer war Hfr und er zeigte sofort seine bemerkenswerte Paarungsfähigkeit, die um den Faktor 1000 oder mehr höher war als die von normalen Kreuzungen. Ich wiederholte das Experiment noch zweimal, bevor ich es glaubte. Die andere Mutation war, wie ich später bewies, eine F- (selbststeril) Mutation eines F+ (fertilen) Stammes. (betont meine)

Quelle: Vor 40 Jahren in GENETIK: Das unorthodoxe Paarungsverhalten von Bakterien


3 Modi des genetischen Transfers in Bakterienzellen |Biologie

Drei Arten des genetischen Transfers in Bakterienzellen sind: (a) Transformation, (b) Transduktion, (c) Konjugation.

Bakterien teilen sich sehr schnell. Die Verdopplungszeit wird auch Generationszeit genannt und kann bis zu 20 Minuten betragen. Bakterien vermehren sich hauptsächlich durch asexuelle Fortpflanzung, zeigen jedoch keine echte sexuelle Fortpflanzung, da sie keine diploide Phase produzieren. Somit fehlt die Meiose. Bakterien tauschen jedoch genetisches Material zwischen zwei Zellen aus.

Arten des genetischen Transfers in Bakterien:

Drei Arten des genetischen Transfers zwischen Bakterienzellen sind:

(ein) Transformation:

Das Phänomen, durch das DNA, die aus einem Zelltyp isoliert wurde, wenn sie in einen anderen Typ eingeführt wurde, in der Lage ist, diesem einige ihrer Eigenschaften zu verleihen, wird als Transformation bezeichnet. Es wurde von Griffith mit seinen Experimenten an Bakterien Streptococcus pneumonia bestätigt.

Die Übertragung von genetischem Material von einem Bakterium auf ein anderes durch Bakteriophagen wird als Transduktion bezeichnet.

Die unidirektionale Übertragung von DNA von einer Zelle zur anderen über eine zytoplasmatische Brücke wird als Konjugation bezeichnet. Der Vorgang entspricht der sexuellen Paarung bei Eukaryoten. Zwei haploide Bakterienzellen unterschiedlicher Stämme kommen sich nahe.

Sie erkennen sich gegenseitig an komplementären Makromolekülen, die sich auf ihrer Oberfläche befinden. Die Spender- oder männliche Zelle übergibt einen Teil oder das gesamte Chromosom an die Empfänger- oder weibliche Zelle. Die Fähigkeit, das genetische Material von Männern zu übertragen, wird durch den in einem Plasmid vorhandenen Geschlechts- oder Fertilitätsfaktor (F-Gen) kontrolliert.

So können Gene auf einem DNA-Molekül, das als F-Gen bezeichneter Sexualfaktor wirkt, von einer Spender- auf eine Empfängerzelle übertragen werden. Dieses Geschlechtsgen kann sich in einem bakteriellen Chromosom befinden oder als autonome Einheit im Zytoplasma existieren.

Männliche Bakterien mit dornenartigen Ausstülpungen, die als Sex-Pili bezeichnet werden, kommen mit weiblichen Bakterien in Kontakt, denen die Pili fehlen, und spenden ihre DNA. Der F-Faktor (ein Plasmid) trägt Gene zur Herstellung von Pili und anderen Funktionen, die für den DNA-Transfer erforderlich sind. Manchmal integriert sich der F-Faktor in das Bakterienchromosom.

Solche Bakterien können ihr genetisches Material mit hoher Frequenz (Hfr) in einer bestimmten Reihenfolge in die weibliche Zelle übertragen. Sie werden als Hfr-Stämme bezeichnet. Die Konjugation wurde zuerst von Lederberg und Tatum in E. coli nachgewiesen. Die Häufigkeit der Rekombination war in Lederbergs Experimenten sehr gering.

Die Hfr-Zelle fungiert als männliches Bakterium und bildet, wenn sie mit der weiblichen (F-)-Zelle vermischt wird, eine Konjugationsbrücke. Die F-Faktor enthaltende DNA bricht an einem bestimmten Punkt und beginnt mit der Insertion der DNA in das Weibchen und die Sequenz des chromosomalen Gentransfers ist immer in der gleichen Reihenfolge (A-, B-, C- und D-Gene).

Der F-Faktor wird zuletzt übertragen. Die Konjugationsbrücke bricht normalerweise, bevor das gesamte Chromosom übertragen wurde. Im angegebenen Beispiel wurden nur die Gene A und B übertragen. Diese A- und/oder B-Gene können mit den entsprechenden Genen im F-Chromosom rekombinieren.

Wenn also B’ in der F—-Zelle eine mutierte Form von B ist, kann der Diebstahl des B’ im F—-Chromosom infolge der Rekombination nach der Konjugation zu B werden. Somit können genetische Marker von einem Wirt auf einen geeigneten Empfänger übertragen werden, dem solche Marker fehlen.

Die Reihenfolge, in der solche Marker an den Empfänger übertragen werden, würde der Reihenfolge folgen, in der sie im Spender vorhanden sind. Somit sind Konjugationsexperimente nützlich, um die Genkarten (Reihenfolge der Anordnung der Gene im Chromosom) von Organismen zu konstruieren.

Hayes (1952) fand einen E. coli-Stamm, bei dem die Rekombinationshäufigkeit 100- bis 1000-mal hoch war, wie von Lederberg berichtet. Der Stamm wurde als hochfrequenter rekombinanter (Hfr) Stamm bezeichnet.


BIOL230_Test2

Enzymatische Reaktion
Substrat (S) + Enzym (E) &rarr Enzym/Substrat-Komplex (ES) &rarr E + Produkt1 + Produkt2
(Beachten Sie, dass das bei der Reaktion verwendete Enzym auch eines der Endprodukte ist. Enzyme können etwa 1 Million Mal wiederverwendet werden.)

-Oxidation - wenn eine Chemikalie H+ und/oder e- verliert.
-Reduktion - wenn eine Chemikalie H+ und/oder e- gewinnt.
-Wenn eine Oxidation und Reduktion stattfindet, wird Energie freigesetzt, die dann gespeichert wird.

  • Ausgangsmaterial: 1 Molekül Glucose + 2 ATPs
  • Produkte : 2 Moleküle Brenztraubensäure + 10 ATPs
  • Die Glykolose der gesamten Atmung produziert 8 ATPs
  • Ausgangsmaterial: 1 Molekül Glucose + 2 ATPs
  • Produkte : 4 ATPs
  • Die gesamte Fermentationsglykolose produziert 2 ATPs
  • 4 ATPs werden direkt aus Glykolyse hergestellt
  • 2 Sätze von (2 H+ und 2 e-) werden an die ETS für insgesamt 6 ATPs gesendet
  • 2 ATPs werden verwendet, um den Prozess zu starten
  • 4 + 6 - 2 = 8 ATPs
  • 4 ATP's werden direkt aus . hergestellt
  • 2 ATPs werden verwendet, um den Prozess zu starten
  • 4 - 2 = 2 ATPs

Jede der 2 Brenztraubensäuren aus der Glykolose, die in den Kreb-Zyklus eingebracht werden, ergibt 5 Sätze (2 H+ und 2 e-), die zum ETS gehen, um jeweils 3 ATPs für insgesamt 30 ATPs zu geben

2 Brenztraubensäuren x 5 Sätze (2 H+ und 2 e-) x 3 ATPs hergestellt aus ETS = 30 ATPs

  • Enthält die Erbinformationen für alle lebenden Zellen.
  • Enthält den Code für alle Zellproteine.
  • RNA ist einzelsträngig, nicht doppelsträngig.
  • RNA hat die stickstoffhaltige Base von Uracil anstelle von Thymin (paart sich immer noch mit ADE).
  • RNA verwendet den Zucker Ribose in ihrem Zucker-Phosphat-Rückgrat anstelle von Desoxyribose.
  • Die meisten Bakterien müssen die zirkuläre DNA zerschneiden, um sie linear zu machen.
  • Ein Enzym schneidet die DNA an einem bestimmten Ausgangspunkt.
  • 2 abgeschnittene Enden der DNA heften sich an 2 Stellen auf der Zellmembran.
  • Die 2 DNA-Stränge wickeln sich ab.
  • Während sich die Stränge abwickeln, brechen die Wasserstoffbrücken zwischen den Basenpaaren, wodurch die stickstoffhaltigen Basen freigelegt werden.
  • Neue DNA-Nukleotide heften sich an die ursprünglich exponierten Nukleotide und bauen 2 neue komplementäre Stränge wieder auf.
  • An neuen komplementären Strängen werden neue Zucker/Phosphat-Rückgrate gebildet.
  • 2 neue Stränge zurückspulen.
  • 2 neue Stränge trennen sich von der Zellmembran.
  • 2 neue Stränge reformieren die zirkuläre Struktur.
  • 30s und 50s ribosomale Untereinheiten binden an m-RNA am "Start"-Codon (AUG).
  • Anfängliche "geladene" t-RNA mit komplementärem Anticodon (UAC) richtet sich mit dem Startcodon der mRNA aus.
  • Ein Codon ist eine Sequenz von 3 Basen auf mRNA, die für eine bestimmte Aminosäure kodieren.
  • Ein Anticodon ist eine Sequenz von 3 Basen auf der tRNA, die sich komplementär mit dem Codon auf der mRNA paart.
  • Eine "geladene" tRNA bezieht sich auf eine tRNA, die eine Aminosäure trägt.
  • Eine "ungeladene" tRNA bezieht sich auf eine tRNA, die keine Aminosäure trägt. Es hat die Aminosäure am Ribosom belassen, um das Protein aufzubauen.
  • 1. Eine zum 2. Codon komplementäre "geladene" tRNA bindet an das 2. Codon der mRNA.
  • 2. Die vorherige Aminosäure verlässt die 1. tRNA und bildet eine Peptidbindung mit der 2. Aminosäure auf der 2. t-RNA.
  • 3. Das Ribosom verschiebt den mRNA-Strang nach unten, so dass das nächste Codon vorhanden ist, um die entsprechende tRNA zusammen mit seiner Aminosäure aufzunehmen.
  • 4. Dann werden die ersten 3 Schritte wiederholt, bis das kodierte Protein vollständig ist.
  • Ribosom verschiebt sich zu einem Nonsense-Codon.
  • Aus der endgültigen t-RNA wird Protein freigesetzt.
  • Die ribosomalen Untereinheiten der 50er und 30er Jahre stammen von m-RNA ab.
  • Nein, alle Aminosäuren können mehr als 1 Codon haben, das dafür kodiert.
  • Außer das "Start"-Codon AUG, das nur für die Aminosäure Methionin kodiert, und das Codon UGG, das nur für Tryptophan kodiert.
  • 1 oder mehrere DNA-Basen werden mit einer anderen Base ausgetauscht, die für eine andere Aminosäure kodieren kann.
  • Normalerweise nicht schädlich, es sei denn, der Code ändert sich, um das Codon zu stoppen, oder ändert den Code für ein benötigtes Protein.
  • Sichelzellenanämie und Tay-Sachs-Krankheit.
  • 1 Base wird aus der Sequenz entfernt, was zu einer Verschiebung des Leserahmens führt. Die Rasterverschiebung beginnt an der Deletionsstelle und setzt sich entlang des DNA-Strangs fort.
  • Normalerweise tödlich für die Zelle.

Das Hinzufügen oder Löschen ganzer Codons ist normalerweise nicht schädlich.

  • Schritte 1 und 2 – Spenderbakterien sterben ab und werden abgebaut und hinterlassen DNA-Fragmente.
  • Schritt 3 – DNA-Fragmente eines toten Spenders dringen in ein lebendes kompetentes Empfängerbakterium ein.
  • Schritt 4 und 5 – Das Donor-DNA-Fragment wird gegen ein Stück der DNA des Empfängerbakteriums ausgetauscht.
  • Streptococcus pneumoniae - Hauptursache für Lungenentzündung beim Menschen.
  • 2 Stämme
  • Sanfte Belastung - macht Kapseln (schädlich)
  • Grobe Belastung - macht keine Kapseln (nicht schädlich)
  • Jeder hat von Natur aus die raue Belastung.
  • Wenn der glatte Stamm eingeführt wird, gehen die "glatten" Gene durch Transformation auf die rauen Stämme über.
  • Schritt 1 – Temperierte Phagen adsorbieren an Bakterium und injizieren ihr Genom.
  • Schritt 2 – Das Phagengenom fügt sich in das Nukleoid der Bakterien ein, um ein Prophagen zu werden.
  • Schritt 3 – Gelegentlich wird während der spontanen Induktion ein kleines Stück bakterieller Spender-DNA anstelle eines Teils der Phagen-DNA als Teil des Phagengenoms aufgenommen, und ein Teil der Phagen-DNA verbleibt im bakteriellen Nukleoid. (Ein Fehler bei der spontanen Induktion.)
  • Schritt 4 – Während sich der Phagen repliziert, repliziert das Stück bakterieller DNA als Teil des Phagengenoms. Jeder Phagen trägt jetzt diese bakterielle DNA.
  • Schritt 5 – Defekter Phagen adsorbiert an das Empfängerbakterium und injiziert das Genom.
  • Schritt 6 – Phagengenom, das DNA des Spenderbakteriums trägt, inseriert in das Nukleoid des Empfängerbakteriums.
  • Streptococcus pyogenes
  • 2 Stämme
  • Toxigener Stamm - produziert erythrogenes Toxin und verursacht Scharlach
  • Nicht toxischer Stamm - produziert kein erythrogenes Toxin, verursacht Strep Throat
  • Die Verwendung von Antibiotika zu Beginn der Infektion des nicht-toxigenen Stamms verringert das Fortschreiten in Richtung Scharlach, da Antibiotika den nicht-toxigenen Stamm abtöten, bevor sie durch die Transduktion in den toxigenen Stamm umgewandelt werden.
  • F+ Konjugation
  • Hfr-Konjugation (hohe Frequenz)
  • R-Plasmid-Konjugation (Resistenz-Plasmid)
  • Spenderbakterium ist F+ männlich (enthält genetischen Code für die F-Pilis-Produktion)
  • Das Empfängerbakterium ist F-weiblich (enthält keinen genetischen Code für die F-Pilis-Produktion).
  • Das Spenderbakterium erzeugt ein F+-Plasmid.
  • Plasmid ist ein doppelsträngiges DNA-Fragment, das für die f-pilis-Produktion kodiert.
  • Der Spender konjugiert mit dem Empfänger mit Sexpilis und überträgt 1 Strang des F+-Plasmids.
  • Sowohl Donor als auch Empfänger erstellen die komplementäre Kopie ihres Plasmidstrangs.
  • Beide Bakterien sind jetzt F+-Männchen und können ein Sexpilis bilden.
  • Es findet keine Übertragung von chromosomaler DNA statt.
  • Ein männlicher F+-Donor inseriert das F+-Plasmid in das Nukleoid, um ein Hfr-Männchen zu werden, und konjugiert mit einem F-weiblich über ein Geschlechtspilis.
  • Ein Donor-DNA-Strang am Ende gegenüber dem inserierten F+-Plasmid beginnt, in das Empfängerbakterium einzudringen.
  • Die Zellen brechen leicht auseinander, sodass normalerweise nur ein Teil des Spender-DNA-Strangs übertragen wird.
  • Der verbleibende DNA-Strang im Spender macht eine komplementäre Kopie und bleibt und bleibt Hfr-Männchen.
  • Ein Fragment des auf den Empfänger übertragenen DNA-Strangs erzeugt eine komplementäre Kopie.
  • Das Donor-DNA-Fragment wird gegen einen Teil der DNA des Empfängerbakteriums ausgetauscht.
  • Das Empfängerbakterium bleibt normalerweise ein F-weibliches (Transfer von chromosomaler DNA, aber nicht von Plasmid).
  • R-Plasmid = Resistenzplasmid.
  • Männliches Spenderbakterium mit R-Plasmid (multiple antibiotikaresistent und männlich) konjugiert mit Bakterium ohne R-Plasmid (antibiotikasensitiv und weiblich) mit Sexpilis.
  • Ein Strang des R-Plasmids wird auf das Empfängerbakterium übertragen.
  • Beide Bakterien bilden eine komplementäre Kopie des R-Plasmids.
  • Beide Bakterien besitzen R-Plasmide und sind mehrfach antibiotikaresistent und männlich.
  • Anatomische Barrieren
  • Reflexe und Sekrete
  • Unspezifische Körperchemikalie
  • Normal residente Mikroorganismen (Bakterien)
  • Entzündung
  • Die Haut ist eine physische Barriere, die nur sehr wenige Infektionen durchdringen können.
  • 3 Ausnahmen: Staphylococcus aureus , Tularämie (Kaninchenfieber) und Dermatophyten-Schimmelpilze (Tinea, Ringelflechte)

Haare dienen auch als physische Barriere.

Augenbrauen, Wimpern, Nasenhaare, Schamhaare, Ohrhaare

Was sind die Reflex- und/oder Sekretionsabwehr, die mit Folgendem verbunden sind:

1. Augen
2. Nase
3. Mund
4. Kehle
5. Magen
6. Darm
7. Harnwege
8. Vaginaltrakt
9. Gehörgang


Warum werden Hfr-Zellen als Hochfrequenz-Rekombinationszellen bezeichnet? - Biologie

Viren sind besondere Lebewesen, so besonders, dass sie früher nicht als Lebewesen erkannt wurden. Viren haben sogar keine Zellstruktur, keine Meiose und Mitose. Ihr genetisches Material ist DNA oder RNA, das virale Genom. Dieses Skript bietet eine Zusammenfassung der genetischen Mechanismen, die in Viren funktionieren, und einige der praktischen Implikationen, die sich daraus ergeben.

Es ist möglich, die molekulare Analyse von Virusgenomen in zwei Ansätze zu unterteilen:

  • Physikalische Analyse von Struktur und Nukleotidsequenz, im Wesentlichen in vitro durchgeführt.
  • Biologische Analyse der Struktur-Funktions-Beziehungen intakter Virusgenome und einzelner genetischer Elemente, meist unter Einbeziehung der Virus-Phänotyp-Analyse in vivo.

Die herkömmliche genetische Analyse von Tierviren basiert auf der Isolierung und Analyse von Mutanten unter Verwendung von Plaque-Reinigungstechniken. Bei Viren, die keine Plaques bilden, waren vor der Entwicklung der Molekulargenetik nur wenige genetische Analysen möglich, aber bestimmte Tricks ermöglichen es, diese genetischen Techniken beispielsweise auf solche Viren anzuwenden,

  • Fokale Immunoassays
  • Biochemische Analyse
  • Physikalische Analyse
  • Molekularbiologie
  • Bildung von transformierten 'Foci' von Zellen.
  • Rekombinationskarten
  • Sortimentskarten/Gruppen
  • Physische Karten
  • Beschränkungskarten
  • Transkriptionskarten
  • Übersetzungskarten

„Stamm“, „Typ“, „Variante“, „Mutant“ und sogar „Isolat“ sind alle Begriffe, die austauschbar verwendet werden, um sie von den ursprünglichen „Eltern-“, „Wildtyp“- oder „Straßen“-Viren zu unterscheiden. Nach den Mutagenesequellen gibt es zwei unterscheidbare Arten von Mutationen:

  • Spontane Mutationen, die natürlich in der Umwelt vorkommen
  • Induzierte Mutationen, die von Forschern mit Mutagenen erzeugt werden.

Beide oben genannten Mutationsarten können unterschiedliche Mutationsarten aufweisen:

  • Plaquemorphologie
  • Host-Bereich
  • Temperatursensitiv (t.s.)
  • Kälteempfindlich
  • Unsinn
  • Löschungen
  • Biochemische Marker
  • Revertanten

Genetische Wechselwirkungen zwischen Viren:

  • Allelische (intragene) Komplementation: verschiedene Mutanten haben komplementäre Defekte im gleichen Protein.
  • Nicht-allelische (intergene) Komplementation: Mutanten mit Defekten in verschiedenen Genen.

  • Heterozygote
  • Interferenz
  • Unterdrückung
  • Phänotypisches Mischen
  • Pseudotypisierung

Einige Vergleiche genetischer Mechanismen und ihrer Anwendungen zwischen verschiedenen lebenden Organismen wurden in MITOPENCOURSEWARE (PDF) geschrieben.

Vorlesung 19. Bakterielle Plasmide und Konjugation

Bakterien sind typische Vertreter von Prokaryonten. Prokaryonten haben eine Zellstruktur und ihre DNA ist in einer sogenannten nukleoiden Region konzentriert. Im Gegensatz zu Eukaryoten haben Bakterien jedoch weder Meiose noch Mitose.

Alle Eigenschaften der Zelle, einschließlich ihrer Virulenz, Pathogenität und Antibiotikaresistenz, werden durch ihr Genom bestimmt. Dies wird durch die spezifischen Sequenzen von Nukleotidbasen in der DNA kodiert. Denken Sie daran, dass die bakterielle DNA eine einzelne, zirkuläre ds-DNA ist, die KEINE Kernmembran und KEINE Histone hat. E. coli ist eine Ausnahme, da seine DNA ein unregelmäßig gewundenes Bündel ist, das frei im Zytoplasma liegt.

Zusätzlich zur Haupt-ds-DNA können einige Bakterienzellen auch ein oder mehrere extrachromosomale Elemente tragen, die kreisförmig erscheinen und als PLAMIDS bezeichnet werden.

Plasmide replizieren UNABHÄNGIG vom Hauptchromosom in der Zelle. Sie tragen zusätzliche genetische Informationen, die für bestimmte Eigenschaften wie Antibiotikaresistenz oder die Fähigkeit, raue Umgebungen zu überleben, kodieren.

Eine dritte Quelle für genetische Informationen in den Bakterienzellen liefern BAKTERIOPHAGEN. Diese werden auch als bakterielle Viren bezeichnet. Sie bestehen aus einem viralen Genom, das von einer Proteinhülle umgeben ist. Sie brauchen einen bakteriellen Wirt, um sich zu vermehren, und wenn sie dies tun, führen sie zum Absterben der Bakterienzelle. In einigen Fällen können sie jedoch LYSOGENIE unterzogen werden. Dies ist eine kontrollierte, langfristige Replikation innerhalb der Bakterienzelle, ohne die Lyse der Bakterienzelle zu verursachen. Auf diese Weise kann es zu einem temporären Teil der Zelle werden und die Eigenschaften der Bakterienzelle verändern.

Vergleich zwischen den 3 Arten von genetischen Informationsquellen in der Bakterienzelle
Genetisches Element TYP Aufbau Größe in kb
Chromosom DNA ds kreisförmig 2,0 bis 4,0 x 10
Plasmide DNA ds kreisförmig 9 bis 60
Bakteriophagen RNA/DNA ss/ds Linear/Kreis 3 bis 40

Es gibt drei Hauptmechanismen der genetischen Rekombination (Erbguttransfer in einen HOST-Organismus) bei Bakterien, die in der Natur und auch unter Laborbedingungen vorkommen: Konjugation, Transformation und Transduktion.

KONJUGATION Dies ist der wichtigste Mechanismus für die weit verbreitete Übertragung genetischer Informationen zwischen Bakterien. Es ist der direkte Transfer von bakterieller DNA zwischen Organismen und erfordert ZELL-ZELLE-KONTAKT.

Die meisten Konjugationen sind PLASMID-VERMITTELT.

PLASMIDE sind kleine, kreisförmige ds-DNA-Moleküle mit einer Größe von etwa 2-10 Kilobasen. Sie alle haben die Fähigkeit, sich in Bakterien zu vermehren. In einer Wirtszelle können mehrere Kopien von Plasmiden gefunden werden, jedoch können sich nicht alle Plasmide selbst übertragen.

Ein KONJUGATIVES Plasmid enthält die Codes für die Gene, die den Transfer zwischen Zellen ermöglichen.

Ein NICHT KONJUGATIVES Plasmid benötigt die Hilfe eines konjugativen Plasmids, um sich auf ein anderes Bakterium zu übertragen.

PLASMIDE MIT NARROW-HOST RANGE existieren nur innerhalb einer einzigen Art.

BROAD-HOST RANGE PLASMIDE kommen in verschiedenen Gattungen von Organismen vor.

  1. 1. Ein ORI oder Replikationsursprung, der eine autonome Replikation ermöglicht.
  2. 2. Ein oder mehrere Gene, die eine spezifische Antibiotikaresistenz verleihen.
  3. 3. Stellen für Restriktionsendonukleasen, die zum Einfügen spezifischer DNA-Fragmente verwendet werden.
  4. 4. Code für Virulenzfaktoren wie Toxine oder Adhäsionen

Plasmide, die eine Konjugation vermitteln können, tragen Gene, die für die Produktion eines PILUS kodieren, eines Proteinanhangs, der sich auf der Oberfläche der Spenderzellen befindet. Bakterien, die diese Plasmide tragen, werden als F(+)-Zellen bezeichnet und sind damit die Spenderzellen. Die Spitze des Pilus heftet sich an die Oberfläche der Empfängerzelle und es findet ein DNA-Transfer statt. Es ist unklar, ob die DNA durch den Pilus übertragen wird oder ob der Pilus als Mechanismus zum Zusammenhalten der beiden Zellen dient. So oder so, dies ist der Grund, warum es auch als BAKTERIELLER SEX bezeichnet wird.

Sobald die Empfängerzelle das F-Plasmid erwirbt, ändert sie sich von einer F(-)- zu einer F (+)-Zelle, wodurch sie jetzt eine Spenderzelle werden kann.

In einem sehr kleinen Teil der Zellen wird das F-Plasmid in das Bakterienchromosom eingebaut. Einmal eingefügt, verhält sich das gesamte Bakterienchromosom wie ein F-Plasmid. Diese werden dann als Hochfrequenz-Rekombinationsstämme (Hfr-Stämme) bezeichnet. Dies führt zu 2 Prozessen:

  1. 1. Das F-Plasmid und die gesamte bakterielle DNA werden mit einer F(-)-Zelle konjugiert.
  2. 2. Das F-Plasmid wird zusammen mit einem Teil der bakteriellen DNA ausgeschnitten, daher wird das F-Plasmid als F-Prime (F’) bezeichnet.

Zum Beispiel ist das F-lac-Plasmid ein F’-Plasmid, das die Gene für das E.coli-Lactose-Operon trägt. Wenn dieses Plasmid auf Nicht-Laktosebildner übertragen wird, werden sie in Laktosefermenter umgewandelt.

Beachten Sie, dass das F-Plasmid auf die Gattung Escherichia und andere eng verwandte Darmbakterien beschränkt ist.

Um Tests auf Dominanz oder Komplementation in Bakterien mittels Konjugation durchzuführen, siehe ( PDF)*.

Vorlesung 20. Bakterielle Transformation

Transformation ist ein Prozess, bei dem genetisches Material aus der Umwelt zu einem Teil der bakteriellen DNA hinzugefügt wird. Die DNA kann auch ein vorhandenes Gen oder einen Teil davon aus dem Genom der Bakterien ersetzen, was zum Verlust der Aktivität dieses Gens führt.

Zum ersten Mal wurde die Transformation 1928 von Frederick Griffith, einem englischen Bakteriologen auf der Suche nach einem Impfstoff gegen bakterielle Lungenentzündung, nachgewiesen. Griffith entdeckte, dass ein nicht-virulenter Stamm von Streptococcus pneumoniae durch Exposition gegenüber virulenten S. pneumoniae-Stämmen, die durch Hitze abgetötet wurden, in einen virulenten umgewandelt werden konnte. 1944 wurde nachgewiesen, dass der transformierende Faktor genetisch bedingt war, als Oswald Avery, Colin MacLeod und Maclyn McCarty einen Gentransfer in S. pneumoniae zeigten. Avery, Macleod und McCarty nannten die Aufnahme und den Einbau von DNA durch Bakterien "Transformation".

Bakterielle Transformation kann als stabile genetische Veränderung durch Aufnahme von nackter DNA (DNA ohne assoziierte Zellen oder Proteine) bezeichnet werden, und Kompetenz bezieht sich auf den Zustand, exogene DNA aus der Umgebung aufnehmen zu können. Dabei sind zwei unterschiedliche Kompetenzformen zu unterscheiden: natürliche und künstliche.

Natürliche Kompetenz Einige Bakterien (etwa 1 % aller Arten) sind von Natur aus in der Lage, DNA unter Laborbedingungen aufzunehmen, viele andere können sie in ihrer natürlichen Umgebung aufnehmen. Solche Spezies tragen Sätze von Genen, die die Maschinerie spezifizieren, um DNA durch die Membran oder Membranen der Zelle zu bringen.[2]

Natürliche Kompetenz Künstliche Kompetenz ist nicht in den Genen der Zelle verankert. Stattdessen wird es durch Laborverfahren induziert, bei denen Zellen passiv für DNA durchlässig gemacht werden, wobei Bedingungen verwendet werden, die normalerweise in der Natur nicht vorkommen.[3]

Elektroporation ist eine weitere Möglichkeit, Löcher in Bakterienzellen (und andere) zu bohren, indem man sie kurz mit einem elektrischen Feld von 10-20 kV/cm schockt. Durch diese Löcher kann Plasmid-DNA in die Zelle eindringen. Dieses Verfahren kann mit großer Plasmid-DNA verwendet werden. [4] Natürliche Membranreparaturmechanismen werden diese Löcher nach dem Schock schnell schließen.

Plasmidtransformation Um in der Zelle zu persistieren und stabil gehalten zu werden, muss ein Plasmid-DNA-Molekül einen Replikationsursprung enthalten, der es ermöglicht, in der Zelle unabhängig vom Chromosom repliziert zu werden. Da die Transformation normalerweise eine Mischung aus seltenen transformierten Zellen und reichlich nicht-transformierten Zellen erzeugt, ist ein Verfahren erforderlich, um die Zellen zu identifizieren, die das Plasmid erworben haben. Plasmide, die in Transformationsexperimenten verwendet werden, enthalten normalerweise auch ein Gen, das eine Resistenz gegen ein Antibiotikum verleiht, für das der beabsichtigte Empfängerbakterienstamm empfindlich ist. Zellen, die auf Medien wachsen können, die dieses Antibiotikum enthalten, werden durch das Plasmid transformiert, da Zellen, denen das Plasmid fehlt, nicht wachsen können.

Ein weiterer Marker, der zur Identifizierung von E. coli-Zellen verwendet wird, die rekombinante Plasmide erworben haben, ist das lacZ-Gen, das für β-Galactosidase kodiert. Da β-Galactosidase ein Homotetramer ist, wobei jedes Monomer aus einem lacZ-α und einem lacZ-ω Protein besteht, wenn nur eines der beiden erforderlichen Proteine ​​in der resultierenden Zelle exprimiert wird, keine Funktion Enzym gebildet wird. Wenn also ein E. coli-Stamm ohne lacZ-α in seinem Genom transformiert wird, unter Verwendung eines Plasmids, das das fehlende Genfragment enthält, produzieren transformierte Zellen β-Galactosidase, während untransformierte Zellen dies nicht tun, da sie nur in der Lage, die Omega-Hälfte des Monomers zu produzieren. Bei dieser Art der Transformation liegt die Polylinker-Region des Plasmids im lacZ-α-Genfragment, was bedeutet, dass bei erfolgreich produzierten rekombinanten Plasmiden das gewünschte Gen irgendwo innerhalb von lacZ-α eingefügt wird. Wenn dieses zerstörte Genfragment von E. coli exprimiert wird, wird kein verwendbares lacZ-α-Protein produziert und daher wird keine verwendbare β-Galactosidase gebildet. Bei Kultur auf Medien, die den farblosen, modifizierten Galaktosezucker X-gal enthalten, erscheinen Kolonien, die das Substrat verstoffwechseln können (und die daher transformiert wurden, jedoch nicht durch rekombinante Plasmide), in farbigen Kolonien, die nicht in der Lage sind, das Substrat zu verstoffwechseln, blau Substrat (und die daher durch rekombinante Plasmide transformiert wurden) erscheinen weiß.

Transformation in Pflanzen und Tieren Transformation ist heute eine Rutin-Technik, die in vielen molekularbiologischen Labors verwendet wird, um DNA in Pflanzen- und Tierzellen zu übertragen. Für Pflanzenzellen stehen eine Reihe von Transformationsmechanismen zur Verfügung:

    Vermittelte Transformation ist die einfachste und einfachste Pflanzentransformation. Diese Bakterien können Pflanzengewebe infizieren und ihre DNA in Zellen einiger Pflanzenarten einschleusen. : Beschichten Sie kleine Gold- oder Wolframpartikel mit DNA und schießen Sie sie in junge Pflanzenzellen oder Pflanzenembryonen. Ein Teil des genetischen Materials bleibt in den Zellen und transformiert sie. : Durch Elektroschock vorübergehende Löcher in Zellmembranen machen. Dies ermöglicht DNA, wie oben für Bakterien beschrieben, einzudringen. (Transduktion): Verpacken Sie das gewünschte genetische Material in ein geeignetes Pflanzenvirus und lassen Sie dieses modifizierte Virus die Pflanze infizieren. Wenn das genetische Material DNA ist, kann es mit den Chromosomen rekombinieren, um transformierte Zellen zu produzieren.

Grundsätzlich sind die Transformationsmechanismen der Tiere ähnlich. Das Einbringen von DNA in tierische Zellen wird gewöhnlich als Transfektion bezeichnet.

21. Bakterielle Transduktion

Wie oben erwähnt, ist die Transduktion einer von drei Mechanismen der genetischen Rekombination in Bakterien, die in der Natur und auch unter Laborbedingungen vorkommen. Mit anderen Worten, Transduktion ist ein Vorgang, bei dem Nukleinsäure von einem Organismus mittels eines intermediären Virus in einen anderen lebenden Organismus übertragen werden kann.

Mit anderen Worten, Transduktion ist der Phagen-vermittelte Transfer von bakterieller DNA.

Phagen sind bakterielle Viren mit einem DNA-Molekül, das in einer Proteinhülle eingeschlossen ist. Die Struktur der Proteinhülle schränkt die DNA-Menge ein, die vom Virus eingeschlossen werden kann, normalerweise etwa 50 Kilobasen.

Die meisten Phagen tragen ds-DNA aufgewickelt in einer Proteinhülle. Es kann auch Arten von Phagen geben, die eine ss-DNA oder ss-RNA aufweisen.

Es gibt zwei Arten von Transduktionen:

Wenn Phagen in eine Bakterienzelle eindringen und sich replizieren, besitzt jeder Phagenkopf normalerweise eine Kopie des replizierten Phagengenoms. Manchmal wird ein leerer Phagenkopf produziert. Bakterielle DNA kann fälschlicherweise in diesen leeren Phagenkopf verpackt und dann in eine andere Bakterienzelle übertragen werden. Somit ist die DNA, die in die zweite Bakterienzelle eindringt, ein kurzer Abschnitt des Chromosoms der ersten Bakterienzelle. Wie bei der Transformation muss eine Rekombination stattfinden, damit die Transduktion erfolgreich ist.

Es wird als generalisiert bezeichnet, da der Phagen zufällig einen beliebigen Teil des Bakterienchromosoms aufnimmt. (Es ist nicht spezifisch für ein bestimmtes Chromosomensegment.)

Die Gene können nur innerhalb einer bestimmten Spezies übertragen werden, da Phagen normalerweise nur eine begrenzte Anzahl von Bakterien angreifen.

Phagen können auch Plasmid-DNA aufnehmen und übertragen. Beispielsweise befindet sich das Penicillinase-Gen von Staphlokokken in einem Plasmid, und die Phagen können dieses Plasmid aufnehmen und durch Transduktion an eine andere Zelle weitergeben, wodurch das Penicillanase-Gen auf andere Staphylokokken-Spezies übertragen wird.

Bakteriophagen, die die Wirtszelle lysieren, werden als virulente Phagen bezeichnet und verursachen einen lytischen Infektionszyklus. Im Gegensatz dazu werden Phagen, die eine Bakterienzelle infizieren können, ohne ihren Tod zu verursachen, als gemäßigte Phagen bezeichnet.

Die Bakterienzelle, die nach einer Phageninfektion überlebt, wird als Lysogen bezeichnet, und der darin integrierte gemäßigte Phagen wird als Prophagen bezeichnet.

Die Phagen-DNA wird dann in die Bakterienzell-DNA eingefügt und auch als Teil des Wirtszell-Chromosoms repliziert.

Wenn eine Bakterienzelle von einem Phagen infiziert wird, kann kein anderer Phagen die Bakterien angreifen, denn sobald der Phagen in die Bakterienzell-DNA integriert ist, verleiht er Immunität gegen eine Superinfektion durch andere Phagen.

Die Lysogenphase ist stabil, aber nicht permanent. Wenn der Prophagen während des Replikationsprozesses ausgeschnitten wird, kann die Bakterienzelle schließlich lysiert werden. Dies kann im Labor repliziert werden, indem Bakterien UV-Licht ausgesetzt werden. (zB Krankenhaussterilisation von Räumen mit UV.)

Im Gegensatz zur generalisierten Transduktion haben temperierte Phagen normalerweise eine spezifische Insertionsstelle auf dem Chromosom und können nur eine kurze DNA-Länge mit einigen Genen auf beiden Seiten dieser Stelle aufnehmen. Daher wird sie als spezialisierte oder restriktive Transduktion bezeichnet.

Es können defekte Phagen auftreten. Da es sich an das bakterielle DNA-Chromosom anheftet und DNA neben der Phagenintegrationsstelle aufnimmt, kann die DNA-Menge zu groß sein, so dass dem Phagen einige Phagengene fehlen. Wenn dieser defekte Phagen in eine zweite Bakterienzelle transduziert wird, kann sich der Phagen immer noch in seine phagenspezifische Stelle integrieren, aber er kann sich weder normal replizieren noch kann er die Bakterienzelle lysieren. Das Endprodukt ist die Integration der DNA der 1. Bakterienzelle in die DNA der 2. Bakterienzelle.

Wie beeinflusst die Transduktion die Virulenz der Bakterien für den Menschen? Da der Prophagen Gene trägt, kann seine Anwesenheit in einer Bakterienzelle die Expression bestimmter Proteine ​​verursachen. Dies wird als lysogene Umwandlung bezeichnet. Zum Beispiel wird das Diphtherie-Toxin von Corynebacterium diptheriae nur produziert, wenn der Beta-Phage die Bakterien infiziert.

Eine weitere häufige Verwendung für die Phagen sind die Lambda-Phagen von E. coli. Sie haben ein Genom von 50 Kilobasen, aber sobald die nicht essentiellen Gene entfernt wurden, sind sie auf 30 Kilobasen reduziert, wodurch Platz für das Einfügen fremder DNA geschaffen wird. Der Phagen infiziert dann E. coli, das sich wiederum zusammen mit dem Phagen (Phagen-synthetisierende Fabrik) repliziert, dann wird die E. coli-Zelle lysiert und die Phagen infizieren andere Zellen.

E.coli ist der ideale Wirt, da es sich alle 20 Minuten repliziert. Außerdem weist E.coli alle unterschiedlichen Phasen in der Bakterienwachstumskurve auf, sodass sein Wachstum im Labor überwacht werden kann.

Die Transduktion kann sowohl zur Genmanipulation als auch zur genetischen Analyse verwendet werden, wie experimentell im Vortrag von MITOPENCOURSEWARE ( PDF) gezeigt wurde.

Vorlesung 22. Bakterielle Transposition

Transposition ist eine Bewegung von sogenannten Transposons, das sind Sequenzen von DNA, die sich innerhalb des Genoms einer einzelnen Zelle an verschiedene Positionen bewegen können. Dabei können sie Mutationen verursachen und die DNA-Menge im Genom verändern. Transposons wurden früher auch als "springende Gene" bezeichnet und sind Beispiele für mobile genetische Elemente. Sie wurden von Barbara McClintock zu Beginn ihrer Karriere[1] entdeckt und erhielt dafür 1983 den Nobelpreis. Es gibt eine Vielzahl mobiler genetischer Elemente, die nach ihrem Transpositionsmechanismus gruppiert werden können. Mobile genetische Elemente der Klasse I oder Retrotransposons bewegen sich im Genom, indem sie in RNA und dann durch reverse Transkriptase zurück in DNA transkribiert werden, während mobile genetische Elemente der Klasse II sich direkt von einer Position zu einer anderen innerhalb des Genoms bewegen, indem sie eine Transposase verwenden, um "cut and fügen Sie sie in das Genom ein. Transposons sind für Forscher sehr nützlich, um die DNA in einem lebenden Organismus zu verändern. Transposons machen einen großen Teil der Genomgrößen aus, was sich an den C-Werten eukaryontischer Arten ablesen lässt.

Transposons werden aufgrund ihres Transpositionsmechanismus in zwei Klassen eingeteilt: Retrotranspositionen und DNA-Transposons.

Retrotransposons funktionieren, indem sie sich selbst kopieren und Kopien an mehreren Stellen wieder in das Genom einfügen. Retrotransposons kopieren sich zunächst selbst in RNA (Transkription), aber zusätzlich zur Transkription wird die RNA durch eine reverse Transkriptase (oft durch das Transposon selbst kodiert) in DNA kopiert und wieder in das Genom eingefügt.

Retrotransposons verhalten sich sehr ähnlich wie Retroviren wie HIV, was einen Hinweis auf den möglichen evolutionären Ursprung solcher Viren gibt.

Es gibt drei Hauptklassen von Retrotransposons:

  • Viral: Reverse Transkriptase codieren (um RNA in DNA umzuwandeln), haben lange terminale Wiederholungen (LTRs), ähnlich wie Retroviren. : kodieren für reverse Transkriptase, fehlen LTRs, transkribiert durch RNA-Polymerase II.
  • Nichtvirale Superfamilie: kodiert nicht für Reverse Transkriptase, die von RNA-Polymerase III transkribiert wird.

Retroviren als transponierbare Elemente

Retroviren wurden erstmals vor 80 Jahren als an der Entstehung von Krebs beteiligte Erreger identifiziert. In jüngerer Zeit wurde gezeigt, dass die AIDS-Epidemie auf das HIV-Retrovirus zurückzuführen ist. In den frühen 1970er Jahren wurde entdeckt, dass Retroviren die Fähigkeit besitzen, ihre RNA-Genome durch Umwandlung in DNA zu replizieren, die stabil in die DNA der Wirtszelle integriert wird. Retroviren wurden erst vor relativ kurzer Zeit als besonders spezialisierte Formen eukaryontischer Transposons erkannt. Tatsächlich handelt es sich um Transposons, die sich über RNA-Zwischenprodukte bewegen, die normalerweise die Wirtszellen verlassen und andere Zellen infizieren können. Die integrierte DNA-Form (Provirus) des Retrovirus weist eine deutliche Ähnlichkeit mit einem Transposon auf.

Der Transpositionszyklus von Retroviren weist andere Ähnlichkeiten mit prokaryotischen Transposons auf, und dies legt eine entfernte familiäre Verwandtschaft zwischen diesen beiden Transposontypen nahe. Entscheidende Zwischenprodukte bei der Retrovirustransposition sind extrachromosomale DNA-Moleküle. Diese werden durch Kopieren der RNA des Viruspartikels in DNA durch eine Retrovirus-kodierte Polymerase namens Reverse Transkriptase erzeugt. Die extrachromosomale lineare DNA ist der direkte Vorläufer des integrierten Elements und der Insertionsmechanismus weist eine starke Ähnlichkeit mit der Transposition "Ausschneiden und Einfügen" auf.

Der Hauptunterschied zwischen Klasse-II-Transposons und Retrotransposons besteht darin, dass ihr Transpositionsmechanismus kein RNA-Zwischenprodukt umfasst. Transposons der Klasse II bewegen sich normalerweise nach einem Mechanismus, der dem Ausschneiden und Einfügen, anstatt dem Kopieren und Einfügen, unter Verwendung des Transposase-Enzyms analog ist. Verschiedene Arten von Transposasen wirken auf unterschiedliche Weise. Einige können an jeden Teil des DNA-Moleküls binden, und die Zielstelle kann daher überall sein, während andere an spezifische Sequenzen binden. Transposase führt einen versetzten Schnitt an der Zielstelle durch, wodurch klebrige Enden erzeugt werden, schneidet das Transposon aus und ligiert es in die Zielstelle. Eine DNA-Polymerase füllt die entstandenen Lücken an den klebrigen Enden und DNA-Ligase schließt das Zucker-Phosphat-Rückgrat. Dies führt zu einer Duplikation der Zielstelle und die Insertionsstellen von DNA-Transposons können durch kurze direkte Wiederholungen (einen gestaffelten Schnitt in der Ziel-DNA, die von DNA-Polymerase gefüllt werden) gefolgt von invertierten Wiederholungen (die für die Transposon-Exzision durch Transposase wichtig sind) identifiziert werden. Die Duplikationen an der Zielstelle können zu Genduplikationen führen, und dies soll eine wichtige Rolle in der Evolution spielen[2]:284 .

Nicht alle DNA-Transposons transponieren durch den Cut-and-Paste-Mechanismus. In einigen Fällen wird eine replikative Transposition beobachtet, bei der ein Transposon sich selbst an eine neue Zielstelle repliziert.

Die Transposons, die sich nur durch Ausschneiden und Einfügen bewegen, können sich selbst duplizieren, wenn die Transposition während der S-Phase des Zellzyklus erfolgt, wenn die "Donor"-Stelle bereits repliziert wurde, die "Ziel"-Stelle jedoch nicht.

Beide Transposonklassen können ihre Fähigkeit verlieren, reverse Transkriptase oder Transposase durch Mutation zu synthetisieren, aber weiterhin durch das Genom springen, weil andere Transposons immer noch das notwendige Enzym produzieren.

Transposons verursachen Krankheiten Transposons sind Mutagene. Sie können das Genom ihrer Wirtszelle auf unterschiedliche Weise schädigen:

  • Ein Transposon oder Retroposon, das sich selbst in ein funktionelles Gen einfügt, wird dieses Gen höchstwahrscheinlich deaktivieren.
  • Nachdem ein Transposon ein Gen verlässt, wird die entstandene Lücke wahrscheinlich nicht korrekt repariert.
  • Mehrere Kopien derselben Sequenz, wie z. B. Alu-Sequenzen, können eine präzise Chromosomenpaarung während der Mitose und Meiose behindern, was zu ungleichen Überkreuzungen führt, einem der Hauptgründe für die Chromosomenduplikation.

Zu den Krankheiten, die häufig durch Transposons verursacht werden, gehören Hämophilie A und B, schwere kombinierte Immunschwäche, Porphyrie, Prädisposition für Krebs und Duchenne-Muskeldystrophie.

Außerdem enthalten viele Transposons Promotoren, die die Transkription ihrer eigenen Transposase vorantreiben. Diese Promotoren können eine abweichende Expression verknüpfter Gene verursachen, die Krankheiten oder mutante Phänotypen verursachen.

Evolution von Transposons Die Evolution von Transposons und ihr Einfluss auf die Genomevolution ist derzeit ein dynamisches Forschungsgebiet.

Transposons kommen in allen wichtigen Lebensbereichen vor. Sie können ihren Ursprung im letzten universellen gemeinsamen Vorfahren haben oder nicht, oder sie sind mehrmals unabhängig voneinander entstanden oder sind vielleicht einmal entstanden und haben sich dann durch horizontalen Gentransfer auf andere Königreiche ausgebreitet[7]. Während Transposons ihren Wirten einige Vorteile verleihen können, werden sie im Allgemeinen als egoistische DNA-Parasiten angesehen, die im Genom von zellulären Organismen leben. Auf diese Weise ähneln sie Viren. Viren und Transposons teilen auch Merkmale in ihrer Genomstruktur und biochemischen Fähigkeiten, was zu Spekulationen führt, dass sie einen gemeinsamen Vorfahren haben.

Da eine übermäßige Transposon-Aktivität ein Genom zerstören kann, scheinen viele Organismen Mechanismen entwickelt zu haben, um die Transposition auf ein beherrschbares Maß zu reduzieren. Bakterien können als Teil eines Mechanismus zur Entfernung von Transposons und Viren aus ihren Genomen hohe Raten von Gendeletionen durchlaufen, während eukaryotische Organismen möglicherweise den RNA-Interferenzmechanismus (RNAi) entwickelt haben, um die Transposon-Aktivität zu reduzieren. Auch beim Nematoden Caenorhabditis elegans reduzieren einige für RNAi benötigte Gene die Transposon-Aktivität.

Transposons könnten vom Immunsystem der Wirbeltiere als Mittel zur Herstellung von Antikörperdiversität kooptiert worden sein. Das V(D)J-Rekombinationssystem arbeitet nach einem Mechanismus ähnlich dem von Transposons.

Es gibt Hinweise darauf, dass transponierbare Elemente als Mutatoren in Bakterien wirken können.

Anwendungen Das erste Transposon wurde in der Pflanze Mais (Zea mays, Maisart) entdeckt und wird als Dissoziator (Ds) bezeichnet. Ebenso stammte das erste molekular isolierte Transposon aus einer Pflanze (Snapdragon). In geeigneter Weise sind Transposons ein besonders nützliches Werkzeug in der Molekularbiologie von Pflanzen. Forscher verwenden Transposons als Mittel zur Mutagenese. Dabei springt ein Transposon in ein Gen und erzeugt eine Mutation. Die Anwesenheit des Transposons stellt ein einfaches Mittel zur Identifizierung des mutierten Allels im Vergleich zu chemischen Mutageneseverfahren bereit.

Manchmal kann die Insertion eines Transposons in ein Gen die Funktion dieses Gens auf reversible Weise unterbrechen. Transposase-vermittelte Exzision des Transposons stellt die Genfunktion wieder her. Dadurch entstehen Pflanzen, in denen benachbarte Zellen unterschiedliche Genotypen aufweisen. Diese Funktion ermöglicht es Forschern, zwischen Genen zu unterscheiden, die innerhalb einer Zelle vorhanden sein müssen, um zu funktionieren (zellautonom) und Genen, die in anderen Zellen als denen, in denen das Gen exprimiert wird, beobachtbare Wirkungen hervorrufen.

Transposons sind auch ein weit verbreitetes Werkzeug für die Mutagenese der meisten experimentell kontrollierbaren Organismen.

Vorlesung 23. Rekombinante DNA in Bakterien

Rekombinante DNA ist die allgemeine Bezeichnung dafür, ein Stück einer DNA zu nehmen und es mit einem anderen DNA-Strang zu kombinieren. Rekombinante DNA wird manchmal auch als "Chimäre" bezeichnet. Durch die Kombination von zwei oder mehr verschiedenen DNA-Strängen können Wissenschaftler einen neuen DNA-Strang erstellen. Der gebräuchlichste rekombinante Prozess beinhaltet die Kombination der DNA von zwei verschiedenen Organismen.

Es gibt drei verschiedene Methoden, mit denen rekombinante DNA hergestellt wird. Sie sind Transformation, Phagen-Einführung und nicht-bakterielle Transformation. Siehe Bakterielle Transformation im Skript 20. Die nicht-bakterielle Transformation ist ein Prozess, der der oben beschriebenen Transformation sehr ähnlich ist. Der einzige Unterschied zwischen den beiden besteht darin, dass nicht-bakteriell keine Bakterien wie E. coli für den Wirt verwendet.

Bei der Mikroinjektion wird die DNA direkt in den Zellkern der zu transformierenden Zelle injiziert. In der Biolistik werden die Wirtszellen mit Hochgeschwindigkeits-Mikroprojektilen wie mit DNA beschichteten Gold- oder Wolframpartikeln beschossen.

Die Einführung von Phagen ist der Vorgang der Transfektion, der der Transformation entspricht, außer dass ein Phagen anstelle von Bakterien verwendet wird. In-vitro-Verpackungen eines Vektors werden verwendet. Dieses verwendet Lambda- oder MI3-Phagen, um Phagenplaques zu produzieren, die Rekombinanten enthalten. Die erzeugten Rekombinanten können anhand verschiedener Selektionsverfahren durch Unterschiede in den Rekombinanten und Nicht-Rekombinanten identifiziert werden.

Rekombinante DNA funktioniert, wenn die Wirtszelle Protein aus den rekombinanten Genen exprimiert.

Eine signifikante Menge an rekombinantem Protein wird vom Wirt nicht produziert, es sei denn, Expressionsfaktoren werden hinzugefügt. Die Proteinexpression hängt davon ab, dass das Gen von einer Sammlung von Signalen umgeben ist, die Anweisungen für die Transkription und Translation des Gens durch die Zelle liefern. Diese Signale umfassen den Promotor, die Ribosomenbindungsstelle und den Terminator. Expressionsvektoren, in die die Fremd-DNA eingefügt wird, enthalten diese Signale. Signale sind artspezifisch. Im Fall von E. coli müssen diese Signale E. coli-Signale sein, da es unwahrscheinlich ist, dass E. coli die Signale menschlicher Promotoren und Terminatoren versteht. Es treten Probleme auf, wenn das Gen Introns enthält oder Signale enthält, die als Terminatoren für einen bakteriellen Wirt wirken. Dies führt zu einer vorzeitigen Beendigung, und das rekombinante Protein kann nicht korrekt prozessiert, korrekt gefaltet oder sogar abgebaut werden. Die Produktion rekombinanter Proteine ​​in eukaryontischen Systemen erfolgt im Allgemeinen in Hefe und Fadenpilzen. Die Verwendung tierischer Zellen ist schwierig, da viele im Gegensatz zu Bakterien eine feste Trägeroberfläche benötigen und komplexe Wachstumsbedürfnisse haben. Einige Proteine ​​sind jedoch zu komplex, um in Bakterien hergestellt zu werden, daher müssen eukaryontische Zellen verwendet werden. Rekombinante DNA hat in den letzten Jahren an Bedeutung gewonnen, und rekombinante DNA wird erst im 21. Im Folgenden sind einige der Bereiche aufgeführt, in denen rekombinante DNA einen Einfluss haben wird.

  • Bessere Ernten (Dürre & Hitzebeständigkeit)
  • Rekombinante Impfstoffe (d. h. Hepatitis B)
  • Vorbeugung und Heilung von Sichelzellenanämie
  • Vorbeugung und Heilung von Mukoviszidose
  • Produktion von Gerinnungsfaktoren
  • Produktion von Insulin
  • Herstellung rekombinanter Arzneimittel
  • Pflanzen, die ihre eigenen Insektizide produzieren
  • Keimbahn- und somatische Gentherapie

Klicken Sie jetzt auf (PDF), um zu sehen, wie Experimente zum Klonen von Genen und zum Klonen durch Komplementation in Bakterien durchgeführt werden.

Vorlesung 24. Genregulation in Prokaryoten

Bei Prokaryoten ist die Genregulation notwendig, weil eine Zelle für maximale Effizienz in der Lage sein muss,

  1. 1. Kontrolle der Menge der produzierten Genprodukte.
    • Einige werden in großen Mengen benötigt.
      • ribosomale Proteine
    • Einige werden nur in geringen Mengen benötigt.
      • viele Enzyme
  2. 2. auf die Umwelt reagieren, indem sie bestimmte Gene oder Gengruppen ein- oder ausschalten.
    • das Lac-Operon, Hitzeschock-Gene
  3. 3. Schalten Sie Gene im richtigen zeitlichen Muster ein und aus.
    • Phagen- oder Virusinfektion, Entwicklung

Es gibt drei Hauptebenen der Genregulation

  1. 1. Kontrolle der RNA-Häufigkeit (transkriptionelle Regulation)
    • Initiierung, Dehnung, Stabilität
  2. 2. Kontrolle der Proteinsynthese (translationale Regulation)
    • Ribosomenbindung, Translationsgeschwindigkeit, Termination
  3. 3. Kontrolle der Proteinaktivität
    • Stabilität, Modifikation, allosterische Effekte
  • konstitutiv, induzierbar oder unterdrückbar
  • positiv, negativ, sowohl positiv als auch negativ
  • und bei Gensätzen gibt es auch eine koordinative und zeitliche Regulation
  • einige Beispiele für diese in Regelkreisen sind das lac-Operon, das trp-Operon und die lysogenen und lytischen Gene von Lambda
    • Das lac-Operon ist ein induzierbares System, das sowohl einer negativen als auch einer positiven Regulation unterliegt
    • Das trp-Operon ist ein reprimierbares System mit zwei Arten von Negativkontrolle
    • die lytischen Gene von Lambda zeigen, wie Gene zeitlich reguliert werden können

    Um mehr über die Genregulation zu erfahren, klicken Sie auf Negativkontrolle (PDF), Positivkontrolle (PDF) und Regelkreise (PDF).


    2. MATERIALIEN UND METHODEN

    2.1 Studienstandort und Probenahme

    Um das Reservoir von zu bewerten Plasmodium spp. im Bongo District (BD), gelegen in der Upper East Region (UER) von Ghana, wurde zum Ende der Trockenzeit im Juni 2012 eine altersstratifizierte Querschnittsstudie durchgeführt. BD zeichnet sich durch eine ausgeprägte saisonale Übertragung aus, und Malaria stellt für den Distrikt ein großes Gesundheitsproblem dar. Details zu Studiendesign, Studienpopulation und Datenerhebungsverfahren wurden zuvor beschrieben (Ruybal-Pesantez et al., 2017). Kurz gesagt, die Stichproben wurden in zwei großen Einzugsgebieten (Vea/Gowrie und Soe) in BD durchgeführt, die ausgewählt wurden, weil sie in Bezug auf Bevölkerungsgröße, Altersstruktur und ethnische Zusammensetzung als ähnlich angesehen wurden. Es wurde jedoch die Hypothese aufgestellt, dass sie sich in Bezug auf die Malaria-Übertragungsintensität und Saisonalität unterscheiden können, da Vea/Gowrie in der Nähe des Vea-Staudamms/Bewässerungsgebiets liegt, während sich Soe nicht in der Nähe großer Gewässer befindet, obwohl kleinere Staudämme für die Bewässerung über das ganze Land verstreut sind Bereich. Die Einzugsgebiete wurden weiter in kleinere Dörfer unterteilt: Vea, Gowrie, Soe Sanabisi und Soe Boko, wobei die Teilnehmer aus Abschnitten dieser Dörfer eingeschrieben waren (Vea: Gonga und Nayire Gowrie: Nayire Kura und Tingre Soe Sanabisi: Tindingo und Akulgoo und Soe Boko : Tamolinga und Missionsgebiet). Für diese Analysen wurden Teilnehmer mit mikroskopisch bestätigtem P. falciparum Infektionen wurden eingeschlossen (n = 267). Methoden im Zusammenhang mit der Mikroskopie, msp2 PCR und die Mikrosatelliten-PCR sind ausführlich beschrieben in (Ruybal-Pesantez et al., 2017). Mikrosatellitendaten sind für 200 . verfügbar P. falciparum Proben und var DBLα-Tags wurden für 209 . sequenziert P. falciparum Proben.

    2.2 Vielfalt von var DBLα-Typen und Mikrosatelliten-Allele

    Wir haben die analysiert var Antigendiversität innerhalb von 209 asymptomatischen Individuen in Ghana mit P. falciparum Infektionen. Für 163 dieser Individuen haben wir außerdem 12 Mikrosatelliten-Loci sequenziert, wie ausführlich in (Ruybal-Pesantez et al., 2017) beschrieben. Die Gesamtzahl der beobachteten Peaks (Allele) an jedem Locus wurde verwendet, um die MOI abzuschätzen. Einzelkloninfektionen wurden als Infektionen mit höchstens einem Mikrosatelliten-Allel an jedem Mikrosatelliten-Locus definiert. Bei Infektionen mit mehreren Klonen wurde der dominante Peak (Allel) an jedem der 12 Mikrosatelliten-Loci für jedes Isolat bestimmt. Die dominanten Peaks bildeten für jedes Isolat das, was wir als „dominanten Haplotyp“ oder „dominante Infektion“ bezeichnen. Isolate mit einer MOI von 1 oder 2, bestimmt durch die maximale Anzahl von Peaks, die an einem bestimmten Mikrosatelliten-Loci beobachtet wurden, stellten die sogenannten „High-Confident-Infektionen“ dar, und dies stellt eine Standardmethode dar, die auf diesem Gebiet verwendet wird (Schultz et al ., 2010). Aufgrund hoher MOI-Werte konnten wir nur bei 59 der 163 Isolate Infektionen mit hoher Konfidenz feststellen. Innerhalb der Typen wurde eine beträchtliche Sequenzdiversität beobachtet, sowohl innerhalb als auch zwischen Isolaten. Da dies eine Mischung aus natürlicher Sequenzdiversität und Sequenzierungsfehlern darstellt und diese beiden Quellen mit unseren Methoden nicht unterschieden werden können, haben wir in dieser Studie die Sequenzdiversität innerhalb des Typs ignoriert.

    2.3 Var Sequenzierungsmethoden und Typzuordnung

    DBLα, die einzige Domäne, die in fast allen gefunden wurde var Gene, ist ein molekularer Marker für var Gendiversität (Kraemer & Smith, 2003 Lavstsen, Salanti, Jensen, Arnot & Theander, 2003 Smith, Subramanian, Gamain, Baruch & Miller, 2000 Taylor, Kyes, Harris, Kriek & Newbold, 2000). Mit durchschnittlichen Leselängen von 400 bp oder mehr unter Verwendung der 454-Sequenzierung sequenzierten wir die gesamte Länge des PCR-Amplikons, ohne dass eine Assemblierung erforderlich war (Day et al., 2017 Rask, Petersen, Chen, Day, & Pedersen, 2016).

    Wir haben DBLα-Sequenzen zu var Die DBLα-Sequenz "typen" in einer Weise, die mit der üblicherweise verwendeten 96%-Nukleotididentitätsdefinition übereinstimmt (Barry et al., 2007). Genauer gesagt werden DBLα-Typen hier unter Verwendung eines Clustering-Algorithmus definiert, der auf die Rohsequenzdaten angewendet wird, so dass jeder DBLα-Sequenztyp-Cluster grob Sequenzen mit einer >97% Aminosäuresequenzidentität entspricht. Dieser Schwellenwert stimmt mit der Mehrheit früherer Arbeiten überein, die unterschiedliche Typen innerhalb von DBLα-Tag-Sequenzen definieren, da er sicherstellt, dass jeder unterschiedliche Sequenztyp sehr wahrscheinlich eine natürlich vorkommende unterschiedliche Variante darstellt (d. h. und nicht nur das Ergebnis von Sequenzierungsfehlern ist).

    Die meisten Analysen wurden mit Mathematica v8-Skripten ausgeführt, sofern nicht anders angegeben. Wir übersetzten DNA-Sequenzen in AA-Sequenzen unter Verwendung des Softwareprogramms EMBOSS Transeq (Goujon et al., 2010 Rice, Longden & Bleasby, 2000). Wir haben Sequenzen aus der Analyse ausgeschlossen, die einen unerwarteten Leserahmen, offensichtliche Frameshift-Substitutionen oder Stoppcodons aufwiesen.

    Drei genomische Isolate wurden als Positivkontrollen für unsere Sequenzierungs- und Analysemethoden verwendet: 3D7, Dd2 und HB3. Diese Proben unterscheiden sich in mehreren Punkten von unseren Feldisolaten: Die Anzahl der var Gene in jedem Genom bekannt ist das MOI genau 1 ist der komplette Satz der DBLα-Sequenzen ist mit hoher Präzision bekannt, so dass es möglich ist, mehrere zu identifizieren var Sequenzen des gleichen Typs innerhalb dieser Genome.

    2.4 Zusammenhang messen

    Die Verwandtschaft wird gemessen als die Anzahl von DBLα-Typen oder Mikrosatelliten-Allelen, die von zwei Isolaten geteilt werden, geteilt durch die durchschnittliche Anzahl von DBLα-Typen oder Mikrosatelliten-Allelen in einem Isolat für dieses Paar. Für DBLα-Typen entspricht dies dem Pairwise Type Sharing (PTS), wie es von Barry et al. ( 2007 ).

    2.5 Var Repertoireüberlappungsindizes

    Ein wichtiger Aspekt der von uns untersuchten Populationsstruktur ist die Überlappung zwischen Isolatpaaren. Wir verglichen die Überlappung zwischen beobachteten Isolaten mit der Überlappung zwischen randomisierten Isolaten unter Verwendung von zwei verschiedenen Indizes: Pairwise Type Sharing (PTS) und dem Jaccard-Ähnlichkeitsindex (JS). Wenn Isolat A ein Repertoire von hat nEIN Typen und Isolat B hat ein Repertoire von nB Typen, und die beiden Isolate teilen sich insgesamt nAB Typen, und die Vereinigung der beiden Mengen ist UAB, definieren wir PTSAB = 2nAB/(nEIN + nB) und JSAB = nAB/UAB. Der PTS-Ähnlichkeitsindex, der zum Vergleich entwickelt wurde var Repertoires, wurde hier genau wie in Barry et al. ( 2007 ).

    Wir untersuchen, ob sich die beobachtete Überlappung von zufällig unterscheidet, indem wir die var Die DBLα-Sequenz gibt Isolate ein, um eine Nullverteilung zu bilden. Wir berücksichtigen mehrere Aspekte der beobachteten Daten, um eine Nullhypothese zu konstruieren. Erstens können wir in den Feldisolaten niemals mehrere Kopien desselben DBLα-Typs beobachten, da wir die Genomposition nicht bestimmen und jede Sequenzvariation innerhalb des Typs nicht von Sequenzierungsfehlern unterschieden werden kann. In unserer Nullverteilung randomisierter Isolate behalten wir die binäre Natur der Typ-Isolat-Matrix bei, so dass es keine wiederholten DBLα-Typen in irgendwelchen randomisierten Isolaten gibt. Wir bewahren auch die Gesamtzahl der Isolate und DBLα-Typen, die Anzahl der pro Isolat beprobten DBLα-Typen und die beobachtete Häufigkeitsverteilung von DBLα-Typen innerhalb des Datensatzes. Wir bewahren diese Aspekte der beobachteten Daten, indem wir die Zeilen- und Spaltensummen der Matrix der DBLα-Typen in Isolaten beibehalten, während die 0/1-Einträge der Matrix randomisiert werden. Schließlich bewahren wir auch die Verbundenheit der ursprünglichen Matrix während der Randomisierung. Wir fragten dann, ob sich die beobachtete Verteilung der Überlappungsindizes zwischen den Isolaten von den Verteilungen der Überlappungsindizes für diese Randomisierungen unterscheidet. Wir verwenden einen effizienten Switch-Algorithmus, um unsere Nullverteilung zu erstellen, den sogenannten Curveball-Algorithmus (Strona, Nappo, Boccacci, Fattorini & San-Miguel-ayanz, 2014). Die Methode wurde mit einem Programm zur Bewertung der Modularität und Stabilität ökologischer Netzwerke implementiert (Grilli, Rogers & Allesina, 2016). Wir haben alle 100 Swap-Einheiten Stichproben gezogen, was dem Vierfachen des empfohlenen Minimums in Strona et al. ( 2014 ) (jede Swap-Einheit entspricht der Anzahl der Zeilen oder Spalten, je nachdem, welcher Wert niedriger ist, und zählt nur die Anzahl der tatsächlichen Swaps in der Matrix im Gegensatz zu allen vorgeschlagenen Swaps).

    2.6 Verknüpfungskoeffizient und Modularität von Verknüpfungsnetzwerken

    Ein weiterer Aspekt der von der Dehnungstheorie vorhergesagten Struktur ist der der Verknüpfung zwischen var Gene. Diese Verknüpfung ergibt sich aus der Selektion gegen Rekombinanten und wird dynamisch aufrechterhalten. Wir haben den Kopplungsungleichgewichtskoeffizienten verwendet, D, um Korrelationen zwischen DBLα-Typen in Bezug auf ihre Anwesenheit in Isolaten zu messen. Wir haben Netzwerke von DBLα-Typen erstellt, die D Werte über einem bestimmten Schwellenwert von D > 0,02 und analysierte die Struktur dieser Netzwerke. Wir haben eine Kopplungsanalyse mit dem gesamten Datensatz durchgeführt und dann die Analyse mit nur einfach infizierten Isolaten wiederholt. Für das Mikrosatelliten-Allele-Verknüpfungsnetzwerk haben wir auch einen Schwellenwert von verwendet D > 0,02.

    Für das Kopplungsnetzwerk vom Typ DBLα haben wir nur DBLα-Typen aufgenommen, die mehr als einmal im Datensatz vorkommen, da nur diese signifikante Kopplungsbeziehungen aufweisen können. Wir haben nur positive Kopplungsungleichgewichtskoeffizienten berücksichtigt, da negative Kopplungen aus Allelen resultieren können, die einen Locus teilen, und die genomische Position der DBLα-Typen wird in dieser Studie nicht bestimmt. Wir betrachten D Werte statistisch signifikant, wenn sie den in Hedrick, Jain und Holden (1978) beschriebenen Schwellenwert überschritten.

    Um Sätze von zu identifizieren var Gene, die tendenziell gemeinsam vorkommen, führten wir eine Modularitätsanalyse von var Verknüpfungsnetzwerke. Zum Vergleich wurde auch die Modularität von Mikrosatelliten-Linkage-Netzwerken durchgeführt. Wir haben die Software MODULAR (Marquitti, Guimarães, Pires, & Bittencourt, 2013 ) verwendet, die die optimale Anzahl von Modulen innerhalb eines Netzwerks definiert und ihre Mitglieder, die Gesamtmodularität des Netzwerks und die Bedeutung der Modularität relativ zu einer Null angibt Modell, das die ursprüngliche Gradverteilung beibehält. Obwohl die Methode für ökologische Systeme konzipiert wurde, basiert sie auf der allgemeinen Netzwerktheorie und der Definition von Modularität als „Teilmengen von eng verbundenen Elementen“. Die folgenden Parametereinstellungen wurden verwendet, um Module in beiden var und Mikrosatelliten-Verbindungsnetzwerke. Alle Kopplungsungleichgewichtskoeffizienten größer als 0,02 (D > 0,02) wurden verwendet, um ein einteiliges Netzwerk zu konstruieren, das als binäre Matrix ausgedrückt wird. Wir haben festgelegt, dass 1.000 randomisierte Matrizen verwendet werden sollten, um das Nullmodell zur Bestimmung der Signifikanz der Modularität zu erstellen, und wir haben die spektrale Partitionierung als Optimierungsmethode verwendet. Im Fall des Kopplungsnetzwerks vom Typ DBLα bestätigten wir die Signifikanz (P < .01) unter Verwendung eines konservativeren Nullmodells als die von MODULAR erzeugten. Diese konservative Null basierte auf 100 Randomisierungen, die die Zeilen- und Spaltensummen der ursprünglichen Matrix wie unten beschrieben beibehalten.

    Für das Kopplungsnetzwerk vom Typ DBLα verwendeten wir die 29 einzelnen Infektionsisolate, um die Kopplungsungleichgewichtskoeffizienten zu bestimmen. Für das Mikrosatelliten-Allel-Linkage-Netzwerk verwendeten wir die 55 vollständigen Infektionen mit hoher Konfidenz, um die Kopplungsungleichgewichtskoeffizienten zu bestimmen. Um zu untersuchen, ob Kräfte im Zusammenhang mit Transmission oder Demografie, die die Diversität bei Mikrosatelliten und var loci könnten in ähnlicher Weise für die beobachtete Struktur verantwortlich sein var Linkage-Netzwerk erstellten wir Abbildung 8 unter Verwendung der 45 Isolate, für die wir sowohl vollständige Mikrosatelliteninfektionen mit hoher Konfidenz als auch Daten vom Typ DBLα haben (unabhängig davon, ob es sich um Einzelinfektionen nach den strengen Mikrosatellitenkriterien handelt).

    2.7 HB-Rekombinationsnetzwerk

    Eine wichtige alternative neutrale Erklärung für die Existenz des var Verknüpfungsmodule ist die sogenannte var Rekombinationshierarchie, die beschreibt, wie die Rekombination unter bestimmten Gruppen von . bevorzugt erfolgt var Gene. Wir haben versucht zu testen, ob diese var Rekombinationsbeschränkungen könnten die Verknüpfungsmodule erklären, indem zuerst a . aufgebaut wird var Rekombinationsnetzwerk und dann Testen, ob die Verbindungsmodule innerhalb dieses Netzwerks gruppiert sind. Das Rekombinationsnetzwerk wurde konstruiert, indem Homologieblöcke (HBs) identifiziert wurden, die konservierte Einheiten von var Rekombination, die in allen DBLα-Tags vorhanden sind. HBs wurden mithilfe des VARDOM-Webservers (Rask, Hansen, Theander, Pedersen & Lavstsen, 2010) mit einem Sammelgrenzwert von 9,97 identifiziert, um eine Übereinstimmung zu definieren.Wir haben dann DBLα-Typen mit einer Kante verbunden, wenn sie einen Homologieblock teilten, da dies als direkter Beweis für ein historisches Rekombinationsereignis zwischen diesen beiden Typen angesehen werden kann. Wir haben die drei HBs, die >50% häufig im DBLα-Tag sind (HB 5, 14 und 36), nicht berücksichtigt.

    2.8 Randomisierungen zur Bewertung der Bevölkerungsstruktur

    Wir fragten, ob die Anzahl der gemeinsamen DBLα-Typen und der gemeinsamen Mikrosatelliten-Allele zwischen den Gebieten A und B mehr oder weniger ist als das, was wir aufgrund der Anzahl der Typen und ihrer Verteilungen in jedem der Gebiete zufällig erwarten würden. Um diese Frage zu beantworten, haben wir die Position des Einzugsgebiets jedes der Isolate randomisiert, so dass die Anzahl der Isolate in jedem Gebiet erhalten blieb, und dann die Anzahl der gemeinsamen DBLα-Typen oder Mikrosatelliten-Allele in den beiden Gebieten bewertet. Wir haben bei jeder Randomisierung die Anzahl der gemeinsamen DBLα-Typen oder Mikrosatelliten-Allele bewertet und eine Verteilung aus 10.000 Randomisierungen erstellt, die wir verwendet haben, um ein einseitiges . zu berechnen P-Wert für die beobachtete Anzahl gemeinsamer Typen oder Mikrosatelliten-Allele. Für die Mikrosatellitenanalyse umfasste die Probe alle Allele der dominanten Infektionen der 163 Isolate, für die wir einen dominanten Mikrosatelliten-Haplotyp berechnen konnten und für die wir hatten var (und Standort-) Daten. Für die var Analyse bestand die Probe aus allen eindeutigen DBLα-Typen, für die wir Daten zum Probenahmeort hatten.

    2.9 Populationsgenetische Variablen

    Während sich das Konzept der erwarteten Heterozygotie und Homozygotie nicht eindeutig auf die weitgehend nichtallelischen var Genfamilie haben wir eine analoge Statistik definiert, die geeignet ist für var Gene—var erwartete Heterozygotie (hv) – und wir haben es hier verwendet, um Fragen zu var Gendiversität auf verschiedenen hierarchischen Ebenen der Bevölkerung. Pairwise Type Sharing (PTS) zwischen Isolaten ist ein Konzept, das von Barry et al. ( 2007 ) zum Teil, weil es nützliche Konzepte aus der Populationsgenetik adaptiert: erwartete Heterozygotie (h) und erwartete Homozygotie (1 − h), zum Fall von var Gene. PTS kann als ungefähr äquivalent zur erwarteten Homozygotie angesehen werden. Hier haben wir die Analogie zum Zweck der Randomisierungen und der Konstruktion von FNS-ähnliche Statistiken, und wir haben die Begriffe „var erwartete Heterozygotie“ (hv), “var erwartete Homozygotie“ (1 − hv), und varFNS (FSTv) zur Klarheit.

    Ausschließlich zum Zweck der Erstellung von Metriken zum Messen var Diversität stellten wir uns vor, dass alle DBLα-Typen Allele an einem einzigen Locus sind. Obwohl diese Annahme angesichts der ektopischen Natur ihres Rekombinationssystems zu einfach ist, ist sie biologisch nicht völlig unangemessen. In diesem Sinne betrachteten wir einen Parasiten als

    60N Einzelperson in Bezug auf var Gene. Die Standardmethode zur Bewertung der erwarteten Heterozygotie und der damit verbundenen Statistiken ist die zufällige Stichprobenziehung von haploiden Organismen („Gameten“) aus der Population. In unserem Fall haben wir Singles probiert var Gene aus der Population, um die Gameten zu repräsentieren. Wir haben dann zwei dieser Singles kombiniert var Gengameten, um diploide Parasiten zu erzeugen, die jeweils zwei enthalten var Gene. Wir taten dies, um Muster in der beobachteten Diversität zu beschreiben, die sich zwischen den beiden Einzugsgebieten oder anderen Teilmengen unserer Isolat-Stichprobe unterscheiden. Unterschiede zwischen der Diversität des DBLα-Typs, die an verschiedenen Standorten beprobt wurde, wurden mit einer Reihe von Auflösungen analysiert: bei der niedrigen Auflösung der beiden Einzugsgebiete bis hin zu den acht Abschnitten, und wir haben auch die DBLα-Typen innerhalb und zwischen verschiedenen Isolaten im selben Abschnitt betrachtet .

    Zu fragen, ob erwartet var Homozygotie innerhalb der Einzugsgebiete von Vea/Gowrie oder Soe größer als erwartet ist, haben wir die bestehenden randomisiert var Genvariation in 2N-Isolate (um Resampling aus dem begrenzten Satz von Genen zu vermeiden). Wir haben die Gene 10.000 Mal neu gemischt, um eine Verteilung zu erstellen. Wir testeten, ob die Mikrosatelliten die räumliche Struktur zwischen den beiden Einzugsgebieten widerspiegelten, indem wir die Anzahl der gemeinsamen Mikrosatelliten-Allele zwischen den Gebieten betrachteten und fragten, ob diese Zahl signifikant von der zufälligen Erwartung abwich. Wir fragten auch, ob die Einzugsgebiete eine geringere Anzahl gemeinsamer Mikrosatelliten-Allele aufweisen als zufällig erwartet, wobei das oben beschriebene Randomisierungsverfahren verwendet wurde.


    Eierstockkrebs: Status des homologen Rekombinationsweges als Prädiktor für das Ansprechen auf Arzneimittel

    Epitheliales Ovarialkarzinom (EOC), insbesondere hochgradiger seröser Subtyp, ist mit Keimbahnmutationen in BRCA1/BRCA2 Gene bei bis zu 20 % der Patienten. BRCA1/BRCA2-Proteine ​​sind wichtige Komponenten des homologen Rekombinationswegs (HR), einem lebenswichtigen DNA-Reparaturprozess, der das Genom vor Schäden durch Doppelstrang-DNA schützt. Jüngste Studien zeigten häufige somatische Mutationen von BRCA1/BRCA2 und Hypermethylierung des Promotors von BRCA1 in EOC, zusätzlich zu Keimbahnmutationen. Vergleich der Veränderungen der DNA-Kopienzahl in Tumoren mit oder ohne BRCA1/BRCA2 Veränderungen, führen zur Identifizierung mehrerer Signaturen, die HR-Pfaddefekte erkennen, hier als „HRness“ bezeichnet. Diese Signaturen sagen die Platinsensitivität und das Überleben bei EOC voraus, wie es zuvor für Keimbahnmutationen von . gezeigt wurde BRCA1/BRCA2. Sie werden derzeit in klinischen Studien als potenzieller prädiktiver Biomarker für das Ansprechen auf Poly(ADP-Ribose)-Polymerase-Inhibitoren untersucht.


    Elektronen auf frischer Tat fangen: Wissenschaft auf der Attosekunden-Skala

    Langwelliges Laserlicht nähert sich einem Atom (links). Der Laserpuls ionisiert das Atom, indem er eines seiner Elektronen verstärkt (Mitte), aber bevor es entweichen kann, kehrt sich das elektrische Feld des Lichts um und zwingt das Elektron zur Rekombination mit dem Atom (rechts). Die zusätzlich aufgenommene Energie des Elektrons wird als Attosekunden-Burst hochfrequenter Röntgenstrahlen freigesetzt (relative Länge des Pulses zur Verdeutlichung übertrieben).

    (PhysOrg.com) -- Zu verstehen, wie man künstliche Photosynthese oder robuste, flexible Hochtemperatur-Supraleiter oder besser Solarzellen oder unzählige andere Fortschritte erzeugt, wird nur möglich sein, wenn wir die Möglichkeit haben, Elektronen durch Einfrieren der Zeit innerhalb von . abzubilden einige Trillionstelsekunden. Ein führendes Unternehmen in der Attosekunden-Wissenschaft erklärt, wie es geht.

    Als in den 1980er Jahren Laser auf den Markt kamen, die ultrakurze Lichtpulse aussenden konnten, erinnerte sich Steve Leone, läuteten sie ein neues Gebiet der „Femtochemie“ ein. Eine Femtosekunde ist ein Billiardstel einer Sekunde, 10 15 Sekunden.

    „Von damals bis heute haben die Menschen hauptsächlich relative Atombewegungen oder die von diesen Bewegungen gesteuerten elektronischen Übergänge studiert“, sagt Leone, Mitglied der Chemical Sciences Division des Berkeley Lab, Professor für Chemie und Physik an der UC Berkeley und Direktor des Chemical Dynamics Beamline an der Advanced Light Source. „Dazu gehören Vibrationen, Rotationen und dergleichen – Bewegungen, die in Zeitskalen von Femtosekunden gemessen werden.“

    Die schnellste bekannte Bewegung zwischen Atomkernen beträgt etwa acht Femtosekunden, die Schwingungsperiode zwischen den beiden Wasserstoffatomen in einem Wasserstoffmolekül. Elektronen binden, lösen und bewegen sich zwischen den Atomen in einem Molekül oder Kristall, aber fast die gesamte Masse des Atoms befindet sich in seinem Kern, der seine Elektronen mit sich herumschleppt. Man kann also viel Chemie machen, indem man die Bewegung von Atomen beobachtet, selbst wenn ihre Elektronen nicht direkt zu sehen sind.

    Aber für Leone reichen Femtosekunden nicht aus. Er will sehen, wie sich Elektronen selbst bewegen.

    „Elektronen sind leichter und schneller und bewegen sich in viel, viel kürzerer Zeit als Atomkerne“, sagt Leone. „Elektronendynamik und Elektronenkorrelation sind die zu lösenden Probleme, wenn wir chemische Prozesse und komplexe Materialien, wie beispielsweise Hochgeschwindigkeitselektronik, wirklich verstehen und schließlich kontrollieren wollen. Um direkt zur Elektronendynamik zu gelangen, müssen wir auf der Attosekunden-Zeitskala arbeiten.“

    Diese Gedanken motivierten den Start des Attosekunden-Wissenschaftsprogramms in Berkeley im Jahr 2004, eine Zusammenarbeit unter der Leitung von Leone und seinem Kollegen in der Chemieabteilung der UC Berkeley, Daniel Neumark, Direktor der Chemical Sciences Division des Berkeley Lab.

    Eine Sekunde hat zwar mehr Femtosekunden als Sekunden in 32 Millionen Jahren, aber Attosekunden sind noch tausendmal kürzer – Zeitscheiben so fein, dass sie zwar gezählt und gemessen, aber kaum vorstellbar sind. In der Zeit, die ein Wasserstoffmolekül braucht, um einen einzigen Vibrationssprung zu machen, sausen seine beiden Elektronen 300 Mal um das Molekül herum.

    Um diese Elektronen in der Tat einzufangen, sind Laserpulse im Subfemtosekundenbereich erforderlich, von Hunderten bis hin zu wenigen Attosekunden. Wie ist es möglich, so kurze Lichtimpulse zu erzeugen? Das Geheimnis liegt in den engen Beziehungen zwischen Photonen und Elektronen. Photonen geben Elektronen unter bestimmten Bedingungen Energie, die Elektronen können diese Energie und mehr zurückgeben.

    Steve Leone definiert „Attosekunde“ im Videoglossar von Berkeley Lab

    Surfendes Licht für schnelleres Licht

    Stellen Sie sich einen roten oder nahen Infrarot-Laserpuls vor (seine langen Wellenlängen werden als „optische“ Wellenlängen bezeichnet). Elektronen aus ihren Bahnen um Atome und beschleunigt sie in Richtung Freiheit.

    Die Intensität des Treiberpulses reicht jedoch nicht immer aus, um das Gas dauerhaft zu ionisieren. Bevor die Elektronen entweichen können, werden die Elektronen oft zurückgezogen und wieder in die Atome beschleunigt, wobei sie die zusätzliche Energie tragen, die sie aus dem elektromagnetischen Feld gewonnen haben.

    Bei der Rekombination emittiert das Atom einen Blitz von höherfrequentem (Ultraviolett oder Röntgen) Licht, das in Attosekunden gemessen wird. Während sich die Elektronen weiter rekombinieren, wiederholt sich der Prozess mit jeder Halbwelle des optischen Zyklus und erzeugt eine Folge heller, hochfrequenter Attosekundenblitze, die perfekt mit der Wellenfrequenz des optischen Treibers synchronisiert sind und sie in die gleiche Richtung tragen.

    Dieser dreistufige Prozess – Elektronenbeschleunigung weg vom Atom, Beschleunigung zurück zum Atom und Rekombination, die einen Attosekundenblitz aussendet – wird als Erzeugung hoher Harmonischer bezeichnet.

    „Die Erzeugung hoher Harmonischer ist eine grundlegende und häufigste Methode, um einen Attosekunden-Laserpuls zu erzeugen“, sagt Leone. „Wenn der Puls des Antriebslasers lang genug ist, ist es relativ einfach, nacheinander Attosekundenpulsfolgen zu erzeugen. Schwierig ist es, einen individuellen Attosekundenpuls zu machen. Nur vier oder fünf Gruppen auf der Welt haben es geschafft.“

    Leones Gruppe, in Partnerschaft mit der von Neumark, ist eine davon und hat auf neue Weise individuelle Attosekundenpulse erreicht. Das am häufigsten verwendete Verfahren zur Erzeugung von Attosekundenpulsen hängt von Filtern ab, die den Abschnitt mit der höchsten Frequenz des harmonischen Pulses auswählen, der mit der energiereichsten Halbwellenwelle in der Trägerpulshüllkurve mitläuft. Aber Leone und Neumark verwendeten mit ihren Studenten und Postdocs eine Methode namens Ionisationsgating.

    Das Ionisations-Gating beginnt mit einem viel intensiveren optischen Puls – einem so intensiven, dass die Vorderseite der Pulshülle Elektronen direkt von den Atomen im Gas schlägt und ein dichtes Plasma bildet, durch das der Puls pflügen muss. Nicht alle Gasatome sind ionisiert, aber die Rekombination von energetisierten Elektronen und Atomen erzeugt immer noch Attosekundenpulse von Röntgenstrahlen, aber es gibt eine schalterartige Beendigung der Pulsfolge.

    Der „Schalter“ ist ein Prozess, der als Phasenanpassungs-Gating bezeichnet wird. Die Attosekundenpulse, die an der Vorderflanke des optischen Pulses erzeugt werden, sind in der Röntgenenergie durch Einstellen der Phase der Halbzyklen innerhalb der Treiberpulshüllkurve abstimmbar. Die Attosekundenpulse müssen nicht auf die stärkste Halbwelle in der optischen Pulshüllkurve eingerastet sein.

    Nach Beendigung des Zuges gelangen die einzelnen Attosekundenpulse zusammen mit dem ursprünglichen Laserstrahl in einen separaten Interaktionsbereich des Laseraufbaus, wo Experimente durchgeführt werden können.

    Ein roter Laser erzeugt durch harmonische Erzeugung Attosekundenpulse von Röntgenstrahlen. Optisches Licht und Röntgenstrahlen wandern gemeinsam in den Wechselwirkungsbereich, werden dann durch einen Spiegel getrennt und von Detektoren erfasst. Von den Attosekundenpulsen im Wechselwirkungsbereich erzeugte Photoelektronen werden von einem Flugzeitdetektor (Kreis) analysiert. Das gestreifte Photoelektronenspektrum, das gegen die Laserpulsverzögerungszeit gezeigt ist, zeigt, dass die Dauer des Röntgenpulses etwa 430 Attosekunden beträgt.

    Beobachten, was in einer Attosekunde passiert

    Sobald die Attosekundenpulse in die Wechselwirkungsregion eingetreten sind, verwendet Leone Techniken, die als „Carrier-Envelope-Phase-Scanning“ und „Optical Streaking“ bezeichnet werden, um zu beobachten, was passiert. Mit diesen kann er einzelne Attosekundenpulse identifizieren und charakterisieren.

    Phasenscannen der Trägerhülle: Wenn ein Elektron während der Ionisation von einem Atom weg verstärkt wird, besteht das Photon, das die Verstärkung durchführt, aus einem elektrischen Feld, das sich in eine Richtung und dann in eine andere Richtung ändert. Diese Felder können den Impuls des Elektrons sowohl erhöhen als auch davon abziehen, sodass das Photoelektron je nachdem, wann es geboren wird, eine andere Kraft erfährt – mal stärker, mal schwächer. Das Scannen des Gases in der Wechselwirkungsregion (welches Gas auch immer Gegenstand des Experiments ist) ermöglicht es, das Timing der von den Attosekunden-Bursts erzeugten Elektronen anhand ihres zusätzlichen Impulses zu identifizieren.

    Optisches Streaking: Ein nachfolgendes Streak-Spektrogramm vergleicht die Energie des Attosekundenpulses mit der Energie des Photoelektrons, während sich die beiden mit der Zeit ändern. Das Streak-Spektrogramm bestätigt die Existenz einzelner Attosekundenpulse, misst deren Länge und bestimmt, wann ein Sekundärelektron erzeugt wird.

    „Wir haben 450 Attosekundenpulse gemessen“, sagt Leone. „Die Zeit wird durch die spezielle Optik begrenzt, die verwendet wird, um die Röntgenstrahlen zu reflektieren. Die Methode kann tatsächlich viel kürzere Impulse erzeugen, die auf verschiedene Frequenzen abstimmbar sind.“

    Irgendwann wird die Methode Stabilität, Zuverlässigkeit und Benutzerfreundlichkeit bei der Erzeugung von Attosekunden-Pulsen liefern, obwohl Leones experimentelles Lasersystem in Gebäude 2 derzeit noch pingelig ist. Leone vergleicht es mit einem "Fernsehgerät, das ein wenig temperamentvoll ist, es funktioniert, aber man muss den Touch haben."

    Trotz dieses überempfindlichen Instruments hat Leones Gruppe einzigartige wissenschaftliche Experimente an Gasphasenproben durchgeführt. Sie verwenden Attosekunden-Röntgenstrahlen als Pumppulse, um ein dünnes Gas aus Schwefelhexafluorid (SF6) zu ionisieren “ - das heißt, die Schwefelverbindungen zerfallen in einer von der Natur vorgegebenen geordneten Routine. Zu wissen, wie die Natur das macht, könnte zur Kontrolle solch komplexer Prozesse führen.

    Praktisch neben Leones Labor in Gebäude 2 nutzt auch Robert Kaindl vom Fachbereich Materialwissenschaften einen Attosekundenlaser, um elektronische Zusammenhänge in Nanopartikeln und komplexen Materialien zu entwirren. Währenddessen beschäftigen sich Leone und Neumark in einem anderen Labor auf dem Campus der UC Berkeley mit Festkörperphysik und untersuchen Phänomene wie Exzitonen (die gebundenen Zustände von negativ geladenen Elektronen mit positiv geladenen Löchern). Diese Arbeit ist entscheidend für die Entwicklung besserer Solarzellen, da Exzitonen wichtige Vorläufer für die Ladungstrennung in Halbleitern sind, um Sonnenlicht in elektrischen Strom umzuwandeln.

    Die Wissenschaft ist so vielversprechend, dass bereits andere Attosekunden-Lasersysteme in Arbeit sind. Im Januar gewährte die W. M. Keck Foundation Leone und Neumark 1 Million US-Dollar, um ein Campus-Labor für Attosekunden-Wissenschaft aufzurüsten. Kurz darauf verlieh das Verteidigungsministerium Leone ein Stipendium der National Security Science and Engineering Faculty in Höhe von 850.000 US-Dollar pro Jahr über fünf Jahre. „Der Keck-Stipendium wird für Ausrüstung verwendet und der DOD-Preis wird den Betrieb finanzieren und die großzügige Unterstützung des Energieministeriums ergänzen“, sagt er.

    Die ultraschnellen Lichtquellen der Zukunft

    Bereits am Horizont sind leistungsstarke Lichtquellen in der Lage, ultrahelle Attosekunden-Röntgenpulse bis zu einer Million Mal pro Sekunde zu erzeugen, wobei eine Kombination aus Linearbeschleunigern, fortschrittlichen Elektroneninjektoren und Freie-Elektronen-Lasern (FELs) verwendet wird.

    Als er in der Accelerator and Fusion Research Division von Berkeley Lab war, entwickelte Sasha Zholents (heute bei Argonnes Advanced Photon Source) ein Laserpuls-Slicing-Schema mit Wiggler-Magneten, das jetzt von der Advanced Light Source verwendet wird, um Femtosekunden-Röntgenstrahlen zu erzeugen. Er war auch Pionier eines ähnlichen Konzepts, um Attosekundenpulse zu erzeugen. Die Pläne von Zholents „waren die Vorläufer der Attosekunden-Hoffnungen für FELs“, sagt Leone.

    Hochintensive, FEL-produzierte Attosekundenpulse, die von Maschinen wie der von Berkeley Lab vorgeschlagenen Lichtquelle der nächsten Generation erzeugt werden können, werden entscheidend sein, um Attosekundenpulse sowohl für Pumppulse als auch für (bisher unpraktische) Sondenpulse zu verwenden. Nur so wird es möglich sein, Aggregatzustände und chemische Prozesse zu erzeugen und zu kontrollieren, die Theoretiker mit Computern visualisieren und modellieren können.

    „Bei all den vielen Techniken, die mit der Attosekunden-Wissenschaft verbunden sind, gibt es herausfordernde Probleme“, sagt Leone. „Die Stärke meiner eigenen Beiträge liegt darin, über neue Wege nachzudenken, um die Messungen und die Wissenschaft mit diesen kurzen Impulsen durchzuführen.“

    * „Zeitaufgelöste Spektroskopie der Attosekunden-Quantendynamik“ von Thomas Pfeifer, Mark J. Abel, Phillip M. Nagel, Aureacutelie Jullien, Zhi-Heng Loh, M. Justine Bell, Daniel M. Neumark und Stephen R. Leone, erscheint in Chemische Physik Briefe und ist für Abonnenten online verfügbar.
    * „Isolierte Attosekundenpulse aus Ionisationsgating von hochharmonischen Emission“ von Mark J. Abel, Thomas Pfeifer, Phillip M. Nagel, Willem Boutu, M. Justine Bell, Colby P. Steiner, Daniel M. Neumark und Stephen R Leone, erscheint in Chemische Physik und ist für Abonnenten online verfügbar.


    Vorlesung 2 - Einführung in die Genetik

    Genetik ist das Studium der Vererbung und der Manipulation genetischer Informationen (normalerweise DNA oder RNA). Es kann uns helfen:

     Krankheiten erkennen und behandeln  Organismen zum Nutzen der Menschheit ausbeuten

    Genetische Ansätze vor der Entwicklung der DNA-Technologie waren klassische Genetik, die Folgendes umfasste:

     Zufallsmutagenese  Selektion  Reassortierung von Organismenmerkmalen durch genetische Kreuzungen (Rekombination)

    Transformation ist das Bearbeiten von DNA und das Zurücksetzen in die Zelle. Die Verwendung von In-vitro-Techniken ermöglicht es uns, DNA-Sequenzen mit hoher Präzision zu resynthesen und die resultierenden Konstrukte in den untersuchten Organismus einzuführen.

    In vitro sind Reagenzglasexperimente. In vivo befindet sich im Organismus.

    Ein neues gentechnisches In-vivo-Verfahren wurde verwendet, um Defekte zu korrigieren, die zu genetischen Erkrankungen in embryonalen Zellen führen – CRISPR.

     Doppelsträngig  Cytosin und Guanin  Adenin und Thymin  Desoxyribose

     Einzelsträngig  Cytosin und Guanin  Adenin und Uracil  Ribose

    A-T hat 3 Wasserstoffbrücken und C-G hat 2 Wasserstoffbrücken. Purine sind Adenin und Guanin und diese sind größer als Pyrimidine (Cytosin und Thymin).

    In den 2 DNA-Strängen sind die Stränge aufgrund der 3’- und 5’-Enden polarisiert.

    Wildtyp ist ein unmodifiziertes natürliches Isolat einer Art. Wir vergleichen alles mit diesem Organismus. Es kommt direkt aus der Umwelt.

    Mutant ist ein Organismus, der sich aufgrund einer spezifischen Änderung seiner DNA-Sequenz vom Wildtyp unterscheidet.

    Mutation ist eine spezifische Veränderung in der DNA-Sequenz eines Organismus, die sich von der DNA-Sequenz im Wildtyp unterscheidet.

    Allel ist eine Kopie eines bestimmten Gens, unabhängig davon, ob es sich um einen Wildtyp einer Mutante handelt.

    Der Phänotyp ist ein identifizierbares oder beobachtbares Merkmal, das durch eine Mutation verändert werden kann. Genotyp ist die definierte Nukleotidsequenz eines Organismus, die normalerweise in Form von Allelen seiner Gene ausgedrückt wird. Rezessiv wird nicht angezeigt, es sei denn, es ist homozygot rezessiv.

    Bakterien sind gute Modellorganismen, denn sie sind:

     Relativ einfach  Einfach zu manipulieren  Bekannt  Schnell regenerieren durch binäre Spaltung

     Haploide Zellen – sie haben nur eine Kopie jedes Gens, sodass mutierte Zellen leicht identifiziert werden können und der Phänotyp sofort exprimiert wird.

    Höhere Organismen sind normalerweise diploid (2 oder mehr Kopien eines Gens) und anfälliger für Mutationen. Da Mutationen normalerweise rezessiv sind, wird es keinen beobachtbaren Unterschied geben.

    Beim vertikalen Gentransfer werden vererbbare Eigenschaften von Organismen an ihre Nachkommen weitergegeben. Änderungen dieser Eigenschaften können zufällig erfolgen und führen, wenn die Änderung von Vorteil ist, zu einer natürlichen Auslese. Dies galt für hohe Organismen, aber Bakterien sollten sich durch direkte Veränderungen an ihre Umgebung angepasst haben, die auch weitergegeben wurden.

    Luria und Delbruck (1941) zeigten, dass die obigen Prinzipien auch für Bakterien gelten. Sie zeigten die Resistenz, die aufgrund von DNA-Änderungen in niedrigen Frequenzen entwickelt wurde – Mutationen.

    Fred Griffith zeigt, dass die vererbbaren Eigenschaften von Bakterien von einem Bakterium auf ein anderes übertragen werden können

     Nicht-pathogen - pathogen  Dies wird als genetische Transformation bezeichnet

    Das transformierende Prinzip für den obigen Prozess wurde als DNA entdeckt. Lederberg und Tatum zeigten, dass beim Mischen von 2 E. coli-Stämmen mit unterschiedlichen Eigenschaften eine Nachkommenschaft mit Eigenschaften beider Elternteile gebildet wurde. Dies wird als Konjugation bezeichnet.

    Dies ist die Übertragung von Genen von einer Bakterienzelle (Spender) und einer anderen (Empfänger) durch direkten Zell-Zell-Kontakt.

    Die Konjugation wird normalerweise durch ein Plasmid kontrolliert. Ein Plasmid ist wie Hilfschromosomen, aber viel kleiner – 0,1-1% der Größe eines Hauptchromosoms. Sie sind in der Regel entbehrlich.

    In E. coli kodiert das konjugative Plasmid einen Sexpilus, der die anfängliche Verbindung zwischen den Zellen herstellt. Der Pilus zieht sich zusammen und zieht die Zellen zusammen, wodurch ein Oberflächenkontakt entsteht. In den meisten Fällen ist es die Plasmid-DNA, die vom Spender auf den Empfänger übertragen wird.

    Nicht-konjugative Plasmide können während der Konjugation übertragen werden, wenn sie über ein spezifisches Mobilisierungsgen verfügen – diese Gene werden aus Plasmid-Klonierungsvektoren entfernt, um die Wahrscheinlichkeit einer Verbreitung rekombinanter Plasmide in natürlichen Populationen zu verringern.

    Die Spenderzelle heftet sich mit ihrem Pilus an eine Empfängerzelle. Der Pilus zieht die Zellen zusammen und die Zellen berühren sich. Ein Strang der Plasmid-DNA wird auf den Empfänger übertragen. Der Empfänger synthetisierte einen komplementären Strang, um eine F+-Zelle zu werden, der Donor synthetisiert einen komplementären Strang, wodurch sein vollständiges Plasmid wiederhergestellt wird.

    Nur ausnahmsweise werden chromosomale Wirtsgene durch Konjugation übertragen, wie im Fall der sogenannten Hochfrequenz (Hfr)-Rekombinationsstämme.

    Das F-Plasmid integriert sich durch Rekombination in das Chromosom. Zellen verbinden sich über einen Konjugationspilus. Ein Teil des F-Plasmids wandert teilweise in die Empfängerzelle, wobei er einen Strang von Spender-DNA nachzieht. Die Konjugation endet mit Stücken von F-Plasmid und Donor-DNA in Empfängerzellen, die komplementäre DNA-Stränge synthetisieren. Donor-DNA und Empfänger-DNA rekombinieren, wodurch eine rekombinante F-Zelle entsteht.

    Transduktion ist Gentransfer, der durch ein bakterielles Virus (Phagen) kontrolliert wird. Phagen können Gene zwischen Bakterien übertragen, weil sie beim Packen der DNA in ihre Phagenpartikel Fehler machen. Die Phagenpartikel werden mit chromosomaler DNA des Wirts oder einer Mischung aus Wirts- und Phagen-DNA gefüllt – diese werden auch als transduzierende Partikel bezeichnet.

    Homologe Rekombination liegt vor, wenn DNA in der Wirtszelle und die DNA, die in eine neue Wirtszelle injiziert wird, integrieren können und Nukleotidsequenzen zwischen den 2 ähnlichen DNA-Molekülen ausgetauscht werden. Dies kann beim E. coli-Bakteriophagen P1 passieren.

    Der Phagen infiziert eine Bakterienzelle, indem er die DNA in die Zelle pumpt. Dadurch bildet sich ein weiterer Phagen in der Zelle. Die Phageninfektion führt zur Lyse von Zonen und der Phagen produziert mehr Nachkommen, die freigesetzt werden.

    Phageninfektion

    Phagen infizieren ihre DNA. Die Enzyme, die von den Phagen stammen, bauen die Wirts-DNA ab. Die Zellen synthetisieren neue Phagen, die Phagen-DNA und einige Wirts-DNA enthalten. Transduzierender Phagen injiziert Spender-DNA. Die Donor-DNA wird durch Rekombination in das Empfängerchromosom eingebaut.


    Histogenese und prämaligne Läsion

    Die Histogenese von FL ist eng mit Schlüsselereignissen der normalen B-Zell-Entwicklung und -Differenzierung verbunden. Während der frühen B-Zell-Entwicklung im Knochenmark durchlaufen Vorläufer-B-Zellen V(D)J-Rekombinationsprozesse, um Gene der schweren (IGH) und leichten Kette von Immunglobulin-V-Regionen aufzubauen, die die variablen Teile von Antikörpermolekülen kodieren. 3 Dabei handelt es sich um DNA-Doppelstrangbrüche an spezifischen Rekombinationssignalsequenzen (RSSs), die sich an den Enden der umlagernden V-, D- und J-Gene befinden. Zuerst, in einer Pro-B-Zelle, und IGHD Gen ist mit einem verbunden IGHJ Gen, und im nächsten Schritt an IGHV Gen wird zum D . rekombinierthJh gemeinsam. 3 B-Zell-Vorläufer, die ein Schwerketten-Gen als Prä-B-Zell-Rezeptor exprimieren, sind Prä-B-Zellen. An den Rekombinationsstellen wird weitere Diversität durch exonukleolytische Entfernung mehrerer Basen und durch Zugabe von nicht-keimbahn-kodierten Basen, den N-Nukleotiden, erzeugt. 3 Sobald eine funktionelle schwere Kette exprimiert ist, werden Genumlagerungen der leichten Kette durchgeführt, um einen reifen B-Zell-Rezeptor (BCR) zu erzeugen.

    In seltenen Fällen passieren Fehler während der V(D)J-Rekombination, und wenn die Enden der neu angeordneten Gene in einem der Immunglobulin-Loci fälschlicherweise mit DNA-Brüchen in einem anderen Chromosom verbunden sind, kommt es zu einer reziproken chromosomalen Translokation. 4 Eine solche Translokation ist wahrscheinlich das erste Ereignis in der Pathogenese der FL. Etwa 90% der FLs zeigen ein t(1418)(q32p21), bei dem das B-Zell-Lymphom 2 (BCL2) Gen ist mit einem verbunden IGHJ Gen oder ein DhJh Gelenk im IGH-Locus. 5,6 Spezifische Merkmale der Translokationen, insbesondere das Vorhandensein von N-Nukleotiden an den Verbindungsstellen der 2 Chromosomen und die Lage der Bruchstellen im IGH-Locus nahe der RSS-Stelle von an IGHD oder IGHJ Gen, argumentieren stark für eine fehlgeleitete V(D)J-Rekombination im Pro-B-Zell-Stadium als Mechanismus. 4 Als Konsequenz ist die BCL2 Gen wird unter die Kontrolle der Enhancer des IGH-Locus gebracht, was eine konstitutive Expression des antiapoptotischen BCL2-Proteins bewirkt. 4

    BCL2 kein starkes Proto-Onkogen ist, und da naive B-Zellen physiologisch BCL2 exprimieren, scheint es, dass die Anwesenheit eines t(1418)-IGH-BCL2 Translokation verursacht keine größere Störung der Physiologie der reifen naiven B-Zellen. Es entfaltet seine pathogenetische Funktion, wenn eine naive B-Zelle in eine T-Zell-abhängige Immunantwort getrieben wird und zu einer GC-B-Zelle wird. In der dunklen Zone des GC durchlaufen Antigen-aktivierte B-Zellen eine massive klonale Expansion und aktivieren den Prozess der somatischen Hypermutation (SHM), um ihre IGV Regionsgene. 3,7 Da somatische Mutationen weitgehend zufällig sind, erwerben nur wenige Zellen affinitätssteigernde Mutationen und werden von T-follikulären Helferzellen (TFH) in der hellen Zone positiv selektiert. 8 Die meisten erwerben nachteilige Mutationen und sterben durch Apoptose. 8,9 Die Apoptose-Anfälligkeit von GC-B-Zellen ist auch ein Toleranzmechanismus, um das Überleben autoreaktiver B-Zellen zu verhindern. 10,11 Offensichtlich ist Apoptose der Standardweg für GC-B-Zellen, und ein wichtiger Faktor für dieses intrinsische Programm ist, dass sie den antiapoptotischen Faktor BCL2 herunterregulieren (Abbildung 1). 9,12 Nur in positiv selektierten GC-B-Zellen der Lichtzone, die eine Differenzierung zu Gedächtnis-B-Zellen oder Plasmazellen durchlaufen, wird die BCL2-Expression reduziert. 12,13 Wenn eine B-Zelle mit einem IGH-BCL2 Die Translokation wird in eine GC-Reaktion getrieben, der normale Apoptose- und Selektionsprozess wird gestört und solche B-Zellen haben einen Überlebensvorteil. 14 Dies erhöht dann das Risiko für den Erwerb weiterer genetischer Läsionen und kann schließlich in einigen dieser Zellen zur Entwicklung einer FL führen. Wie in den folgenden Abschnitten ausführlicher diskutiert wird, verursachen diese zusätzlichen genetischen Läsionen und pathogenetischen Ereignisse einen Differenzierungsstillstand im Stadium einer GC-B-Zelle.

    B-Zellen mit IGH-BCL2 Translokationen sind auch bei gesunden Erwachsenen nachweisbar. Die Häufigkeit solcher Zellen beträgt 1 pro 10 5 B-Zellen des peripheren Blutes, mit großen Unterschieden zwischen den Individuen. 15,16 Die Häufigkeiten nehmen mit zunehmendem Alter tendenziell zu. 17 Ursprünglich dachte man, dass diese BCL2 Translokations-positive zirkulierende Zellen sind polyklonale naive B-Zellen, die aus zahlreichen unabhängigen Translokationsereignissen stammen und sich in diesem reifen B-Zell-Kompartiment ansammeln. Spätere elegante Studien zeigten jedoch, dass t(1418)-tragende Zellen bei gesunden Erwachsenen hauptsächlich unter Immunglobulin-M-positiven (IgM + )IgD + CD27 + -Gedächtnis-B-Zellen mit somatisch mutierten IGV Gene, und dass der Pool solcher Zellen meist von 1 oder wenigen Klonen dominiert wird. 18,19 Diese Klone persistieren oft, und in einigen Fällen wurde gezeigt, dass zirkulierende Klone, die mehrere Jahre vor der Diagnose einer FL im peripheren Blut vorhanden waren, bereits eine Reihe von genetischen Läsionen trugen BCL2 Translokation. 20,21 Kombinierte Studien mit humanen B-Zellen und einem Mausmodell zeigen, dass B-Zellen, die BCL2 ständig überexprimieren, mehrere GC-Passagen durchlaufen, bis sie schließlich zu einer FL führen (Abbildung 2). 22

    Szenario für FL-Pathogenese. Während der frühen B-Zell-Entwicklung erwerben Pro-B-Zellen in seltenen Fällen ein t(1418) IGH-BCL2 Translokation als Fehler der IGH-Rekombination. Dies führt zu einer konstitutiven Expression von BCL2. t(14:18)-tragende B-Zellen können sich zu reifen naiven B-Zellen weiterentwickeln und bei antigener Stimulation eine GC-Reaktion eingehen. In der GC wird BCL2 normalerweise herunterreguliert, um die Apoptoseanfälligkeit von GC-B-Zellen zu fördern. t(1418)-tragende GC-B-Zellen haben jedoch einen Überlebensvorteil und können sich klonal ausdehnen und zu Gedächtnis-B-Zellen werden. t(1418)-positive B-Zellen im peripheren Blut finden sich hauptsächlich unter den IgM-Gedächtnis-B-Zellen. Solche Zellen können wiederholte GC-Reaktionen durchlaufen und dadurch weitere genetische Läsionen erwerben. In einigen reaktiven Lymphknoten können GCs gefunden werden, die von monoklonalen BCL2 + GC B-Zellen dominiert werden. Diese werden FLIS genannt und die B-Zell-Klone können als prämaligne angesehen werden, da sie neben dem t(1418) oft weitere genetische Läsionen tragen. Aus solchen Strukturen können sich FLs entwickeln, nachdem zusätzliche Genmutationen aufgetreten sind. Darüber hinaus wurden Mutationen, die die N-Glykosylierung von Aminosäuren in den variablen Regionen des BCR fördern, in FLIS nachgewiesen, 28,61 sodass eine chronische antigene Stimulation als zusätzlicher pathogenetischer Faktor, die durch die BCR-Stimulation durch Lektine auf Stromazellen auftritt, bereits in FLIS auftreten kann (und vielleicht sogar früher, da die Mutationen, die die N-Glykosylierung verursachen, durchaus in frühen GC-Passagen auftreten können, wenn SHM hochaktiv ist). Fast die Hälfte der FL-Fälle exprimiert IgG, so dass zu irgendeinem Zeitpunkt während der FL-Pathogenese ein beträchtlicher Teil der Fälle eine Class-Switch-Rekombination (CSR) durchgemacht hat.

    Szenario für FL-Pathogenese. Während der frühen B-Zell-Entwicklung erwerben Pro-B-Zellen in seltenen Fällen ein t(1418) IGH-BCL2 Translokation als Fehler der IGH-Rekombination. Dies führt zu einer konstitutiven Expression von BCL2. t(14:18)-tragende B-Zellen können sich zu reifen naiven B-Zellen weiterentwickeln und bei antigener Stimulation eine GC-Reaktion eingehen. In der GC wird BCL2 normalerweise herunterreguliert, um die Apoptoseanfälligkeit von GC-B-Zellen zu fördern. t(1418)-tragende GC-B-Zellen haben jedoch einen Überlebensvorteil und können sich klonal ausdehnen und zu Gedächtnis-B-Zellen werden. t(1418)-positive B-Zellen im peripheren Blut finden sich hauptsächlich unter den IgM-Gedächtnis-B-Zellen. Solche Zellen können wiederholte GC-Reaktionen durchlaufen und dadurch weitere genetische Läsionen erwerben. In einigen reaktiven Lymphknoten können GCs gefunden werden, die von monoklonalen BCL2 + GC B-Zellen dominiert werden. Diese werden FLIS genannt und die B-Zell-Klone können als prämaligne angesehen werden, da sie neben dem t(1418) oft weitere genetische Läsionen tragen. Aus solchen Strukturen können sich FLs entwickeln, nachdem zusätzliche Genmutationen aufgetreten sind. Darüber hinaus wurden Mutationen, die die N-Glykosylierung von Aminosäuren in den variablen Regionen des BCR fördern, in FLIS nachgewiesen, 28,61 sodass eine chronische antigene Stimulation als zusätzlicher pathogenetischer Faktor, die durch die BCR-Stimulation durch Lektine auf Stromazellen auftritt, bereits in FLIS auftreten kann (und vielleicht sogar früher, da die Mutationen, die die N-Glykosylierung verursachen, durchaus in frühen GC-Passagen auftreten können, wenn SHM hochaktiv ist). Fast die Hälfte der FL-Fälle exprimieren IgG, so dass zu irgendeinem Zeitpunkt während der FL-Pathogenese ein beträchtlicher Teil der Fälle eine Class-Switch-Rekombination (CSR) durchlaufen hat.

    B-Zellen tragen IGH-BCL2 Translokationen können auch im GC von ∼ 2 % bis 3 % der reaktiven Lymphknoten gesunder Erwachsener nachgewiesen werden. 23-25 ​​Oft sind ihre Zahlen eher gering und sie sind unter normalen GC-B-Zellen verstreut. 26 In anderen Fällen werden typischerweise mehrere GCs von BCL2-exprimierenden GC-B-Zellen mit der t(1418)-Translokation dominiert. Dies wurde als FL in situ (FLIS) bezeichnet. 24,27 Die Zellen exprimieren typische GC-B-Zell-Marker wie CD10, sind monoklonal und zeigen eine aktive Hypermutation. 24,28 Ihre Proliferationsrate ist jedoch niedriger als die von normalen GCs, mit einem erhöhten Anteil an B-Zellen der hellen Zone. 24 Eine Progression von FLIS zu FL wird nur in seltenen Fällen beobachtet, aber FLIS scheint dennoch Vorläuferläsionen von FL und prämaligne klonale B-Zell-Expansionen darzustellen, da in einigen Fällen eine klonale Beziehung zwischen einem FLIS und einem nachfolgenden FL nachgewiesen wurde, und FLIS trägt neben dem t häufig bereits genomische Imbalancen als weitere genetische Läsionen (1418). 29,30


    HDL-METABOLISMUS UND ATHEROSKLEROSE

    HDL und umgekehrter Cholesterintransport

    Apolipoprotein A-I (ApoA-I) ist das Hauptprotein von HDL und bietet sowohl Struktur als auch Funktion. Lipidarmes apoA-I und reifes HDL tragen beide zur Entfernung von Cholesterin aus Makrophagen bei und verhindern die Bildung von Schaumzellen (Abbildung 2). Obwohl der Cholesterinfluss von Makrophagen zu HDL (oder ApoA-I) die Cholesterinakkumulation in Läsionen lindert, hat der Nettofluss von Cholesterin aus der Läsion wenig bis gar keinen Einfluss auf die systemischen Cholesterinspiegel. Dennoch reduziert der Makrophagen-Cholesterin-Efflux in HDL die Entzündung und die atherosklerotische Belastung und ist der erste Schritt beim reversen Cholesterintransport (RCT) (Abbildung 10) (685–687). Dieser Weg wurde erstmals 1966 beschrieben (688). Die Geschwindigkeit, mit der Cholesterin durch den RCT-Weg fließt, ist von größerer Bedeutung als die Steady-State-Spiegel von HDL-Cholesterin (HDL-C). Interessanterweise erfolgt die Cholesterinbewegung von Makrophagen zu HDL auf mindestens 4 Wegen (70). Erstens stimuliert lipidarmes apoA-I den Efflux von Phospholipid und freiem Cholesterin durch Interaktion mit dem ATP-bindenden Kassettentransporter A1 (ABCA1) (Abbildung 2), der Pre-Beta-HDL und naszierende scheibenförmige Partikel erzeugt (689). Je stärker das ApoA-1 lipidiert wird, gehen die scheibenförmigen HDL-Partikel in eine kugelförmige Struktur über und verlieren ihre Fähigkeit, mit ABCA1 zu interagieren und den Cholesterinausfluss durch ABCA1 zu stimulieren. Sowohl scheibenförmige HDL-Partikel als auch reife kugelförmige HDL-Partikel können auch den freien Cholesterin-Efflux von einem anderen Transporter fördern, dem ATP-bindenden Kassettentransport G1 (ABCG1), von dem angenommen wird, dass er sich auf subzellulären Organellen im Gegensatz zur Plasmamembran befindet (Abbildung 2) ( 690.691). Dieser Transporter ist ein kritischer Regulator des intrazellulären Cholesterintransports, der zellulären Cholesterinverfügbarkeit und des Cholesterinexports (690,692). Der primäre Rezeptor von HDL für die Aufnahme von Cholesterylester (CE), der Scavenger-Rezeptor BI (SR-BI), ist auch ein bidirektionaler Transporter für freies Cholesterin, da er den Aus- und Einstrom von freiem Cholesterin zwischen Zellen und reifem HDL (693-695) erleichtert. (Figur 2). Die Nettorichtung des Cholesterinflusses wird durch den Cholesterinkonzentrationsgradienten (Plasmamembran und HDL-Verhältnis von freiem Cholesterin zu Phospholipid) (696) sowie durch die Phospholipid-Unterart (697.698) bestimmt. Schließlich kann Cholesterin einfach durch passive wässrige Diffusion von der Plasmamembran zum HDL gelangen, was ein Hauptweg des Cholesterinausflusses aus Makrophagen ist (Abbildung 2) (70,687,695). Auf HDL wird freies Cholesterin in der Phospholipid-Oberflächenschicht solubilisiert und schnell durch Lecithin:Cholesterin-Acyltransferase (LCAT) verestert (Abbildung 6) und das hydrophobe CE wird dann zum HDL-Kern (699.700) mobilisiert.

    Abbildung 10.

    Vorteilhafte Funktionen von HDL. HDL vermittelt eine Reihe von atheroprotektiven Prozessen. HDL ist entscheidend für den umgekehrten Cholesterintransport, wo es den ersten Schritt der Entfernung von Cholesterin aus der Peripherie und Makrophagen-Schaumzellen zur Beseitigung durch die Leber vermittelt. HDL kann den letzten Schritt des umgekehrten Cholesterintransports direkt vermitteln, indem es Cholesterin über die Wechselwirkung mit SR-BI an die Leber liefert. HDL reduziert die LDL-Oxidation und den oxidativen Status der Zellen, indem es Lipidhydroperoxide aus LDL und Zellen entfernt. HDL verhindert auch die LDL-Oxidation über seine antioxidativen Enzyme (PON1, LCAT und Lp-PLA2) und durch die Reduktion von Lipidhydroperoxiden durch ApoA-I. HDL erhält die Endothelzellbarriere durch Stimulierung der Gefäßrelaxation, die aus einer erhöhten Stickoxidproduktion durch HDL-induzierte Signalübertragung über eine Reihe von Endothelzellrezeptoren (SR-BI, S1P, ABCG1) resultiert. HDL verhindert die Thrombusbildung, indem es Gerinnungsfaktoren hemmt und den Cholesterinausfluss aus den Blutplättchen über SR-BI stimuliert, um die Blutplättchenaggregation zu reduzieren. HDL verhindert die Apoptose von Endothelzellen und Makrophagen durch Signalwege, die die Expression des pro-apoptotischen Proteins Bid und des anti-apoptotischen Faktors Bcl-xl modulieren. HDL reduziert auch die Anfälligkeit für Apoptose, indem es den Stress des endoplasmatischen Retikulums lindert, indem überschüssiges freies Cholesterin und Lipidhydroperoxide aus den Zellen entfernt werden. HDL begrenzt die Entzündung von atherosklerotischen Läsionen, indem es die Endothelzellaktivierung hemmt, was zu einer geringeren Rekrutierung von Monozyten führt. HDL reduziert auch die Entzündung der Läsion, indem es den entzündungshemmenden M2-Phänotyp der Makrophagen über die ABCA1/JAK2-Signalgebung fördert, um die entzündungshemmende Zytokinproduktion zu steigern (IL-10, TGF-β). HDL hemmt die Umwandlung in den entzündlichen M1-Phänotyp der Makrophagen, indem es die antigenspezifische Aktivierung der T-Helfer-1-(Th-1)-Zelle verhindert, um Interferon-gamma zu produzieren. HDL enthält eine Reihe von Proteinen und bioaktiven Lipiden, die die HDL-Funktion regulieren. Darüber hinaus steuert HDL eine Reihe von atheroprotektiven Prozessen, indem es die Genexpression moduliert, indem es microRNAs auf Empfängerzellen überträgt.

    Sphärisches reifes HDL transportiert dann CE zu peripheren Zellen und Geweben und zurück zur Leber als Teil des RCT-Wegs (Abbildung 10). HDL liefert CE über 2 Hauptwege an die Leber. HDL liefert CE an die Leber durch Bindung an SR-BI (Abbildung 6), was die selektive Aufnahme von Kernlipiden vorantreibt (694). Ein weiterer Hauptweg der Cholesterinabgabe an die Leber wird durch LDL und den LDL-Rezeptor (LDLR) vermittelt (Abbildung 6) (701). Im Kreislauf tauscht HDL CE gegen TG von VLDL und LDL durch Cholesterylester-Transfer-Protein (CETP)-Aktivität ( 6 ) aus, und diese Aktion ist verantwortlich für die Steuerung von CE durch den LDL-Rezeptor-Weg (702). Neben diesen Hauptwegen kann die Aufnahme von HDL durch Holopartikel auch zur Abgabe von HDL-CE an die Leber beitragen. Hepatozyten und viele andere Zelltypen in anderen Geweben nehmen wahrscheinlich an der HDL-Retroendozytose teil, bei der ApoA-I- oder HDL-Partikel durch Endozytose aufgenommen und ohne Abbau in späten Endosomen und Lysosomen (703,704) wieder sekretiert werden. SR-BI und CD36 können an diesem Prozess sowie andere potenzielle HDL-Rezeptoren (705–707) beteiligt sein. Zum Beispiel die F0F1 ATPase und P2Y13 Es wurde berichtet, dass der Rezeptor die Aufnahme des gesamten HDL-Partikels erleichtert (703.704.708.709). Die Leber scheidet dann sowohl Cholesterin als auch aus Cholesterin stammende Gallensäuren in die Galle aus, die mit dem Kot aus dem Körper entfernt wird, wodurch die RCT von peripheren Makrophagen zur Galle über HDL und die Leber abgeschlossen wird (710). Neuere Erkenntnisse deuten darauf hin, dass es wahrscheinlich auch einen HDL-unabhängigen Weg zur systemischen Cholesterinentfernung durch transintestinale Cholesterinausscheidung (TICE) gibt (711). Historisch wurden die antiatherogenen Eigenschaften von HDL weitgehend auf die Rolle von HDL in der RCT und die Entfernung von überschüssigem Cholesterin aus Makrophagen und peripheren Geweben zurückgeführt, jedoch tragen ständig neue alternative HDL-Funktionen wahrscheinlich erheblich zum Schutz von HDL vor CVD bei.

    HDL-Spiegel und Risiko von CVD

    Historisch war HDL-C gleichbedeutend mit dem Begriff HDL, jedoch sind die Menge an Cholesterin im HDL-Pool (HDL-C) und die Anzahl und Qualität der HDL-Partikel (HDL-P) unabhängige Konzepte, die im Kontext zu berücksichtigen sind der HDL-Funktion. Mehrere Jahrzehnte hochwertiger epidemiologischer Studien haben eindeutig gezeigt, dass die HDL-C-Spiegel unabhängig von Rasse, Geschlecht und ethnischer Zugehörigkeit umgekehrt mit dem Risiko und den Ereignissen von CVD korreliert sind (712). In gut kontrollierten Studien zur Bewertung des CVD-Risikos unter Verwendung multivariater Ansätze zur Anpassung an Kovariaten sind sowohl ApoA-I als auch HDL-C starke unabhängige Prädiktoren für das CVD-Risiko (474). Nichtsdestotrotz korrelieren HDL-C-Spiegel auch umgekehrt mit Insulinresistenz, Fettleibigkeit und Triglyceriden. Daher ist die Kausalität von HDL-C beim Schutz vor CVD schwer zu definieren und etwas umstritten, hauptsächlich aufgrund epidemiologischer Diskrepanzen zwischen der Dosis-Reaktion der HDL-C-Spiegel auf die CVD-Ergebnisse. Es ist möglich, dass HDL-C-Spiegel einfach nur ein Biomarker für CVD sind und keine kausale Rolle bei Arteriosklerose spielen, jedoch belegen eine zunehmende Zahl funktioneller Studien eindeutig die funktionelle Bedeutung von HDL für biochemische Mechanismen der Atherosklerose. Auf jeden Fall haben epidemiologische Studien der letzten 50 Jahre viele Erkenntnisse zum HDL-C- und CVD-Risiko geliefert. Der erste Beweis stammte aus der Framingham Heart Study im Jahr 1966, die einen Zusammenhang zwischen HDL-C und ASCVD aufzeigte (713). 1975 wurde in einer norwegischen Studie (Tromso Heart Study) (714) festgestellt, dass HDL-C-Spiegel umgekehrt mit CVD assoziiert sind. In den folgenden Jahren berichteten die Honolulu Heart Study (1976) (715) und die Framingham Heart Study (1977) (559), dass viele CVD-Patienten niedrige HDL-C-Werte aufwiesen. Im Laufe der Jahre wurde immer wieder berichtet, dass niedrige HDL-C-Spiegel mit einem erhöhten Risiko für ASCVD und Ereignisse verbunden sind (716-718). In den späten 1980er und frühen 1990er Jahren wurde der Zusammenhang zwischen HDL-C und CVD allgemein akzeptiert, da Studien während dieser Zeit ergaben, dass niedrige HDL-C-Spiegel unabhängig von anderen Risikofaktoren auch bei Patienten mit normalen Gesamtcholesterinwerten mit einem CVD-Risiko verbunden waren (719-721).

    Klinische Ergebnisstudien

    Vor der Statin-Ära legten die Ergebnisse randomisierter kontrollierter klinischer Studien nahe, dass eine Erhöhung des HDL-C-Spiegels um 1 mg/dl oder 1 % die Mortalität aufgrund von Herz-Kreislauf-Erkrankungen um 3–4 % (722.723) reduziert. In der Air Force/Texas Coronary Atherosclerosis Prevention Study (AFCAPS/TexCAPS) reduzierte die Behandlung von Männern und Frauen mit durchschnittlichen TC- und LDL-C-Werten und unterdurchschnittlichen HDL-C-Werten mit Lovastatin (20-40 mg) das LDL-C um 25 % und erhöhtes HDL-C um 6 %, was zu einer Reduzierung des Risikos für das erste größere akute koronare Ereignis um 37 % führte (724). Diese Ergebnisse zeigten, dass die Statin-Therapie das Risiko für CVE bei Patienten mit niedrigem HDL-C wirksam reduziert. Inwieweit der Nutzen aus der HDL-C-Erhöhung kam, ist unklar. Abgeschlossene Studien an Studienteilnehmern, die Statine erhielten, ergaben widersprüchliche Ergebnisse in Bezug auf die Bedeutung einer Erhöhung des HDL-C, teilweise aufgrund der Hinweise darauf, dass die Anwendung von Statinen (Fluvastatin) bei Studienteilnehmern mit niedrigem HDL-C die koronare Herzkrankheit (KHK) mit geringem bis keinem Anstieg verringerte HDL-C-Spiegel (725-727). In der Fluvastatin-Regressionsstudie zeigten Patienten mit niedrigem HDL-C-Wert unter Placebo eine erhöhte (angiographische) Progression der Krankheit im Vergleich zu Patienten mit hohen HDL-C-Werten (727). Zusammenfassend unterstützen die Beweise aus diesen und einer großen Anzahl epidemiologischer Studien überwiegend einen klaren inversen Zusammenhang zwischen HDL-C-Spiegeln und dem CVD-Risiko. Dies wird klinisch gezeigt, indem ein Anstieg der HDL-Spiegel durch Injektionen von rekonstituiertem HDL (rHDL) zu einer atherosklerotischen Plaquerückbildung führte, wie durch intravaskulären Ultraschall bestimmt (728). Eine Reihe von Tierstudien unterstützt eindeutig die HDL-C-Hypothese. Beispielsweise blockiert die HDL-Erhöhung bei Mäusen und Kaninchen konsequent die Atherogenese (729-731). Es hat sich jedoch als schwierig erwiesen, den HDL-C-Spiegel durch Mono- oder Kombinationstherapie zu erhöhen, um Risiken und Ereignisse zu reduzieren. Zwei große klinische Outcome-Studien zur Erhöhung von HDL mit Niacin zeigten keinen Nutzen. Bei Patienten mit KHK mit LDL-C-Spiegeln, die mit einem Statin gut kontrolliert wurden, die Zugabe von Niacin mit verlängerter Freisetzung in AIM-HIGH (732) und Niacin mit verlängerter Freisetzung plus Laropiprant (Prostaglandin-D2-Rezeptorblocker zur Hemmung von Flush) in HPS-2THRIVE (733) konnte die kardiovaskulären Ergebnisse nicht reduzieren. Allerdings erschwerten strukturelle Einschränkungen des Designs der beiden Niacin-Studien ihre Interpretation (734). Darüber hinaus konnten größere kardiovaskuläre Outcome-Studien mit den 3 CETP-Inhibitoren Torcetrapib (735), Dalcetrapib (736) und Evacetrapib jetzt keinen Nutzen bei der Reduzierung kardiovaskulärer Ereignisse zeigen. Vor kurzem wurde der CETP-Inhibitor (Anacetrapib) in der REVEAL-Studie getestet, die eine positive Ergebnisstudie war (737). Der Nutzen von Anacetrapib bei der Senkung des CVE scheint jedoch weitgehend durch eine Senkung des Nicht-HDL und nicht durch einen Anstieg des HDL-C (738) zu erklären. In jüngerer Zeit zeigten zwei rekombinante ApoA-I-Produkte MDCO-216 und CER001 keinen Nutzen in bildgebenden Studien (739 740). Insgesamt hat das Scheitern dieser klinischen Studien Zweifel an der HDL-Hypothese aufkommen lassen. Tatsächlich ist die Erhöhung von HDL-C derzeit kein primäres Ziel für eine therapeutische Intervention. Dennoch wurde berichtet, dass die HDL-Infusion beim Menschen die Endothelfunktion verbessert, was zur Hemmung der Atherogenese beitragen sollte (741). Derzeit haben sich HDL-Partikelinfusionstherapien nicht als wirksamer Ansatz zur Reduzierung kardiovaskulärer Ereignisse erwiesen (742), klinische Studien mit rekonstituiertem HDL laufen jedoch noch. Darüber hinaus zeigen neuere Studien, dass die HDL-Partikelzahl und die Cholesterin-Efflux-Kapazität bessere Indikatoren für das KHK-Risiko sind als der HDL-C-Spiegel (743,744). Das therapeutische Targeting von HDL-Nichtcholesterin-Fracht, -Qualität und -Funktion ist im Kommen und gewinnt an Unterstützung, da HDL viele andere biologische Eigenschaften besitzt, die wahrscheinlich zur Prävention von Arteriosklerose und CVD beitragen (745). Darüber hinaus liefert die Quantifizierung der HDL-Funktion, einschließlich der Cholesterin-Efflux-Kapazität, einen besseren Risikoindex als HDL-C-Spiegel im Steady-State (746).

    Partikelanzahl und Cholesterinausfluss

    Ein schwerer Schlag für die HDL-Kausalität bei Atherosklerose kommt von genetischen Studien. Mendelsche Erkrankungen, die zu sehr niedrigen HDL-C-Spiegeln führen, haben zu widersprüchlichen Daten geführt, da Mutationen in kritischen Lipoprotein-Genen (z ). Die ApoA-I Milano-Mutation ist mit niedrigen HDL-C-Spiegeln und einem reduzierten CVD-Risiko verbunden (747). Es wurde berichtet, dass die Infusion von rekombinantem ApoA-I Milano eine Regression der Atherosklerose induziert (749), aber seit der Veröffentlichung der ersten Regressionsstudie gab es keine klaren Fortschritte bei der Entwicklung als Therapieansatz. Die Beweise, dass einige genetische Ursachen für einen niedrigen HDL-C-Wert mit einem erhöhten Risiko für vorzeitige Arteriosklerose verbunden sind, andere hingegen nicht, unterstützen die Annahme, dass die HDL-Funktion wichtiger sein könnte als der HDL-C-Spiegel. Dennoch sind Mendelsche Störungen mit niedrigem HDL-C-Spiegel selten, und daher sind die Stichprobengrößen in diesen Studien begrenzt und es ist schwierig, genaue Schlussfolgerungen zu ziehen. Um dieses Problem anzugehen, wurden genomweite Assoziationsstudien durchgeführt, um zu klären, ob HDL-C ein Risikoindex oder ein kausaler Faktor ist. Diese Studien sind insofern begrenzt, als viele Varianten, die den HDL-C-Spiegel erhöhen oder senken, auch andere Lipoproteine, nämlich den LDL-C-Spiegel, beeinflussen. Zum Beispiel Varianten in CETP erhöhen den HDL-C-Spiegel und senken den LDL-C-Spiegel, was die Risikovorhersage auf der Grundlage des HDL-C-Spiegels erschwert (750). Studien haben jedoch gezeigt, dass die Varianz, die ausschließlich mit dem HDL-C-Spiegel verbunden ist, nicht mit kardiovaskulären Ereignissen verbunden ist. Zum Beispiel Einzelnukleotidpolymorphismen (SNPs) in der endothelialen Lipase (LIPG), die den HDL-C-Spiegel erhöhen, nicht mit einer verminderten CVD in Verbindung gebracht werden(751).

    Da fehlgeschlagene klinische Studien zur Erhöhung des HDL-C-Spiegels und genetische Studien die Kausalität für HDL-C bei CVD nicht einheitlich belegen, werden HDL-Funktionstests in zukünftigen prospektiven Studien wahrscheinlich eine bessere Klärung der kausalen Rolle von HDL bei CVD liefern. Es wurde berichtet, dass die Cholesterin-Efflux-Kapazität, ein Marker für die HDL-Funktion, invers mit dem CVD-Risiko assoziiert ist, unabhängig vom HDL-C-Spiegel (744.746). Dies wurde erstmals in einer Querschnittsstudie mit Radio-Tracing des Cholesterin-Efflux nachgewiesen (746). Eine nachfolgende Studie fand auch einen inversen Zusammenhang zwischen der HDL-Ausflusskapazität und Atherosklerose, berichtete jedoch über einen positiven Zusammenhang mit kardiovaskulären Ereignissen (752). In einer dritten Studie, in der der HDL-Cholesterin-Efflux in einer US-Kohorte unter Verwendung einer Fluoreszenzmethode untersucht wurde, wurde der Efflux erneut mit einem verringerten CVD-Risiko in Verbindung gebracht (743). Kürzlich wurde in einer großen, verschachtelten prospektiven Fall-Kontroll-Studie (n=3.494 Probanden) der EPIC-Norfolk-Studie (744.753) festgestellt, dass die HDL-Cholesterin-Efflux-Kapazität umgekehrt mit dem CVD-Risiko und -Ereignissen verbunden ist. Diese Assoziationen waren unabhängig von vielen anderen mitbegründenden Faktoren, darunter HDL-C, T2DM, Fettleibigkeit, LDL-C und Alter (744).

    Neben dem HDL-Cholesterin-Efflux und funktionellen Indizes als Risikoprädiktoren wurde auch von der HDL-Partikelzahl (HDL-P) berichtet, dass sie Biomarkerpotenzial bietet. HDL-P-Zahlen können unter Verwendung von Kernspinresonanz (754) oder kalibrierten Ionenmobilitätsassays (755) quantifiziert werden. In der großen multiethnischen Studie zur Atherosklerose (MESA) (756) wurde festgestellt, dass HDL-P invers mit der medialen Dicke der Carotis-Intima (cIMT) und der koronaren Herzkrankheit (KHK) assoziiert ist, unabhängig von der LDL-Partikelzahl und dem HDL-C-Spiegel. Wichtig ist, dass HDL-P nach Anpassung um Triglyceride und Apolipoprotein B (apoB) invers mit KHK assoziiert bleibt, was darauf hindeutet, dass HDL-P den HDL-C-Spiegeln als Biomarker für ASCVD und Ereignisse weit überlegen ist (757.758). Darüber hinaus korrelieren weder HDL-C-Spiegel noch HDL-P-Spiegel mit dem Cholesterin-Efflux aus Makrophagen, daher ist die Rate des Cholesterin-Effluxes immer noch entscheidend für das Verständnis der RCT- und HDL-Funktion. Ebenso ist die HDL-Qualität wichtiger als die ApoA-I-Werte, die ebenfalls nicht mit der HDL-Funktion korrelieren, z.B. RCT (759). Serumproben mit identischen ApoA-I- und HDL-C-Spiegeln wiesen unterschiedliche Cholesterin-Akzeptanzkapazitäten auf, hauptsächlich aufgrund von HDL-Spiegeln vor der Beta, die zu einem veränderten ABCA1-vermittelten Cholesterin-Efflux beitrugen (759). Diese Studien weisen stark darauf hin, dass die HDL-Funktion (Cholesterin-Efflux-Kapazität) im Gegensatz zu den HDL-C-, HDL-P- und ApoA-I-Spiegeln eine wichtigere Risikobewertung und eine bessere Vorhersage zukünftiger Ereignisse sowie ein begründeteres therapeutisches Ziel bietet zur Reduzierung von CVD-Risiken und -Ereignissen. Klinische Assays für ApoA-I und HDL-P sind jedoch weit verbreitet und gut etabliert, während Assays für die Cholesterin-Efflux-Kapazität nicht standardisiert wurden und derzeit ein Forschungsinstrument bleiben.

    HDL-Zusammensetzung und -Analyse

    Historisch wurden HDL durch Dichtegradienten-Ultrazentrifugation (DGUC) basierend auf isopyknischem Gleichgewicht isoliert, und HDL wurden seit den 1950er Jahren durch ihre Dichte 1,063-1,21 g/ml definiert (760,761). Basierend auf der Masse kann HDL auch durch Größenausschlusschromatographie (Fast Protein Liquid Chromatography, FPLC) von anderen Lipoproteinen getrennt werden, und das Molekulargewicht von HDL reicht von 175.000 - 360.000 Da (762). Neben DGUC und FPLC kann die Affinitätschromatographie auch zur Reinigung von HDL aus Plasma mit Antikörpern gegen ApoA-I (763) oder ApoA-II verwendet werden, da HDL-Heterogenität Partikel umfasst, die ApoA-I:apoA-II (75%) enthalten oder nur apoA-I (25%) (763.764). Darüber hinaus wird jetzt die asymmetrische Flussfeld-Fluss-Fraktionierung verwendet, um HDL zu isolieren und zu charakterisieren (765). HDL kann auch durch nicht-denaturierende Gradienten-Gelelektrophorese, z.B. Polyacrylamid-Gelelektrophorese. Großes HDL (HDL2, 8,8-12,9 nm Durchmesser) und kleine HDL (HDL3, 7,2-8,8 nm) sind beide α wandernde Partikel (hohe negative Ladung), während Pre-β HDL (5,4-7 nm) β wandernde Partikel sind, für die sie definiert sind. Zur Quantifizierung von Prä-β-HDL-Partikeln wird häufig eine 2-D-Gelelektrophorese verwendet, um Prä-β von reifem HDL zu trennen (766). HDL-P-Zahlen können entweder durch kernmagnetische Resonanzspektroskopie oder kalibrierte Ionenmobilitätsassays quantifiziert werden. HDL kann auch durch andere Methoden quantifiziert und qualifiziert werden, einschließlich vertikaler Rotor-Ultrazentrifugation und Transmissionselektronenmikroskopie.

    HDL sind sehr dynamisch und sollten als heterogener Pool von Unterklassen mit unterschiedlichen Größen, Formen, Dichten, Proteinzusammensetzungen und Lipiddiversität anerkannt werden. Lipidfreies ApoA-I wird als amphipathische Helix von der Leber und dem Dünndarm sezerniert und wird schnell von ABCA1 zu prä-β HDL lipidiert, das dann nach Aufnahme von Phospholipid und freiem Cholesterin aus Hepatozyten und peripheren Zellen scheibenförmig wird . Bei weiterer Lipidierung und Cholesterinakkumulation und -veresterung bildet sich naszierendes kugelförmiges HDL mit einem Durchmesser von 7-12 nm. Reifes HDL enthält 3-4 ApoA-I-Moleküle, von denen 1 auf dem Partikel verbleibt und das andere ApoA-I frei ist, um mit anderem HDL auf dem Partikel (di-)assoziieren (austauschen) kann. Dies ist hauptsächlich mit der Umlagerung der wässrigen Phase und der Oberfläche von HDL verbunden (767). Als solche befinden sich HDL in einem ständigen Umgestaltungs- und Umwandlungszustand. Jedes kugelförmige HDL-Partikel hat ungefähr 50-130 Phospholipide, 10-50 freie Cholesterinmoleküle, 30-90 CE-Moleküle und 10-20 Triglycerid (TG)-Moleküle (536). Phosphatidylcholin macht die größte Menge an Lipiden auf HDL aus (ungefähr 90%), jedoch wurden über 200 Arten von Lipiden berichtet, darunter Sphingolipide, Acylglycerine, Isoprenoide, Glycerophospholipide und Vitamine (768.769). Das HDL-Proteom wurde umfassend untersucht und es besteht ein allgemeiner Konsens von ungefähr 80 Proteinen (770,771). Neben ApoA-I und ApoA-II transportiert HDL über ein Dutzend weitere Apolipoproteine ​​sowie viele Enzyme und andere Faktoren. Es wurde auch festgestellt, dass HDL kleine RNAs transportiert, nämlich microRNAs (miRNA), die bei Hypercholesterinämie und Atherosklerose verändert sind (772,773). Interessanterweise wurde gezeigt, dass HDL eine Vielzahl von exogenen, nicht-Wirts-kleinen RNAs transportiert, einschließlich rRNA- und tRNA-Fragmenten, die von Bakterien- und Pilzspezies stammen, die im Mikrobiom und in der Umgebung vorhanden sind (774). Die Größe von HDL wird durch die Menge an CE und Triglycerid (TG) im hydrophoben Kern, und HDL wird im Allgemeinen basierend auf der Größe in 5 Unterklassen unterteilt. Bestimmte HDL-Unterarten wurden mit dem Risiko für Herz-Kreislauf-Erkrankungen in Verbindung gebracht, und die Unterarten haben unterschiedliche biologische Funktionen, z. große HDL sind weniger entzündungshemmend (775-777). Viele der Ladungen oder Komponenten von HDL werden in der kleinen HDL-Unterklasse angereichert, die viele der alternativen Funktionen zum gesamten HDL-Pool (778.779) bereitstellt. Die Konzentration aller HDL-Partikel im Plasma beträgt ungefähr 20 umol/l, jedoch sind kleine HDL-Partikel mit ungefähr 10 umol/l die am häufigsten vorkommende Unterklasse. HDL sind heterogene Partikel, die eine Vielzahl von Proteinen, Lipiden und Nukleinsäuren transportieren, die viele der biologischen Eigenschaften und positiven Funktionen von HDL für Gesundheit und Funktionsstörungen bei bestimmten Krankheiten verleihen.

    HDL-Zellsignalisierung

    Viele der zellulären Funktionen von HDL – Überleben, Proliferation, Vasodilatation – werden durch HDL-induzierte Zellsignalkaskaden vermittelt (780). Als solches kann HDL als hormonähnliche Agonisten charakterisiert werden. Obwohl noch erhebliche Arbeiten zur Identifizierung von HDL-bindenden Proteinen und Rezeptoren auf der Zelloberfläche verbleiben, hat sich gezeigt, dass HDL viele Signalkaskaden durch verschiedene Rezeptoren aktiviert. Das am besten untersuchte Beispiel dafür ist die Fähigkeit von HDL, an die Plasmamembran zu binden und durch Zellsignalisierung Cholesterin aus intrazellulären Speichern in Organellen zur Plasmamembran für den Efflux zu mobilisieren. Dies wurde der HDL-induzierten Aktivierung der Proteinkinase C (PKC) zugeschrieben (781). Insbesondere bindet ApoA-I an ABCA1 und aktiviert Phosphatidylcholin-Lipasen, die PKC aktivieren, was zum Transport von zellulärem Cholesterin aus den intrazellulären Speichern zur Plasmamembran für den Efflux sowie zur PKC-vermittelten Phosphorylierung von ABCA1 führt, was die Stabilität des Transporters erhöht und Efflux-Aktivität (782–784). Dies ist ein Paradebeispiel für HDL-induzierte Zellsignalisierung, die zur HDL-Cholesterin-Efflux-Kapazität beiträgt, die die Cholesterinbelastung für Makrophagen in der Läsion reduziert, die Bildung von Schaumzellen verhindert und Atherogenese antagonisiert. Andere HDL-induzierte Signalwege, die zu einem erhöhten Cholesterin- und Lipid-Efflux führen, umfassen Proteinkinase A (PKA) (785.786), Zellteilungskontrollprotein 42 (Cdc42) (787) und Janus-Kinasen-2 (JAK2) (788.789) Kaskaden. HDL (dh ApoA-I)-induzierte Zellsignalisierung durch ABCA1 unterdrückt auch die Aktivierung des Makrophagen-M1-Phänotyps und die entzündungsfördernde Zytokinproduktion (Abbildung 10) und fördert die entzündungshemmende Zytokin-Sekretion des M2-Phänotyps (z. B. Interleukin 10 (IL-10)) durch JAK2-Signalisierung und Aktivierung von Signaltransducer und Aktivator der Transkription 3 (STAT3) (75). Darüber hinaus wurde berichtet, dass die apoA-I:ABCA1:JAK2-Achse Entzündungen in Endothelzellen durch die Aktivierung von Cyclooxygenase-2 (COX-2) unterdrückt, was zu erhöhten Prostaglandinen (PGI .) führt2), die auch die Atherogenese unterdrückt (790).Es wurde auch berichtet, dass HDL Zellsignalisierung durch SR-BI induziert. Es wurde berichtet, dass die HDL-Bindung an die extrazelluläre Schleife von SR-BI die Aktivierung der zytoplasmatischen C-terminalen Domäne von SR-BI auslöst, was zur Phosphorylierung der Proteinkinase Src und zur Aktivierung sowohl der Leberkinase B1 (LKB1) als auch der Calmodulin-abhängigen Proteinkinase führt ( CAMK) (791.792). Dies führt zu einer Zellsignalisierung durch nachgeschaltete Kinasen – AMP-aktivierte Proteinkinasen (AMPK) (792), Proteinkinase Akt (791) und Mitogen-aktivierte Proteinkinase (MAPK) (791) – die letztendlich die Angiogenese reguliert ( Ubiquitinligase Siah (Siah1/2) und Hypoxie-induzierbarer Faktor 1α (HIF1α) (793)), Insulinsensitivität (Glukosetransporter 4 (Glut4)(794)), Revaskularisierung (Rac1(795)), und Vasodilatation (COX(796), endotheliale Stickoxidsynthase (eNOS)(797,798)). Interessanterweise wurde kürzlich gezeigt, dass Makrophage SR-BI Efferozytose (Phagozytose toter Zellen) im Rahmen von Atherosklerose über einen Src/Akt/Rac1-Signalweg vermittelt und Nekrose in Läsionen reduziert (185). Alle diese Downstream-Effekte tragen zur HDL-Funktion und in geringerem Maße zur Atherogenese bei.

    Die robusteste Aktivierung des HDL-Signals wird durch bioaktive Lipide auf HDL vermittelt, nämlich das Lysosphingolipid Sphingosin-1-Phosphat (S1P). Ein Großteil des im Umlauf befindlichen S1P ist mit HDL assoziiert, und HDL-S1P aktiviert die G-gekoppelten S1P-Rezeptoren (S1P1-5) auf der Oberfläche vieler vaskulärer Zelltypen, einschließlich Makrophagen, Endothelzellen und glatter Muskelzellen. Aktivierung von S1P1 und S1P2 Rezeptoren aktivieren eine Vielzahl von Signalkaskaden und Faktoren, die direkt zu den vielen antiatherogenen Eigenschaften von HDL beitragen, einschließlich der Erhöhung der endothelialen Barrierefunktion (799) und der Angiogenese (800, 801), während gleichzeitig Entzündungen (802) und Apoptose (803) verringert werden. Es wurde auch festgestellt, dass HDL die Migration der glatten Muskulatur durch S1P-Signalübertragung hemmt, ein Schlüsselfaktor für Restenose und Plaque-Entwicklung (804). All dies sind kritische Prozesse für die Atherogenese. Zur Unterstützung dieser Studien wurde festgestellt, dass Patienten mit KHK erniedrigte HDL-S1P-Spiegel aufwiesen (805). Die wichtigsten terminalen Effektorfaktoren in diesen Signalkaskaden des G-Protein-Rezeptors sind fokale Adhäsionskinase (FAK), nuklearer Faktor κ beta (NF-㮫), Nicotinamidadenindinukleotidphosphat (NADPH)-Oxidase, eNOS, STAT3 und B -Zell-Lymphom-extragroß (Bcl-xl) (780). Dieser HDL-S1P-Signalweg wurde auch mit Vasorelaxation (806) und Zytoprotektion (z. B. Kardiomyozyten) (807) in Verbindung gebracht. Zusätzlich zu diesen direkten Signalwegen aktiviert HDL wahrscheinlich auch die Zellsignalisierung indirekt über ATP (β-ATPase/P2Y12/13)(808) oder Toll-like-Rezeptoren (809). Insgesamt liegt die HDL-induzierte Zellsignalisierung in Gefäß- und Entzündungszellen den antiatherogenen Eigenschaften von HDL in der Gesundheit zugrunde, und Defizite in der HDL-Signalisierung führen wahrscheinlich zu einer Verbindung von HDL-Dysfunktion bei Stoffwechselerkrankungen mit einem erhöhten Atheroskleroserisiko.

    Entzündungshemmendes HDL

    Außerhalb des umgekehrten Cholesterintransports sind die entzündungshemmenden Eigenschaften von HDL die am umfassendsten untersuchte HDL-Funktion und spielen wahrscheinlich eine große Rolle bei der Antiatherogenität von HDL (Abbildung 10). Die entzündungshemmenden Eigenschaften von HDL werden durch zahlreiche Mechanismen in vielen Zelltypen verliehen. Neben der Bereitstellung der Gefäßbarriere kontrollieren Endothelzellen die Gefäßentzündung, indem sie Adhäsionsmoleküle exprimieren, die die Monozytenadhäsion und die endgültige Migration in die atherosklerotische Läsion unterstützen. Darüber hinaus sezernieren aktivierte Endothelzellen Zytokine und rekrutieren Monozyten durch Chemokinfreisetzung. Die Induktion von Adhäsionsmolekülen, Zytokinen und Chemokinen in aktivierten Endothelzellen ist größtenteils auf die transkriptionale Aktivierung von NF-㮫 zurückzuführen. Beim Menschen führte die Injektion von apoA-I zu einer verminderten Expression von Adhäsionsmolekülen in atherosklerotischen Plaques (810). Ein Mechanismus, durch den HDL die Aktivierung von Endothelzellen und Monozyten unterdrückt, besteht in der Hemmung der NF-kB-Aktivität durch Abschwächung der IkB-Kinase-Aktivität (811). Nichtsdestotrotz verringert HDL die Expression von Adhäsionsmolekülen durch mehrere Mechanismen. Mit HDL oder ApoA-I vorbehandelte Zellen sind vor TNFα oder oxidiertem LDL (oxLDL)-induzierter Adhäsionsmolekülexpression geschützt. Darüber hinaus kann die HDL-Bindung an SR-BI auch zur Hemmung der Expression von Adhäsionsmolekülen beitragen, da die SR-BI-vermittelte Akt-Aktivierung die Expression der Häm-Oxygenase-1 förderte. Darüber hinaus wurde berichtet, dass die Hochregulierung von 3-beta-Hydroxysteroid-Delta 24 (DHCR24) durch die HDL-Bindung an SR-BI der Fähigkeit von HDL zugrunde liegt, Adhäsionsmoleküle zu unterdrücken (812). Darüber hinaus wurde festgestellt, dass die HDL-Suppression des intrazellulären Adhäsionsmoleküls-1 (ICAM-1) in Endothelzellen teilweise durch den Transfer von miR-223 auf Empfängerzellen vermittelt wird (773). Neuere Studien deuten auch darauf hin, dass TGFβ und AMPK auch zur Unterdrückung der Expression von Adhäsionsmolekülen durch HDL beitragen (813).

    Zusätzlich zu den tiefgreifenden Auswirkungen von HDL auf das vaskuläre Endothel unterdrückt HDL die Myelopoese, die Monozytenrekrutierung, die Makrophagenaktivierung, die Proliferation und die Emigration aus atherosklerotischen Läsionen. Ähnlich wie seine Wirkung auf Endothelzellen unterdrückt HDL auch die Expression von Adhäsionsmolekülen in Monozyten, was die Adhäsion von Monozyten und die Migration zu atherosklerotischen Läsionen hemmt (814). Es wurde gezeigt, dass HDL und ApoA-I die CD11b-Expression auf menschlichen Monozyten sowohl durch ABCA1-abhängige als auch durch unabhängige Mechanismen unterdrücken (814). Die HDL-Hemmung der Monozytenaktivierung, die die Unterdrückung von Zytokinen und Adhäsionsmolekülen umfasst, wird sowohl durch Peroxisom-Proliferator-aktivierte Gamma-Rezeptoren (PPARγ) als auch durch NF-kB-Transkriptionsfaktoren vermittelt (815). Die Unterdrückung von Chemokinen und Zytokinen in myeloischen Zellen hemmt die Infiltration und Migration von zirkulierenden Monozyten und antagonisiert somit Atherosklerose. Es wurde auch berichtet, dass HDL die Makrophagen-Reprogrammierung durch den Transkriptionsfaktor ATF3 vermittelt, der die Toll-like-Rezeptor-Signalgebung reduziert (816). Wichtig ist, dass ein Großteil der Hemmung der Makrophagenaktivierung durch HDL’s (und ApoA-I’s) durch die Veränderung des Cholesterinspiegels in den Lipid-Rafts der Plasmamembran durch den Cholesterin-Efflux vermittelt wird, der durch ABCG1/SR-BI und ABCA1 vermittelt wird, jedoch ApoA-I die Signalübertragung durch ABCA1 und der vom Cholesterin-Efflux unabhängige JAK/STAT-Signalweg können ebenfalls zum HDL-Effekt beitragen, wie oben beschrieben (75.817) (814.818). Es wurde auch gezeigt, dass HDL die Auswanderung von Makrophagen fördert, indem es überschüssiges Cholesterin entfernt und Signalwege induziert (208). Zusätzlich zu den Auswirkungen von HDL auf Monozyten und Makrophagen unterdrückt HDL auch die Neutrophilenaktivierung und die Sekretion von vaskulären glatten Muskelzellen von Monozyten-Chemoattraktant-Protein-1 (MCP1) stark (819).

    Neben der Rolle von HDL bei der angeborenen Immunität deuten neuere Erkenntnisse darauf hin, dass HDL mehrere Rollen bei der adaptiven Immunität spielt (820). Mäuse, denen ApoA-I fehlt, entwickeln eine Autoimmunität, wenn sie einem hohen Cholesterinspiegel ausgesetzt sind (Ernährung und Hintergrund, Ldlr -/- ), das die T-Zell-Aktivierung und die Produktion von Autoantikörpern umfasst (821.822). Dieser Phänotyp wurde durch ApoA-I-Injektionen gerettet. Es wurde auch berichtet, dass HDL sowohl die Aktivierung von Antigen-präsentierenden Zellen (APC) von T-Zellen als auch die T-Zell-Aktivierung von Monozyten unterdrückt, wodurch die Sekretion von proinflammatorischen Zytokinen und Chemokinen verhindert wird (Abbildung 10) (823,824). ApoA-I verhindert auch das phänotypische Umschalten von T-regs in proinflammatorische follikuläre T-Helferzellen während der Atheroprogression (92). Darüber hinaus wurde berichtet, dass der Cholesterin-Efflux in HDL und ApoA-I die Myelopoese und die Proliferation myelopoetischer Stamm- und Vorläuferzellen als Funktionsverlust für beide unterdrückt Abca1 und Abcg1 bei Mäusen führte zu einer erhöhten Myelopoese (820). Es wurde auch gefunden, dass die Injektion von apoA-I diesen Phänotyp rettet (825). Darüber hinaus wurde berichtet, dass HDL- und Cholesterin-Efflux die Proliferation von Megakaryozyten-Vorläufern, die Thrombozytenspiegel und die Thrombozytose unterdrücken (826). Gemeinsam hemmen HDL und ApoA-I die zirkulierenden Spiegel von hämatopoetischen Vorläuferzellen, Monozyten, Neutrophilen und Blutplättchen, die alle zur Fähigkeit von HDL beitragen, Entzündungen und Atherosklerose zu begrenzen.

    Antithrombotisches HDL

    Eine weitere antiatherogene Funktion von HDL ist die Fähigkeit, die Thrombozytenaktivierung, Aggregation und Thrombusbildung direkt und indirekt zu hemmen (Abbildung 10). Es wurde festgestellt, dass HDL-C-Spiegel umgekehrt mit der Thrombusbildung beim Menschen assoziiert sind (827). HDL ist erforderlich, um überschüssiges Cholesterin aus der Plasmamembran von Blutplättchen für eine ordnungsgemäße Funktion zu entfernen, und Blutplättchen, die aus Mäusen isoliert wurden, denen SR-BI fehlt, um den Cholesterinausfluss zu HDL zu vermitteln, erwiesen sich als anfälliger für eine Aktivierung (828,829). Es wurde festgestellt, dass sowohl HDL- als auch Cyclodextrin-vermittelter Cholesterin-Efflux die Thrombozytenaggregation hemmen (828). Es wurde jedoch berichtet, dass HDL-induzierte Zellsignalisierung durch Bindung an Glykoprotein IIb/IIIa auf der Oberfläche von Thrombozyten Phospholipase C (PLC) und PKC aktiviert, was zu einem Fluss durch das Na+/H+-Antiportsystem führt (717). Dieser Weg kann zu einer Alkalisierung des Zytoplasmas und einer Calciumfreisetzung führen, was die Thrombozytenaktivierung verringern kann (830). Darüber hinaus hemmt HDL dosisabhängig die stimulierte Thrombozytenaktivierung, was zu einer verminderten Thrombozytenaggregation, Granulatsekretion und Fibrinogenbindung führt. Bei Ratten hemmten ApoA-I-Injektionen die Thrombusbildung und verringerten die Thrombusmasse (831). Die antithrombotischen Wirkungen von HDL werden zum Teil auch durch die Fähigkeit von HDL vermittelt, den Gewebefaktor und die Faktoren X, Va und VIIIa zu hemmen (Abbildung 10) (832). HDL verhindert auch die Thrombusbildung durch Zellsignalisierung und Stickoxid (NO)-Produktion in Endothelzellen (828) und die Unterdrückung der Expression von Gewebefaktor und Thrombozyten-aktivierendem Faktor in Endothelzellen (833,834). HDL reduziert auch den Einfluss von Erythrozyten auf die Thrombusbildung (835). Zusammengenommen verfügt HDL über mehrere biologische Mechanismen, die die Thrombusbildung hemmen und somit zu den antiatherogenen Eigenschaften von HDL beitragen.

    Pro-vasodilatorisches HDL

    Das Endothel trägt signifikant zum Gefäßtonus bei, und HDL verleiht Schutz gegen Endothelzellaktivierung, Apoptose und Verlust der Barrierefunktion, was für die Atherogenese kritisch ist. Es wurde berichtet, dass HDL eine endothelabhängige Vasodilatation in Aortenringen induziert (806), und Personen mit niedrigem HDL haben eine reduzierte endothelabhängige Vasorelaxation (Abbildung 10) (741). Der Nutzen von HDL für Endothelzellen wird größtenteils durch die Zellsignalisierung durch Phosphatidylinositol-3-Kinase (PI3K) und Akt vermittelt und wird durch bioaktive Lipide und assoziierte Proteine ​​auf HDL, einschließlich Lysosulfatid, S1P und Sphingosylphosphorylcholin (SPC) (791.798.806), induziert. Ein wichtiges Ergebnis der HDL-induzierten Zellsignalisierung ist die Produktion von NO (Abbildung 10) sowohl durch die signalisierungsinduzierte Phosphorylierung von eNOS als auch durch eine erhöhte eNOS-Expression (791.836). HDL kann eNOS-Phosphorylierung durch SR-BI, S1P-Rezeptor (S1P1-5) und ABCG1-vermittelter Cholesterin-Efflux (806.837). HDL-induziertes NO liegt vielen der positiven Eigenschaften von HDL für Endothelzellen zugrunde, einschließlich HDL-induzierter Vasodilatation, Straffung der Zell-Zell-Verbindungen und erhöhter Barrierefunktion, Differenzierung endothelialer Vorläuferzellen, Zellüberleben und -proliferation, Zellmigration, Hemmung der Apoptose und Unterdrückung der Expression von Adhäsionsmolekülen. Darüber hinaus hat HDL auch NO-unabhängige Eigenschaften auf Endothelzellen, einschließlich induzierter Proliferation, erhöhter Barrierefunktion, unterdrückter Entzündung und verminderter Apoptose (838). Diese Studien definieren eindeutig eine vorteilhafte Rolle von HDL bei der vaskulären Integrität, die dem HDL-Schutz gegen Atherosklerose zugrunde liegt.

    Anti-Apoptose-HDL

    HDL hat mehrere anti-apoptotische Eigenschaften, die das Überleben der Zellen verbessern (Abbildung 10). Nach verschiedenen Metriken unterstützt HDL die mitochondriale Funktion und verhindert die Freisetzung von apoptotischen Signalen, einschließlich Cytochrom C (205.839). Darüber hinaus steuert HDL die Expression von Bcl-xl, einem starken anti-apoptotischen Faktor, und unterdrückt Bid, das ein pro-apoptotisches Protein ist (839,840). HDL vermittelt diese Genexpressionsänderungen durch Zellsignalisierung und NO-Produktion durch Aktivierung von Oberflächenrezeptoren durch HDL-assoziierte Proteine ​​und bioaktive Lipide, einschließlich Apolipoprotein J (apoJ) und S1P (803,840). Darüber hinaus gibt es wahrscheinlich alternative anti-apoptotische Mechanismen, die aus der HDL-induzierten Signalgebung resultieren. Nichtsdestotrotz wurde gezeigt, dass HDL die Apoptose in Endothelzellen (Abbildung 10) unterdrückt, die mit Tumornekrosefaktor (TNFα) und oxLDL (839.841.842) aktiviert wurden. HDL-Proteine ​​(Apolipoprotein M, apoM) und apoM-bindende Lipide (S1P) tragen zur Fähigkeit von HDL bei, Tight Junctions und das Überleben von Endothelzellen zu erhöhen (843). Mäuse mit einem Mangel an ApoM haben reduzierte S1P-Spiegel und einen Verlust der Endothel-Barrierefunktion (843). Die Fähigkeit von HDL, die Endothel-Barrierefunktion zu unterstützen, ist ein Schlüsselmerkmal seiner Anti-Atherosklerose-Eigenschaften und stellt ein klassisches Beispiel für die Kontrolle der zellulären Genexpression und des Phänotyps von HDL dar, die für die Gefäßgesundheit von Vorteil sind. HDL besitzt aber auch viele Kapazitäten im extrazellulären Raum (z.B. Plasma), die vor Arteriosklerose schützen.

    Antioxidatives HDL

    Ein Schlüsselfaktor bei der Monozytenaktivierung und Chemotaxis in der Gefäßwand ist die Akkumulation von oxLDL, das proinflammatorischer und proatherogener ist als unmodifiziertes LDL. LDL kann durch verschiedene endogene Mechanismen oxidiert werden (844). In der Gefäßwand kann LDL von vielen Zelltypen modifiziert (oxidiert) werden, einschließlich glatter Gefäßmuskelzellen, Endothelzellen und Makrophagen (776). Bemerkenswerterweise verhindert HDL die Oxidation von LDL (Abbildung 10) und neuere Erkenntnisse deuten darauf hin, dass dies durch 4 verschiedene Proteine ​​geschehen kann, die auf HDL zirkulieren – apoA-I (845,846), LCAT (847), Lipoprotein-assoziierte Phospholipase A2 (Lp- PLA2) (848,849) und Paraoxonase 1 (PON1) (430,846). Erstens kann HDL einfach oxidierte Lipide oder oxidierende Faktoren aus Zellen aufsaugen, wodurch ihre Assoziation mit LDL und ihre Modifikation von LDL-Lipiden und -Proteinen verhindert werden. Darüber hinaus entfernt HDL Lipidhydroperoxide aus LDL-Partikeln (846). Insbesondere sind kleine apoAI enthaltende HDL-Partikel am effizientesten bei der Aufnahme von Lipidhydroperoxiden, die durch Oxidation der Methioninreste in apoA-I (850) zu ihren inaktiven Lipidhydroxiden reduziert werden. Im Vergleich zu apoA-II sind die Methioninreste in apoA-I konformativ förderlicher für die Reduktion von Lipidhydroperoxiden (851,852). Darüber hinaus sind HDL mit niedrigem oberflächenfreiem Cholesterin und Sphingomyelin effizienter bei der Aufnahme von Lipidhydroperoxiden (745,853). Die Fähigkeit von HDL, die Oxidation über diesen Mechanismus zu verhindern, wird auch durch die selektive Entfernung von HDL-Lipidhydroperoxiden und -hydroxiden durch Hepatozyten SR-BI (854) aufrechterhalten. Außerdem wird ApoA-I-Methioninsulfoxid durch Methioninsulfoxid-Reduktasen zu Methionin reduziert (850). LCAT zirkuliert auf HDL und es wurde auch berichtet, dass es die LDL-Oxidation blockiert, da eine LCAT-Überexpression in Mäusen die LDL-Oxidation reduziert, wie durch reduzierte LDL-Autoantikörper bestimmt (855). Lp-PLA2 scheint auf LDL pro-atherogen und auf HDL anti-atherogen zu sein (856). Seine Aktivität auf HDL trägt wahrscheinlich zur antioxidativen Kapazität von HDL bei, da die HDL-assoziierte Lp-PLA . gehemmt wird2 schwächte die Fähigkeit von HDL, die LDL-Oxidation zu blockieren (848). Das stärkste antioxidative HDL-Protein ist wahrscheinlich PON1. Die Überexpression von PON1 bei Mäusen verleiht eine verbesserte antioxidative Kapazität von HDL, und PON1 selbst verhindert die LDL-Oxidation in vitro (432). Am wichtigsten ist, dass HDL, das aus Mäusen isoliert wurde, denen PON1 fehlt, eine reduzierte Fähigkeit zur Verhinderung der LDL-Oxidation aufweist. Die antioxidative Kapazität von HDL spielt wahrscheinlich eine große Rolle bei der Vorbeugung von Entzündungen und Atherogenese und verleiht HDL wie vielen anderen alternativen Funktionen eine positive Rolle für die Gesundheit.

    Interzellulare HDL-Kommunikation

    HDL nimmt wahrscheinlich auch an der interzellulären Kommunikation durch den Transfer von Nukleinsäuren zwischen Geweben teil. Kürzlich wurde berichtet, dass HDL miRNA transportiert (Abbildung 10), bei der es sich um kleine nicht-kodierende RNAs handelt, die die Genexpression durch Bindung an komplementäre Zielstellen in der 3’ untranslatierten Region von mRNAs unterdrücken und somit die Translation hemmen und den mRNA-Abbau induzieren ( 772). Interessanterweise ist das HDL-miRNA-Profil bei Hypercholesterinämie und Atherosklerose signifikant verändert (772). Es wurde berichtet, dass miRNAs von Makrophagen zu HDL exportiert werden, und es wurde gezeigt, dass HDL spezifische miRNAs auf Empfänger-Hepatomzellen (Huh7) und Endothelzellen überträgt, wahrscheinlich über den HDL-Rezeptor SR-BI (773). In Endothelzellen lieferte HDL miR-223 an Empfängerzellen, wo es direkt auf die Expression des intrazellulären Adhäsionsmoleküls-1 (ICAM-1) abzielte (Abbildung 10) und somit die Adhäsion von Neutrophilen an die Zellen hemmte (773). miR-223 wird in Endothelzellen nicht transkribiert oder prozessiert, und die HDL-Lieferung von reifem miR-223 an das Endothel verleiht wahrscheinlich teilweise die entzündungshemmende Fähigkeit von HDL, die mit der Unterdrückung von Adhäsionsmolekülen verbunden ist. Zukünftige Studien sind erforderlich, um die physiologische Relevanz und funktionelle Bedeutung von HDL-miRNAs in Mensch- und Tiermodellen im Kontext von Arteriosklerose und anderen entzündlichen Erkrankungen zu bestimmen.

    Antiinfektiöses HDL

    HDL trägt auch zur angeborenen Immunität bei, indem es die Funktion der Immunzellen moduliert. Diese Hypothese wurde jedoch im Zusammenhang mit Arteriosklerose nicht ausführlich untersucht. HDL sind antiinfektiös, antiparasitär und antiviral. HDL hat die einzigartige Fähigkeit, endotoxischen Schock zu verhindern, bindet leicht an Lipopolysaccharide (LPS) und trägt zur Entfernung von LPS durch die biliäre Ausscheidung bei, wodurch die angeborene Immunität unterstützt wird (857-859). Unter den vielen Proteinen, die auf HDL zirkulieren, ist das Apolipoprotein L1 (Apo-L1) (auch als Trypanosomen-Lytischer Faktor bekannt) in bestimmten Unterklassen von HDL vorhanden (860,861). Dieser Faktor tötet Trypanosom brucei und Trypanosom brucei rhdesiense, Parasiten, die Schlafkrankheit verursachen, indem sie ionische Poren in Endosomen erzeugen (860-862). Obwohl vielversprechend, sind zukünftige Studien erforderlich, um zu definieren, wie die HDL-Regulierung der angeborenen Immunität zur Hemmung der Atherogenese beiträgt.

    HDL-Dysfunktion

    HDL verleiht viele antiatherogene Eigenschaften, die bei Arteriosklerose und anderen entzündlichen und metabolischen Erkrankungen verloren gehen. Dazu gehören 9 Schlüsselprozesse –


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