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Aktivierte Trägermoleküle und ihre Beziehung zu Enzymen

Aktivierte Trägermoleküle und ihre Beziehung zu Enzymen


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Ich lese Molekularbiologie der Zelle, und eine Sache, die ich nicht ganz verstehe, ist der Unterschied zwischen einem Enzym und einem aktivierten Trägermolekül. Ich verstehe, dass Enzyme die Aktivierungsenergie für eine Reaktion senken und in diesem Sinne die Geschwindigkeit beschleunigen, mit der eine Reaktion abläuft. Ich verstehe auch, dass aktivierte Trägermoleküle als Energiequelle fungieren, die ungünstige Reaktionen (wie anabole Reaktionen) vorantreiben kann. Aber den genauen Unterschied verstehe ich noch nicht ganz. Ich fragte mich, ob jemand etwas Licht in diese Sache bringen könnte.


Ich werde mich auf die Bedeutung des „aktivierten Trägermoleküls“ konzentrieren, da es zahlreiche Beschreibungen von Enzymen gibt. Dazu muss ich zunächst zwei weitere Ideen vorstellen. Ich entschuldige mich bei den Puristen, dass sie dies auf die Ebene der Frage zugeschnitten haben.

1. Gibbs Freie Energie in biochemischen Betrachtungen

Es gibt verschiedene Arten, Energie zu betrachten, und in der Chemie kann man es gewohnt sein, zu berücksichtigen Bindungsenergie in Bezug auf ein bestimmtes Molekül. In der Biochemie (um die es in dieser Frage geht) liegt der Fokus jedoch auf der Energetik von Gesamtprozessen. Zum Beispiel "Sind die Reaktionen bei der Synthese von Glucose aus Pyruvat energetisch günstig?" oder „Wie kann die Synthese von Glucose aus Pyruvat erfolgen, wenn die Gesamtreaktion energetisch nicht günstig ist?“ Ebenso für einzelne Reaktionen, wie die Bildung von Peptidbindungen zwischen Aminosäuren.

Für solche Betrachtungen ist das thermodynamische Konzept (Gibbs) Freie Energie (G) am nützlichsten. Dies liegt daran, dass Veränderung in der freien Energie (ΔG) während einer Reaktion (oder einer anderen Zustandsänderung) gibt an, ob eine Reaktion spontan ablaufen kann. Um aus einem nützlichen Abschnitt in Berg zu zitieren et al.

Eine Reaktion kann nur spontan erfolgen, wenn G ist negativ.

So weist in der eben erwähnten Reaktionsfolge die Gesamtsynthese von Glucose aus Pyruvat (Gluconeogenese) ein positives ΔG auf und ist energetisch ungünstig, während die des umgekehrten Prozesses (Glykolyse) energetisch günstig ist. Ebenso wenig überraschend hat die Bildung von Peptidbindungen ein positives ΔG und ist energetisch nicht günstig.

2. Wie kommen energetisch ungünstige Reaktionen in lebenden Zellen zustande?

Die in der Überschrift gestellte Frage ergibt sich aus der Tatsache, dass Gluconeogenese und Peptidbindungsbildung in lebenden Zellen ablaufen, obwohl die Kernreaktionen, die die Prozesse repräsentieren, für sich genommen energetisch ungünstig sind. Die Antwort ist im Titel von [Abschnitt 14.1.1. von Berg et al.]

Eine thermodynamisch ungünstige Reaktion kann durch eine günstige Reaktion getrieben werden

Wie bereits erwähnt, ist das ΔG des Gesamtprozesses wichtig. Wenn also eine Reaktion mit einem positiven ΔG an eine negative G größerer Größenordnung „gekoppelt“ wird, kann die Gesamtreaktion ablaufen. Zum Beispiel:

A → B ΔG = 20 kJ/mol (ungünstig) C → D ΔG = -30 kJ/mol (günstig) A + C → B + D ΔG = -10 kJ/mol (günstig)

Wenn die Reaktion C → D allein abläuft, wird die freie Energie als biochemisch nutzlose Wärme freigesetzt. Wenn es an Reaktion A → B gekoppelt ist, treibt es diese an, wobei der Rest als Wärme verloren geht.

3. Die Rolle aktivierter Trägermoleküle bei der Energiekopplung

Natürlich kann jede gekoppelte Reaktion dazu führen, dass Wasser sozusagen bergauf läuft. Um jedoch fortfahren zu können, müssen die Ausgangsmoleküle für die günstige Reaktion regeneriert werden. Es ist effizienter, diesen Regenerationsprozess zu spezialisieren, indem ein begrenzter Bereich spezialisierter Reaktionen mit einer negativen Änderung der freien Energie verwendet wird. Eine Beschreibung der Substrate (reagierenden Moleküle) solcher spezialisierten günstigen Reaktionen ist „aktivierte Trägermoleküle“. Alberts et al. definiere sie als:

Kleine diffusionsfähige Moleküle in Zellen, die leicht austauschbare Energie in Form einer oder mehrerer energiereicher kovalenter Bindungen speichern. Beispiele sind ATP und NADPH.

Berg et al. verwenden Sie den Begriff auch, beschreiben Sie ihn jedoch anhand der folgenden Beispiele:

  • ATP als aktivierter Träger von Phosphorylgruppen, da der Phosphoryltransfer von ATP ein exergonischer Prozess ist (d. h. ein negatives ΔG hat)
  • Nicotinamidadenindinukleotid (NAD+) ist ein wichtiger Elektronenträger bei der Oxidation von Brennstoffmolekülen. (Obwohl es in diesem Fall die Halbreaktion ist, die die Oxidation der reduzierten Form beinhaltet, NADH - oder NADPH, wie von Alberts erwähnt et al. - das ein negatives ΔG hat).
  • Coenzym A… ist Träger von Acylgruppen (aber es ist die Übertragung der Acylgruppe von Acyl-CoA-Molekülen – z. B. Acetyl-CoA – unter Erzeugung von CoA, das ein negatives ΔG hat).

Beispiele für die Beteiligung solcher Moleküle am Stoffwechsel finden sich in dem zitierten Band, ich möchte jedoch betonen, dass die spezifischen Reaktionen dieser Moleküle mit den von ihnen getragenen Gruppen (oder Elektronen) wichtig sind.

Und was ist mit Enzymen?

Wie das Poster sagte: „Enzyme senken die Aktivierungsenergie für eine Reaktion“. Sie sind (im Allgemeinen) große Proteinkatalysatoren, die keinen Einfluss auf das ΔG haben und am Ende der Reaktion unverändert sind.

Natürlich sind sie wichtig für biochemische Reaktionen, sie nehmen an ihnen teil und stellen Bindungsstellen bereit, um die Substrate und aktivierten Träger in Gegenüberstellung zu bringen, damit sie reagieren können. Aber sie könnten sich nicht stärker von den kleinen aktivierten Trägern unterscheiden.


4.2: Kontrolle der enzymatischen Aktivität

  • Beigetragen von Kevin Ahern, Indira Rajagopal und Taralyn Tan
  • Professor (Biochemie und Biophysik) an der Oregon State University

Eine druckbare Version dieses Abschnitts finden Sie hier: BiochemFFA_4_2.pdf. Das gesamte Lehrbuch ist kostenlos bei den Autoren erhältlich unter http://biochem.science.oregonstate.edu/content/biochemistry-free-and-easy


Methoden der intrazellulären Signalübertragung

Die Induktion des Signalwegs aktiviert eine Sequenz von enzymatischen Modifikationen, die wiederum von der nächsten stromabwärts gelegenen Komponente erkannt werden.

Lernziele

Erklären Sie, wie die Bindung eines Liganden die Signalübertragung in einer Zelle auslöst

Die zentralen Thesen

Wichtige Punkte

  • Die Phosphorylierung, die Addition einer Phosphatgruppe an ein Molekül wie ein Protein, ist eine der häufigsten chemischen Modifikationen, die in Signalwegen auftritt.
  • Die Aktivierung von Second Messengers, kleinen Molekülen, die ein Signal weitergeben, ist ein häufiges Ereignis nach der Induktion eines Signalweges.
  • Calciumionen, zyklisches AMP und Inositolphospholipide sind Beispiele für weit verbreitete sekundäre Botenstoffe.

Schlüsselbegriffe

  • zweiter Bote: jede Substanz, die verwendet wird, um ein Signal innerhalb einer Zelle zu übertragen, insbesondere eine, die eine Kaskade von Ereignissen auslöst, indem sie zelluläre Komponenten aktiviert
  • Phosphorylierung: die Addition einer Phosphatgruppe an eine Verbindung, die oft durch Enzyme katalysiert wird

Die Induktion eines Signalweges hängt von der Modifikation einer zellulären Komponente durch ein Enzym ab. Es können zahlreiche enzymatische Modifikationen auftreten, die wiederum von der nächsten nachgeschalteten Komponente erkannt werden.

Eine der häufigsten chemischen Modifikationen, die in Signalwegen auftritt, ist die Addition einer Phosphatgruppe (PO4 –3) zu einem Molekül wie einem Protein in einem Prozess namens Phosphorylierung. Das Phosphat kann zu einem Nukleotid wie GMP hinzugefügt werden, um GDP oder GTP zu bilden. Phosphate werden auch häufig Serin-, Threonin- und Tyrosinresten von Proteinen hinzugefügt, wo sie die Hydroxylgruppe der Aminosäure ersetzen. Die Übertragung des Phosphats wird durch ein Enzym namens Kinase katalysiert. Verschiedene Kinasen sind nach dem Substrat benannt, das sie phosphorylieren. Die Phosphorylierung von Serin- und Threoninresten aktiviert oft Enzyme. Die Phosphorylierung von Tyrosinresten kann entweder die Aktivität eines Enzyms beeinflussen oder eine Bindungsstelle erzeugen, die mit nachgeschalteten Komponenten in der Signalkaskade interagiert. Phosphorylierung kann Enzyme aktivieren oder inaktivieren, die Umkehrung der Phosphorylierung, Dephosphorylierung durch eine Phosphatase, wird die Wirkung umkehren.

Beispiel für Phosphorylierung: Bei der Proteinphosphorylierung wird eine Phosphatgruppe (PO4-3) an Reste der Aminosäuren Serin, Threonin und Tyrosin angehängt.

Auch die Aktivierung von Second-Messengern ist ein häufiges Ereignis nach der Induktion eines Signalweges. Sie sind kleine Moleküle, die ein Signal weitergeben, nachdem es durch die Bindung des Signalmoleküls an den Rezeptor ausgelöst wurde. Diese Moleküle helfen, ein Signal durch das Zytoplasma zu verbreiten, indem sie das Verhalten bestimmter zellulärer Proteine ​​​​ändern.

Calciumion ist ein weit verbreiteter zweiter Botenstoff. Die freie Konzentration an Calciumionen (Ca 2+ ) innerhalb einer Zelle ist sehr gering, da Ionenpumpen in der Plasmamembran kontinuierlich Adenosin-5′-triphosphat (ATP) verwenden, um es zu entfernen. Für Signalzwecke wird Ca 2+ in zytoplasmatischen Vesikeln, wie dem endoplasmatischen Retikulum, gespeichert oder von außerhalb der Zelle zugänglich gemacht. Wenn eine Signalübertragung stattfindet, ermöglichen Ligand-gesteuerte Calciumionenkanäle, dass die höheren Mengen von Ca 2+ , die außerhalb der Zelle (oder in intrazellulären Speicherkompartimenten) vorhanden sind, in das Zytoplasma fließen, was die Konzentration von zytoplasmatischem Ca 2+ erhöht. Die Reaktion auf den Anstieg von Ca 2+ variiert je nach beteiligtem Zelltyp. So führt beispielsweise in den β-Zellen der Bauchspeicheldrüse die Ca 2+ -Signalgebung zur Ausschüttung von Insulin, während in Muskelzellen eine Erhöhung von Ca 2+ zu Muskelkontraktionen führt.

Ein weiterer zweiter Messenger, der in vielen verschiedenen Zelltypen verwendet wird, ist zyklisches AMP (cAMP). Zyklisches AMP wird durch das Enzym Adenylylcyclase aus ATP synthetisiert. Die Hauptaufgabe von cAMP in Zellen besteht darin, an ein Enzym namens cAMP-abhängige Kinase (A-Kinase) zu binden und dieses zu aktivieren. A-Kinase reguliert viele lebenswichtige Stoffwechselwege. Es phosphoryliert Serin- und Threoninreste seiner Zielproteine ​​und aktiviert sie dabei. A-Kinase kommt in vielen verschiedenen Zelltypen vor, die Zielproteine ​​in jeder Zellart sind unterschiedlich. Unterschiede führen zu unterschiedlichen Reaktionen auf cAMP in verschiedenen Zellen.

Beispiel für cAMP als Second Messenger: Dieses Diagramm zeigt den Mechanismus der Bildung von zyklischem AMP (cAMP). cAMP dient als zweiter Botenstoff, um Proteine ​​in der Zelle zu aktivieren oder zu inaktivieren. Die Beendigung des Signals tritt auf, wenn ein Enzym namens Phosphodiesterase cAMP in AMP umwandelt.

Inositolphospholipide, die in geringen Konzentrationen in der Plasmamembran vorhanden sind, sind Lipide, die auch in sekundäre Botenstoffe umgewandelt werden können. Da diese Moleküle Membrankomponenten sind, befinden sie sich in der Nähe von membrangebundenen Rezeptoren und können leicht mit ihnen interagieren. Phosphatidylinositol (PI) ist das wichtigste Phospholipid, das bei der zellulären Signalübertragung eine Rolle spielt. Enzyme, die als Kinasen bekannt sind, phosphorylieren PI, um PI-Phosphat (PIP) und PI-Bisphosphat (PIP .) zu bilden2).


Biosynthese und Struktur-Wirkungs-Beziehungen des Lipids, einer Familie von Glykolipiden

Das Glykolipid Lipid A ist die konservierte, amphipathische Einheit von LPS.

Lipid A bindet mit hoher Affinität an bestimmte Toll-ähnliche Rezeptoren und Caspasen.

Bakterien verändern ihre Lipid-A-Strukturen, um die Immunaktivitäten zu modulieren.

Nicht-toxische Lipid-A-Kongenere sind wirksame immunmodulatorische Mittel.

Lipopolysaccharid (LPS), ein Glykolipid, das in der äußeren Membran gramnegativer Bakterien vorkommt, ist ein starker Auslöser angeborener Immunantworten bei Säugetieren. Ein typisches LPS-Molekül besteht aus drei verschiedenen Strukturdomänen: einem Polysaccharid namens Ö-Antigen, ein Kern-Oligosaccharid, und Lipid A. Lipid A ist die amphipathische Glykolipid-Einheit von LPS. Es stimuliert das Immunsystem, indem es eng an den Toll-like-Rezeptor 4 bindet. In jüngerer Zeit wurde auch gezeigt, dass Lipid A intrazelluläre Caspase-4 und Caspase-5 aktiviert. Eine beeindruckende Vielfalt wird in Lipid A-Strukturen von verschiedenen Gram-negativen Bakterien beobachtet, und es ist allgemein bekannt, dass subtile Veränderungen der chemischen Struktur zu dramatisch unterschiedlichen Immunaktivitäten führen können. Zum Beispiel Lipid A aus Escherichia coli ist für den Menschen hochgiftig, während ein biosynthetischer Vorläufer namens Lipid IVEIN blockiert diese toxische Aktivität und Monophosphoryl Lipid A von Salmonella Minnesota ist ein Impfstoff-Adjuvans. Somit könnte das Verständnis der Struktur-Aktivitäts-Beziehungen in dieser Glykolipid-Familie genutzt werden, um nützliche immunmodulatorische Wirkstoffe zu entwickeln. Hier geben wir einen Überblick über die Biosynthese, Modifikation und Struktur-Aktivitäts-Beziehungen von Lipid A.


Enzyme: Wie sie funktionieren und was sie tun

Enzyme beschleunigen chemische Reaktionen im menschlichen Körper. Sie binden an Moleküle und verändern diese auf spezifische Weise. Sie sind neben Tausenden anderer Funktionen für die Atmung, die Verdauung von Nahrung, die Muskel- und Nervenfunktion unerlässlich.

In diesem Artikel erklären wir, was ein Enzym ist, wie es funktioniert und geben einige gängige Beispiele für Enzyme im menschlichen Körper.

Share on Pinterest Das Enzym Amylase (im Bild) spaltet Stärke in Zucker auf.

Enzyme bestehen aus Proteinen, die in komplizierte Formen gefaltet sind und im ganzen Körper vorhanden sind.

Die chemischen Reaktionen, die uns am Leben erhalten – unser Stoffwechsel – beruhen auf der Arbeit, die Enzyme leisten.

Enzyme beschleunigen (katalysieren) chemische Reaktionen In einigen Fällen können Enzyme eine chemische Reaktion millionenfach schneller ablaufen lassen, als sie ohne sie gewesen wäre.

EIN Substrat bindet an die aktive Seite eines Enzyms und wird umgewandelt in Produkte. Sobald die Produkte das aktive Zentrum verlassen, ist das Enzym bereit, sich an ein neues Substrat zu binden und den Vorgang zu wiederholen.

Das Verdauungssystem – Enzyme helfen dem Körper, größere komplexe Moleküle in kleinere Moleküle wie Glukose zu zerlegen, damit der Körper sie als Brennstoff verwenden kann.

DNA Replikation – Jede Zelle Ihres Körpers enthält DNA. Jedes Mal, wenn sich eine Zelle teilt, muss diese DNA kopiert werden. Enzyme helfen bei diesem Prozess, indem sie die DNA-Spulen abwickeln und die Informationen kopieren.

Leberenzyme – die Leber baut Giftstoffe im Körper ab. Dazu verwendet es eine Reihe von Enzymen.

Das „Schloss-und-Schlüssel“-Modell wurde erstmals 1894 vorgeschlagen. In diesem Modell hat das aktive Zentrum eines Enzyms eine bestimmte Form, in die nur das Substrat wie Schloss und Schlüssel hineinpasst.

Dieses Modell wurde jetzt aktualisiert und heißt das Induziert-Fit-Modell.

In diesem Modell ändert das aktive Zentrum seine Form, wenn es mit dem Substrat interagiert. Sobald das Substrat vollständig eingerastet und in der exakten Position ist, kann die Katalyse beginnen.

Enzyme können nur unter bestimmten Bedingungen wirken. Die meisten Enzyme im menschlichen Körper funktionieren am besten bei etwa 37 °C – Körpertemperatur. Bei niedrigeren Temperaturen arbeiten sie immer noch, aber viel langsamer.

Ebenso können Enzyme nur in einem bestimmten pH-Bereich (sauer/alkalisch) funktionieren. Ihre Präferenz hängt davon ab, wo sie im Körper zu finden sind. Enzyme im Darm funktionieren beispielsweise am besten bei einem pH-Wert von 7,5, während Enzyme im Magen bei pH 2 am besten funktionieren, da der Magen viel saurer ist.

Ist die Temperatur zu hoch oder ist die Umgebung zu sauer oder alkalisch, ändert sich die Form des Enzyms dies verändert die Form des aktiven Zentrums, so dass keine Substrate daran binden können – das Enzym ist geworden denaturiert.

Einige Enzyme können nur funktionieren, wenn ein bestimmtes Nicht-Protein-Molekül an sie gebunden ist. Diese werden Kofaktoren genannt. Zum Beispiel kann Carboanhydrase, ein Enzym, das den pH-Wert des Körpers aufrechterhält, nicht funktionieren, wenn es nicht an ein Zinkion gebunden ist.

Um sicherzustellen, dass die körpereigenen Systeme richtig funktionieren, müssen manchmal Enzyme verlangsamt werden. Wenn beispielsweise ein Enzym zu viel aus einem Produkt herstellt, muss es einen Weg geben, die Produktion zu reduzieren oder zu stoppen.

Die Aktivität von Enzymen kann auf verschiedene Weise gehemmt werden:

Wettbewerbshemmer – ein Molekül blockiert das aktive Zentrum, sodass das Substrat mit dem Inhibitor um die Bindung an das Enzym konkurrieren muss.

Nicht-kompetitive Inhibitoren – ein Molekül bindet sich an ein anderes Enzym als das aktive Zentrum und verringert dessen Wirkung.

Nicht konkurrenzfähige Hemmstoffe – der Inhibitor bindet an Enzym und Substrat, nachdem sie aneinander gebunden haben. Die Produkte verlassen das aktive Zentrum weniger leicht und die Reaktion wird verlangsamt.

Irreversible Inhibitoren – ein irreversibler Inhibitor bindet an ein Enzym und inaktiviert es dauerhaft.

Im menschlichen Körper gibt es Tausende von Enzymen, hier nur einige Beispiele:

  • Lipasen – eine Gruppe von Enzymen, die bei der Verdauung von Fetten im Darm helfen.
  • Amylase – hilft, Stärke in Zucker umzuwandeln. Amylase kommt im Speichel vor.
  • Maltase – auch im Speichel enthalten, spaltet den Zucker Maltose in Glukose. Maltose kommt in Lebensmitteln wie Kartoffeln, Nudeln und Bier vor.
  • Trypsin – im Dünndarm gefunden, spaltet Proteine ​​in Aminosäuren auf.
  • Laktase – kommt auch im Dünndarm vor, spaltet Laktose, den Zucker der Milch, in Glukose und Galaktose.
  • Acetylcholinesterase – baut den Neurotransmitter Acetylcholin in Nerven und Muskeln ab.
  • Helicase – entwirrt DNA.
  • DNA-Polymerase – DNA aus Desoxyribonukleotiden synthetisieren.

Enzyme spielen eine große Rolle im täglichen Betrieb des menschlichen Körpers. Durch die Bindung und Veränderung von Verbindungen sind sie für das reibungslose Funktionieren des Verdauungssystems, des Nervensystems, der Muskeln und vielem mehr von entscheidender Bedeutung.


Evolution der ersten Zelle | Biologie

Frühe lebende Zellen waren RNA-Lebensformen, selbstreplizierende RNA, die von Lipoproteinvesikeln bedeckt war, waren die Präprokaryoten, mit der Zeit ersetzten Proteine ​​die katalytische Funktion von RNA und DNA ersetzte die kodierende Funktion von RNA, den Vorläufern moderner Prokaryoten durch DNA- RNA-Protein-Funktionstypen entwickelten sich.

Die Evolution der ersten primitiven Zelle aus der RNA-Welt stellt eine große Lücke dar. Die primitive Bakterienzelle stellt im Vergleich zu unseren Vorstellungen von der RNA-Welt eine immens komplizierte Struktur mit mindestens 1000 Genen dar.

Folgende Probleme müssen gelöst werden, um diese Lücke zu schließen:

1. Dominierende Rolle von Proteinen als Enzymen gegenüber Ribozymen.

2. Differenzierung verschiedener RNA-Typen.

3. Die Verschiebung von RNA zu DNA als Träger der genetischen Information.

5. Bildung von Chromosomen.

6. Erhöhung der genetischen Information.

7. Phänotypische Expression eines Genotyps.

9. Evolution des Stoffwechselprozesses.

Die Einführung von Pro­teinen als Enzyme führte zu einer spezifischeren Kata­lyse. Die enzymatische Fähigkeit der RNA-Stränge könnte verbessert werden, wenn einzelne Aminosäuren wie in tRNA angehängt würden, d. h. Aminosäuren fungierten als Coenzyme für die Ribozyme. Der nächste Schritt ist die Spezialisierung der RNA, sodass der ‘+’-Strang die Rolle der mRNA hatte und der ‘-‘-Strang als tRNA fungierte und an den ‘+’-Strang mit einem Anti- -Codontriplett.

Schließlich könnten die Aminosäuren zu einem Polypeptidstrang zusammengekoppelt werden, was die katalytische Aktivität weiter verbessern würde. Diese Idee wird dadurch unterstützt, dass tRNAs aus verschiedenen Organismen mit ähnlicher Funktion enger verwandt sind und somit tRNA auf den Ursprung des genetischen Codes und auf eine RNA-Welt zurückgeführt werden kann.

Unterscheidung verschiedener RNA-Typen:

Die funktionelle Spezialisierung verschiedener RNAs war adaptiv, um die Effizienz innerhalb von Protozellen zu steigern. Einige RNA-Arten (tRNA) sind auf das Sammeln von Aminosäuren spezialisiert und andere (rRNA) darauf, sie miteinander zu verbinden, und bilden die Grundlage des Codes in einer dritten Art von RNA (mRNA).

Die Entstehung komplexer Organismen erfordert den Übergang von RNA zu DNA als genetischem Material. Doppelsträngige DNA ist wesentlich stabiler als RNA und erlaubt enzymatisches Korrekturlesen und Korrigieren im Zusammenhang mit der Replikation und reduziert so die Mutationsrate (Abb. 2.10).

Die genetische Information in RNA-Organismen entspricht maximal 10 Tausend Basenpaaren im Vergleich zu 10 Millionen Basenpaaren im Bakterienchromosom.

Der Ersatz von Ribose durch Desoxyribose im Kohlenhydratrückgrat der RNA und der Ersatz der Uracilbase durch Thymin führte zu DNA. Desoxyribose wird in Zellen durch eine enzymatisch kontrollierte Reduktion von Ribose gebildet. Die enzymatische Synthese von DNA aus RNA durch reverse Transkriptase im RNA-Virus ist heute gut bekannt.

Herkunft des Codes in der ersten Zelle:

Der genetische Code, der auf vier Basen basiert, die in Tripletts mit Redundanz für zwanzig Aminosäuren exprimiert werden, ist fast universell. Es gibt zwar keine chemische Beziehung zwischen dem mRNA-Codon oder Anticodon von tRNA und der chemischen Struktur der Aminosäure, aber die Spezifität der gegebenen tRNA gegenüber einer bestimmten Aminosäure hat sich entwickelt. All diese Funktionen minimieren das Risiko von Replikationsfehlern und die Rate von Punktmutationen.

Bildung des Chromosoms:

Frei schwebende RNA-Moleküle, die einmal in einer Membran eingeschlossen waren, würden adaptiv werden, um Gene in einem einzigen Chromosom miteinander verbunden zu haben. Verschiedene Arten von frei schwebenden RNA-Molekülen, die in ihren Protozellen repliziert werden, erfahren nach Teilung der Protozelle mit reduzierter Fitness eine ungleiche Verteilung in Tochterzellen.

Dies könnte überwunden werden, indem die RNA-Moleküle zu einem Einzelstrang verbunden werden, kombiniert mit gleichzeitiger Replikation, was zu einer gleichmäßigen Verteilung des Genoms zwischen den Tochterzellen führt.

Zunehmende genetische Informationen:

Die Genomgröße wird mit zunehmender Komplexität von einigen wenigen Genen im Virus auf 1000 in Bakterien, 5000 in Fruchtfliegen und 30000 in menschlichen oder höheren Pflanzen erhöht, aber nicht mit einer drastischen Zunahme der Anzahl übersetzbarer Gene verbunden.

Der wichtige Mechanismus zur Erhöhung der genetischen Information ist die Genverdoppelung, gefolgt von Mutation und Selektion, die zur Produktion neuer Enzyme und Biomoleküle führt. Natürlicher horizontaler Gentransfer, wie er bei Bakterien vorkommt (Transformation, Konjugation, Transduktion) könnte zu einer Erhöhung der genetischen Information führen.

Phänotypische Expression eines Genotyps:

Obwohl Gene oft mit bestimmten phänotypischen Merkmalen korreliert sind, spezifizieren Gene nur Proteine ​​/ Enzyme. Variationen eines Gens (Allele) können durch Variationen des spezifizierten Proteins Auswirkungen auf den Phänotyp haben. Tatsächlich ist die Produktion eines bestimmten Phänotyps das Ergebnis eines Netzwerks von Interaktionen zwischen Genen und Enzymen und zwischen verschiedenen Enzymen, das viel zu komplex ist, um aufgeklärt zu werden.

Ursprung der Zellmembran in der ersten Zelle:

Die spontane Bildung von molekularen Doppelschichten auf den Wasseroberflächen durch Lipide diente als Modell für die Entstehung der doppelschichtigen Phospholipid-Zellmembran. Dies liegt am hydrophoben (gegenseitig angezogenen) und hydrophilen (von Wasser angezogenen) Ende der linearen Moleküle (Abb. 2.11).

Wenn die Lipidfilme Kugeln bilden, sind die hydrophoben Enden innerhalb des Films verborgen, der den niedrigsten Energiezustand erreicht. Phospho­lipide werden leicht in Gegenwart von Lipiden, Glycerin und Phosphat gebildet und solche Kugeln können experimentell durch Schütteln und Beschallen hergestellt werden.

Ständige Zugabe von Masse zum Inhalt der Kugeln und zur Membran führt zur Knospung und Teilung der Zellen. Der Sitz der meisten lebenswichtigen Funktionen (Energiestoffwechsel, Transportkanäle) der Zelle in der Zellmembran basiert auf einer Vielzahl von eingebetteten Proteinen (Abb. 2.12).

Evolution des Stoffwechsels in der ersten Zelle:

Die grundlegenden Arten des Energiestoffwechsels sind Phototrophie, Atmung, Fermentation, Metanogenese, die alle unter den Bakterien vertreten sind. Der dissimilatorische Energiestoffwechsel (katabol) bezeichnet den Mechanismus zur Bildung von ATP mit energiereichen Phosphatbindungen (Abb. 2.13).

Der assimilatorische Stoffwechsel (anabol) bezieht sich auf Stoffwechselprozesse, die dazu dienen, die Bestandteile der Zelle aus chemischen Verbindungen der Umgebung durch phototrophe (Photosynthese­sis), chemotrophe (Chemosynthese) oder hetero­trophische Modi aufzubauen. Die Prozesse des Energiestoffwechsels basieren auf gekoppelten Redoxprozessen vom Typ AH2 -1- B BH2 + A.

Der wichtige Wasserstoffträger in der Zelle ist NADVNADFH oder seine phosphorylierte Version NADP/NADPH (Abb. 2.14).

Fermentation stellt die primitivste Form des Energiestoffwechsels dar, deren Biochemie einfach ist und kein externes Oxidationsmittel (Elektronenakzeptor) benötigt und unabhängig von O . ist2. Gut bekannte Fermentationsverfahren umfassen Milchsäurefermentation, Ethanolfermentation, Buttersäurefermentation. Der respiratorische Kohlenhydratstoffwechsel wird durch eine anaerobe Fermentation eingeleitet.

Der erste membrangebundene Elektronentransportmechanismus basierte auf einfachen funktionellen Molekülen, jedoch ohne die Proteinkomponente. Die später entwickelte Proteinkomponente verbesserte die Effizienz und Spezifität.

Solche nackten Moleküle wie Chinin, metallhaltige Por­phyrine, anorganisches FeS, das in anoxischer präbi­otischer Erde üblich ist, könnten in primitive Zellmembranen eingebaut sein, die photoaktiviert werden können und für ein primitives Elektronentransportsystem oder eine Art photochemischer Energieübertragung verantwortlich sind (Abb. 2.15 ).

Aus lichtempfindlichem Porphyrin ist Protochlorophyll und Cytochrom geworden. Atmende Organismen werden aus phototrophen Organismen durch sekundären Verlust von Chlorophyll und abhängig von externen chemischen Reduktionsmitteln abgeleitet. Die photosynthetischen purpurroten Nichtschwefelbakterien haben ein Elektronentransportsystem, das fast identisch mit dem der Mitochondrien ist (Abb. 2.16).

Der Mechanismus zur Erklärung des Ursprungs komplizierter biochemischer Prozesse, die viele Schritte und Zyklen umfassen, ist die Tatsache, dass diese Wege meist reversibel sind und den Prozess in beide Richtungen katalysieren.

Assimilationsreduzierung von CO2 mit Hilfe von NADFH2 und Energie (ATP) kann in umgekehrter Richtung verlaufen und ein dissimilativer und oxidativer Weg werden, der organisches Material zu CO . abbaut und oxidiert2 und ATP über den respiratorischen glykolytischen Stoffwechselweg und den Zitronensäurezyklus freisetzen (Abb. 2.17).

CO2 Durch den Calvin-Zyklus in organisches Material assimiliert, wird es über den glykolytischen Weg oxidiert, was eigentlich ein umgekehrter Prozess des Calvin-Zyklus ist. Der Ursprung des Zitronensäurezyklus lässt sich daran erkennen, dass grüne Schwefelbakterien CO . aufnehmen2 durch einen reduktiven Zitronensäurezyklus, der ATP benötigt (Abb. 2.18).

Prokaryotische Zelle:

Aus der obigen Diskussion ist kristallklar, dass die chemische Evolution auf der präbiotischen Erde zu organischen Molekülen führte, die Proteine, Nukleinsäuren usw. umfassten. Etablierung von Enzymsystemen und einer umgebenden Lipidmembran Ein Energietransfermechanismus mit ATP hat sich entwickelt.

Dies könnte der Beginn einer stabilen strukturellen und funktionellen Organisation gewesen sein, die einer biologischen Zelle ähnelt. Diese Zellen werden aufgrund des Fehlens von membrangebundenen Kernen und Organellen als prokaryotisch bezeichnet.

Primitive prokaryontische Zellen waren im Wesentlichen anaerobe Zellen (anaerobe Bakterien), da die frühe Erde sauerstoffarm war. Die Erschöpfung organischer Verbindungen in der Ursuppe führte zum Auftreten photosynthetischer Zellen (Blaualgen), die CO . fixieren können2 und wahrscheinlich auch Stickstoff.

Photosynthetische Zellen waren für die Sauerstoffproduktion in der Atmosphäre verantwortlich, was zur Entstehung von aeroben Zellen (aeroben Bakterien) mit Stoffwechselwegen für die aerobe Atmung führte.


Enzymproduktion und -reinigung: Extraktions- und Trennmethoden | Industrielle Mikrobiologie

In diesem Artikel werden wir über die Herstellung und Reinigung von Enzymen diskutieren. Erfahren Sie mehr über das e Extraktions- und Trennmethoden zur Isolierung und Reinigung von Enzymen. Die Extraktionsverfahren sind: 1. Extraktion fester Substratkulturen 2. Extraktion von Zellen und die Trennverfahren sind: 1. Feststofftrenntechniken 2. Membrantrenntechniken 3. Gelfiltration 4. Adsorptionstechniken 5. Präzipitationstechniken. Sehen Sie sich auch den untenstehenden Artikel an, um sich ein Bild von der Lagerfähigkeit von Enzymen und E zu machen Enzymimmobilisierung .

Bei der Enzymproduktion besteht ein sehr ungünstiges Verhältnis zwischen Rohstoffeinsatz und Produktausstoß. Dies erfordert die Installation von Konzentrationsverfahren. Aus wirtschaftlichen Gründen der Enzymapplikation ist für industrielle Enzympräparationen meist eine Konzentration bis zum 10-fachen ausreichend.

Beispielsweise enthalten in Waschmitteln verwendete Enzymprodukte etwa 5-10% Protease, während Amylasepräparate zur Verwendung bei der Mehlbehandlung nur etwa 0,1% reine a-Amylase enthalten. Bei Anwendungen, bei denen hochreine Enzyme erforderlich sind, z. B. bei der enzymatischen Analyse, ist jedoch eine 1000-fache Reinigung durchaus üblich.

Bei einigen Anwendungen, wie zum Beispiel beim Backen und bei der Dextroseherstellung, muss die Anwesenheit von verunreinigenden Enzymen sehr gering sein oder streng kontrolliert werden. Darüber hinaus enthalten die aus mikrobiellen Kulturen gewonnenen Enzym-Rohlösungen – unabhängig von ihrer Herkunft – unterschiedliche Arten von Nebenprodukten. Eine Trennung all dieser Stoffe kann wegen möglicher unerwünschter Wirkungen erforderlich sein.

In Anbetracht der Enzymstabilität gibt es einen weiteren Grund für die Behandlung von rohen Enzympräparaten. Da der Trend bei Enzymanwendungen zum Einsatz flüssiger Präparate geht, ist die Stabilisierung ein wichtiges Verfahren.

Techniken zur großtechnischen Isolierung und (Teil-) Reinigung von Enzymen aus mikro- und hygienischen Quellen verwenden hauptsächlich traditionelle Verfahren. Die meisten Geräte finden sich in lebensmittelverarbeitenden Betrieben. Für die Enzymisolierung spezifische Geräte im Großmaßstab werden nicht vermarktet.

Nahezu alle Verfahrensschritte werden mit Ausnahme der Trocknung bei niedrigen Temperaturen (bevorzugt 0°-10°C) durchgeführt.

Trennprozesse werden in der Regel nicht kontinuierlich, sondern chargenweise durchgeführt. Das Scale-up von Batch-Operationen verursacht jedoch von Natur aus verlängerte Verarbeitungszeiten, die für viele Enzyme zu erhöhten Aktivitätsverlusten aufgrund der Denaturierung des Enzymproteins führen.

Aus diesem Grund erscheint die Anwendung kontinuierlicher Verfahren sinnvoll, aber die Notwendigkeit hochzuverlässiger Maschinen und ausgeklügelter Prozesssteuerung verzögert die Einführung kontinuierlicher Verfahren. Außerdem geht der Wert der kontinuierlichen Verarbeitung verloren, wenn ein einzelner Prozessschritt chargenweise durchgeführt wird, vielleicht während der Fällung.

Extraktionsmethoden :

Der erste Schritt bei der Isolierung von Enzymen ist ihre Extraktion. Techniken, die in diese Gruppe fallen, werden entweder verwendet, um Enzyme aus einer festen Substratkultur abzutrennen oder um Enzyme aus dem Inneren mikrobieller Zellen freizusetzen.

Extraktion fester Substratkulturen:

Enzyme, die durch Kultivierung fester Subshystrate hergestellt wurden, waren früher vom extrazellulären Typ. Es ist daher leicht vorstellbar, dass die Extraktion von Schimmelkleie eher ein Auswaschprozess ist. Gegenstromverfahren der Perkolation sind die am häufigsten verwendeten Geräteoperationen.

In vielen Fällen wird die Schimmelkleie vor der Extraktion getrocknet. Dies ist praktisch, wenn die Verwendung des jeweiligen Enzympräparats saisonabhängig ist. Die Kulturen können in relativ kleinen Anlagen das ganze Jahr über hergestellt werden, während die Extraktion in Zeiten des Enzymbedarfs durchgeführt wird.

Andererseits ist leicht zu erkennen, dass die Extraktion aus getrockneter Kleie Lösungen mit höheren Enzymkonzentrationen ergibt. Und schließlich vermeidet das Trocknen Interferenzen, die durch die Aktivität lebender Zellen frischer Kulturen verursacht werden. Diese Argumentation gilt jedoch möglicherweise nicht für kontinuierlich betriebene Kulturanlagen.

In allen Fällen handelt es sich bei dem Extraktionsmittel um Wasser, das jedoch Säuren (anorganisch oder organisch), Salze, Puffer oder andere Substanzen enthalten kann, um die Löslichkeit des Enzyms zu erleichtern oder seine Stabilität in Lösung zu verbessern oder um unerwünschte Wirkungen auszuschließen oder zu minimieren, die durch kontaminierende Nebenprodukte oder Mikroorganismen.

Die Entscheidung, ob ganze Zellen für einen biochemischen Prozess oder isolierte Enzyme eingesetzt werden, hängt von vielen Faktoren ab. Technical difficulties and the related cost of large-scale isolation play an important role.

There are a number of methods for cell disruption, as reviewed by Hughes et al. (1971). Chemical and biochemical methods, such as autolysis, treat­ment with solvents, detergents, or lytic enzymes, have the disadvantage of being in principle batch operations. Their conduct is difficult to standardize and optimize. More recommendable are mechanical techniques.

At present, the APV-Manton-Gaulin homogenizer seems to be the most versatile type for cell disintegration. In this machine the cell suspension passes a homogenizing valve at the selected operating pressure and im­pinges on an impact ring. The strong shearing forces combined with the sudden decompression lead to a disruption of the cell wall. Dunnill and Lilly (1972), who examined the disruption of yeast, found that release of protein can be described by a first order rate equation-

Where R is the amount of soluble protein released in g per kg cell mass, Rm the maximum amount of soluble protein released, K a temperature-dependent rate constant, N the number of times the cell suspension has passed the homogenizer, and P the operating pressure. With industrial models, be­tween 50 and 9000 liters of bacterial suspension per hr can be treated, depending on the size of the machine. Ball mills available on the market have a volume capacity of 0.6-250 liters.

Separation Methods :

It is possible here to give only the barest outline of methods that find wider application in the large-scale production of enzymes.

Solids Separation Techniques:

Such methods are involved in the clari­fication of culture liquors and extracts, in the separation of precipitates, and in the sterilization of liquid enzyme preparation by mechanical methods.

The solids to be separated may have a number of properties which make separation processes difficult. For instance, they may be greasy, sometimes colloidal, and often density differences between solid particles and liquid phase are very small. Therefore, pretreatment of the liquor is usually inevitable, as conducted by acidification, addition of water miscible sol­vents or liquid polyions, mild heating, etc.

The problems of large-scale solid-liquid separation are complex and di­verse. There are two approaches- centrifugation and filtration. Industrial centrifuges are not ideal for removal of finely divided biological solids. Disc type centrifuges without solid discharge have proved most efficient for separation of easily settling suspensions of greasy particles. Decanters are used in cases where solids content is high but easily settling, e.g., in the production of dried acetone precipitates.

In cases of poorly settling protein precipitates, hollow bowl centrifuges are employed for separation from low solids suspensions as obtained during fractionated enzyme precipitation. In all cases flow rates must be determined empirically. Sometimes (e.g., with precipitates) the throughput is reduced to less that 10% of the nominal capacity. This requires the integration of cooling devices.

Most frequently filters are more suitable for separation of biological particles. Generally large proportions of filter aids are required. In continu­ous processes vacuum drum filters are used, with diatomaceous earth, wood-meal, or starch as pre-coat materials. Batch operations are conducted with filter presses.

Membrane Separation Techniques:

Membrane processes allow separa­tion of solutes from one another or from a solvent, with no phase change or interphase mass transfer. There are many different kinds of membrane processes, the classification of which is based on the driving forces that cause the transfer of solutes through the membrane. Such a force may be trans-membrane differences in concentrations, as in dialysis electric poten­tial, as in electro-dialysis or hydrostatic pressure, as in microfiltration, ultrafiltration, and reverse osmosis.

At present, ultrafiltration is the only membrane process of importance in large-scale enzyme production. From normal filtration processes it differs just by the size range of the particles to be separated (molecular weight cutoffs between 500 and 300,000). Two types of ultrafiltration membranes are used, which differ in their transport mechanisms and their separation properties.

Isotropic porous membranes are the type most similar to conventional filters. They possess a spongy structure with extremely small random pores the average size of which is in the range of 0.05 to 0.5 microns. Molecules with a diameter smaller than that of the smallest pore will pass the mem­brane quantitatively, whereas particles larger than the largest pore will be retained at the filter surface. Molecules of intermediate size, however, will only pass to some extent.

Another proportion of these particles will be retained within the structure of the membrane. This leads, first, to a decrease in retention (or vice versa, in permeation) with a resulting fouling of the membrane, and secondly, to a reduced discrimination among solutes of different size. In order to minimize fouling it is useful to use membranes with a mean pore size well below that of the solute to be retained. Therefore, porous membranes are advisable for the concentration of high molecular weight solutes (molec. Weight < 1 x 10 6 ).

Diffusive membranes are capable of more selective molecular discrimina­tion. They are essentially homogeneous hydrogel layers, through which the solvent as well as the solute is transported by molecular diffusion under the driving force of a concentration or a chemical potential gradient. The transportation of a molecule through the membrane requires considerable kinetic energy.

This depends, of course, on the dimensions of the diffusing molecule and on the mobility of the single polymer chains within the membrane matrix. As a rule, the rate of diffusion is high when the polymer segments of the matrix are only loosely interlaced, i.e., when the gel matrix is highly hydrated. For this reason all membranes made from hydrophilic polymers and capable of swelling in water to a certain degree are princi­pally suited as pressure filtration membranes for aqueous solutions.

In addition to the retention potential of the membrane the flux is impor­tant for economic reasons. Since in both the porous and the diffusive filter types the flux depends largely on the thickness of the membrane, it is necessary to keep the membrane as thin as possible.

This requirement has been fulfilled by the construction of anisotropic membranes. They consist of a highly consolidated but very thin (0.1-5 μm) active layer on a compara­tively thick (1 to 20 microns) highly porous support. The advantage of these anisotropic membranes is that there is no reduction in solvent permeability at constant hydrostatic pressure because there is no blockage within the membrane.

In any ultrafiltration system, accumulation of solutes at the membrane surface occurs, which leads to formation of a “slime” that increasingly impedes solvent flow through the membrane, until convective transport of solute toward the membrane is equal to the rate of back diffusive transport away from the membrane. This phenomenon is called “concentration polar­ization”.

Proteins and colloidal particles build up solid or thixotropic gels when concentrated beyond a certain point. The solute concentration on the membrane surface reaches an upper limit which is typically between 20 and 70% solute by volume. In order to reduce the polarization effect, in industrial ultrafiltration equipment the feed solution passes the membrane surface at high flow rate.

When a macromolecular solution is ultra-filtered, flux of solvent is de­scribed by the relationship-

Where A is the membrane constant (dependent on temperature, indepen­dent of pressure over the normal operating range), ΔP is the hydrostatic pressure driving force, and Δπ is the osmotic pressure difference across the membrane. For macromolecular solutions with concentrations over 1% w/v, osmotic pressures exceeding 10 to 50 psi are not uncommon.

There are several basic types of ultra-filters – thin channel, tubular, helical tubes, spiral wrapped, and hollow fiber systems. Suitability of a single type depends on the properties of the system to be treated.

The technique of ultrafiltration has the advantage of combining both separation of impurities and concentration of the desired enzyme. However, due to its principle, it is a rather nonselective process. Better results, regarding separation of molecules from each other, can be obtained by gel filtration, but in many cases its application is not economically feasible.

In principle, gel filtration is the diffusional partitioning of solute mole­cules between the readily mobile solvent phase and that confined in spaces within the porous gel particles that make up the stationary phase. Diffusional exchange of solutes takes place between the stationary and mobile phases. The extent to which a molecule penetrates the station­ary phase is represented by the partition coefficient Kav, according to the equation

Where Ve is the volume of solvent required to elute solute from the gel column, V0 is the void volume (i.e., the volume of liquid external to the gel particles), and VT is the total volume of column bed. Kav is inversely proportional to the log of the molecular weight, as shown empirically.

Gel filtration works rapidly and preservingly, without mechanical stress as in ultrafiltration. However, precipitation of proteins within the gel column may occur as a consequence of desalting. In some cases it has been observed that the metal bridges of enzyme quaternary structures were uncoupled.

Adsorption Techniques:

Because of the possibility of highly selective separations, adsorption processes are increasingly used. Properties of en­zyme molecules as different as, e.g., lipophily, electric charge, specificity, etc., are the basis of separation. This results in a great number of adsor­bents, such as active carbon, hydroxyapatite, ion exchangers, carrier fixed substrate analogs, and so forth.

A common feature of all adsorption tech­niques is the principle of adsorption followed by desorption or elution. Separation is achieved by adsorption and elution of either enzyme or impu­rities. Two methods are available, batch wise adsorption or column chroma­tography. The latter process has greater separation efficiency and, in addi­tion, offers the possibility of semi-continuous operation.

Among the different adsorption techniques, affinity chromatography is of very great interest, but far from being applicable on a large scale. Ion exchangers available for large-scale processes are of the resin, large-pore gels, or cellulose types. In particular, ion exchange resins exhibit useful properties for industrial production of enzymes.

It must, however, be taken into consideration that the proximity of a resin matrix with a high charge density can affect the structural integrity of enzymes. Large-pore ion exchangers and cellulose exchangers have a number of properties which make them very suitable for enzyme separation processes, but the former are very costly. Obviously, they are only suitable for batch processes be­cause they are compressed in columns.

Precipitation Techniques:

Separation from solution by salting out is one of the oldest and yet most important procedures of concentration and purification of enzymes. The logarithm of the decrease in protein solubility in concentrated electrolyte solutions is a linear function of increasing salt concentration (ionic strength), as described by the equation-

where s is the solubility of the protein in g/liter solution τ the ionic strength in moles per liter B 1 , an intercept constant, is dependent on pH, tempera­ture, and the nature of the protein in solution K 1 is the salting out constant which is independent of pH and temperature, but varies with the protein in solution and the salt used. From the preceding relationship it can be derived that precipitation of protein of known concen­trations will occur when the ionic strength satisfies the equation

This means that the electrolyte concentration required for protein precipi­tation varies with protein concentration.

The influence of the most important precipitation parameters can be outlined shortly as follows – Higher valency salts produce higher ionic strength than lower valency salts. At a constant ion strength, protein solubility increases with increasing distance (in both directions) from its isoelectric point. As a result, lower ionic strength is required for precipita­tion when carried out at the isoelectric point of the protein.

The commonly used salt for precipitation is ammonium sulfate. The reasons can be found in the high solubility of this salt and in its low price. In addition, ammonium sulfate is nontoxic for most enzymes and in many cases it acts as a stabilizing agent. In ammonium sulfate solutions precipitated enzymes are often storable for years without significant loss when kept at low temperatures.

In contrast to neutral salts, solvents are less customary for large-scale precipitation of enzymes. The reason is higher costs of raw materials and equipment. Explosion proof equipment and recycling of the solvents are inevitable requirements.

Solvent precipitation is based on the fact that the solubility of enzymes decreases with the decreasing dielectric constant (ϵ) of the solvent. The concentration required is lower the less hydrophilic the solvent is. Thus, an increasing precipitating effect can be achieved in the series methanol (ϵ25 = 33), ethanol (ϵ25 = 24), isopropanol (ϵ25 = 18). Besides aliphatic alcohols, acetone (ϵ25 = 20) is often used as a precipitant.

Solvent precipitates are distinguished from salt precipitates by the ease with which they settle. However, at temperatures above 4°C denaturation of the enzyme protein can occur. Therefore, it is quite normal to work at temperatures below zero. This, however, requires large cooling capacity in industrial manufacture.

All these difficulties can be avoided by using polyethyleneglycol with a molecular weight of 6000. This precipitant does not effect enzyme denatur­ation and is relatively independent of temperature and electrolyte concen­tration. However, there is a strong dependence on hydrogen ion concentra­tion. The best results are obtained at the isoelectric point of the enzyme to be precipitated.

As the solubility of a protein molecule is lowest at its isoelectric point, successive precipitation of different enzymes from a solution can be achieved by changing the pH. These precipitates settle easily and can easily be separated from the solution by centrifugation.

Conversion to Storage Form :

Storability of an enzyme requires the preparation of a suitable storage form. Commercial enzyme products are available either in solution or in solid state. Generally, users prefer solutions because of their easier han­dling, but enzymes are usually very unstable in aqueous solution.

For this reason stabilization of dissolved enzymes is a very important step in the manufacture of liquid enzyme preparations. The storage stability is af­fected by the following two factors- microbial deterioration of the enzyme solution and denaturation of the enzyme protein. These two problems seem to be closely related to each other.

Many treatments have been tried in order to prevent growth of microor­ganisms. The methods include, for instance, incorporation of chemical pre­servatives, pasteurization, addition of salts and polyhydric alcohols, and irradiation. But some of those treatments are undesirable due to legal aspects. Therefore, the most suitable method to repress microbial growth is to dissolve the enzyme in a highly concentrated solution of salts and sugars.

With liquid preparations, storage at low temperatures and at suitable pH is essentially inevitable. It is well known that substrates almost invariably protect the corresponding enzyme against physical, chemical, or physicochemical agents. This can be attributed to either conformational stabiliza­tion or steric or competitive protection.

From a number of publications it can be seen that almost any effect on enzyme stability may a priori be an allosteric one due to attack at sites other than the active site of the enzyme. For example- in thermolysin, a bacterial protease, Ca ions stabilize the enzyme molecule, while Zn ions are required for activity. The enormous value of Ca ions in stabilizing bacterial α-amylase has long been known.

A number of techniques are available for stabilization.

Some of them are presented in the following list, immobilization methods excluded:

(1) Conformational or charge stabilization and/or protection from dilution-dissociation by using buffers, glycerol, substrates, or inhibitors.

(2) Protection of active site thiol via disulfide exchange by thiols, redox dyes, oxygen-binding agents, or chelating agents.

(3) Miscellaneous methods include, e.g., inhibition or removal of proteo­lytic enzymes protection from light by photosensitive dyes lowering activity of water by viscosity effectors, salts, or sugars lowering surface energy by antifoams cooling and crystallization protection by antifreeze removal of harmful agents and sterilization for protection against microbial attack.

Commercially available solid enzyme preparations are dried mold brans, dried precipitates, or dried solutions. Spray drying is the preferred method for removal of water from enzyme solutions due to economic reasons. How­ever, it is only applicable to enzymes sufficiently resistant to the tempera­ture conditions of this process. On the other hand, freeze drying is most preserving, but its use is limited by cost considerations as well as by the fact that unless the salt concentrations of the enzyme solution are sufficiently reduced, eutectic mixtures may be formed.

This may lead to incomplete drying or to severe foaming and protein denaturation. A specific method of drying sometimes used is granulation in a fluidized bed with milk sugar or maltodextrin as carrier. In this case, of course, sufficiently high specific activity of the enzyme is required in order to ensure satisfactory activity of the commercial preparation.

Enzyme Immobilization :

In commercial applications enzymes are used commonly in the soluble or “free” form. This practice, however, is very wasteful, because the enzyme is discharged at the end of the reaction, although its activity is scarcely lessened in reactions carried out under optimum conditions.

Immobiliza­tion prevents diffusion of the enzymes in the reaction mixture and permits their recovery from the product stream by simple solid-liquid separation methods. As a consequence, reaction products are free of enzyme and reuse of the enzyme is possible. Another advantage of immobilized enzymes is that they can be used in continuously operated reactors.

Methods of Immobilization:

In principle, immobilization of an enzyme can be achieved by fixing it on the surface of a water-insoluble material, by trapping it inside a matrix that is permeable to the enzyme’s substrate and products, and by cross-linking it with suitable agents to give insoluble particles. Bound enzymes may be prepared by covalent coupling to active matrices or by heteropolar and/or van der Waals binding to adsorbents or ion ex­changers.

Covalent coupling to activated carrier materials is achieved by methods known in peptide and protein chemistry. Some examples of enzymes immo­bilized in this pattern are given in Table 15.3. The formation of covalent bonds has the advantage of an attachment which is not reversed by pH, ionic strength, or substrate. However, covalent binding offers the possibil­ity that the active site of enzyme may be blocked through the chemical reaction used in the immobilization reaction and the enzyme rendered inactive.

There are a large number of methods of covalent attachment. The groups of enzymes that take part in the formation of the chemical bond are- amino, imino, amide, hydroxyl, carboxy, thiol, methylthiol, guanidyl, imidazole groups, and the phenol ring. Methods have been developed for covalently attaching enzymes to inorganic carriers such as alumina, glass, silica, stainless steel, etc.

Adsorption of enzymes at solid surfaces (Table 15.4) offers the advantage of extreme simplicity. It is carried out accord­ing to the principles of chromatography. The conditions of adsorption in­volve no reactive species and thus do not result in modification of the enzyme. The binding of enzymes, however, is reversible and for this reason adsorbed enzymes present the problem of desorption in the presence of substrate or increased ionic strength.

Commonly used adsorbents include many organic and inorganic materials such as alumina, carbon, cellulose, clays, glass (including controlled-pore glass), hydroxyapatite, metal oxides, and various siliceous materials. Ion exchange resins bind enzyme by electrostatic interactions. The first successful commercial application of immo­bilized aminoacylase (for resolution of DL-amino acids) involved fixing of the enzyme by adsorption to DEAE-Sephadex as carrier.

Inclusion of enzymes in polymer gels, microcapsules, or filamentous structures has the advantage of relatively mild reaction conditions. This method is free from the risk of blocking active site groups on the enzyme molecule by chemical bonds the enzyme is retained in its native state.

The major drawbacks of this immobilization technique are two- retardation of the enzymic reaction due to diffusional control of the transport of substrate and products (particularly with high molecular weight substrates and/or products) and continuous loss of enzyme due to the distribution of pore sizes. Materials used for entrapment include silicone rubber, silica gel, starch, and, preferably, polyacrylamides. Exam­ples of enzymes immobilized by entrapment are given in Table 15.5.

A variation of the inclusion method is encapsulation within semiperme­able membranes. Materials such as collodion poly­styrene, cellulose derivatives, and, most commonly, nylon have been used to form thin, spherical, semipermeable membranes shaped into micro­capsules which include the enzyme to be immobilized. The size of the capsules can range from μm to many μm. As has been demonstrated by Kitajima and Kondo (1971) with yeast, it is possible to encapsulate multi-enzyme systems from cell extracts and to carry out fermentation in such artificial cells.

Enzymes can be polymerized by cross-linking with low molecular weight multifunctional agents (see Table 15.6). This method leads to the formation of a three-dimensional network of enzyme molecules when the reaction is carried out in the absence of a support. However, usually it results in a considerable loss of activity. Com­monly, enzymes are cross-linked after adsorption onto a suitable carrier.

Cross-linking agents most commonly used include diazobenzidine and its derivatives and particularly glutaraldehyde. On the other hand, enzymes can become immobilized by copolymerization, i.e., covalent incorporation into polymers. The methods most often em­ployed involve copolymerization with maleic anhydride and ethylene. As with entrapped and microencapsulated enzymes, these derivatives show little or no activity toward macromolecular substrates.

An alternative to the immobilization of isolated enzymes is immobiliza­tion of whole microbial cells. This method provides a means of avoiding expensive enzyme purification operations. Entrapment of enzymes within whole cells may also be useful when various enzymes are involved in a given process.

And, finally, immobilized intact cells have proved effective in processes involving enzymes that require cofactors for mediating their catalytic action. Some examples of whole cell immobilization are shown in Table 15.7. Cells can be immobilized by fixing them to carriers, such as fibers or granular materials, or by entrapment.

Properties of Immobilized Enzymes:

After immobilization of an en­zyme, its properties can be changed significantly. Such alterations may be attributed to (1) the physical and chemical nature of the carrier used, (2) the chemical and/or conformational changes in the enzyme structure, and (3) the “heterogeneous nature” of catalysis caused by immobilization.

Effects of altered reactivity include kinetic constants (resulting from a change in activation energy), optimum pH, Michaelis constant, and sub­strate specificity. A matrix charge can affect the hydrogen ion concentra­tion in the locus of the attached enzyme and thus change its apparent pH optimum in one direction or the other, depending on the use of either cationic or anionic carriers, and the apparent Michaelis constant if the substrates are also charged it is increased if the matrix and the substrate charges are alike and decreased if they are opposite. Changes in enzyme specificity can result from conformational changes in the enzyme molecule caused by the attachment itself.

One of the more important results of enzyme immobilization is the reten­tion of activity for considerable periods of time under suitable conditions of storage. The stability of immobilized enzymes to storage, heat, and pH basically depends on the nature of the carrier surface to which the enzyme is bound.

Among 50 immobilized enzymes, as compared with their soluble counterparts, Melrose (1971) found 30 more stable and 8 less stable than the soluble forms 12 showed no difference from the free systems. The reasons for the observed increase in stability are not clear. It may be attributed, for example, to prevention of conformational inactivation or to shielding of active groups on the enzyme from reactive groups in solution.


How Enzymes Work

Figure 3. Diagram of a catalytic reaction showing difference in activation energy in uncatalysed and catalysed reaction. The enzyme reduces the energy barrier required to activate the substrate, allowing more substrates to become activated, which increases the rate of product formation. Note that the energy difference between the substrate and the product is not changed by the enzyme.

In all chemical reactions, there is an initial input of energy that is required before the reaction can occur. If this initial energy requirement (called the activation energy or energy barrier) is small, then the reaction will happen quickly and easily. If the activation energy is large, then the reaction will take longer to occur. Enzymes function to reduce the activation energy required for a chemical reaction to occur.

First, the enzyme binds to the substrate and slightly distorts its shape. The change in shape activates the substrate molecule and decreases the total activation energy required for the substrate to be turned into product. As the number of activated substrate molecules increases, so does the conversion of substrate to product. An analogy for this effect is a ski hill, with skiers at the bottom of one side of the hill representing substrates, skiers on the top of the hill representing activated substrates, and the products being the number of skiers that ski down the other side. If the height of the hill is lowered (due to the presence of the enzyme), then more skiers can make it to the top, increasing the number that ski down to become products.

Practice Questions

Fill in the blank: When an enzyme catalyzes a reaction, ________.

  1. it raises the activation energy of the reaction.
  2. it is used once and discarded.
  3. it becomes a product.
  4. it acts as a reactant.
  5. it lowers the activation energy of the reaction.

What will happen to the rate at which a chemical reaction proceeds if the activation energy is increased?

  1. The reaction will happen faster (at a higher rate).
  2. The reaction will happen slower (at a lower rate).
  3. The reaction rate will not change.

In Summary: Enzymes

Enzymes are proteins that speed up reactions by reducing the activation energy. Each enzyme typically binds only one substrate. Enzymes are not consumed during a reaction instead they are available to bind new substrates and catalyze the same reaction repeatedly.


Key Pathway • Ras/RAF/Mitogen-Activated Protein [MAP] Kinase Pathway

Ras = G-protein specific to this pathway RAF = proto-oncogene serine/threonine kinase

MEK = mitogen-activated protein kinase MAPK = mitogen-activated protein kinase

Ras • a small G protein (GTPase) involved in signal transduction leading to cell division and proliferation. If not regulated properly, Ras proteins can lead to uncontrolled cell division that eventually results in tumor formation.

RAF [Rapidly Accelerated Fibrosarcoma] • family of protein kinases that are involved with retroviral oncogenes (genes that can potentially cause cancer).

Tyrosine-Kinase Associated Receptors • associate with intracellular proteins that have tyrosine kinase activity. These receptors lack the tyrosine kinase domain that was discussed earlier and, therefore, accomplish tyrosine phosphorylation by cytoplasmic tyrosine kinases instead.

Cytokine receptors make up the largest family of receptors that relay signals into the cell by cytoplasmic tyrosine kinases. These particular receptors are associated with the cytoplasmic kinase, Jak (Janus kinase). Jak will go on to activate a gene regulatory protein called STAT (signal transducers and activators of transcription). The pathway is described and depicted below:

Key PathwayJak/Stat pathway (Janus kinase/signal transducers and activators of transcription) • The Jak/Stat pathway is the principal pathway for cytokines and growth factors in humans. This pathway is activated by a number of cytokines (most commonly interferons) and growth factors. Activation stimulates cell proliferation, differentiation, migration and apoptosis. Furthermore, cytokines control the synthesis and release of a number of inflammatory mediators. When a cytokine binds to its enzyme-linked receptor it results in a conformational change leading to phosphorylation of the intracellular active-enzyme domain, eventually leading to the transcription of inflammatory mediators. As with all signal transduction mechanisms, homeostasis is reliant on proper regulation of all these different pathways. Lack of proper regulation of the JAK pathway can cause inflammatory disease, erythrocytosis, gigantism and leukemias.


ER/SR Calcium Pump: Function

Ca 2+ Binding and Catalytic Activation

Binding of two calcium ions per ATPase molecule is an absolute requirement for enzyme activation . The cooperative character of binding is consistent with a sequential binding mechanism to two interdependent sites (I and II). Spectroscopic studies provided early suggestions of Ca 2+ -induced conformational effects, accounting for binding cooperativity and enzyme activation. A detailed characterization of the large conformational changes produced by Ca 2+ binding was then obtained by high-resolution diffraction studies.

The functional role of the Ca 2+ -induced conformation change lies in its absolute requirement for enzyme activation, rendered possible by the long-range intramolecular linkage. The requirement for Ca 2+ involves both ATP use for phosphoenzyme formation in the forward direction of the cycle and the formation of ATP upon addition of ADP to phosphoenzyme formed with Pi in the reverse direction of the cycle. Activation is not obtained by Ca 2+ occupancy of the first binding site only but requires the occupancy of the second site, which may then be considered a Ca 2+ trigger point for enzyme activation. Ca 2+ -binding affects directly the M4, M5, and M6 transmembrane helices and is then transmitted to the extramembranous region, resulting in the large displacement of the headpiece domains and catalytic activation. Single mutations of several residues in the segments connecting the Ca 2+ -binding region with the phosphorylation domain, such as M4, M5, and the M6–M7 loop, interfere with the phosphorylation reactions.


C3 and C4 Plants

Carbon fixation resulting in a three-carbon sugar is known as C3 photosynthesis, and most plants use this kind of photosynthesis. It works well in cool, moist conditions where plants can keep the pores that let carbon dioxide in, called stomata, open throughout the day.

For many summer annual plants, conditions are too hot to allow stomata to remain open throughout the day, so these plants have adapted by developing C4 photosynthesis. C4 photosynthesis is named as such because the fixation of carbon dioxide, by an enzyme called PEP carboxylase, results in a four-carbon sugar. The carbon acquired this way is then passed on to RUBISCO and enters the Calvin cycle.