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Wie ist eine RT-PCR repräsentativ für den RNA-Gehalt in einer Zelle?

Wie ist eine RT-PCR repräsentativ für den RNA-Gehalt in einer Zelle?


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Zum Beispiel sammeln wir zuerst alle RNA-Inhalte aus einer Säugerzelllinie. Nehmen wir zum Beispiel an, wir sammeln 80 ul RNA mit einer Konzentration von 150 ng/ul. Als nächstes nehmen wir 1.000 ng der RNA, um cDNA herzustellen. Diese 1.000 ng sind jedoch eine völlig zufällige Stichprobe der gesamten RNA, die wir hatten. Inwiefern ist diese zufällige RNA-Probe repräsentativ für den RNA-Gehalt ursprünglich in unseren Zellen?


Es ist nicht genau klar, was der Fragesteller fragt, aber…

… eine Möglichkeit, darüber nachzudenken, ist die Frage, wie wahrscheinlich es ist, dass in der Probe, die aus der RNA-Präparation entnommen wird, eine RNA mit geringer Häufigkeit fehlt. Dies würde die Stichprobe qualitativ nicht repräsentativ machen.

Die Frage besagt, dass 12.000 ng RNA isoliert werden. Da nichts anderes angegeben ist, gehe ich davon aus, dass es sich um Gesamt-RNA handelt. Eine grobe Schätzung der Gesamt-RNA pro eukaryotischer Zelle beträgt 20 pg.

Dies bedeutet, dass die Vorbereitung aus 6 x 10 . stammte5 Zellen. (Ich gehe von einer Ausbeute von 100 % aus, aber dies wird die Schlussfolgerung nicht wirklich beeinflussen.)

Nehmen wir nun an, dass eine mRNA mit geringer Häufigkeit mit 10 Kopien pro Zelle vorhanden ist. Das gesamte RNA-Präparat enthält daher 6 x 106 Kopien dieser mRNA mit geringer Häufigkeit.

Von den insgesamt 12.000 ng nehmen wir eine Probe von 1.000 ng. Mit anderen Worten, wir nehmen 1/12 der RNA-Präparation. Wenn dieses RNA-Präparat 10 . enthält6 Kopien der mRNA mit geringer Häufigkeit Wie wahrscheinlich ist es, dass wir zufällig eine Probe nehmen, die keine Kopien dieser mRNA mit geringer Häufigkeit enthält? Hier versagt meine Mathematik, aber intuitiv sage ich, dass die Wahrscheinlichkeit ist sehr sehr klein.

Wenn es nun 1.000 verschiedene mRNAs mit geringer Häufigkeit in der Zelle gibt, ist die Wahrscheinlichkeit, dass jede von ihnen fehlt, sehr sehr klein, aber die Gesamtwahrscheinlichkeit, eine davon zu verpassen, beträgt 1000 x sehr sehr klein, also vielleicht sehr klein.

Ich werde weiter darüber nachdenken, wie man den Wert von berechnet sehr sehr klein, aber wenn jemand helfen möchte - danke im Voraus!


Was sind die Unterschiede zwischen PCR, RT-PCR, qPCR und RT-qPCR?


Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist eine relativ einfache und weit verbreitete molekularbiologische Technik zur Amplifikation und Detektion von DNA- und RNA-Sequenzen. Im Vergleich zu herkömmlichen Methoden der DNA-Klonierung und -Amplifikation, die oft Tage dauern können, benötigt die PCR nur wenige Stunden. Die PCR ist hochempfindlich und erfordert eine minimale Matrize zum Nachweis und zur Amplifikation spezifischer Sequenzen. Die grundlegenden PCR-Methoden haben sich gegenüber dem einfachen DNA- und RNA-Nachweis weiter entwickelt. Nachfolgend haben wir einen Überblick über die verschiedenen PCR-Methoden und die Reagenzien gegeben, die wir bei Enzo Life Sciences für Ihren Forschungsbedarf anbieten. Unser Ziel ist es, Wissenschaftlern dabei zu helfen, schnell auf PCR-Reagenzien zuzugreifen, die sie in ihrem nächsten Forschungsprojekt verwenden können!

Für die Standard-PCR benötigen Sie lediglich eine DNA-Polymerase, Magnesium, Nukleotide, Primer, das zu amplifizierende DNA-Template und einen Thermocycler. Der PCR-Mechanismus ist so einfach wie sein Zweck: 1) doppelsträngige DNA (dsDNA) wird hitzedenaturiert, 2) Primer richten sich an den einzelnen DNA-Strängen aus und 3) die Primer werden durch DNA-Polymerase verlängert, wodurch zwei Kopien des Originals entstehen DNA-Strang. Der Denaturierungs-, Annealing- und Elongationsprozess über eine Reihe von Temperaturen und Zeiten wird als ein Amplifikationszyklus bezeichnet. Jeder Schritt des Zyklus sollte für das verwendete Template und Primer-Set optimiert werden. Dieser Zyklus wird ungefähr 20-40 mal wiederholt und das amplifizierte Produkt kann dann analysiert werden. PCR wird häufig verwendet, um DNA für die anschließende experimentelle Verwendung zu amplifizieren. Die PCR findet auch Anwendung in Gentests oder zum Nachweis pathogener DNA.

Da es sich bei der PCR um eine hochsensitive Methode handelt und für einzelne Reaktionen sehr kleine Volumina benötigt werden, wird die Anfertigung eines Mastermixes für mehrere Reaktionen empfohlen. Der Mastermix muss gut gemischt und dann nach der Anzahl der Reaktionen aufgeteilt werden, um sicherzustellen, dass jede Reaktion die gleiche Menge an Enzym, dNTPs und Primern enthält. Viele Anbieter, wie beispielsweise Enzo Life Sciences, bieten auch PCR-Mixe an, die bereits alles außer Primern und dem DNA-Template enthalten.

Guanin/Cytosin-reiche (GC-reiche) Regionen stellen eine Herausforderung bei Standard-PCR-Techniken dar. GC-reiche Sequenzen sind stabiler als Sequenzen mit geringerem GC-Gehalt. Darüber hinaus neigen GC-reiche Sequenzen dazu, Sekundärstrukturen wie Haarnadelschleifen zu bilden. Infolgedessen sind GC-reiche Doppelstränge während der Denaturierungsphase schwer vollständig zu trennen. Folglich kann die DNA-Polymerase den neuen Strang nicht ungehindert synthetisieren. Eine höhere Denaturierungstemperatur kann dies verbessern und Anpassungen in Richtung einer höheren Annealing-Temperatur und einer kürzeren Annealing-Zeit können eine unspezifische Bindung von GC-reichen Primern verhindern. Zusätzliche Reagenzien können die Amplifikation von GC-reichen Sequenzen verbessern. DMSO, Glycerin und Betain helfen, die durch GC-Wechselwirkungen verursachten Sekundärstrukturen aufzubrechen und erleichtern so die Trennung der Doppelstränge.


RT-PCR & cDNA-Synthese

Die Synthese von DNA aus einer RNA-Matrize über reverse Transkription erzeugt komplementäre DNA (cDNA). Reverse Transkriptasen (RTs) verwenden eine RNA-Matrize und einen zum 3&prime-Ende der RNA komplementären Primer, um die Synthese der Erststrang-cDNA zu steuern, die direkt als Matrize für die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) verwendet werden kann. Diese Kombination aus reverser Transkription und PCR (RT-PCR) ermöglicht den Nachweis von RNAs geringer Häufigkeit in einer Probe und die Produktion der entsprechenden cDNA, wodurch das Klonen von Genen mit geringer Kopienzahl erleichtert wird. Alternativ kann die Erststrang-cDNA unter Verwendung von DNA-Polymerase I und DNA-Ligase doppelsträngig gemacht werden. Diese Reaktionsprodukte können zur direkten Klonierung ohne Amplifikation verwendet werden. In diesem Fall ist RNase H-Aktivität, entweder von der RT oder von außen zugeführt, erforderlich.

Viele RTs sind von kommerziellen Anbietern erhältlich. Die Reverse Transkriptase des Aviären Myeloblastosevirus (AMV) und die Reverse Transkriptase des Moloney Murine Leukämievirus (M-MuLV, MMLV) sind RTs, die häufig in molekularbiologischen Arbeitsabläufen verwendet werden. ProtoScript ® II Reverse Transcriptase ist eine rekombinante M-MuLV Reverse Transkriptase mit reduzierter RNase H-Aktivität und erhöhter Thermostabilität. Es kann verwendet werden, um Erststrang-cDNA bei höheren Temperaturen als das Wildtyp-M-MuLV zu synthetisieren. Das Enzym ist bis zu 50°C aktiv und bietet eine höhere Spezifität, eine höhere Ausbeute an cDNA und mehr cDNA-Produkt voller Länge mit einer Länge von bis zu 12 kb.

Die Verwendung von konstruierten RTs verbessert die Effizienz der Produktbildung in voller Länge, stellt sicher, dass das Kopieren des 5&prime-Endes des mRNA-Transkripts vollständig ist und ermöglicht die Vermehrung und Charakterisierung einer originalgetreuen DNA-Kopie einer RNA-Sequenz. Die Verwendung von thermostabileren RTs, bei denen Reaktionen bei höheren Temperaturen durchgeführt werden, kann für die reverse Transkription von RNA, die eine Sekundärstruktur enthält, hilfreich sein.

Hilfe zum Vergleich der verfügbaren RTs und cDNA-Synthesereagenzien finden Sie in unserer Auswahltabelle für die RT/cDNA-Synthese.

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Dieses Produkt ist nur für Forschungszwecke bestimmt. Dieses Produkt ist nicht für therapeutische oder diagnostische Zwecke bei Mensch oder Tier bestimmt.


Übersicht über qPCR und RT-qPCR

Die quantitative PCR, unabhängig davon, ob sie einen reversen Transkriptionsschritt umfasst oder nicht, wird routinemäßig in molekularbiologischen Labors eingesetzt und hat die Art und Weise der Forschung aufgrund ihrer relativ einfachen Pipeline revolutioniert (Abbildung 2). Zu den Vorteilen gegenüber der Standard-PCR gehört die Möglichkeit, in Echtzeit und ohne Agarosegel zu visualisieren, welche Reaktionen funktioniert haben. Es ermöglicht auch eine wirklich quantitative Analyse. Eine der häufigsten Anwendungen von qPCR ist die Bestimmung der Kopienzahl einer interessierenden DNA-Sequenz. Mit der absoluten Quantifizierung kann der Anwender die Zielkopienzahlen in Bezug auf eine Standardkurve definierter Konzentration weitaus genauer als je zuvor bestimmen. Die RT-qPCR hingegen erlaubt die Untersuchung von Veränderungen der Genexpression bei Behandlung von Modellsystemen mit Inhibitoren, Stimulanzien, kleinen interferierenden RNAs (siRNAs) oder Knockout-Modellen etc. Diese Technik wird auch routinemäßig verwendet, um Veränderungen in der Expression sowohl zu detektieren vor (als Qualitätskontrolle) und nach (Bestätigung der Änderung) RNA-Seq-Experimenten.

Workflow eines Standard-qPCR- und RT-qPCR-Experiments. Nach der Probenisolierung wird die Integrität vor der cDNA-Generierung und dem Beginn des qPCR-Assays analysiert, wobei entweder interkalierende Farbstoffe oder Hydrolysesonden verwendet werden. Die Fluoreszenz wird während der gesamten PCR-Zyklen nachgewiesen und verwendet, um eine Amplifikationskurve zu erzeugen, die verwendet wird, um die Zielprobe während der Datenanalyse zu quantifizieren.

Probenvorbereitung

Der wichtigste Schritt in der qPCR- und RT-qPCR-Pipeline ist wohl die Probenisolierung. Unabhängig davon, wie gut Ihr Assay-Design ist, erhalten Sie keine genauen Ergebnisse, wenn das Ausgangsmaterial verunreinigt oder abgebaut ist. Eine qualitativ hochwertige Stichprobe ist der Startblock für qualitativ hochwertige Daten. Bei der Isolierung von DNA für qPCR ist es wichtig, dass sie frei von Verunreinigungen ist, die die Reaktion hemmen könnten. Am häufigsten wird die Extraktion mit handelsüblichen Kits durchgeführt, die den Vorteil haben, benutzerfreundlich, einfach und schnell zu sein, insbesondere wenn sie in ein Robotersystem integriert sind. Die Art der durchgeführten RNA-Extraktion hängt von der Art der benötigten RNA ab. Die am häufigsten verwendete Extraktionsmethode ist mit Gesamt-RNA-Extraktionskits. Diese isoliert Boten-RNA (mRNA die Vorstufe der Proteinsynthese), Transfer-RNA (tRNA entschlüsselt mRNA während der Translation mit dem Ribosom) und ribosomale RNA (rRNA liest die Aminosäurereihenfolge während der Translation und verknüpft sie mit dem Ribosom), aber oft (nicht immer) ). Angesichts der explosionsartigen Zunahme des Interesses an Enhancer-RNAs (eRNAs kleine RNAs, die von Enhancern transkribiert werden), deren Länge beträchtlich variieren kann, ist es wichtig, dass die Extraktionsverfahren sorgfältig überlegt werden, um die Isolierung der interessierenden RNA sicherzustellen. Neben Extraktionsüberlegungen ist es wichtig, dass RNA nicht mit DNA kontaminiert ist, da diese in der qPCR-Reaktion nicht von cDNA unterschieden werden kann. Um dies zu überwinden, beruhen die meisten Protokolle auf der Verwendung einer DNase I-Behandlung, die jegliche DNA verdaut.

Während der Isolierung ist ein Probenabbau immer möglich. Dementsprechend beinhaltet jede gute Pipeline einen Qualitätskontrollschritt, um die Integrität der Probe zu beurteilen. Dies kann schnell durch Auswertung des A260/280-Verhältnisses (Vergleich der Absorption bei 260 vs 280 nm, ein Maß für die Kontamination durch Proteine) und des A260/230-Verhältnisses (260 vs 230 nm, ein Hinweis auf das Vorhandensein organischer Verunreinigungen) erfolgen. der Probe ist dies jedoch nicht sehr genau und wird von mehreren Faktoren beeinflusst. Eine genauere Maßnahme ist die Verwendung eines virtuellen Gelelektrophoresesystems wie dem Aligent Bioanalyser. Dieses System arbeitet mit einem Chip, der RNA nach Größe trennt und RNA durch Fluoreszenzfarbstoffe erkennt. Diese wird dann in einen Computer übersetzt, der mithilfe eines Algorithmus eine RNA-Integritätszahl (RIN) erzeugt, die die Qualität der Probe repräsentiert, wobei 10 die höchste ist.

Der letzte Schritt bei der Probenvorbereitung für die RT-qPCR ist die Generierung von cDNA. cDNA verwendet RT-PCR ( 1 ), um cDNA aus der RNA-Matrize unter Verwendung einer reversen Transkriptase zu erzeugen. Dies kann unter Verwendung von Oligo(dT)-Primern erfolgen, die an den polyA-Schwanz der RNA anlagern, oder unter Verwendung von Zufallshexameren (Primer mit einer Länge von sechs bis neun Basen, die an mehreren Punkten entlang des RNA-Transkripts anlagern). Im Allgemeinen wird eine Mischung der beiden Primer als am besten angesehen, da sie die Amplifikation von polyA-Schwanz-RNA (hauptsächlich mRNA) und nicht-polyA-enthaltender RNA (tRNA, rRNA usw.) ermöglicht. Neben der Primerüberlegung kann die cDNA-Generierung Teil des qPCR-Experiments sein (als einstufige RT-qPCR bezeichnet) oder separat von der qPCR (zweistufige RT-qPCR) generiert werden, wie in Abbildung 3 gezeigt. Der Vorteil von Einstufige RT-qPCR besteht darin, dass es weniger experimentelle Variationen und ein geringeres Kontaminationsrisiko gibt sowie ein Hochdurchsatz-Screening ermöglicht. Daher wird diese Option normalerweise für das klinische Screening verwendet. Dies bedeutet jedoch, dass die Probe nur eine begrenzte Anzahl von Malen verwendet werden kann, während die zweistufige RT-qPCR mehr Reaktionen pro Probe und flexible Priming-Optionen ermöglicht und normalerweise die bevorzugte Option für breit angelegte Genexpressionsanalysen ist, aber dies tut mehr Optimierung erfordern.


Eosinophile von Mensch und Maus haben antivirale Aktivität gegen das Parainfluenza-Virus

Atemwegsviren verursachen Asthma-Exazerbationen. Da Eosinophile die prominenten Leukozyten in den Atemwegen von 60–70% der Patienten mit Asthma sind, untersuchten wir die Auswirkungen von Eosinophilen auf ein verbreitetes Atemwegsvirus, die Parainfluenza 1, in der Lunge. Eosinophile, die nach Ovalbumin-Sensibilisierung und Provokation in die Atemwege von Wildtyp-Mäusen rekrutiert wurden, verringerten 4 Tage nach der Infektion die Parainfluenzavirus-RNA in der Lunge im Vergleich zu nicht sensibilisierten Tieren signifikant. Diese antivirale Wirkung wurde auch bei transgenen IL-5-Mäusen mit einer Fülle von Eosinophilen der Atemwege (NJ.1726) beobachtet, ging jedoch bei transgenen Mäusen mit Eosinophilenmangel (PHIL) und bei IL-5-transgenen Mäusen, die mit Mäusen mit Eosinophilenmangel gekreuzt wurden (NJ .1726-PHIL). Der Verlust des eosinophilen Granulaproteins Eosinophilenperoxidase bei Verwendung von transgenen Mäusen mit Eosinophilenperoxidase-defizienter Wirkung verringerte die antivirale Wirkung der Eosinophilen nicht. Eosinophile antivirale Mechanismen wurden ebenfalls untersucht in vitro. Isolierte humane Eosinophile reduzierten die Parainfluenzavirus-Titer signifikant. Dieser Effekt beinhaltete keinen Abbau viraler RNA durch eosinophile Granula-RNasen. Eosinophile, die mit einem Stickoxid-Synthase-Inhibitor behandelt wurden, verloren jedoch ihre antivirale Aktivität, was darauf hindeutet, dass Eosinophile die virale Infektiosität durch die Produktion von Stickoxid abschwächen. Folglich wurde die Produktion von eosinophilem Stickstoffmonoxid mit einer intrazellulären Fluoreszenzsonde gemessen. Eosinophile produzierten Stickstoffmonoxid als Reaktion auf das Virus und auf einen synthetischen Agonisten des virussensitiven angeborenen Immunrezeptors, den Toll-like-Rezeptor (TLR) 7. IFNγ erhöhte die Expression des eosinophilen TLR7 und verstärkte die TLR7-induzierte Stickoxidproduktion. Diese Ergebnisse legen nahe, dass Eosinophile die Virusclearance in der Lunge fördern und zu angeborenen Immunantworten gegen Infektionen mit Atemwegsviren beim Menschen beitragen.

Eosinophile von Mensch und Maus wirken antiviral gegen Parainfluenza-Viren durch die Produktion von Stickstoffmonoxid und indem sie als Sackgassenwirt für Virusinfektionen dienen, jedoch nicht durch die Produktion von eosinophilen Granula-RNasen oder eosinophiler Peroxidase. Eosinophile können bei Atemwegsinfektionen beim Menschen eine unterschätzte antivirale Rolle spielen.

Eosinophile infiltrieren die Atemwege von etwa zwei Dritteln der Patienten mit Asthma (1) und wurden experimentell mit einer Hyperreaktivität der Atemwege (2) und einem Remodeling der Atemwege (3) in Verbindung gebracht. Dies hat verständlicherweise zu der Annahme geführt, dass Eosinophile bei Asthma ausschließlich maladaptiv sind und daher viele Asthmabehandlungen darauf ausgerichtet sind, eosinophile Entzündungen zu reduzieren (4–7). Diese Strategie hat zu unterschiedlichen Ergebnissen geführt. Viele Asthmapatienten bleiben trotz maximaler Therapie schlecht kontrolliert (8). Exazerbationen von Asthmasymptomen verursachen weiterhin erhebliche Morbidität, Gesundheitsausgaben und Todesfälle (9, 10). Darüber hinaus gibt es praktisch keine Prävention und Behandlung der häufigsten Ursache von Asthma-Exazerbationen, Atemwegsvirusinfektionen (11). Diese Mängel unterstreichen unser begrenztes Verständnis der Biologie von Eosinophilen und haben zu Studien geführt, die versuchen, die Rolle von Eosinophilen bei Atemwegsvirusinfektionen bei Asthma zu definieren. Beispielsweise hatten transgene IL-5-Mäuse mit erhöhten systemischen Eosinophilen niedrigere Titer des Respiratory Syncytial Virus (RSV) im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen (12), während IL-5-transgene Mäuse mit Atemwegs-Eosinophilie niedrigere Titer des Pneumonievirus bei Mäusen im Vergleich hatten mit Bedienelementen (13). In ähnlicher Weise fanden wir, dass Eosinophile, die nach einer Ovalbumin-Sensibilisierung in die Atemwege rekrutiert wurden, mit weniger Parainfluenza-1-Virus in der Lunge von Meerschweinchen assoziiert waren, obwohl diese Experimente nicht darauf ausgerichtet waren, eine kausale Rolle für Eosinophile zu belegen (14). Zusammengenommen legen diese Studien nahe, dass Eosinophile zur antiviralen Immunität in der Lunge beitragen.

Eosinophile erkennen eindringende Viren über mehrere Mechanismen, einschließlich Toll-like-Rezeptor (TLR)-Ligand-Interaktionen (15). TLR7 bindet einzelsträngige RNA, die ein gemeinsames Genommotiv für viele Atemwegsviren ist (16). Die TLR7-Ligation löst die primäre myeloische Differenzierung aus. 88 (MyD88) Adapterprotein-abhängige Signalübertragung, die eine antivirale Eosinophilen-Antwort fördert (12). Die Mediatoren, die für die antivirale Aktivität der Eosinophilen verantwortlich sind, werden jedoch diskutiert. Eosinophile setzen nach Aktivierung eine Vielzahl von Granulaproteinen frei, die antiviral sein können. Eosinophiles kationisches Protein und von Eosinophilen abgeleitetes Neurotoxin sind Mitglieder der RNase A-Superfamilie und sollen eine viruzide Wirkung haben, indem sie virale RNA-Genome abbauen (13, 17, 18). Eosinophile Peroxidase wird auch aus eosinophilen Granula freigesetzt und trägt zur Bildung antimikrobieller reaktiver Sauerstoffspezies bei (19). Ob Eosinophile mit diesen Proteinen oder durch einzigartige Mechanismen alle Viren angreifen, erfordert weitere Untersuchungen.

Das Parainfluenzavirus ist eines von mehreren Viren, von denen bekannt ist, dass sie Asthma-Exazerbationen verursachen (20). Parainfluenza wird bei akuten Asthma-Exazerbationen bei bis zu 18 % der Erwachsenen in den Atemwegen nachgewiesen (21). Seine Prävalenz ist ähnlich wie bei Influenza und Coronavirus und signifikant höher als bei RSV bei Erwachsenen. Angesichts von jährlich schätzungsweise 16 Millionen Akutbesuchen wegen Asthma-Exazerbationen (22) stellen parainfluenzainduzierte Exazerbationen eine erhebliche Krankheitslast dar, jedoch ist die Interaktion zwischen Parainfluenzavirus und Eosinophilen nicht klar definiert.

In dieser Studie untersuchten wir die Hypothese, dass Eosinophile eine Parainfluenzavirus-Infektion in der Lunge hemmen. Die hier beschriebenen Experimente bewerteten die Wirkung von Eosinophilen auf die Parainfluenzavirus-Clearance in vivo und bewertete die Rolle potenzieller antiviraler Mediatoren. Wir untersuchten auch die Auswirkungen von IFNγ auf die antiviralen Reaktionen von Eosinophilen als einen möglichen Mechanismus zur Steigerung der Eosinophilen-vermittelten antiviralen Aktivität.

Mäuse, die IL-5 im Atemwegsepithel exprimieren (NJ.1726) (23), Eosinophil-defiziente Mäuse (PHIL) (24) und Eosinophil-Peroxidase-defiziente Mäuse (25) wurden durch Rückkreuzung auf einem C57BL/6-Hintergrund aufrechterhalten. Die Tiere wurden in Übereinstimmung mit dem U.S. Animal Welfare Act behandelt. Die Protokolle wurden von Institutional Animal Care and Use Committees der Oregon Health & Science University (Portland, OR) und der Mayo Clinic (Scottsdale, AZ) genehmigt.

Parainfluenzavirus (Sendaivirus ATCC, Manassas, VA) wurde in Monolayern von Rhesusaffennieren(RMK)-Zellen gezüchtet, durch Saccharose-Dichtezentrifugation gereinigt und in RMK-Zellen titriert (26) (sehen die Online-Materialien und -Methoden). Die Titer wurden als Vielfache der infektiösen Gewebekulturdosis von 50 % (TCID .) ausgedrückt50 Virusmenge, die erforderlich ist, um 50 % der RMK-Monoschichten zu infizieren).

Weibliche Mäuse im Alter von 6–8 Wochen wurden durch intraperitoneale Injektion mit 0,04 µg bzw. 0,2 µg Ovalbumin (Sigma, St. Louis, MO) mit Alaun an Tag 1 bzw. 14 sensibilisiert. An den Tagen 24, 26 und 28 wurden die Mäuse mit Ketamin (45 mg/kg) und Xylazin (8 mg/kg) anästhesiert und mit intratrachealem 2% Ovalbumin gereizt. Mäuse wurden mit Parainfluenza infiziert (2,8 × 10 4 TCID50 Einheiten) intranasal am Tag 27. Am Tag 31 wurden die Lungen gespült und homogenisiert (sehen die Online-Materialien und -Methoden).

Parainfluenza-Matrixprotein-RNA in Lungenhomogenaten wurde durch Echtzeit-RT-PCR amplifiziert und auf 18S normalisiert. Die relative RNA-Expression wurde unter Verwendung einer Parainfluenza-RNA-Standardkurve in absolute RNA-Replikate umgewandelt (sehen die Online-Materialien und -Methoden).

Eosinophile wurden durch Dichtezentrifugation unter Verwendung von Ficoll-Paque Plus (Sigma) und negativer Selektion (sehen die Online-Materialien und -Methoden). Das Protokoll wurde vom Institutional Review Board genehmigt. Die Probanden gaben eine schriftliche Einverständniserklärung ab.

Humane Eosinophile wurden über Nacht mit oder ohne IFNγ (300 U/ml) inkubiert. Medium wurde entfernt und Parainfluenza (1 × 10 5 TCID50) wurde 2 Stunden lang zugegeben. Einige Kulturen wurden mit Stickstoffmonoxid-Synthase-Inhibitor, Nω-Nitro-L-argininmethylester-Hydrochlorid ([l -NAME] 100 μM Sigma) 30 Minuten vor der Inokulation. Die virale Infektiosität wurde in RMK-Zellen durch Hämadsorptionsassay quantifiziert. Infektiöse Titer werden als TCID . ausgedrückt50 U/ml Kulturüberstand.

Humane Eosinophile wurden mit einer Stickstoffmonoxid-detektierenden Fluoreszenzsonde (Strem, Newburyport, MA) beladen und einer Parainfluenza oder einem synthetischen TLR7-Agonisten ausgesetzt. sehen die Online-Materialien und -Methoden. Die Fluoreszenz wurde 60 Minuten später durch einen Plattenleser gemessen.

Humane Eosinophile wurden mit Parainfluenza geimpft (1 × 10 5 TCID50) für 2 Stunden, gewaschen, um ungebundenes Virus zu entfernen, und 72 Stunden in frischem Medium gehalten. Virale RNA in Kulturüberständen wurde alle 24 Stunden durch Echtzeit-RT-PCR quantifiziert (sehen die Online-Materialien und -Methoden).

Die Expression von Eosinophilen TLR7 wurde durch Echtzeit-RT-PCR und Immunfluoreszenz (sehen die Online-Materialien und -Methoden).

Die Daten wurden unter Verwendung einer Einweg-ANOVA mit Bonferronis . verglichen post hoc Prüfung. Die Daten sind als Mittelwert (±SEM) dargestellt. EIN P ein Wert von weniger als 0,05 wurde als signifikant angesehen.

C57BL/6-Mäuse, sensibilisiert und mit Ovalbumin herausgefordert, wiesen 4 Tage nach der Infektion im Vergleich zu nicht-sensibilisierten Tieren eine signifikant reduzierte (um ~ 90%) Parainfluenzavirus-RNA in den Lungen auf ( 1A ). Ovalbumin-Sensibilisierung und Provokation verursachten einen wesentlichen Anstieg von Eosinophilen in der bronchoalveolären Lavageflüssigkeit sowie von Makrophagen und Neutrophilen ( 1B ).

Abbildung 1. Ovalbumin-Sensibilisierung und Provokation erhöhen die Beseitigung von Parainfluenzavirus-Infektionen in der Lunge in vivo. (EIN) C57BL/6-Mäuse wurden sensibilisiert (intraperitoneal, Tag 1 und 14) und provoziert (intratracheal, Tag 24, 26 und 28) mit Ovalbumin und infiziert mit Parainfluenzavirus (intranasal, Tag 27). Die Parainfluenzavirus-RNA wurde 4 Tage nach der Infektion durch Echtzeit-RT-PCR quantifiziert. Sensibilisierte und gereizte Mäuse wiesen im Vergleich zu nicht sensibilisierten, mit Parainfluenza infizierten Kontrollmäusen eine signifikant reduzierte Parainfluenza-RNA in der Lunge auf. (B) Ovalbumin-Sensibilisierung und Provokation erhöhten die Gesamtzahl an Entzündungszellen, Makrophagen (MΦ), Eosinophilen (Eos) und Neutrophilen (Neut) in bronchoalveolärer Lavageflüssigkeit im Vergleich zu nicht sensibilisierten Kontrollen. Es gab keine Unterschiede bei den Lymphozyten (Lymphe) zwischen den Gruppen (n = 5). *P < 0,05 im Vergleich zu nicht sensibilisierten, mit Parainfluenza infizierten Kontrollmäusen. Die Daten sind als Mittelwerte (±SEM) dargestellt.

NJ.1726-Mäuse (↑Eos ↑IL-5) exprimieren konstitutiv IL-5 im Lungenepithel und weisen eine erhöhte Anzahl von Eosinophilen in der Lunge auf (23). 4 Tage nach der Infektion war die Parainfluenza-RNA in den Lungen von NJ.1726-Mäusen im Vergleich zu den Kontrollen von Wurfgeschwistern vom Wildtyp signifikant verringert ( 2A ). NJ.1726 IL-5-transgene Mäuse wurden mit PHIL-Mäusen (ØEos), die von Geburt an keine Eosinophilen aufweisen, gekreuzt, um die Wirkung von Eosinophilen von IL-5 zu unterscheiden. Der Parainfluenza-RNA-Gehalt in der Lunge von IL-5-exprimierenden Eosinophilen-defizienten NJ.1726-PHIL-Mäusen (ØEos ↑IL-5) war ähnlich dem in infizierten Wildtyp-Mäusen, was darauf hindeutet, dass Eosinophile und nicht IL-5 vermitteln die antivirale Wirkung. In ähnlicher Weise hatten PHIL-Mäuse mit Eosinophilenmangel allein Parainfluenza-RNA-Spiegel, die mit infizierten Wildtyp-Mäusen vergleichbar waren ( 2A ). Bronchoalveoläre Lavage bestätigte einen signifikanten Anstieg von Eosinophilen in den Atemwegen von NJ.1726-Mäusen im Vergleich zu Kontrollen von Wurfgeschwistern vom Wildtyp und eine Abwesenheit von Eosinophilen in PHIL- und NJ.1726-PHIL-Mäusen ( 2B ). Es gab keine signifikanten Unterschiede in der Gesamtzahl der Leukozyten oder anderer entzündlicher Zelluntergruppen bei der bronchoalveolären Lavage zwischen den Gruppen ( 2C ).

Figur 2. Eosinophile fördern die Clearance des Parainfluenzavirus in der Mauslunge in vivo. Wildtyp (WT) Kontrollmäuse (C57BL/6), transgene Mäuse mit hohen Lungeneosinophilen aufgrund einer Überexpression von IL-5 durch einen lungenspezifischen Promotor (NJ.1726 ↑Eos ↑IL-5), transgene Mäuse mit hohen Lungen IL-5, aber ohne Eosinophile (NJ.1726-PHIL ØEos ↑IL-5), und Eosinophilen-defiziente Mäuse (PHIL transgene Mäuse ØEos) wurden mit Parainfluenzavirus (intranasal) infiziert. (EIN) Der Parainfluenza-RNA-Gehalt in der Lunge wurde durch Echtzeit-RT-PCR 4 Tage nach der Infektion quantifiziert. NJ.1726-Mäuse (↑Eos ↑IL-5) hatten im Vergleich zu Kontrollmäusen (WT) eine signifikant reduzierte Parainfluenza-RNA. NJ.1726-PHIL-Mäuse (ØEos ↑IL-5) und PHIL-Mäuse (ØEos) wiesen Parainfluenza-RNA-Spiegel vergleichbar mit WT auf. (B) Bronchoalveoläre Lavage von mit Parainfluenza infizierten NJ.1726-Mäusen (↑Eos ↑IL-5) enthielt im Vergleich zu allen anderen Gruppen signifikant mehr Eosinophile. In der bronchoalveolären Lavage von PHIL- (ØEos) oder NJ.1726-PHIL-Mäusen (ØEos ↑IL-5) wurden keine Eosinophilen nachgewiesen. (C) Bei anderen Entzündungszelltypen gab es keine Unterschiede zwischen den Gruppen (n = 7–10). *P < 0,05. Die Daten sind als Mittelwerte (±SEM) dargestellt.

Eosinophile Peroxidase ist ein Granulaprotein, das von Eosinophilen freigesetzt wird. Wildtyp- und transgene eosinophile Peroxidase-defiziente Mäuse wurden sensibilisiert und mit Ovalbumin provoziert und mit Parainfluenzavirus infiziert. Die Parainfluenzavirus-RNA wurde 4 Tage nach der Infektion durch Echtzeit-RT-PCR aus der homogenisierten Lunge quantifiziert. Die Sensibilisierung und Provokation von Ovalbumin war mit einer signifikant reduzierten Parainfluenza-RNA sowohl bei Wildtyp- als auch bei eosinophilen Peroxidase-defizienten Mäusen im Vergleich zu nicht sensibilisierten Kontrollen verbunden (Abbildung 3A), was darauf hindeutet, dass die durch Eosinophile vermittelte antivirale Wirkung nicht von der Freisetzung von eosinophiler Peroxidase abhängig war. Sensibilisierte und provozierte Wildtyp- und Eosinophilen-Peroxidase-defiziente Mäuse hatten im Vergleich zu nicht-sensibilisierten Wildtyp- und Eosinophilen-Peroxidase-defizienten Mäusen signifikant erhöhte Atemwegs-Eosinophile (Abbildungen 3B und 3C).

Figur 3. Für die antivirale Wirkung der Eosinophilen ist keine Eosinophilenperoxidase erforderlich in vivo. (EIN) WT-Mäuse und eosinophile Peroxidase-Knockout-Mäuse (EPX –/– ) wurden sensibilisiert und mit Ovalbumin provoziert (S/C) und mit Parainfluenzavirus infiziert. Virale RNA wurde 4 Tage nach der Infektion durch Echtzeit-RT-PCR quantifiziert. Sensibilisierte und gereizte WT (WT S/C) und EPX –/– Mäuse (EPX –/– S/C) hatten im Vergleich zu nicht sensibilisierten, mit Parainfluenza infizierten Kontrollmäusen eine signifikant reduzierte Parainfluenza-RNA in der Lunge. (B) Ovalbumin-Sensibilisierung und Provokation erhöhten Eosinophile in der bronchoalveolären Lavage-Flüssigkeit bei WT- und EPX –/–-Mäusen im Vergleich zu nicht-sensibilisierten Kontrollen. (C) Bei anderen Entzündungszelltypen gab es keine Unterschiede zwischen den Gruppen (n = 4–5). *P < 0,05. Die Daten sind als Mittelwerte (±SEM) dargestellt.

Isolierte menschliche Eosinophile wurden 2 Stunden mit Parainfluenza inokuliert, dann gewaschen, um ungebundenes Virus zu entfernen, und 72 Stunden in frischem Medium kultiviert, um zu beurteilen, ob Parainfluenza Eosinophile direkt infiziert und, wenn ja, ob Eosinophile die Produktion viraler Nachkommen unterstützen. Parainfluenza-RNA, quantifiziert durch Echtzeit-RT-PCR aus Kulturüberständen, stieg über 72 Stunden progressiv an (Abbildung 4, linke Achse), was darauf hinweist, dass das Virus in der Lage ist, Eosinophile zu infizieren und virale Transkripte zu produzieren. Trotz der Replikation blieben die Parainfluenzavirus-Titer, die durch Hämadsorptionstests bestimmt wurden, zu diesen Zeitpunkten jedoch nicht nachweisbar ( Abbildung 4 , rechte Achse), was darauf hinweist, dass Eosinophile die Produktion infektiöser Viren nicht unterstützen.

Figur 4. Parainfluenza-infizierte Eosinophile produzieren virale Nachkommen, die nicht infektiös sind. Humane Eosinophile wurden aus dem peripheren Blut isoliert und 2 Stunden mit Parainfluenzavirus infiziert, gewaschen, um ungebundenes Virus zu entfernen, und 72 Stunden in Kultur gehalten. Parainfluenza-RNA aus eosinophilen Überständen wurde alle 24 Stunden durch Echtzeit-RT-PCR quantifiziert (festes Quadrat, linke Achse). Gleichzeitig wurden die Titer des infektiösen Parainfluenzavirus durch einen Hämadsorptionstest unter Verwendung von Nierenzellen von Rhesusaffen bestimmt und als 50%ige Gewebekultur-Infektionsdosis (TCID .) ausgedrückt50) U/ml (offener Kreis, rechte Achse) (n = 4). Die Daten sind als Mittelwerte (±SEM) dargestellt.

Die RNA-Spiegel, die drei Parainfluenzavirus-Strukturproteine ​​(dh Matrixprotein, Fusionsprotein und Nukleoprotein) kodieren, wurden 2 Stunden nach der Inokulation zwischen virusinfizierten Eosinophilenkulturen und Kulturen mit virusinfizierten Medien verglichen, um zu bestimmen, ob die Eosinophilen-vermittelte antivirale Wirkung resultiert aus der Freisetzung von eosinophilen Granula-RNasen. Gleichzeitig wurden die Parainfluenzavirus-Titer zu diesem Zeitpunkt in RMK-Zellen durch Hämadsorptionsassay bestimmt. Eosinophile verringerten signifikant die Parainfluenzavirus-Titer im Vergleich zu virusgeimpften Kulturen ohne Eosinophile, was zeigt, dass Eosinophile die Parainfluenzavirus-Infektiosität reduzieren ( 5A ). Eine weitere Verringerung der Virustiter wurde beobachtet, wenn Eosinophile mit IFNγ vorbehandelt wurden. Die RNA-Mengen für alle drei Parainfluenzavirus-Strukturproteine ​​waren jedoch zwischen Kulturen, die virusinfizierte Eosinophile enthielten, und Virus-inokulierten Kulturen ohne Eosinophile ähnlich ( 5B ), was zeigt, dass die verringerte Infektiosität nicht auf den Abbau des viralen RNA-Genoms zurückzuführen war durch die eosinophilen Granula-RNasen.

Abbildung 5. Die antivirale Aktivität von Eosinophilen gegen Parainfluenza umfasst keine granulären RNasen. Humane Eosinophile wurden aus peripherem Blut isoliert und mit Parainfluenzavirus infiziert. (EIN) Die virale Infektiosität wurde 2 Stunden nach der Inokulation mittels Hämadsorptionsassay bestimmt und als virales TCID . ausgedrückt50 U/ml. In den Überständen von kultivierten Eosinophilen (Eos) und mit IFNγ (Eos + IFNγ) vorbehandelten Eosinophilen war die Parainfluenza-Infektiosität im Vergleich zu Parainfluenzavirus, das in Medien ohne Eosinophile (Medien + IFNγ) kultiviert wurde, nahezu nicht nachweisbar. (B) RNA, die für Parainfluenzavirus-Strukturproteine, Matrix, Fusion und Nukleoprotein (NP) kodiert, wurde in eosinophilen Überständen durch Echtzeit-RT-PCR 2 Stunden nach der Inokulation quantifiziert. Zwischen keinem der drei Gene wurden Unterschiede festgestellt, was darauf hindeutet, dass die Verringerung der Parainfluenza-Infektiosität nicht auf den Abbau der viralen RNA durch eosinophile Granula-RNasen zurückzuführen war (n = 4–7). *P < 0,05. Die Daten sind als Mittelwerte (±SEM) dargestellt.

Das Parainfluenzavirus wurde in Gegenwart von isolierten humanen Eosinophilen 2 Stunden lang inkubiert und dann wurde die virale Infektiosität durch Titerierung in RMK-Zellen (mittels Hämadsorptionsassay) quantifiziert. Wie in Fig. 6A gezeigt, verringerten Eosinophile signifikant die Parainfluenzavirus-Titer im Vergleich zu Parainfluenza, die in Medien ohne Eosinophile inkubiert wurden. Eosinophile wurden mit dem Stickoxid-Synthase-Inhibitor kultiviert, l -NAME, um festzustellen, ob die durch Eosinophile vermittelte antivirale Wirkung auf die Stickoxidproduktion zurückzuführen ist. Mit l treated behandelte Eosinophile -NAME lost their ability to reduce virus titers, indicating that, upon exposure to virus, eosinophils attenuate viral infectivity through the production of nitric oxide ( Figure 6A ). The quantity of nitric oxide produced by eosinophils was evaluated with a copper-conjugated intracellular nitric oxide–detecting fluorescent probe 1 hour after addition of virus. Eosinophils exposed to parainfluenza virus had significantly increased fluorescence, indicating that eosinophils produce nitric oxide in response to parainfluenza infection. This increased fluorescence was blocked by l -NAME, confirming that nitric oxide was the mediator responsible ( Figures 6B and 6C ).

Abbildung 6. Eosinophil-derived nitric oxide reduces parainfluenza virus infectivity. Human eosinophils isolated from peripheral blood were cultured overnight with IFNγ. (EIN) Eosinophils were treated with the nitric oxide synthase inhibitor Nω-Nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride ( l -NAME 100 μM) or vehicle for 30 minutes, then infected with parainfluenza virus. Virus infectivity was quantified 2 hours after infection by hemadsorption assay and expressed as viral TCID50 U/ml. Parainfluenza virus infectivity was significantly decreased in the presence of eosinophils. Eosinophils treated with l -NAME lost their antiviral activity (n = 4). (B) Nitric oxide production was assessed using an intracellular nitric oxide–detecting fluorescent probe. Eosinophils loaded with the probe were treated with l -NAME or vehicle and infected with parainfluenza for 1 hour. Eosinophil fluorescence increased significantly in response to parainfluenza infection, indicating an increase in nitric oxide production by eosinophils. l -NAME treatment prevented parainfluenza-induced nitric oxide production by eosinophils (n = 4). (C) Representative images of eosinophils loaded with nitric oxide–detecting fluorophore. Magnification, ×100. *P < 0.05. Data are presented as means (±SEM).

Eosinophils were cultured with or without IFNγ overnight. IFNγ increased eosinophil TLR7 expression relative to unstimulated eosinophils, both quantitatively by real-time RT-PCR ( Figure 7A ) and qualitatively by immunostaining ( Figure 7B ). Eosinophils’ response to TLR7 agonist was also evaluated with a nitric oxide–detecting fluorescent probe. Eosinophils treated for 1 hour with the synthetic TLR7 agonist, R837, had significantly increased fluorescence compared with vehicle-treated controls, indicating that TLR7 agonist induces nitric oxide production ( Figures 7C and 7D ). R837-mediated nitric oxide production was potentiated in eosinophils exposed to IFNγ. l -NAME and the oligonucleotide TLR7 antagonist, IRS661, but not a control oligonucleotide, blocked R837-induced nitric oxide production.

Abbildung 7. IFNγ up-regulates Toll-like receptor 7 (TLR7) expression and potentiates TLR7-induced nitric oxide production in eosinophils. Human eosinophils were isolated from peripheral blood and grown in culture. (EIN) TLR7 expression was quantified by real-time RT-PCR from eosinophils treated with or without IFNγ. TLR7 RNA was significantly increased in eosinophils treated with IFNγ compared with untreated eosinophils (n = 5). (B) Eosinophils were immunostained with antibodies against TLR7 (green), and nuclei were labeled with 4′,6-diamidino-2-phenylindole (blue). TLR7 was expressed in unstimulated (−IFNγ) and IFNγ stimulated (+IFNγ) eosinophils. Images obtained with an LSM780 confocal microscope (numerical aperture 1.4 Zeiss, Thornwood, NY). (C) Eosinophils were loaded with an intracellular nitric oxide–detecting fluorescent probe and stimulated with synthetic TLR7 agonist R837. Eosinophil fluorescence increased in response to R837. IFNγ pretreatment potentiated the R837-induced increase in fluorescence. R837-induced fluorescence was blocked by l -NAME and by the oligonucleotide TLR7 antagonist IRS661, but not by a control oligonucleotide (IRS control) (n = 6). (D) Representative images of eosinophils loaded with nitric oxide–detecting fluorophore. Magnification, ×100. *P < 0.05 compared with no IFNγ control. # P < 0.05 compared with all other groups, except between IFNγ-treated R837 and R837 + IRS control. Data are presented as means (±SEM).

Our results demonstrate a significant antiviral effect of eosinophils on parainfluenza virus infection in mouse airways in vivo and in isolated human eosinophils in vitro. Eosinophils appear to mediate their antiviral effects via both passive and proactive mechanisms. Specifically, our data show that eosinophils are a “dead-end” cellular host for parainfluenza, failing to propagate infectious viral progeny after infection. Thus, elevated eosinophil numbers in the lung may passively disrupt airway infection by acting as a cellular decoy and/or “sink,” interfering with the progressive expansion of viral numbers during infection. Our data also show that eosinophils proactively mediated antiviral activities through the production of nitric oxide and up-regulation of TLR7. In contrast, we did not find evidence that eosinophils directly attenuate parainfluenza through the release of eosinophil peroxidase or by degrading the viral RNA genome through the release of granule RNases.

These findings expand on prior eosinophil studies (12–14, 17, 18, 27) by establishing an antiviral role for eosinophils against parainfluenza virus, while suggesting that key differences exist in the eosinophils’ antiviral mechanisms against different viruses. Previous studies proposed that eosinophils inhibit RSV and pneumonia virus in mice, in part via the degradation of viral RNA genomes by eosinophils’ granule RNases, eosinophil cationic protein, and eosinophil-derived neurotoxin (13, 17, 18). However, we found that eosinophils did not alter the quantity of viral RNA transcripts for three key parainfluenza virus structural proteins (i.e., matrix, fusion, and nucleoprotein), despite causing a substantial reduction in parainfluenza infectivity, titered in RMK cells by hemadsorption assay. This suggests that eosinophils do not inhibit parainfluenza through RNase activity on the viral genome. Importantly, our methods differed from prior studies by quantifying both viral RNA and infectivity compared with only assessing viral infectivity after treating infected eosinophils with RNase inhibitors. Concurrent measurement of viral RNA levels and infectivity led to the additional finding that, although human eosinophils infected with parainfluenza produce viral RNA, these viral progeny are not infectious. This phenomenon, termed an “abortive” infection, has been described for many viruses, including RSV (28) and coronavirus (29) in macrophages, and influenza A in neutrophils (30), as well as for parainfluenza virus in Madin-Darby bovine kidney cells (31) and chick embryo fibroblasts (32). Evidence suggests that specific virus and host cell characteristics impact productive versus abortive outcomes during virus infections (33), but those characteristics require further investigation.

Eosinophils also inhibit parainfluenza through the production of nitric oxide. Previously, systemic suppression of nitric oxide production using an inhibitor of nitric oxide synthase delayed clearance of RSV in wild-type mice and in IL-5 transgenic animals with systemic eosinophilia in vivo (12, 34). Given the widespread expression of nitric oxide synthases, however, these studies were unable to distinguish the specific role of eosinophil-derived nitric oxide, which our study has elucidated. The ability of eosinophils to produce nitric oxide has been suspected for some time, given the presence of both constitutive and inducible nitric oxide synthase isoforms in eosinophils (35), but detecting nitric oxide has historically been challenging due to its short half-life and rapid diffusion across biologic membranes (36). These issues were overcome by using a copper-conjugated intracellularly retained fluorescent probe. We found that eosinophils generate nitric oxide in response to virus infection, and in response to stimulation with synthetic TLR7 agonist. IFNγ potentiated TLR7-mediated nitric oxide production in eosinophils, likely in part through the up-regulation of TLR7 expression. Thus, our results show that antiviral cytokine signaling augments eosinophils’ viral detection and their antiviral nitric oxide response.

Nitric oxide mediates antiviral effects via the production of a variety of reactive nitrogen products that inhibit viral proteases (37), and alter host cell function through nitrosylation of tyrosine and thiol groups (38). The consequences of these nitrogen species are diverse, ranging from inhibition of virus protein and RNA synthesis to potentiation of inflammation and injury to the respiratory tract (39). Nitric oxide also regulates many other physiologic processes, including eosinophil migration (40) and survival (41, 42), airway epithelial cell ciliary motility (43), and airway caliber through airway smooth muscle relaxation (44). Eosinophil-derived nitric oxide may affect multiple functions in the airway beyond what our experiments were designed to assess.

Eosinophils’ attenuation of parainfluenza virus infection was not dependent on the release of eosinophil peroxidase. Eosinophil peroxidase is a granule protein that, together with the respiratory burst from activated eosinophils, generates potent reactive oxygen species that have been suggested to contribute to host immune defense (45). For example, eosinophil peroxidase has been shown to have virucidal effects against human immunodeficiency virus in vitro (46). However, the role of eosinophil peroxidase in vivo as a host defense mechanism remains unclear. Eosinophil peroxidase deficiency had no effect in an experimental model of helminthic parasite infections in mice (47), and its deficiency has also been detected in humans without manifesting an apparent phenotype (48). Our data further suggest that eosinophil peroxidase has no role in eosinophils’ antiviral activity against parainfluenza.

Importantly, our experiments differentiate the effects of eosinophils’ versus IL-5. Although NJ.1726 IL-5 transgenic mice (↑Eos ↑IL-5) with an abundance of airway eosinophils had reduced parainfluenza virus in the lung, NJ.1726-PHIL mice (ØEos ↑IL-5) with elevated IL-5 in the absence of eosinophils did not. This is pertinent given the presence of IL-5 receptors on leukocytes other than eosinophils, including macrophages and neutrophils (49), which could have contributed to the antiviral effect in vivo. Furthermore, our data demonstrate that, although an induced airway eosinophilia promoted viral clearance, clearance of virus was similar for eosinophil-deficient mice relative to wild-type control animals. This suggests that the presence of a specific airway eosinophilia mediates one or more unique antiviral mechanisms not occurring at homeostatic baseline, and underlines the need for better characterization of asthma phenotypes when evaluating respiratory virus infections in humans.

Human studies have historically been confounded by the heterogeneity of asthma phenotypes (50), the need for invasive bronchoscopic testing, the immune effects of corticosteroid treatment, differences in virus detection methods (i.e., PCR, ELISA, culture) and the variety of respiratory viruses that cause asthma exacerbations (20). Recent trials that studied exacerbation rates in well characterized steroid-resistant eosinophilic subjects with asthma treated with mepolizumab, a monoclonal antibody against IL-5, found no difference in the incidence of respiratory tract infections (4, 5). However, airway infections were rare events, and were diagnosed clinically without objective evidence of the presence of an infecting virus. Furthermore, these trials did not quantify airway and lung parenchymal eosinophils, nor did they characterize the eosinophils’ activation state after treatment. Nonetheless, future studies that define the interaction between eosinophils and viruses may lead to novel treatment targets for eosinophilic asthma and for respiratory virus infections in humans.

The results of our study paradoxically suggest that eosinophils have beneficial antiviral effects during respiratory virus infections despite considerable evidence linking viruses to asthma exacerbations (20, 21). However, we cannot conclude that eosinophils’ antiviral effects result in fewer exacerbations. On the contrary, it is possible, and perhaps likely, that eosinophils’ ability to detect and respond to viruses promotes an exuberant, and ultimately detrimental, airway inflammatory response in subjects with asthma. Although our study did not specifically address airway physiology, Adamko and colleagues (14) found that eosinophils mediate virus-induced airway hyperreactivity in sensitized guinea pigs, and were associated with lower viral titers, yet lower viral titers did not improve airway hyperreactivity. Thus, the negative effects of activated eosinophils’ in the airway may mask any positive impact from fewer viral transcripts. Consequently, as therapies become progressively more targeted against pulmonary eosinophils, there will be an even greater need for understanding the complexity of eosinophil biology in the lungs.


Advantages & Limitations of scRNA-Seq Assays

scRNA-Seq is a very powerful method that allows transcriptomic analysis of heterogeneous tissue, or dynamic processes in one single experiment. Without microdissection or FACS-sorting, samples can be directly prepared for the scRNA-Seq protocol. Depending on the number of cells and the sequencing depth, scRNA-Seq can be very sensitive and detect a population representing less than 1% of the total population.

Because of the quantity of information generated by scRNA-Seq, some of the protocol steps have to be handled with care. The preparation of the single-cell solution can be challenging especially for tissues or cells surrounded by an extracellular matrix. The protocols used to isolate these cells can by themselves modify the transcriptome and the sequencing data could be the result of these manipulations instead of an endogenous cellular process. In contrast, for bulk RNA-Seq, tissues can be directly lysed in trizol, freezing the transcriptome at the very first step of the extraction. scRNA-Seq identifies fewer transcripts than bulk RNA-Seq and this imperfect coverage can lead to a biased quantification. However, this flaw can be corrected by bioinformatic analysis. Finally, most scRNA-Seq protocols only focus on poly-A RNAs, which excludes all non-coding RNAs.

scRNA-Seq is more expensive and more time-consuming than bulk RNA-Seq but in one experiment, you obtain the transcriptome profile of several populations.


Pulmonary Adenocarcinoma—Pathology and Molecular Testing

Prodipto Pal MD, PhD , . Ming-Sound Tsao MD, FRCPC , in Pulmonary Adenocarcinoma: Approaches to Treatment , 2019

Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction

Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) is feasible in clinical laboratories, however, with its own set of challenges. As noted earlier, ALK rearrangement has many different candidate fusion partners, even for the ALK-EML4, the most common fusion in NSCLC, there are many fusion variants, largely due to different breakpoint regions on EML4, thus would require a multiplexed approach. However, with RT-PCR-based methods, a priori knowledge of the candidate fusion genes is needed to identify fusion variants which can later be confirmed by subsequent sequencing 101 and has been used in studies with high level of sensitivity albeit with varying level of specificity (85%–100%) compared with FISH. 102,103 A negative result by RT-PCR requires appropriate caution due to the potential of false-negative results due to the missing unknown fusion variants. In addition, RT-PCR assays are dependent on procuring high-quality RNA from FFPE tissue. Newer RNA-based assays are under active development (assays such as NanoString system) that can simultaneously detect various fusion partners as well as offer the added advantage of detecting other driver fusion-type alterations in a multiplexed setup (such as ROS1, RET, etc.). 104–106


Schlussfolgerungen

In summary, we described an alternative method using Real-Time RT-PCR to determine the rate of mRNA degradation by accurately measuring the number of mRNA molecules relative to total RNA. Using this approach, we obtained a values for the β-actin mRNA half-life in Nalm-6 cells that are comparable to those estimated from Northern blot studies using normal human leukocytes [13]. Therefore, Real-Time RT-PCR is a reliable method for measuring mRNA half-life. Because of its sensitivity, half-life of mRNAs expressed at very low level can be determined in cases in which Northern blots may not be sensitive enough. The length of the amplified fragment is important to determine the mRNA half-life because incomplete or degraded mRNA can interfere with the measurement of the actual mRNA half-life. Ideally, full-length cDNA molecules should be amplified to ensure integrity and identity of the mRNA species. The use of the fluorogenic SYBR Green I dye limits the length of the amplified product (cDNA recommended to be less than 200 bp). However, the use of TaqMan ® (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), molecular beacons (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR, USA), or fluorescence resonance energy transfer (FRET) probes (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN, USA) could overcome this limitation and allow amplification of longer PCR products. In addition, since multiplex Real-Time RT-PCR can be achieved in the same reaction tube using different fluorogenic dyes, this method could be modified to simultaneously estimate mRNA half-life of several genes. Thus, our approach represents a rapid and sensitive assay to determine mRNA half-life.


Sars-CoV-2 RNA on surfaces poor indicator of quantity, timing of previous contamination

Novel Coronavirus SARS-CoV-2 Transmission electron micrograph of SARS-CoV-2 virus particles, isolated from a patient. Image captured and color-enhanced at the NIAID Integrated Research Facility (IRF) in Fort Detrick, Maryland. Credit: National Institute of Allergy and Infectious Diseases, NIH

A team of UK investigators has shown that RNA copies recovered from surfaces are a poor indicator for determining the numbers of viable SARS-CoV-2 virus particles.

The research, published in Applied and Environmental Microbiology, a publication of the American Society for Microbiology, found that a common UK isolate of SARS-CoV-2 that may have initially contaminated surfaces in the general environment became undetectable within 48 hours. The isolate of SARS-CoV-2 remained viable for more than twice as long on hydrophobic surfaces as on hydrophilic surfaces.

The materials tested in the study were representative of those in personal protective equipment, as well as high hand-touch sites such as stainless steel.

An impediment to determining how long SARS-CoV-2 remains viable on different surfaces has been that in most cases, viable virus that has landed on surfaces is rarely detected, according to corresponding author Thomas Pottage, BSc, Senior Project Leader—Biosafety and Bioresponse, Public Health England, Porton Down, UK. However, many studies have used reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) successfully to detect viral RNA and use this as an indicator of how much of the virus was previously found on the surface.

Therefore, the investigators first sought to determine the relationship between initial quantities of viable virus, and subsequent RNA copy number on a contaminated surface, hoping that the latter could serve as a surrogate for the former. To test this, they contaminated surfaces of interest with artificially high concentrations of the virus in the laboratory. But there was no clear relationship between the numbers of RNA copies recovered over time to the number of viable virus particles in the initial inoculum. The investigators did observe that the numbers of virus particles decreased quite rapidly.

The relationship in levels of RNA and viable SARS-CoV-2 shows that in previous surface sampling studies where SARS-CoV-2 RNA was recovered, there were likely low concentrations of viable virus on those surfaces at the time of contamination, according to Pottage.

"This study estimates that the SARS-CoV-2 would survive less than two days on surfaces under normal environmental concentrations," said Pottage.

Conversely, artificially high concentrations of SARS-CoV-2 that were deliberately deposited on surgical mask material and stainless steel in a laboratory setting resulted in relatively lengthy persistence, with 99.9% reductions in viable virus taking place over 122 and 114 hours, respectively. Viability dropped the fastest on a polyester shirt, with a 99.9% reduction occurring over 2.5 hours.

"Our results show that the porous but hydrophobic surfaces of the surgical mask and Tyvek coverall produce similar decay rates when compared to the non-porous hydrophobic surfaces of stainless steel," with a reduction in numbers of virus particles of 99.999% over seven days, said the authors. Viable SARS-CoV-2 was recovered from these surface materials over longer periods of time compared to the porous, hydrophilic surfaces tested, cotton and woven polyester.


Small RNA Detection by in Situ Hybridization Methods

Small noncoding RNAs perform multiple regulatory functions in cells, and their exogenous mimics are widely used in research and experimental therapies to interfere with target gene expression. MicroRNAs (miRNAs) are the most thoroughly investigated representatives of the small RNA family, which includes short interfering RNAs (siRNAs), PIWI-associated RNA (piRNAs), and others. Numerous methods have been adopted for the detection and characterization of small RNAs, which is challenging due to their short length and low level of expression. These include molecular biology methods such as real-time RT-PCR, northern blotting, hybridization to microarrays, cloning and sequencing, as well as single cell miRNA detection by microscopy with in situ hybridization (ISH). In this review, we focus on the ISH method, including its fluorescent version (FISH), and we present recent methodological advances that facilitated its successful adaptation for small RNA detection. We discuss relevant technical aspects as well as the advantages and limitations of ISH. We also refer to numerous applications of small RNA ISH in basic research and molecular diagnostics.

Schlüsselwörter: LNA probe PLA Piwi-interacting RNA TIRCA enzyme-labeled fluorescence signal amplification padlock probes rolling circle amplification short interfering RNA tyramide signal amplification.

Figuren

Types of nucleotide modifications used…

Types of nucleotide modifications used in small RNA ISH probes. ( EIN )…

Sequence amplification and detection methods…

Sequence amplification and detection methods for small RNA ISH include ( EIN )…

Sequence amplification and detection methods…

Sequence amplification and detection methods for small RNA ISH include ( EIN )…


Schau das Video: Reverse Transcription PCR (Juli 2022).


Bemerkungen:

  1. Hurley

    Märchen

  2. Ever

    Ich muss dir sagen, dass du getäuscht wurdest.

  3. Rousskin

    Wie gut es ist, dass wir es geschafft haben, einen so unvergleichlichen Blog zu finden, und umso hervorragender als so vernünftige Schriftsteller!

  4. Bromleigh

    Ich kann mich gerade nicht an der Diskussion beteiligen - ich habe keine Zeit. Aber ich werde zurückkehren - ich werde definitiv schreiben, was ich denke.

  5. Acrisius

    Vielen dank für Ihre Hilfe. Ich sollte.

  6. Sonny

    Das passt nicht zu mir.



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