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2.8: Proteinlokalisierung - Biologie

2.8: Proteinlokalisierung - Biologie



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In eukaryotischen Zellen, in denen Reaktionen und Proteine ​​oft in spezialisierten membrangebundenen Kompartimenten (Organellen) eingeschlossen sind, muss ein System vorhanden sein, um bestimmte Proteine ​​gezielt von ihrem Entstehungsort in der Zelle zu ihrem Einsatzort in der Zelle zu transportieren Zelle. In diesem Abschnitt werden wir zwei Hauptmodi der Proteinlokalisierung diskutieren. Wir beginnen mit den Komponenten der Endomembransystem. Dieses System beinhaltet die cotranslationale Translokation durch Membranen und die spätere Lieferung und Verarbeitung durch verschiedene Organellen über Vesikel und den motorischen Protein-vermittelten Transport. Es wird für Proteine ​​verwendet, die innerhalb der Kompartimente des Endomembransystems funktionieren, für Proteine, die in die Plasmamembran eingebettet sind, und für sekretierte Proteine.

Wir werden auch einen anderen Modus des Protein-Targeting und der Translokation diskutieren. Diese breite Klasse von Protein-Targeting-Mechanismen tritt streng posttranslational auf und lenkt Proteine ​​zum Zellkern, den Mitochondrien, den Plastiden und den Peroxisomen. Es teilt bestimmte Konzepte – wie Signalpeptide – mit dem oben erwähnten Endomembransystem-Targeting.

Diskussion: Sie haben in diesem Kurs bisher viele Arten von Proteinen kennengelernt. Nennen Sie einige dieser Proteine ​​und ihre Position innerhalb der Zelle. Wo würden Sie beispielsweise glykolytische Enzyme erwarten?

Designherausforderung

Eukaryotische Zellen enthalten membrangebundene Organellen, die Materialien, Prozesse und Reaktionen effektiv voneinander und vom Zytoplasma trennen. Dies stellt an sich schon ein Problem dar: Wie kann die Zelle die Lage von Materialien zwischen diesen Organellen kontrollieren? Genauer gesagt, wie kann eine eukaryotische Zelle Verbindungen von ihrem Ursprungsort (in den meisten Fällen dem Zytoplasma) dorthin transportieren, wo sie benötigt werden (vielleicht den Zellkern, die Mitochondrien oder die Zelloberfläche)?

Kommt Ihnen die obige Designherausforderung bekannt vor? Diese Herausforderung wurde in der Eukaryoten-Einheit des Kurses eingeführt. Wir diskutierten die Notwendigkeit, Autobahnen zu vernetzen, die eine gerichtete Bewegung von Vesikeln von einem Ort zum anderen ermöglichen.

Proteintranslokation und das Endomembransystem

In Eukaryoten werden alle mRNAs von zytoplasmatischen Ribosomen gebunden und die Translation beginnt im Zytoplasma. Bei einigen Proteinen existieren jedoch die ersten paar (die meisten N-terminalen) Aminosäuren, um kein Protein bereitzustellen Funktion (sie werden sowieso später ausgeschnitten, wie wir sehen werden) sondern eher um die Proteine ​​zu liefern die Anschrift. Wenn das zu translatierende Protein an einen anderen Ort transportiert werden muss (im Grunde irgendwo anders als das Zytoplasma), enthält es a Signalfolge, eine kontinuierliche Reihe von Aminosäuren, die von a . erkannt werden Signalerkennungspartikel (SRP). Verschiedene SRPs erkennen verschiedene Signalfolgen.

Wenn ein Protein dazu bestimmt ist, Teil des Endomembransystems (dem ER, Golgi, Endosomen, Plasmamembran oder von der Zelle sezerniert) zu werden, führt die Entstehung des Signalpeptids und sein Einfangen durch sein verwandtes SRP zum Stillstand des Ribosoms. Die Übersetzung kann nicht fortgesetzt werden, bis die SRP entfernt wurde. Der resultierende Komplex diffundiert durch die Zelle, bis er mit einem SRP-Rezeptor auf der Oberfläche des rauen ER in Kontakt kommt. Das an das SRP gebundene Ribosom wird an der rauen ER-Oberfläche an einem Transmembrankanal namens a . andocken translocon. Wenn das Ribosom an das Translokon bindet, wird das SRP freigesetzt und das Ribosom kann das Protein weiter translatieren. Das Translokon wird sich weit genug öffnen, damit das neu erzeugte Protein direkt in das Lumen oder die Membran des rauen ER eindringen kann.

ER Translocon-Komplex. In den Ribosomen (gelb und hellblau) findet die Polymerisation statt. Durch das ER-Translokon (grün: Sec61, blau: TRAP-Komplex und rot: Oligosaccharid-Transferase-Komplex) wird das neu synthetisierte Protein über die Membran (grau) in das Innere des ER transportiert. Sec61 ist der proteinleitende Kanal und der OST fügt dem entstehenden Protein Zuckereinheiten hinzu.

Diskussion: Wenn das SRP an die wachsende Peptidkette und das Ribosom bindet, bleibt das Ribosom stehen. Welche Bedeutung hat das Ihrer Meinung nach? Was würden Sie vorhersagen, wenn das Ribosom die mRNA weiter translatieren könnte, während das SRP gebunden ist?

Endomembransystem

Ab diesem Zeitpunkt ist das Protein in die Endomembransystem. Die raue ER-Membran ist der Produktionsort für alle Transmembranproteine ​​sowie die Proteine ​​für den Golgi-Apparat, Lysosomen, Endosomen, Zellmembranen und mehr. Bei den vielen Optionen für Proteinziele ist das grobe ER an der kotranslationalen Sortierung der Proteine ​​beteiligt, die bestimmte Signalsequenzen enthalten. Proteine, die für ähnliche Orte bestimmt sind, werden zusammen in Transportvesikel verpackt, die aus der rauen ER-Membran knospen. Diese Vesikel verschmelzen zur Cis-Flocke des Golgi (am nächsten zum Kern). Das Lumen von Golgi enthält Enzyme, die spezifische Sequenzen auf ihren Zielproteinen erkennen und ihre Ziele modifizieren. Viele Arten von posttranslationalen Modifikationen treten auf, wenn das Protein im Golgi reift:. Die Phosphorylierung von Oligosacchariden an lysosomalen Proteinen erfolgt in der cis Seite des Golgi-Apparates, während Galaktose, Sialinsäure und andere Kohlenhydrate zu Proteinen in der trans Seite des Golgi-Apparats. Diese posttranslationalen Modifikationen können die Struktur und Funktion des Proteins verändern und können auch als Signal fungieren, das hilft, den endgültigen Bestimmungsort des Proteins zu definieren. Bis die Proteine ​​auftauchen (wieder in Vesikeln), wurden verschiedene Proteine ​​mit derselben Adresse in die gleichen Vesikel einsortiert (diesen Vorgang könnten Sie hier visualisieren).

Das Endomembransystem

Die vesikuläre Bewegung (auch im Modul "Eukaryoten" beschrieben) ist ein energieintensiver Prozess, bei dem Mikrotubuli und Motorproteine ​​​​verwendet werden. Vesikel sind zu groß, um effektiv innerhalb der Zelle diffundieren zu können. Motorproteine ​​transportieren Vesikel und ihre Fracht, indem sie unidirektional entlang von Mikrotubuli wandern. Während sich die Motorproteine ​​entlang des Mikrotubulus bewegen, wird chemische Energie in Form von ATP in mechanische Energie umgewandelt.

Woher "wissen" Vesikel, dass sie ihr Ziel erreicht haben?

Mikrotubuli-basierter Trafficking gibt Vesikel wiederholte Stöße oder Züge in eine allgemeine Richtung (d. h. vom Zellkern weg). Bei Zellen, die viel länger als breit sind (Neuronen, Wurzelhaare), kann der vesikuläre Handel ziemlich dramatisch sein. Kinesine "wissen" jedoch nicht, dass sie beispielsweise auf die Plasmamembran im Vergleich zur lysosomalen Membran zusteuern. Sie helfen nur, ihre Fracht zu verteilen. Tatsächlich ist es das Vesikel selbst, das sein Ziel erkennt (obwohl es ohne das Motorprotein nicht in der Lage wäre, sich zu bewegen). In das Vesikel eingebettete SNARE-Proteine ​​und sein Ziel erkennen sich gegenseitig und erleichtern die Fusion des Vesikels mit der Membran seines Zielkompartiments. Diese Proteine ​​erleichtern beispielsweise die Freisetzung von Neurotransmittern, wodurch Neuronen interzelluläre Signale übertragen können. Dieselben SNAREs sind das Ziel vieler Neurotoxine, einschließlich Botulinumtoxin (Botox). Die Hemmung der Neurotransmitterfreisetzung durch Botox induziert eine schlaffe Muskellähmung.

Energiegeschichte: Schreiben Sie eine Energiegeschichte für den vesikulären Transport mit in der Zelle. Fügen Sie eine Beschreibung des Gesamtprozesses und der Anfangs- und Endzustände der im Prozess verwendeten Energie bei. Welche Arbeiten werden insgesamt durchgeführt?

Andere Proteintransportsysteme

Es gibt viele Organellen, denen ihre Proteine ​​nicht zugeführt werden über das Endomembransystem, wie der Zellkern, die Mitochondrien und Chloroplasten. Proteine, die in Nicht-Endomembran-Kompartimente sortiert sind, codieren Signalpeptide, aber ihre Translokation ist nicht an die Translation gekoppelt. Diese Proteine ​​werden im Zytoplasma vollständig translatiert, obwohl sie oft sofort von Chaperoninen gebunden werden, die ihre Faltung verhindern.

Proteintranslokation in den Zellkern

Diskussion: Stellen Sie eine Hypothese auf, wie Wissenschaftler bei der Entdeckung eines nuklearen Lokalisierungssignals vorgehen könnten. Was sind einige Experimente/Daten, die sie benötigen würden, um zu bestimmen, ob eine Sequenz ein Kernlokalisierungssignal ist?

Kernporenkomplexe werden als „gated“ Kanäle bezeichnet, die als selektive Gates fungieren, die spezifische Makromoleküle in den und aus dem Kern transportieren können. Kleinere Proteine ​​(<30 kDal) müssen von diesem Komplex nicht erkannt werden, sondern können frei hindurch diffundieren. Größere Proteine ​​müssen jedoch ein bestimmtes Peptidmotiv tragen, das als a . bezeichnet wird nukleare Lokalisierungssignale (NLS).

Kernlokalisationssignale werden erkannt von importins, kleine Proteine, die das nukleäre Lokalisierungssignal erkennen und daran binden. Ein an Importine gebundenes Protein kann mit dem Kernporenkomplex interagieren und durch den Kanal in den Kern gelangen.

Diskussion: Es gibt einige verschiedene Kernlokalisierungssignale, die in Kernproteinen gefunden werden. Diese Signale enthalten mehrere Lysin- und Argininreste. Was sind die chemischen Eigenschaften von Lysin und Arginin? Was sagt Ihnen das über die möglichen chemischen Eigenschaften von Importinen?

Proteintranslokation in Mitochondrien

Etwa 10 % der Proteine ​​einer eukaryontischen Zelle befinden sich in den Mitochondrien. Das Mitochondrium selbst synthetisiert nur etwa 11-12 Proteine ​​und muss daher den Großteil seiner Proteine ​​aus dem Zytoplasma importieren. Mitochondriale Proteine ​​werden vollständig synthetisiert, bevor sie die mitochondriale Membran passieren. Diese Proteine ​​haben ein N-terminales Targeting-Signal, das sich zu einer stark basischen amphiphilen Helix faltet. Sobald diese Signalsequenz aus dem Ribosom austritt, wird ein zytoplasmatisches Chaperon-Protein das Signal erkennen, daran binden und schließlich den Protein/Ribosom-Komplex an die mitochondriale Außenmembran andocken.

Auf der Oberfläche der Mitochondrien wird die N-terminale Signalsequenz in einen proteinleitenden Kanal (genannt Tom) eingefügt, der das Protein durch die äußere Membran und -je nach vorhandener Signalsequenz- in den proteinleitenden Kanal der inneren Membran transportiert (genannt Tim). Beachten Sie, dass es viele mögliche Zielorte für ein mitochondriales Protein gibt (wie für Plastidenproteine). Signalsequenzen innerhalb des Proteins selbst interagieren mit Erkennungsproteinen am Mitochondrium, um die endgültige Position des Proteins zu bestimmen.

Der endgültige Bestimmungsort eines mitochondrialen Proteins (äußere Membran, Zwischenmembranraum, innere Membran oder Matrix) wird durch seine besondere Anordnung von Signalsequenzen bestimmt.


Mitochondrien sind komplexe Organellen, deren Fehlfunktion einem breiten Spektrum menschlicher Erkrankungen zugrunde liegt. Die Identifizierung aller in dieser Organelle residenten Proteine ​​und das Verständnis ihrer Integration in die Stoffwechselwege stellen die Zellbiologie vor große Herausforderungen. Um dieses Ziel zu erreichen, führten wir Massenspektrometrie, GFP-Tagging und maschinelles Lernen durch, um ein mitochondriales Kompendium von 1098 Genen und ihrer Proteinexpression in 14 Mausgeweben zu erstellen. Wir verknüpfen schlecht charakterisierte Proteine ​​in diesem Inventar aufgrund der gemeinsamen Evolutionsgeschichte mit bekannten mitochondrialen Signalwegen. Mit diesem Ansatz sagen wir voraus, dass 19 Proteine ​​für die Funktion des Komplexes I (CI) der Elektronentransportkette wichtig sind. Wir validieren eine Teilmenge dieser Vorhersagen mit RNAi, einschließlich C8orf38, die wir weiter zeigen, birgt eine vererbte Mutation in einem tödlichen, infantilen CI-Mangel. Unsere Ergebnisse haben wichtige Implikationen für das Verständnis der CI-Funktion und Pathogenese und veranschaulichen allgemein, wie unser Kompendium als Grundlage für systematische Untersuchungen von Mitochondrien dienen kann.

Diese Autoren haben gleichermaßen zu dieser Arbeit beigetragen


Teil 3: Erkennung von Proteinlokalisierungssignalen

00:00:13.05 Hallo.
00:00:14.05 Mein Name ist Manu Hegde.
00:00:15.11 Ich bin Gruppenleiterin am MRC Laboratory of Molecular Biology in Cambridge, England.
00:00:21.03 Und dies ist der dritte in einer Reihe von drei Vorträgen und wir haben darüber diskutiert, wie
00:00:25.16 Proteine ​​innerhalb der Zelle werden selektiv zwischen den verschiedenen Organellen aufgeteilt.
00:00:31.12 Und in diesem speziellen Vortrag möchte ich ein wenig darüber sprechen, wie man sehr hohe Wiedergabetreue erreicht
00:00:36.04 in Erkennung der Lokalisierungssignale.
00:00:39.07 Zur Erinnerung: Die meisten Proteine ​​in der Zelle, kurz nachdem sie synthetisiert wurden,
00:00:45.23 müssen auf eine von mehreren verschiedenen Organellen aufgeteilt werden.
00:00:48.23 Und das kann vom endoplasmatischen Retikulum reichen, hier drüben, Mitochondrien, Peroxisomen, Kern,
00:00:54.14 und so weiter.
00:00:56.18 Und ein großes Problem war der Versuch, die Mechanismen zu verstehen, mit denen man alles erreichen kann
00:01:01.17 diese verschiedenen Proteine ​​werden mit hoher Genauigkeit in das richtige Fach sortiert.
00:01:07.02 Und was wir im ersten Gespräch gelernt haben, sind einige der ganz grundlegenden Prinzipien
00:01:10.17, wie dies erreicht wird.
00:01:12.11 Kurz gesagt haben Proteine ​​typischerweise Signalsequenzen oder andere Elemente, die spezifisch erkannt werden
00:01:19.10 von Maschinen, die verschiedenen Organellen gewidmet sind.
00:01:23.05 Also haben zum Beispiel Proteine, die zum endoplasmatischen Retikulum gelangen, eine Reihe von Maschinen,
00:01:28.06 Proteine ​​für Mitochondrien haben eine andere, und diese Maschinerie sorgt dafür, dass Sie erkannt werden können
00:01:33.13 dieser Signale und bringen die Proteine ​​in den richtigen Teil der Zelle.
00:01:37.24 Darüber hinaus hat die Zelle aufgrund von Fehlern in diesen Prozessen von Zeit zu Zeit
00:01:42.19 hat auch eine Maschinerie zum Abbau von Proteinen entwickelt, die nicht an die richtige Stelle gelangen.
00:01:48.10 Und was wir im zweiten Teil der Serie gelernt haben, ist, dass selbst leichte Steigerungen in
00:01:54.02 die Anzahl der Ausfälle reicht aus, um Krankheiten zu verursachen.
00:01:58.12 Und so ist über lange Zeit sogar ein Protein fehl am Platz – sagen wir,
00:02:03.21 zwei- bis dreimal mehr als es sein sollte -- kann unter Umständen Krankheiten verursachen
00:02:09.22 wie Neurodegeneration.
00:02:11.23 Und was das wirklich in unseren Köpfen hervorrief, ist angesichts dieses einen Proteins. fehl am Platz
00:02:19.03 kann das verursachen, und die Zelle muss buchstäblich mit Tausenden von Proteinen umgehen, um dorthin zu gelangen
00:02:24.07 der richtige Ort ist, ist es offensichtlich wichtig, eine einigermaßen gute Lokalisierungstreue zu erhalten
00:02:29.16 Problem für die Zelle.
00:02:31.00 Also, wie wird das eigentlich erreicht?
00:02:33.21 Und ich möchte versuchen, dies für Proteine ​​anzugehen, die zum endoplasmatischen Retikulum gelangen.
00:02:38.20 Also, um dich daran zu erinnern, Proteine, die entweder auf der Oberfläche der Zelle landen, hier drüben oder
00:02:45.00 außerhalb der Zelle beginnen diese blauen Proteine ​​zunächst ihre Synthese am endoplasmatischen Retikulum.
00:02:51.07 Ribosomen, die sie synthetisieren, docken also an der ER-Oberfläche an und verlagern die
00:02:56.15 Protein durch die Membran oder in die Membran einbringen, und diese Proteine ​​werden dann transportiert
00:03:01.18 zu ihren endgültigen Zielen.
00:03:03.22 Und die Frage ist, wie sind die Signale, die hier erkannt werden, um sie richtig zu stellen?
00:03:08.20 Ort und über die Membran mit hoher Genauigkeit von der jeweiligen Maschinerie erkannt?
00:03:14.13 Um dich daran zu erinnern, was diese Maschinerie ist, hier ist ein Beispiel für ein Protein, das sich windet
00:03:19.04 im Lumen der Notaufnahme, und die Schritte, die von der ersten Synthese an führen
00:03:24.17 um zum Lumen zu gelangen.
00:03:25.23 Kurz nachdem es mit der Synthese begonnen hat, legt das Protein also eine Signalsequenz frei, die
00:03:32.11 hier blau dargestellt, und diese Sequenz, die normalerweise hydrophob ist, wird erkannt
00:03:38.06 durch einen Faktor namens Signalerkennungspartikel.
00:03:41.03 Und SRP wirkt auf das Ribosom selbst und erkennt dieses Protein, wenn es aus dem Ribosom kommt
00:03:47.23 Tunnel verlassen.
00:03:48.24 SRP hat dann einen Rezeptor an der Membran und dieser Rezeptor, SRP-Rezeptor genannt, abgekürzt
00:03:55.21 SR hier, hilft dann bei der Übertragung des Proteins auf einen anderen Faktor namens Sec61.
00:04:02.19 Und Sec61 ist eine Komponente des Proteintranslokationskanals.
00:04:08.02 Und was passiert ist, dass das Signal nach der Übertragung auf Sec61 wieder erkannt wird und
00:04:15.04 muss er erfolgreich den Sec61-Kanal aktivieren.
00:04:19.02 Und was ich mit Engagement meine ist, es muss nicht nur erkannt, sondern irgendwie geöffnet werden
00:04:24.15 Kanal, so dass Sie in späteren Schritten eine Pore erhalten, die sich über die Membran bildet
00:04:30.18 und Translokation des Proteins durch die Membran.
00:04:34.04 Irgendwann während dieses Translokationsprozesses wird das Signalpeptid von einem spezifischen gespalten
00:04:39.12 Enzym, und schließlich kommt es zur Translokation des gesamten Proteins durch die Membran in
00:04:44.22 das Lumen des endoplasmatischen Retikulums.
00:04:46.23 Nun stellt sich heraus, dass die gleiche Maschinerie auch mit integralen Membranproteinen befasst ist, und
00:04:52.08 dies kann auf verschiedene Arten gesehen werden.
00:04:54.13 Wenn also zum Beispiel ein Protein synthetisiert wird, dann. synthetisiert ein Transmembransegment,
00:05:01.24 hier auch blau dargestellt, dass die hydrophobe Sequenz seitlich in
00:05:07.21 die Lipiddoppelschicht, damit Sie ein integrales Membranprotein herstellen können, das die Lipiddoppelschicht überspannt.
00:05:14.06 Also, was Sie haben, ist eine Maschinerie, die dann Proteine ​​​​erkennen muss, um sie zu zielen
00:05:19.20 in die Notaufnahme, zum Öffnen des Kanals und zum Einführen in die Membran.
00:05:25.21 Also muss dieser Prozess natürlich nicht nur für ein Protein ablaufen, das gehen muss
00:05:30.21 das ER, aber für buchstäblich Tausende von verschiedenen Proteinen.
00:05:34.17 Und so das Proteinpartikel zur Signalerkennung. aber der Signalerkennungs-Partikelweg
Es wird angenommen, dass 00:05:40.16 ungefähr 5.000 bis 6.000 verschiedene Proteine ​​​​in unserem Genom behandelt.
00:05:46.12 Und diese Proteine ​​unterscheiden sich erheblich – einige von ihnen durchdringen die Membran nur einmal, viele
00:05:50.20 von ihnen werden sezerniert und gehen bis ins Lumen, viele von ihnen überspannen die Membran
00:05:55.08 mehrmals -- und alle diese Proteine ​​haben Sequenzen, die erkannt werden müssen
00:06:01.10 für diese Prozesse, und jede einzelne dieser Sequenzen ist einzigartig.
00:06:06.21 Es stellt sich also die Frage, wie man so viele verschiedene Sequenzen erkennt?
00:06:13.08 Und wie macht man das mit einigermaßen hoher Wiedergabetreue?, was wir für ziemlich wichtig halten
00:06:18,00, da selbst geringfügige Ineffizienzen und Ausfälle im Laufe der Zeit erhebliche Folgen haben können.
00:06:24.24 Was Sie also wirklich verstehen wollen, sind meiner Meinung nach zwei wichtige Schritte.
00:06:30.03 Das erste, ganz links gezeigt, ist das Signalerkennungspartikel und wie
00:06:35.16 erkennt es Signalpeptide.
00:06:37.21 Der zweite ist, wie der Sec61-Kanal Signalpeptide erkennt, um sich zu öffnen.
00:06:44.15 Und wie können wir das tun?
00:06:46.04 Und was Sie wirklich tun möchten, ist, sich diese spezifischen Schritte im Prozess anzusehen
00:06:51.18 mit einem hohen Auflösungsgrad, und was Sie am liebsten tun würden, ist, welche zu haben
00:06:56.14 Grad an molekularer Einsicht in die Natur der Wechselwirkung zwischen SRP und
00:07:02.23 das Signalpeptid und Sec61 und das Signalpeptid.
00:07:07.08 Es gibt jedoch eine Reihe verschiedener Herausforderungen, diese Komplexe mit hoher Auflösung zu betrachten
00:07:12.15 strukturelle Ansätze.
00:07:14.09 Zum Beispiel die am besten aufgelösten strukturellen Ansätze, wie die Röntgenkristallographie
00:07:19.07 oder NMR, erfordern große Mengen an homogener Probe.
00:07:23.17 Diese Schritte sind jedoch spezifische Schritte in einem kotranslationalen Weg, daher ist der Prozess
00:07:31.00 tritt während der Proteinsynthese auf, was bedeutet, dass es sehr schwierig ist, nicht nur homogen zu werden
00:07:36.19 Probe, aber um es in großen Mengen zu bekommen.
00:07:40.24 Das zweite Problem ist, dass diese Komplexe enorm sind, also im eukaryotischen System
00:07:46.14 zum Beispiel besteht das Ribosom aus etwa 80 Proteinen, vielen RNAs, SRP besteht
00:07:53.14 von sechs verschiedenen Proteinen und RNAs, und diese Proteine ​​sind zum Beispiel sehr schwer zu
00:07:59.13 in Kristalle locken.
00:08:01.11 Und das dritte Problem ist, dass es sehr wahrscheinlich ist, dass diese Interaktionen selbst entweder
00:08:06.23 flexibel oder dynamisch.
00:08:09.04 Bei diesen Herausforderungen war es also sehr schwierig, eine hohe Auflösung zu erhalten
00:08:13.16 Informationen über die Art dieser Interaktionen.
00:08:16.11 Der Ansatz, der in der Vergangenheit typischerweise gewählt wurde, ist diese Strategie des Teilens und Herrschens.
00:08:22.20 und die Strategie hier ist, dass Sie einen Proteinkomplex wie SRP nehmen und ihn in kleine Stücke schneiden
00:08:29.21 Stück, also entweder einzelne Proteine ​​oder einzelne Domänen von Proteinen, die man dann kristallisieren kann.
00:08:36.00 Und die Hoffnung ist, dass diese kleineren Teile schließlich zu einem größeren zusammengefügt werden
00:08:41.22 insgesamt können Sie einen Einblick in die Funktionsweise der Maschinerie gewinnen.
00:08:45.07 Aber es war eine ziemliche Herausforderung, die einheimischen Komplexe in Aktion zu sehen.
00:08:51.15 Der Hauptansatz, der verfügbar war, um solch große Komplexe zu untersuchen, war Elektronen
00:08:56.16 Mikroskopie, und ich werde später etwas ausführlicher beschreiben, aber die Grundidee
00:09:01.18 ist, dass man solche Proben nehmen kann und man nicht viele davon braucht, und rekonstruieren
00:09:07.20 dreidimensionale Strukturen mit dem Elektronenmikroskop.
00:09:11.21 Bis vor kurzem waren solche Strukturen jedoch relativ begrenzt in welcher Auflösung
00:09:18.08 sie bieten.
00:09:19.08 Das sind sie. das sind bahnbrechende Studien, vom Beckmann-Labor oder vom Akey und
00:09:24.14 Rapoport-Labors, die darüber informiert haben, wo sich das Ribosom befindet, das in Blau und dargestellt ist
00:09:30.19 gelb, Komplexe wie SRP sitzen und ihre Gesamtorganisation, und man kann solche verwenden
00:09:36.16 Strukturen zum Andocken von Röntgenstrukturen einzelner Komponenten, um einen Gesamtüberblick zu bekommen
00:09:43.03 wie diese Strukturen aussehen.
00:09:44.13 Aber wenn Sie sehen möchten, was die tatsächlichen Interaktionen im nativen Komplex sind, stellt sich das heraus
00:09:50.14 um einiges anspruchsvoller zu sein.
00:09:52.13 Und es gibt eine Reihe von Gründen, warum dies ein Problem war, aber zum Beispiel, wenn Sie
00:09:57.17 schau dir hier das Sec61 translocon an kannst du das sehen, weil diese Komponente eingebettet ist
00:10:05.15 in einer Lipiddoppelschicht muss man es aus dieser Doppelschicht extrahieren und sie wird dann umgeben
00:10:10.20 durch Lipide und Detergenzien, die die Fähigkeit beeinträchtigen, das zu sehen, was Sie sehen möchten.
00:10:16.24 Und das, zusammen mit anderen Einschränkungen der Auflösung, hat es sehr schwierig gemacht
00:10:21.10, um molekulare Wechselwirkungen z. B. zwischen dem Signalpeptid und SRP oder dem Signal zu sehen
00:10:27.13 Peptid und Sec61 in einer Detailtiefe, die einen Einblick in die Art und Weise der Erkennung gibt.
00:10:32.24 Das ist also die Herausforderung.
00:10:35.18 Und ich muss sagen, es ist sicherlich ziemlich beeindruckend, dass im Laufe von 60 Jahren seit dieser Zeit
00:10:42.04 Es wurde eine elektronenmikroskopische Aufnahme gemacht, und diese Bilder, die ich Ihnen gerade gezeigt habe, haben eine viel bessere Auflösung
00:10:47.04 Ansichten, wie Ribosomen, das sind diese dunklen, dichten Partikel hier, aussehen, wenn sie sind
00:10:51.23 auf ein Protein abzielen oder an einer Membran angedockt sind, aber die molekularen Details von
00:10:57.19 diese Interaktionen waren eine ziemliche Herausforderung.
00:11:00.01 Also waren wir natürlich größtenteils Zuschauer bei dem Versuch, diese Ereignisse zu verstehen
00:11:05.23 bei molekularer Auflösung.
00:11:08.05 Und was passiert ist, ist, dass Rebecca Voorhees meinem Labor beigetreten ist und Rebecca, wie sich herausstellt,
00:11:14.09 kam aus Venki Ramakrishnans Labor, den Flur runter für mich im MRC Laboratory of Molecular
00:11:19.00 Biologie, und in Venkis Labor hatte Rebecca einen Freund, Israel Fernandez, und Israel. nicht
00:11:25.20 nur interessierte er sich für Strukturen des Ribosoms und so weiter. ebenso wie Venkis Major
00:11:31.00 Interesse, war aber besonders daran interessiert, elektronenmikroskopische Methoden auf
00:11:35.20 diese Probleme.
00:11:37.09 Und so stellt sich heraus, dass das LMB Vorreiter bei der Entwicklung vieler Tools war
00:11:42.23 für hochauflösende Elektronenmikroskopie, und Rebecca, durch ihre Freundschaft mit Israel, behielt
00:11:50.13 von den neuesten Entwicklungen, nicht nur bei der Detektion der EM-Proben, von eingefrorenen hören
00:11:56.16 EM-Samples, aber auch im rechnerischen Aspekt des Wiederzusammensetzens von 3D-Strukturen aus
00:12:02.13 ansonsten sehr verrauschte Bilder.
00:12:05.00 Und so beschloss Rebecca irgendwann, dass sie wirklich lernen wollte, wie man EM macht
00:12:11.10 Kryo-Elektronenmikroskopie zur Auflösung von Strukturen.
00:12:14.21 Also haben wir uns hingesetzt und entschieden, was wir uns zunächst anschauen sollten.
00:12:20.04 Und wir haben uns entschieden, zumindest als Ausgangspunkt zu üben, wie wir
00:12:25.08 die EM nutzen können, wie wir Strukturen zusammenbauen und so weiter, würden wir eigentlich von a ausgehen
00:12:30.20 Quelle, die viele, viele Ribosomen hat, die an dem Prozess beteiligt sind, an dem wir interessiert sind.
00:12:35.13 Dieses EM-Bild, aufgenommen in den 1950er oder 60er Jahren von George Palade, zeigt also die Bauchspeicheldrüse.
00:12:43.16 Und die Bauchspeicheldrüse ist dafür bestimmt, Tonnen und Tonnen von Enzymen abzusondern.
00:12:48.02 Also, was hier passiert, ist, dass fast alle Ribosomen hier mit dem ER verbunden sind
00:12:54.05 Membran und sie sind dabei, Proteine ​​durch diese Membran in das Lumen zu verlagern.
00:13:00.03 Und so dachten wir, nun, wir könnten einfach hier anfangen.
00:13:03.16 Also haben wir die Bauchspeicheldrüse genommen und sie in ER-Mikrosomen umgewandelt, also diese
00:13:10.12 sind jetzt Vesikel, bei denen die Oberfläche dieser Vesikel mit verschiedenen Ribosomen besetzt ist
00:13:15.23, die hoffentlich an der Translokation mit dem Sec61-Komplex beteiligt sind, und wir haben dann solubilisiert
00:13:23.01 diese in mildem Reinigungsmittel, und unser Labor hatte ziemlich viel Erfahrung mit den biochemischen Eigenschaften
00:13:30.01 von Ribosom-Translokon-Interaktionen.
00:13:33.07 Also haben wir die Membranen unter Bedingungen solubilisiert, wo solche Wechselwirkungen
00:13:38.00 wurden beibehalten und dann nur große Partikel isoliert.
00:13:42.06 Denn in diesem Bild sind die Ribosomen, nachdem Sie die Membran losgeworden sind, am größten
00:13:46.23 Komponenten in der Probe vorhanden.
00:13:49.09 Und dann haben wir diese Proben auf ein EM-Gitter aufgetragen, das dann eingefroren wurde.
00:13:54.23 Was Sie also erhalten, ist ein Bild, von dem ich vermute, dass es für Sie sehr schwer zu sehen ist, aber
00:14:01.12 enthält in diesem Bild einzelne ribosomale Partikel.
00:14:06.07 Und dieses Bild ist von Natur aus verrauscht, und das liegt daran. die Dosis der Elektronen
00:14:10.22 verwendet, um den Schaden zu begrenzen, ist es ziemlich niedrig, aber innerhalb dieses verrauschten Bildes des Individuums
00:14:17.17 Ribosomen sind hoffentlich Ribosomen, die in verschiedenen Ausrichtungen gesehen werden.
00:14:23.24 Und was man tun kann – und ich vereinfache hier ein bisschen – ist, dass man es nehmen kann
00:14:28.15 große Anzahl solcher Bilder, wähle daraus einzelne ribosomale Partikel aus und rechnerisch
00:14:36.07 Wenn Sie verschiedene Ansichten dieses Ribosoms haben, rekonstruieren Sie die Struktur
00:14:41.01 muss ausgesehen haben.
00:14:42.20 Wenn also die Partikel heterogen sind, gibt es zusätzliche Methoden zur Trennung
00:14:47.18 die Partikel in verschiedene Unterklassen und rekonstruieren daraus mehrere Strukturen
00:14:52.10 eine Probe.
00:14:53.10 Also, das hat Rebecca gemacht und wir haben dieses Projekt gestartet und dann habe ich nichts gehört
00:14:59.21 für ein paar Monate, und eines Tages kommt Rebecca ins Labor und sie springt buchstäblich
00:15:05.08 rauf und runter, und alles was sie sagt ist "Ich kann Helices sehen!" und ich habe wirklich keine Ahnung was
00:15:10.04 sie redet, aber es stellt sich heraus, dass sie eine erste Rekonstruktion von
00:15:14.16 etwa 80.000 dieser Partikel,
00:15:17.13 und diese Art von Bild konnte sie sehen.
00:15:20.12 Also, wenn Sie wie ich damals waren, war es ein bisschen schwierig, es genau zu verstehen
00:15:26.16 was du dir hier ansiehst, also lass mich dir einfach einen Rundgang geben
00:15:29.21 was diese Struktur darstellt.
00:15:31.20 Und diese Filme, die ich Ihnen zeigen werde, werden von Aaron Lewis, einem Absolventen, ermöglicht
00:15:35.17 Student im Labor, der dir dabei geholfen hat, eine Tour durch die Sache zu machen.
00:15:39.23 Also, was Sie hier sehen, ist eine Rekonstruktion von etwa 80.000 ribosomalen Partikeln aus dem
00:15:46.17 Mikrosomen, und es ist hellblau gefärbt für die große Untereinheit des Ribosoms, gelb
00:15:54.04 für die kleine Untereinheit und der Sec61-Kanal ist rot gefärbt.
00:15:58.06 Und in dieser speziellen Ansicht wäre die Membran genau hier. also geht es richtig
00:16:03.13 durch das Zentrum von Sec61 und vermutlich würde das Protein auf diese Weise translozieren
00:16:11.18 über die Membran.
00:16:13.12 Also drehen wir das Ribosom jetzt so, dass der Sec61 dir sofort zugewandt ist, und der
00:16:20.16 Die Ebene der Membran ist hier im Wesentlichen dort, wo sich der Bildschirm befindet.
00:16:24.20 Und wenn Sie den Sec61 wegschneiden, können Sie sehen, dass er dort sitzt, wo er sein sollte, richtig
00:16:30.01 am Ende des Tunnels im Inneren des Ribosoms, durch den neu synthetisiert wird
00:16:35.12 Proteine ​​entstehen.
00:16:36.18 Sec61 sitzt also genau dort, wo Proteine ​​zuerst aus dem Ribosom kommen.
00:16:41.22 Also, wenn wir es dann auf die andere Seite drehen und die kleine Untereinheit transparent machen, kannst du
00:16:48.04 dann sehen Sie, dass der Eingang zu diesem Tunnel zwischen den beiden Untereinheiten des
00:16:52.19 Ribosom, wo der Peptidyltransfer stattfindet, d. h. neue Peptidbindungen werden gebildet,
00:16:57.17 und das Protein geht dann durch das Zentrum der ribosomalen großen Untereinheit, um am
00:17:02.22 die andere Seite.
00:17:03.23 Wenn wir nun das Ribosom in eine kanonischere Ansicht verwandeln, ist dies die Ansicht, die Sie oft sehen
00:17:08.11 In Lehrbüchern, die Übersetzungen darstellen, würde die mRNA hier hingehen.
00:17:14.00 Es würde sich im Grunde über die kleine Untereinheit schlängeln und Translationsfaktoren würden binden
00:17:20.08 hier drüben.
00:17:21.08 Hier werden also neue tRNAs zum Ribosom gebracht, um sie zu Proteinen zusammenzusetzen.
00:17:27.13 Wir konzentrieren uns jetzt auf den Teil, der uns am meisten interessiert, nämlich den Sec61, und
00:17:33.05 Wenn wir in den Sec61-Komplex hineinzoomen, sehen Sie auch hier die Membran
00:17:38.15 Flugzeug ist. ist, dass einzelne Helices von Sec61 sichtbar sind.
00:17:44.00 Tatsächlich kann man sogar in dieser ersten Rekonstruktion sehen, dass diese spiralförmig aussieht und
00:17:49.16 man sieht sogar die Steigung der Helices.
00:17:52.09 Sie können dann die Dichtekarten schärfen, die zu diesen Bildern führen, und wenn Sie dies tun
00:17:58.04 dass man vom Sec61 eine noch bessere Auflösung bekommt, und das ist es auch. du kannst sehen, ganz einfach
00:18:04.01, um das Rückgrat des Sec61-Komplexes durch diese experimentelle Dichte zu verfolgen.
00:18:10.12 Die Dichte hier wird in Grau angezeigt, und die Spur des Rückgrats, die wir ableiten
00:18:16.12 davon ist rot dargestellt.
00:18:18.17 Also, da bereits strukturelle Informationen aus einem Homolog von Sec61 bekannt sind
00:18:24.15 von Archaeen, abgeleitet von Tom Rapoports Schleife. Gruppe durch Röntgenkristallographie, it
00:18:29.24 war es möglich, ein Modell des Sec61-Komplexes aus dem des Säugetierkomplexes zu konstruieren.
00:18:36.12 Außerdem war die Auflösung, wenn man sich das Ribosom selbst anschaut, absolut umwerfend.
00:18:41.15 Sie können hier also sehen, dass die Seitenketten verschiedener Teile des Ribosoms leicht sind
00:18:47.04 passte in die Dichte, die wiederum in diesem grauen Netz dargestellt wird.
00:18:51.09 Und so arbeitete Israel, dessen Interesse am Ribosom lag, mit Rebecca zusammen, um
00:18:56.19 bauen ein atomares Modell des Ribosoms, das sich als das erste sehr hochauflösende herausstellte
00:19:01.16 Atommodell des Säugetierribosoms, und zusammen konstruierten sie ein Atommodell
00:19:07.05 des Säugetierribosoms und des Sec61-Komplexes.
00:19:11.20 Und so stellte sich heraus, dass dieser Ribosomen-Sec61-Komplex hauptsächlich leer war, also war er es nicht
00:19:18.18 eigentlich alles zu übersetzen, und das ist wahrscheinlich meine Schuld, denn es war
00:19:24.10 nur ein Übungsbeispiel.
00:19:26.06 Die Probe, die wir analysiert haben, wurde tatsächlich aus Mikrosomen hergestellt, die ich gemacht habe, als ich war
00:19:33.00 ein Student vor ungefähr 20 Jahren.
00:19:35.19 Und so ziemlich sicher alle. Teil der Proteine, die synthetisiert wurden
00:19:40.00 als diese Bauchspeicheldrüse zum ersten Mal geerntet wurde, war längst hydrolysiert und verschwunden.
00:19:45.06 Aber dennoch sagte uns dies, dass es möglich war, auf atomarer Ebene zu sehen
00:19:51.11 oder Details mit nahezu atomarer Auflösung nicht nur des Ribosoms, sondern auch des Sec61-Komplexes.
00:19:58.10 Also konnten wir uns dann anderen Problemen zuwenden.
00:20:02.01 Und im. in der Folgezeit seit dieser ursprünglichen Struktur haben wir und andere
00:20:08.08 haben solche Methoden verwendet, um Zwischenstufen in der Übersetzung und Zwischenstufen in der Qualitätskontrolle zu untersuchen
00:20:14.22 Prozesse am Ribosom, oder was uns hier interessiert, für diesen Vortrag, Zwischenprodukte im
00:20:20.21 Translokationsprozess.
00:20:22.23 Die Frage, die wir versuchen zu beantworten, lautet also, was genau diese Zwischenprodukte bewirken.
00:20:29.08 wenn ich kurz zurückgehen kann. interagieren diese Zwischenstufen des SRP mit
00:20:35.14 das Signal oder Sec61, die mit dem Signal interagiert, aussehen?
00:20:39.12 Und idealerweise wünscht man sich eine Struktur vor und nach dem Erkennen des Signals
00:20:46.05 in jedem Fall, so dass Sie hoffen können, die Art von Konformationsänderungen abzuleiten, die möglicherweise
00:20:50.24 auftreten, die eine spezifische Erkennung ermöglichen.
00:20:55.00 Dazu haben wir eine Probe mit In-vitro-Translation generiert.
00:21:01.12 Und hier ist die Idee, dass Sie natürlich in einem In-vitro-Lysat, also diesem Lysat,
00:21:07.03 besteht aus einem Zytosol, das alle Faktoren für die Translation enthält, mit denen Sie
00:21:12.16 kann eine spezifische mRNA programmieren, die es Ihnen ermöglicht, einige interessierende Proteine ​​zu synthetisieren.
00:21:18.16 Also haben wir ein Protein entworfen und erzeugt, das eine hydrophobe Sequenz enthält, die
00:21:24.12 wir glauben, dass es von SRP erkannt werden sollte und von diesem Weg angesteuert wird, und dann haben wir modifiziert
00:21:30.14 das System wie folgt.
00:21:32.19 Zuerst haben wir eine verkürzte mRNA verwendet, die es dem Ribosom ermöglicht, an einen Punkt zu gelangen, an dem die hydrophobe
00:21:41.10 Sequenz ist aus dem Ribosom gekommen, bleibt aber über die letzte tRNA angehängt, weil
00:21:48.15 das Ribosom, damit. ohne weitere mRNA zu übersetzen, bleibt am Ende stehen
00:21:53.08 ganz am Ende dieser mRNA.
00:21:55.11 Sie haben also ein exponiertes Signal und das würde endogenes SRP rekrutieren.
00:22:01.18 Wir sehen uns also ein endogenes Ribosom an, das nur im Zytosol vorhanden ist.
00:22:08.11, die endogenes SRP aus derselben Probe rekrutiert.
00:22:12.15 Das sind sie also. das sind native Komplexe und das einzige was wir gemacht haben ist konstruiert
00:22:17.06 es mit einem Protein, das ein exponiertes Signal hat, und einer weiteren Konstruktion eines Affinitäts-Tags
00:22:23.09 am N-Terminus, damit wir das gezielt herausfischen können.
00:22:28.08 Wir haben dann eine Parallelprobe hergestellt, in der die hydrophobe Sequenz in diesem Fall vergraben ist
00:22:34.14 im Ribosom.
00:22:36.06 Und der Grund dafür war, dass es frühere experimentelle Arbeiten gab, die darauf hindeuteten
00:22:42.03 Wenn sich hydrophobe Sequenzen im Ribosom befinden, kann SRP durch Mechanismen, die wir nicht kennen
00:22:47.24 verstehen, für diese Ribosomen rekrutiert werden.
00:22:51.04 Und wir haben überprüft, dass dies im Säugetiersystem tatsächlich der Fall ist, und das erlaubte
00:22:55.18 Wir müssen ein Sample haben, bevor das Signal erkannt wird, und ein Sample, nachdem das Signal erkannt wird.
00:23:02.24 Und durch den Vergleich dieser beiden Beispiele werden Sie sehen, dass wir versuchen können, die Natur abzuleiten
00:23:07.13 dieser Interaktion.
00:23:09.20 So kann man dann mit den gleichen EM-Methoden ein Bild rekonstruieren. was das Ribosom-SRP
00:23:17.17 Komplex sieht aus, und ich gebe Ihnen noch einmal eine kurze Tour, wie das aussieht.
00:23:21.23 wie diese Struktur aussieht.
00:23:24.00 Also, ganz ähnlich wie zuvor gefärbt, ist die große Untereinheit hier hellblau, und die
00:23:28.21 kleine Untereinheit des Ribosoms in Gelb und SRP ist in Grün.
00:23:33.12 Und Sie können sehen, dass sich SRP um einen Großteil der großen Untereinheit schlängelt, wobei ein Teil davon sitzt
00:23:38.16 an der Schnittstelle zwischen den Untereinheiten, hier, und Sie können möglicherweise tief im Inneren des Ribosoms sehen,
00:23:44.19 eine tRNA.
00:23:46.01 Und das liegt daran, dass dieses Ribosom unser interessierendes Protein übersetzen sollte.
00:23:52.06 Und wenn. das ist tatsächlich der Fall, denn wenn man die kleine Untereinheit transparent macht
00:23:56.07 Sie können dann sehen, dass es eine tRNA, hier in Lila, an der P-Stelle des Ribosoms gibt.
00:24:02.18 Und diese tRNA, wenn wir das jetzt ein bisschen umdrehen und die große Untereinheit transparent machen,
00:24:09.15 endet mit einem Peptid.
00:24:14.08 Und dieses Peptid geht durch den Tunnel im Ribosom und es wird ein wenig
00:24:20.12 etwas schwerer zu sehen am Ende des Tunnels, weil der Tunnel dort etwas breiter wird,
00:24:24.22, aber wenn wir dann auf den Teil von SRP zoomen, der das Signalpeptid binden sollte,
00:24:30.03 können wir das sehen. Sie können dort auch einen Teil der entstehenden Kette sehen, hier in gezeigt.
00:24:34.17 in Blau.
00:24:35.20 Die Region von SRP, die hier das Signalpeptid bindet, wird also als M-Domäne bezeichnet.
00:24:44.00 und die M-Domäne isoliert – oder zumindest der größte Teil der M-Domäne isoliert – wurde
00:24:49.06 früher mit kristallographischen Methoden untersucht.
00:24:51.19 Es gibt also hochauflösende Strukturen der M-Domäne von verschiedenen Arten und das ist
00:24:57.10 was lässt uns wissen, dass die M-Domäne so aussieht und dass dies extra ist
00:25:02.02 Dichte für das Signalpeptid.
00:25:03.22 Schauen wir uns also genau diese Region genauer an.
00:25:06.08 Und noch einmal zur Orientierung, das Protein, das aus dem Ribosom kommt, kommt genau hier heraus,
00:25:12.24 und so sitzt die M-Domäne, die das Signal bindet, direkt an der Mündung des ribosomalen Ausgangs
00:25:17.19 Tunnel bereit, das Signal zu erfassen.
00:25:20.12 Also, hier ist die gleiche Ansicht, die Sie zuvor gesehen haben, und was grün dargestellt ist, ist die Röntgenstruktur
00:25:27.05 der menschlichen SRP-M-Domäne, und Sie können sehen, dass sie ziemlich in die experimentelle Dichte passt
00:25:34.09 schön, und dass es im Zentrum dieser Klaue zusätzliche Dichte gibt.
00:25:38.24 Also. Also sieht die M-Domäne ungefähr so ​​aus, und in der Mitte ist etwas mehr
00:25:44.20 Dichte, die wir dem Signal in unserem Sample zuordnen können.
00:25:50.08 Zusätzlich zu dieser zusätzlichen Dichte sahen wir zwei weitere Dichtestücke, die wir nicht konnten
00:25:54.11 berücksichtigen, und diese sind mit C1 und C2 gekennzeichnet.
00:25:58.00 Und der Grund, warum wir sie C1 und C2 genannt haben, ist, dass in diesen Röntgenstrukturen der
00:26:03.03 M-Domäne, der C-Terminus war immer abgeschnitten.
00:26:06.24 Und das liegt daran, dass der C-Terminus die Kristallisation irgendwie zu stören scheint,
00:26:11.13 und so wurden diese entfernt, und weil wir diese im bekannten Röntgenbild nicht erklären konnten
00:26:16.12 Struktur und das war zusätzliche Dichte, wir haben diese der
00:26:20.16 C-terminale Regionen der SRP54 M-Domäne.
00:26:24.22 Nun, diese C-terminalen Regionen standen nicht wirklich im Fokus, weil
00:26:31.24 sie sind in der Regel nicht besonders gut erhalten.
00:26:34.14 Bei genauerem Hinsehen stellt sich jedoch heraus, dass es immer eine C-terminale Helix gibt
00:26:40.08 oder bei Säugetieren zwei Helices, und obwohl die genaue Reihenfolge nicht unbedingt ist
00:26:46.14 gut konserviert stellt sich heraus, dass diese Helices immer amphipathisch sind und was man meint
00:26:52.02 von amphipathisch ist, dass sie eine Helix bilden, so dass eine Oberfläche der Helix hydrophob ist
00:26:57.16 und die andere Oberfläche ist hydrophil.
00:27:00.09 Und wir haben uns vorgestellt, dass diese Helices, weil das Signal hydrophob ist,
00:27:06.02 sitzen hier wahrscheinlich so, dass die hydrophobe Oberfläche dem Signal zugewandt ist,
00:27:12.04 und die hydrophile Oberfläche ist dem wässrigen Lösungsmittel und dem Ribosom auf der anderen Seite zugewandt.
00:27:17.11 Wir denken also, dass diese SRP54 M-Domäne die Wiege der
00:27:26.00 Signalpeptid, genau in der Mitte hier, und dass es im Wesentlichen von dem bedeckt ist
00:27:31.07 entspricht einem Deckel, der von diesen beiden Helices gebildet wird.
00:27:35.00 Und was ist. das Farbschema hier ist gelb ist hydrophob und blau oder lila
00:27:41.09 ist hydrophil, und das sieht man. dass der Satz. das äh. der zentrale Hohlraum
00:27:47.04 dieser Klaue ist sehr hydrophob, was der Fähigkeit entspricht, ein Signalpeptid zu binden.
00:27:53.09 Wie sieht die Struktur also aus, bevor das Signal eingeschaltet wird?
00:27:59.18 Und hier, ganz oben, ist das die Struktur, die ich dir gerade gezeigt habe fast
00:28:05.00 die gleiche Ansicht -- da ist das Signal, da, und dann sind das die beiden Helices, C1 und
00:28:11.04 C2, die einen Deckel über dem bilden. das Signal -- und dann, wenn man sich den anderen Komplex anschaut,
00:28:17.22 hier hatten wir zunächst, vielleicht naiv, erwartet, dass die Dichte verschwinden würde
00:28:24.08 zwischen hier und hier wäre natürlich die Dichte für das Signal.
00:28:28.05 Und das liegt daran, dass das Signal hier noch im Ribosom ist.
00:28:31.24 Aber tatsächlich fehlt hier die Dichte, wo früher Helix C2 war.
00:28:38.12 Und nach kurzem Nachdenken wurde uns klar, was eindeutig passiert sein muss, wenn
00:28:43.08 Sie haben die zentrale hydrophobe Höhle dieser Klaue in dieser Struktur unbesetzt, die
00:28:49.18 amphipathische Helix C2 bewegt sich einfach hinein und besetzt diese Klaue.
00:28:55.07 Und denken Sie noch einmal daran, dass amphipathisch bedeutet, dass eine Oberfläche davon hydrophob ist, was
00:29:00.15 würde sehr gut zur hydrophoben Oberfläche dieses Hohlraums passen.
00:29:04.11 Wir glauben also, dass, wenn ein Signalpeptid nicht gebunden ist, die Stelle, an der
00:29:10.05 Das Signalpeptid, das binden wird, ist mit einem Platzhalter besetzt.
00:29:15.13 Also, hier ist ein Bild davon, was unserer Meinung nach in Bezug auf die beiden Konformationen vor sich geht.
00:29:22.22 Also, in dem Zustand, in dem das Signalpeptid nicht gebunden ist, hier ist die Struktur davon
00:29:29.05 Teil der M-Domäne, und in der Höhle dieser M-Domäne sitzt ein Platzhalter.
00:29:35.12 Und irgendwann, wenn das Signalpeptid bindet, rückt dieser Platzhalter aus dem Weg
00:29:40.11 und das Signal sitzt hier, und dieser Platzhalter dient nun als Deckel zu diesem Hohlraum.
00:29:45.24 Was das bewirkt, ist also das Signal, das hydrophob und anfällig ist
00:29:50.16 zu Aggregation oder unangemessenen Wechselwirkungen, ist vollständig gegen die Hydrophilie abgeschirmt
00:29:57,15 und wässriges Lösungsmittel.
00:29:59.14 Also, wenn wir dann einen Schritt zurücktreten und schauen, wie das in die Gesamtfunktion von passt
00:30:05.01 SRP, Sie stellen sich vor, dass Ribosomen dabei sind, ein Protein zu übersetzen
00:30:10.14 werden wahrscheinlich ab und zu von SRP gesampelt, und obwohl wir es nicht verstehen
00:30:16.19 Wir glauben, dass SRP an Ribosomen rekrutiert werden kann, wenn diese mit der Synthese beginnen
00:30:23.21 eine hydrophobe Domäne.
00:30:25.11 Also, wenn ein signifikanter Teil der hydrophoben Domäne synthetisiert wurde, aber immer noch
00:30:30.15 im ribosomalen Tunnel wird SRP zu diesen Ribosomen rekrutiert.
00:30:36.15 Und was passiert im Detail in der Region, in der das Signal erkannt werden soll
00:30:42.08 ist, dass dieser amphipathische Platzhalter, der genau hier sitzt, wahrscheinlich dynamisch kommt
00:30:48.19 in und aus dieser Stelle.
00:30:51.06 Und das entstehende Protein, das vom Ribosom synthetisiert wird, passiert direkt vorn
00:30:55.12 davon, richtig. genau hier.
00:30:57.17 Die Idee ist also, dass die Sequenzen des entstehenden Proteins, wenn sie hydrophil sind,
00:31:04.03 diese hydrophobe Rille und damit diesen amphipathischen Platzhalter nicht besetzen können
00:31:10.02 würde dort bleiben.
00:31:11.05 Aber irgendwann ist die Sequenz, die aus dem Ribosom kommt, ausreichend hydrophob
00:31:16.24 dass das SRP passieren wird. die im Grunde gewartet hat
00:31:22.09 dort, wird jetzt das Signal, das hier blau angezeigt wird, und dieser Platzhalter binden
00:31:27.20 wird verschoben.
00:31:29.16 Die Idee ist also, nur Signale zu verwenden, die ausreichend hydrophob sind, um effizient zu sein
00:31:35.13 und stabil verschieben, dass dieser Platzhalter von SRP erkannt wird.
00:31:39.22 Und ab diesem Zeitpunkt ist das Signal abgeschirmt und dieser Komplex würde an die Oberfläche gebracht
00:31:45.11 der Notaufnahme, wo Sie ein erfolgreiches Targeting erhalten würden.
00:31:49.16 Also, der nächste Schritt ist natürlich, nachdem du in der Notaufnahme angekommen bist, musst du diese Translokation finden
00:31:55.22 Kanal und im Idealfall haben Sie das Signal – wenn es ein echtes Bona-Fide-Signal ist – öffnen Sie das
00:32:01.21 Translokationskanal.
00:32:02.24 Also, wie passiert das?
00:32:04.10 Wenn wir uns also die Schritte ansehen, die erforderlich wären, um einen solchen Kanal zu öffnen,
00:32:10.04 Wenn nichts passiert, befindet sich der Sec61-Kanal im Ruhezustand, und dann
00:32:16.06 ist es. Aufgrund biochemischer Daten wird seit langem spekuliert, dass beim ersten Eintreffen
00:32:21.09 am Kanal und das Ribosom bindet, dass es eine Art Priming-Reaktion gibt, und
00:32:27.18, dass diese Priming-Reaktion als eine subtile Konformationsänderung in Sec61 nachgewiesen werden kann,
00:32:32.24, aber es ist nicht ganz klar, was diese Änderung ist, und diese Priming-Reaktion wird angenommen
00:32:37.18 bereiten es irgendwie darauf vor, von dem Signalpeptid angegriffen zu werden.
00:32:41.17 Um diese Abfolge von Ereignissen zu verstehen, möchten Sie idealerweise strukturelle Informationen
00:32:46.11 für jeden dieser drei Schritte.
00:32:48.17 Nun, diesen Ruhezustand – und das habe ich vorhin kurz erwähnt – kann man aus
00:32:53.22 wirklich eine bahnbrechende Struktur, die durch Röntgenkristallographie des Homologs des Sec61 erstellt wurde
00:32:59.18 Kanal namens SecY-Kanal, abgeleitet von Archaeen, und das wurde von Tom Rapoport gemacht
00:33:05.18 Labor vor einigen Jahren.
00:33:07.21 Der vorbereitete Zustand. man kann wahrscheinlich eine vernünftige Schätzung aus unserer Struktur von
00:33:13.08 ein leeres Ribosom an Sec61 gebunden, denn so würde es vermutlich aussehen
00:33:18.09 wenn ein Ribosom zum ersten Mal ankommt und die entstehende Kette und das Signalpeptid nicht miteinander verbunden sind
00:33:23.24 den Kanal noch.
00:33:25.01 Also bleibt uns dieser besetzte Kanal.
00:33:27.12 Wie bereiten wir das vor?
00:33:29.22 Also, wenn du aufgepasst hast, kann man vermutlich die gleichen Methoden anwenden wie wir
00:33:34.10 verwendet, um Zwischenstufen in SRP-Komplexen zu erzeugen, um auf ähnliche Weise diese eingebundene Struktur zu erzeugen.
00:33:42.00 Also wenden wir uns wieder unserem In-vitro-System zu, wo wir es mit einer Nachricht programmieren können, die
00:33:47.24 Codes für transloziertes Protein.
00:33:51.11 Und hier haben wir das Protein Prolaktin verwendet, und das ist ein extrem gut untersuchtes Protein
00:33:56.16 und ein beträchtlicher Teil der Biochemie auf diesem Gebiet hat sich speziell etabliert
00:34:01.21 welcher Schritt während seiner Übersetzung den Sec61-Kanal aktiviert.
00:34:07.00 Wir könnten also all diese angehäuften Informationen ausnutzen und uns ein Zwischenprodukt ansehen, in dem das Signal
00:34:13.04 scheint den Sec61-Kanal stabil und signifikant aktiviert zu haben.
00:34:21.05 Und dann haben wir eine Version davon gemacht, die ein Epitop-Tag auf einem flexiblen hatte
00:34:25.21 Linker, damit wir ihn reinigen konnten, und wir haben dann solche Komplexe in Detergens solubilisiert,
00:34:32.05 über dieses Epitop-Tag gereinigt und dann eine dreidimensionale Struktur rekonstruiert.
00:34:39.02 Und wieder ist die kleine Untereinheit gelb, die große Untereinheit hellblau, die tRNA,
00:34:44.21, das Sie jetzt sehen können, weil dies gerade dabei ist, ein Protein zu übersetzen, ist in Lila,
00:34:50.04 und Sec61 ist hier oben in Rot.
00:34:53.19 Wenn Sie also die Dichte für den Sec61-Komplex vergrößern und alle
00:34:59.08 Helices, die den Sec61-Komplex selbst umfassen, it. es gab hier eine dichte, die aussah wie
00:35:04.24 eine zusätzliche Helix, die wir nicht erklären konnten.
00:35:08.00 Und das macht absolut Sinn, denn jetzt sollte dieser Sec61-Komplex von einem
00:35:13.16 Signalpeptid und wir denken, dass diese Helix dafür steht.
00:35:17.07 Und noch einmal, wenn man das nachschärft. Diese Dichtekarten können Sie tatsächlich sehen,
00:35:22.03 in vielen der guten Bereiche von Sec61 kann man das Rückgrat und viele davon getrost platzieren
00:35:28.01 die Seitenketten des Sec61-Komplexes.
00:35:31.11 Und so können wir diese Informationen dann verwenden, um ein atomares Modell des Sec61-Komplexes zu konstruieren
00:35:39.08 beschäftigt mit dieser zusätzlichen Helix. Helixdichte, die wir dann einem Signalpeptid zuordnen können.
00:35:45.11 Mit dieser Struktur haben wir also Momentaufnahmen des Ruhezustands, dieses vorbereiteten Zustands,
00:35:53.10, wenn das Ribosom zum ersten Mal ankommt, und dieser aktivierte Zustand etwas später, wenn
00:35:57.19 ein Signalpeptid hat an den Sec61-Komplex gebunden.
00:36:01.07 Was wir also tun können, ist, diese drei Zustände zu vergleichen und zu versuchen, zumindest einige abzuleiten
00:36:06.10 Informationen darüber, wie ein Signal erkannt werden könnte.
00:36:09.17 Also, es gibt eine riesige Menge an Informationen in diesen Strukturen, aber ich werde mich nur konzentrieren
00:36:14.00 über ein paar sehr spezifische Änderungen.
00:36:17.16 Zuerst ist es also wichtig, eine Vorstellung davon zu bekommen, was der Ruhezustand ist, der Start
00:36:23.23 Punkt, der Kanal sieht wahrscheinlich aus wie aus der Röntgenstruktur des Rapaport-Labors.
00:36:29.06 Diese Strukturen können also ähm sein. etwas verwirrend anzusehen, wenn man es nicht gewohnt ist anzuschauen
00:36:34.07, aber in einer vereinfachten Version kann man es sich als Zylinder vorstellen, der eine Naht hat
00:36:40.16 Mitte, die hier in Orange und Lavendel gezeigt wird, und die Helices, die diese Naht bilden
00:36:48.08 sind hier in der ähnlich eingefärbt. im Aufbau.
00:36:52.00 Und die Idee dieser Naht ist, dass sie ein seitliches Tor ist.
00:36:55.08 Also, hier ist die Ebene der Membran, und die Idee ist, dass sich diese Naht in der richtigen Reihenfolge trennen könnte
00:37:01.13, damit Proteine ​​in die Lipiddoppelschicht eindringen können.
00:37:05.09 Außerdem, und zwar nicht hier, aber im Cartoon, in der Mitte von
00:37:09.18 dieser Kanal ist ein Plug, denn wenn nichts passiert, sollte der Kanal natürlich
00:37:14.08 geschlossen sein.
00:37:15.20 Und so gibt es in der Mitte einen Stopfen, der den Kanal geschlossen hält und eine Naht, die sich öffnen könnte
00:37:21.17, um Proteinen das Eindringen in die Lipiddoppelschicht zu ermöglichen.
00:37:24.12 Um die Übersichtlichkeit zu verbessern, werde ich alles außer entfernen
00:37:29.20 für die Helices des seitlichen Tors, okay?
00:37:33.20 Und dann können wir fragen, was mit dieser Region des Sec61-Kanals passiert
00:37:39.04 wenn ein Ribosom bindet?
00:37:41.01 Das ist also gezeigt. oh, ich habe vergessen zu erwähnen, dies ist eine Ansicht des Steckers, der senkrecht schaut
00:37:47.02 durch die Membran.
00:37:48.13 Okay.
00:37:49.13 Folgendes passiert also, wenn wir den Ruhezustand des Kanals hier mit dem vergleichen
00:37:56.10 Zustand, wenn das Ribosom bindet, aber das Signalpeptid noch nicht da ist.
00:38:01.03 Und was Sie in Grau sehen können, ist die Ruhestruktur im Vergleich zu der. das. der grundierte
00:38:07.16 Zustand, wenn das Ribosom bindet.
00:38:09.22 Und was man sieht ist, dass sich diese Helices des seitlichen Tors ganz leicht bewegt haben.
00:38:15.16 Und was passiert zu sein scheint, ist, dass die orangefarbene Hälfte des Translocons ist, was es ist
00:38:19.22 bindet das Ribosom, bleibt relativ zur anderen Hälfte fixiert.
00:38:25.15 Also ist dieses seitliche Tor ganz leicht geknackt.
00:38:30.03 Und ich sollte betonen, dass solche kleinen Änderungen eigentlich ziemlich schwer zu überzeugen wären
00:38:34.19 von, es sei denn natürlich reicht die Auflösung der Strukturen aus, um darauf vertrauen zu können
00:38:40.10 die Änderung ungefähr des Durchmessers einer Helix ist eine zuverlässige Änderung.
00:38:45.17 Was wir also sehen können ist das seitliche Tor, relativ zu diesem Zustand, wo es ist.
00:38:50.02 wo es versiegelt ist, ist jetzt teilweise geknackt.
00:38:53.14 Es hat jetzt keine nennenswerten Risse und der Stopfen im Kanal bleibt dort, also
00:39:00.12 der Kanal ist noch geschlossen.
00:39:02.19 Wir stellen uns also vor, dass dies der Zustand ist, in dem das Signal zum ersten Mal am ankommt
00:39:08.22 Sec61-Kanal.
00:39:10.07 Die Frage ist also, was passiert als nächstes?
00:39:13.24 Also verschieben wir das hier und das ist die Struktur, an die das Signal gebunden ist, und die
00:39:17.24 Signal wird jetzt in Türkis angezeigt.
00:39:20.20 Und so. was hier passiert ist, ist, dass sich das seitliche Tor weiter auseinander bewegt hat und die
00:39:25.24 Signal nimmt nun eine Position zwischen diesen Helices des seitlichen Tors ein.
00:39:30.18 Also, das ist hier in diesem Diagramm dargestellt, wo das seitliche Tor wieder weiter auseinander liegt als
00:39:35.22 in diesem vorbereiteten Zustand.
00:39:38.09 Und nun passiert, weil das seitliche Tor weiter auseinander gerückt ist, der Kanal
00:39:45.06 öffnet tatsächlich.
00:39:47.01 Und ich werde Ihnen diese Teile der Struktur nicht zeigen, aber im Wesentlichen, wenn die
00:39:51.03 Das seitliche Tor bewegt sich auseinander, die innere Öffnung im Kanal, tief im Kanal, bewegt sich.
00:39:57.08 wird es etwas breiter.
00:39:59.20 Und es gibt eine Reihe von Aminosäuren, die sich an der Einschnürungsstelle befinden, und dort ist es
00:40:05.22 Der Stopfen scheint zu sitzen. Wenn diese Einschnürungsstelle breiter wird, scheint der Stopfen nicht zu sein
00:40:11.20 haben länger eine stabile Bindungsposition und werden daher ungeordnet, und so denken wir
00:40:17.01 dass das Einschalten des Signals mit dem Öffnen des Kanals gekoppelt ist
00:40:22.22 im Säugetier-Translokationsweg.
00:40:26.05 Und das macht natürlich Sinn, weil man den Kanal nicht öffnen möchte, es sei denn
00:40:30.23 Sie haben festgestellt, dass das Substrat, das aus dem Ribosom kommt, ein Protein ist, das
00:40:35.22 Sie wollen sich eigentlich über die Membran bewegen.
00:40:38.11 Schauen wir uns also an, was diese Bewegungen en. mit sich bringen.
00:40:43.23 Also wieder der orange Teil, hier diese Hälfte des Translokons, wie hier abgebildet.
00:40:50.04 in diesem Diagramm ist der Teil, der das Ribosom bindet.
00:40:53.08 Also, wir werden das einfach festhalten und fragen, wie die andere Hälfte des Moleküls funktioniert
00:40:59.22 relativ dazu verschieben?
00:41:02.00 Und was Sie sehen können, und ich zeige Ihnen nur einen Teil der Struktur, ist das
00:41:05.22 im Ruhezustand ist diese Helix – es ist eine Helix namens Helix 2 – sehr eng
00:41:12.02 neben diesen orangefarbenen Helices des seitlichen Tors.
00:41:15.23 Und dann, während des Primings, wenn der Kanal noch frei ist, aber noch nicht belegt ist,
00:41:22.10 diese Helix bewegt sich ganz leicht, um das seitliche Tor zu knacken, und dann bewegt sie sich weiter
00:41:26.24 auseinander während des aktivierten Zustands.
00:41:29.13 Das ist in einem Film vielleicht einfacher zu sehen, aber. die ich dir in nur zeige
00:41:34,15 pro Minute, aber die Frage ist, wo ist die Signalbindung relativ zu diesen spezifischen Zuständen?
00:41:42.14 Und das Bemerkenswerte ist, dass, wenn man das Signal diesen Zuständen überlagert, das Signal endgültig ist
00:41:49.12 Die Position ist der Stelle, an der diese Helix 2 ursprünglich begann, sehr ähnlich.
00:41:55.22 Und das bedeutet Helix 2, deren Aufgabe im Ruhezustand darin besteht, Wechselwirkungen zu bilden
00:42:01.07 mit der anderen Hälfte des seitlichen Tors, um das Tor geschlossen zu halten, wird jetzt durch a ersetzt
00:42:07.22 Signalpeptid, das sehr ähnliche Wechselwirkungen zu bilden scheint.
00:42:12.00 Und die Folge davon ist, dass nur Sequenzen stabiler sind oder besser ersetzen können
00:42:18.23 Diese Interaktionen als die Starthelix 2 werden Helix 2 erfolgreich in der Reihenfolge verdrängen
00:42:25.12, um an dieser Position zu binden.
00:42:27.23 Das erinnert in vielerlei Hinsicht an das, was mit der SRP passiert, wie Sie gleich sehen werden.
00:42:35.23 Also, hier ist die Idee, dass Helix 2 in gewisser Weise wie ein Platzhalter ist,
00:42:42.19 weil dort die. das Signal wird schließlich binden und wenn das Signal angezeigt wird
00:42:47.13, diese Hälfte des Moleküls dreht sich weg und das Signal nimmt diese Position ein
00:42:54.15 wo früher Helix 2 war.
00:42:57.10 Im Fall von SRP ist der Ort, an dem das Signal schließlich gebunden wird, tatsächlich
00:43:04.22 in diesem Zustand besetzt, also gibt es einen amphipathischen Platzhalter, der dort sitzt, und wann
00:43:09.16 das Signal kommt aus dem Ribosom, dieser Platzhalter wandert aus dem Weg und das Signal
00:43:15.11 bindet in dieser Position.
00:43:16.21 Also, warum ist das so. also gut, die. Lassen Sie mich zuerst sagen, dass es etwas interessant ist
00:43:22.17 und ziemlich überraschend, dass der Erkennungsmechanismus in diesen beiden sehr unterschiedlichen Molekülen
00:43:27.20 ist in gewisser Weise analog.
00:43:31.04 Offensichtlich sind die molekularen Details alle sehr unterschiedlich, aber diese Idee, dass das Signal sich windet
00:43:37.04 bis Bindung an einer Position, um eine Reihe von Wechselwirkungen zu übernehmen, die von einem intramolekularen
00:43:45.04 Platzhalter, ist beiden Systemen gemeinsam.
00:43:47.19 Also, was wäre der Vorteil davon?
00:43:50.19 Dazu ist es sinnvoll, zur ursprünglichen Frage zurückzukehren: Wie funktioniert molekulares
00:43:56.11 Funktioniert die Signalerkennung bei einer unglaublichen Substratvielfalt?
00:44:02.02 Die Anzahl der Proteine, die von diesen beiden Faktoren erkannt werden müssen, ist also buchstäblich
00:44:06.18 zu Tausenden.
00:44:08.04 Und diese Proteine ​​sind alle sehr unterschiedlich, also die ganz typischen molekularen
00:44:12.11 die Erkennung einer Reihe sehr spezifischer Interaktionen, wie beispielsweise eines Schlosses und eines Schlüssels, scheint nicht zu sein
00:44:17.21 hier möglich.
00:44:19.10 Was also zu passieren scheint, sind in beiden Fällen intramolekulare Platzhalter.
00:44:27.16 und was diese Platzhalter zu tun scheinen, ist, dass sie eine Gesamtschwelle für Interaktionen festlegen
00:44:33.02 die überwunden werden muss, um ein Signal als tatsächliches Signal erkennen zu können.
00:44:39.07 Und es gibt zwei unabhängige Parametersätze, einen, der von SRP und seinem Platzhalter festgelegt wird.
00:44:45.06 und ein anderes, das von Sec61 und seinem Platzhalter gesetzt wird, und weil diese beiden Sets
00:44:50.04 der Parameter sind in gewisser Weise ähnlich – offensichtlich brauchen beide hydrophobe Signale, um zu wirken
00:44:56.18 - sie werden sich dennoch in den molekularen Details unterscheiden.
00:45:01.05 Die Idee ist also, dass durch zwei leicht unterschiedliche Parametersätze die Gesamt
00:45:06.08 Treue ist das, was durch beide Tore erlaubt ist, wird dann erhöht.
00:45:12.17 Auf diese Weise können Sie eine sehr breite Palette von Sequenzen erhalten, die sehr wenig Ähnlichkeit haben
00:45:19.01 aneinander in Bezug auf den eigentlichen Ablauf dennoch zu erkennen, weil sie beide
00:45:24.20 diese Schwellen überschreiten, die von der Erkennungsmaschinerie gesetzt werden,
00:45:28.23 sowohl von SRP als auch von Sec61.
00:45:32.16 Damit möchte ich zum Schluss einfach anerkennen, dass ich eine tolle Gruppe hatte
00:45:38.19 der Leute, mit denen ich in den letzten Jahren zusammengearbeitet habe, nicht nur die Leute in meinem Labor, sondern
00:45:44.13 Kollegen, zuerst bei den National Institutes of Health, wo ich viele Jahre war und
00:45:48.05 jetzt im MRC Laboratory of Molecular Biology.
00:45:51.12 Und natürlich wurde die Arbeit, über die ich hier gesprochen habe, von Rebecca Voorhees ausgeführt,
00:45:56.08, der den strukturellen Ansatz für dieses Problem wirklich vorangetrieben hat.
00:45:59.22 Und Rebecca ist jetzt auf dem Weg zum Caltech.
00:46:02.22 Die Filme, die ich gezeigt habe, wurden von Aaron Lewis gemacht, der hier gezeigt wird.
00:46:06,15 Sekunden von links.
00:46:08.04 Danke fürs Zuhören.

  • Teil 1: Kompartimentierung von Proteinen in Zellen

Nachweis von Proteininteraktionen durch subzellulären Lokalisierungsassay

Korrespondenz mit: Maria-Magdalena Mocanu, Institut für Biophysik, Universität für Medizin und Pharmazie „Carol Davila“, Bukarest 050474, Rumänien. E-Mail: [email protected] Nach weiteren Artikeln dieses Autors suchen

Institut für Biophysik und Zellbiologie, Medizinische Fakultät, Universität Debrecen, Debrecen, 4032 Ungarn

Institut für Biophysik und Zellbiologie, Medizinische Fakultät, Universität Debrecen, Debrecen, 4032 Ungarn

MTA-DE Cell Biology and Signaling Research Group, Medizinische Fakultät, Universität Debrecen, Debrecen, 4032 Ungarn

Institut für Biophysik, Universität für Medizin und Pharmazie „Carol Davila“, Bukarest, 050474 Rumänien

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Mehrere Techniken wurden entwickelt, um Proteinassoziation oder -interaktionen zu untersuchen, wie Co-Immunpräzipitation, Co-Lokalisierung, Fluoreszenz-Resonanz-Transfer-Energie (FRET) oder Hefe-Zwei-Hybrid-System 1 . Dennoch hat jede der oben genannten Techniken ihre Vor- und Nachteile. Von Patienten stammende Gewebeproben sind einzigartig, da sie nicht durch exogene Expression oder Überexpression genetisch veränderter Proteine ​​modifiziert werden können und typischerweise eine hohe Hintergrundfluoreszenzintensität aufweisen 1, 2 . Um all diese Hindernisse zu umgehen, entwickelte eine schwedische Forschungsgruppe den Proximity Ligation Assay (PLA), ein proteomisches Werkzeug, das die Visualisierung von Proteininteraktionen und deren posttranslationalen Modifikationen mit hoher Sensitivität mit Hilfe von amplifizierter DNA ermöglicht 3, 4 . Die Technik wurde ursprünglich als Werkzeug zum Nachweis von Zytokinen etabliert 5, 6 und wurde weiter angepasst, um die posttranslationale Proteinmodifikation in situ zu untersuchen 2, 3, 7 .

Das PLA-Verfahren verwendet zwei Antikörper, die mit Oligonukleotiden (Proximity-Sonden) konjugiert sind, wobei jeder Antikörper spezifisch für ein interessierendes Protein oder eine Zellstruktur ist 3 . Dem Reaktionsgemisch werden zwei Konnektor-Oligonukleotide zugesetzt, was zur Bildung von zirkulärer DNA führt, gefolgt vom Verbinden der freien DNA-Enden durch Zugabe von DNA-Ligase. Im nächsten Schritt wird die Rolling Circle Amplification (RCA) ein einzelsträngiges DNA-Produkt erzeugen, das mit einer der Proximity-Sonden verbunden ist und mehrere verkettete Kopien der Konnektor-Oligonukleotide enthält. Der Nachweis der amplifizierten DNA erfolgt durch Hybridisierung mit einem fluoreszenzkonjugierten Oligonukleotid (Detektionsoligonukleotide), das komplementär zu einem kurzen Abschnitt des Konnektor-Oligonukleotids ist, der in der Fluoreszenzmikroskopie als heller Fleck mit hohem Signal-Rausch-Verhältnis erscheint 2, 3, 6 . Die Interpretation der Ergebnisse von PLA basiert auf der Annahme, dass ein PLA-Signal detektierbar ist, wenn sich die Näherungssonden in einem Abstand von mehreren zehn Nanometern befinden 7, 8 . PLA wurde jedoch auch als „molekulares Lineal“ angesehen, das geeignet ist, um Abstände zwischen zwei Epitopen im Bereich von 10–30 nm 3 zu messen. Dennoch sollte für die quantitativen Messungen im Bereich von 2–10 nm der Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) als zuverlässigeres Werkzeug in Betracht gezogen werden 9-13 und gleichzeitig sollten die Sättigungsmerkmale von PLA berücksichtigt werden 14 . Es ist bekannt, dass Photobleaching oder Autofluoreszenz von Gewebeproben Nachteile für FRET darstellen können, daher sollten Forscher diese Tatsachen bei der Auswahl der optimalen Methode zur Beantwortung ihrer wissenschaftlichen Fragen berücksichtigen 1 . Dennoch können einige Messtechniken die Autofluoreszenzeffekte auf FRET minimieren. Die Genauigkeit von FRET-Messungen kann durch zellweise Korrektur für Autofluoreszenz 15 und durch die Verwendung von FRET in Kombination mit einer anderen Technik verbessert werden: der Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskopie 16 .

Die Entwicklung neuer Instrumente, schnellerer Computer und verschiedener Softwaretools führte zur Anpassung von PLA an eine statistisch robustere Technik, die Durchflusszytometrie 2, 8 . Wenn die posttranslationalen Modifikationen des PDGF-Rezeptors durch Fluoreszenzmikroskopie analysiert wurden, variierte die Zahl der quantifizierten Zellen im Bereich von 100–130 Zellen/Probe 4 . Statistische Verbesserungen wurden sichtbar, als die Dimerisierung von EGFR oder HER2 durch PLA untersucht wurde, die auf die Durchflusszytometrie angewendet wurden, was die Messung von Tausenden von Zellen pro Sekunde ermöglichte 8 . Darüber hinaus wurde die Technik entwickelt, um den gleichzeitigen Nachweis von mRNA-Molekülen und Proteinkomplexen oder posttranslationalen Modifikationen auf Einzelzellebene zu ermöglichen 17 .

Der Artikel von Burns et al. kürzlich in Cytometry Part A veröffentlicht wurde eine neue Version von PLA, Subzellulärer Lokalisations-Assay (SLA), vorgestellt, der die Identifizierung der subzellulären Lokalisation der interessierenden Proteine ​​unter Verwendung von Mikroskopie und einer Hochdurchsatzmethode, der Durchflusszytometrie, ermöglicht 18 . Die Technik erfordert zwei Proximity-Sonden: (i) einen Antikörper, der ein Tag erkennt, bei dem es sich um ein reichlich vorhandenes Molekül handeln muss, das für eine Organelle oder einen Teil einer Organelle charakteristisch ist (z. B. beschädigte DNA im Zellkern) (ii) einen weiteren Antikörper gegen das interessierende Protein . Die durchflusszytometrische Version von SLA bietet nicht nur eine Hochdurchsatzerkennung durch Messung von >10.000 Zellen/Sekunde, sondern ist auch in vielen Forschungslabors oder Krankenhäusern in Reichweite, im Gegensatz zur eingeschränkten Verfügbarkeit und Niedrigdurchsatzfähigkeit von bildgebenden Zytometern. Darüber hinaus ist auch die gleichzeitige Messung der subzellulären Lokalisation durch SLA und einen anderen durch Fluoreszenzmarkierung nachweisbaren Parameter möglich. Die weit verbreitete Anwendung von SLA kann jedoch durch die Komplexität des Protokolls zum Vorbereiten der Proximity-Sonden und zum Durchführen von SLA behindert werden 18 .

SLA wurde verwendet, um die Proteinlokalisation in zwei subzellulären Hauptkompartimenten zu untersuchen, nuklear und mitochondrial. Der am weitesten entwickelte Teil des Artikels war die Anwendung von SLA im Kernkompartiment zur Untersuchung des nuklearen Imports von Transkriptionsfaktoren in Zellpopulationen oder in verschiedenen Zelluntergruppen als Funktion der Zeit und zur Lokalisation des Tumorsuppressorproteins Brustkrebs 1 ( BRCA1) auf beschädigte DNA. Nuklearer Import der Transkriptionsfaktoren: Nuklearfaktor Kappa-Leichtketten-Enhancer von aktivierten B-Zellen (NF-κB) und Nuklearfaktor von aktivierten T-Zellen (NF-AT) wurde in verschiedenen Zelllinien und in mononukleären Zellen des peripheren Blutes untersucht von SLA. Als Proximity-Sonden dienten in diesen Experimenten ein Antikörper gegen die Transkriptionsfaktoren und ein weiterer Antikörper gegen doppelsträngige DNA. SLA zeigte nicht nur die nukleare Translokation von NF-κB und NF-AT als Funktion der Zeit, sondern ermöglichte den Autoren auch, diese Ereignisse in verschiedenen Zellsubpopulationen zu analysieren 18 .

Neben den Forschungsanwendungen von SLA kann die Technik einen klinischen Nutzen haben, wie ihre Fähigkeit zeigt, die Interaktion zwischen dem Tumorsuppressorprotein BRCA1 und dem Marker für DNA-Doppelstrangbrüche, Gamma-H2A-Histonfamilie, Mitglied X (yH2AX) nachzuweisen DNA-Schäden. Doppelstrangbrüche stellen einen Marker für die Bewertung der DNA-Reparaturmechanismen nach einer Krebstherapie dar 19 . Lymphozyten, Haut- oder Tumorbiopsien können von Patienten vor und nach der Therapie entnommen und auf die Anzahl der yH2AX-Foci untersucht werden 20 . Die Autoren zeigten in ihren Experimenten, dass die BRCA1-yH2AX-Interaktion von den Zellzyklusphasen abhängig ist. Die Messung der nuklearen Kolokalisation von BRCA1 und Histon yH2AX durch konfokale Mikroskopie bestätigte die SLA-Ergebnisse. Da SLA eine Hochdurchsatzmethode ist, schlugen die Autoren vor, dass diese Technik die klassische Mikroskopie-Zählmethode ergänzen kann 18 .

Zusammenfassend stellten die Autoren eine neue Technik vor, die auf den Prinzipien des Proximity-Ligation-Assays basiert und in der Lage ist, die Lokalisation eines interessierenden Proteins in verschiedenen subzellulären Kompartimenten zu quantifizieren. Neben den vielfältigen Forschungsanwendungen, die vom Nachweis der Kernlokalisation von Transkriptionsfaktoren bis hin zur Untersuchung der Kinetik in mehreren Zellpopulationen gleichzeitig im Hochdurchsatz und im Multiplexverfahren reichen, hat die Technik ein hohes Potenzial für die klinische Praxis.


Alternative Namen

  • IL12A
  • IL12B
  • CLMF p35
  • CLMF p40
  • Zytotoxische Lymphozytenreifungsfaktor 35 kDa Untereinheit
  • Zytotoxische Lymphozytenreifungsfaktor 40 kDa Untereinheit
  • Interleukin 12 Alpha-Kette
  • Interleukin-12 Beta-Kette
  • NK-Zellen-stimulierende Faktorkette 1
  • NK-Zellen-stimulierende Faktorkette 2
  • NKSF1
  • NKSF2

Relevanz

Zelluläre Lokalisierung


Fehllokalisierung durch Veränderungen der Proteininteraktion oder Modifikation

Zusätzlich zur Veränderung des Lokalisierungssignals eines Proteins können krankheitsbezogene Mutationen zu einer Fehllokalisierung eines Proteins durch Proteinsequestrierung führen. Mutationen innerhalb der LMNA (lamin A/C)-Gen, das Laminopathien verursacht, wurde kürzlich berichtet, dass es zu einer Fehllokalisierung des DNA-bindenden Transkriptionsrepressors Zinkfingerprotein 239 (ZNF239, auch bekannt als MOK2) führt. Das pathogene mutierte Protein Lamin A/C sequestriert ZNF239 in nukleäre Aggregate, und es wird angenommen, dass dieser Prozess anschließend ZNF239-Zielgene dereguliert (Dreuillet et al., 2008).

Auch erbliche genetische Veränderungen, die die für die korrekte Proteinlokalisierung relevanten posttranslationalen Modifikationen verändern, werden mit menschlichen Erkrankungen in Verbindung gebracht. In einer aktuellen Studie haben Cordeddu et al. berichteten über eine genetische Veränderung bei Patienten mit Noonan-ähnlichem Syndrom, die eine N-Myristoylierungsstelle in SHOC2, ein leucinreiches Repeat-enthaltendes Protein, einführt. Diese erworbene Fettsäuremodifikation führt bei Wachstumsfaktorstimulation zu einer abweichenden SHOC2-Targeting auf die Plasmamembran und einer beeinträchtigten Translokation zum Zellkern (Cordeddu et al., 2009).

Fehllokalisierung von fehlgefalteten Proteinen

Eine fehlerhafte Faltung von Proteinen mit wichtigen zellulären Rollen kann Krankheiten verursachen, bei denen der Verlust der Proteinfunktion und nicht ihre Fehllokalisierung die Pathologie vorantreibt (Hung et al., 1997 Payne et al., 1998 Skach, 2000 Tanaka et al., 2003). Fehlfaltung kann auch dazu führen, dass Proteine, die ihre intrinsische Funktion beibehalten, aber fehlgeleitet werden und infolge ihrer Fehllokalisierung nicht mehr normal funktionieren (Conn et al., 2007). Dementsprechend kann eine abweichende Lokalisierung von fehlgefalteten Proteinen bei vielen Krankheiten einen nachteiligen Funktionsgewinn oder dominant-negative Wirkungen haben. Mehrere erbliche genetische Störungen wurden mit einem veränderten Handel mit fehlgefalteten G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) in Verbindung gebracht. Beispiele für solche Störungen sind Retinitis pigmentosa (Conn et al., 2007 Mendes et al., 2005) und nephrogene Diabetes insipidus (Robben et al.) ., 2006). In einigen Krankheitszuständen ist der Defekt in der Zelloberflächenmembranexpression von GPCRs auf einen dominant-negativen Effekt des falsch gefalteten Rezeptors auf sein Wildtyp-Gegenstück aufgrund ihrer Assoziation im ER und einer Fehlleitung des resultierenden Komplexes zurückzuführen (Brothers et al. , 2004 Conn et al., 2007 Gehret et al., 2006 Karpa et al., 2000). Fehllokalisierte, fehlgefaltete Proteine, die toxische Funktionsgewinne oder dominant-negative Effekte ausüben, werden zunehmend als Kardinalmerkmal vieler neurodegenerativer Erkrankungen erkannt (Kasten 1).

Fehllokalisierung von Signalproteinen

Bei der Signalübertragung handelt es sich um die Übertragung eines Signals in Zeit und Raum. Da Proteine ​​nicht so schnell diffundieren können wie niedermolekulare sekundäre Botenstoffe, ist die subzelluläre Lokalisierung von Signalproteinen in der Nähe ihrer nachgeschalteten Ziele ein Schlüsselelement vieler Signaltransduktionskreisläufe (Scott und Pawson, 2009). Die Translokation von Signalproteinen bietet ein effizientes Mittel, um das Signal über eine beträchtliche Distanz oder zwischen Zellkompartimenten zu transportieren. Es wurde gezeigt, dass die Deregulierung der raumzeitlichen Signaldynamik an der Tumorentstehung, Tumor

Kasten 1. Aberrante Proteinlokalisation bei neurodegenerativen Erkrankungen

Trotz einer Fülle experimenteller Daten zu neurodegenerativen Erkrankungen hat sich noch kein Konsens über die Natur der neuropathogenen Spezies herausgebildet und wie sie die Degeneration von Neuronen beispielsweise bei Alzheimer, Parkinson, Huntington und Prionenerkrankungen, Amyotropher Lateralsklerose (ALS) oder . fördern Frontotemporale Lobärdegeneration (FTLD). In den letzten Jahren wurden beträchtliche Beweise dafür gesammelt, dass die früheren Stadien des Protein-Fehllokalisationsprozesses direkter mit der Pathogenese verbunden sind als die filamentösen Proteinaggregate selbst. Die Bildung großer Proteinaggregate und Einschlusskörperchen könnte sogar einen nützlichen Abwehrmechanismus darstellen, der dazu dient, irreversibel aggregierte Proteine ​​zu eliminieren. Dementsprechend wurde in Mausmodellen gezeigt, dass neurofibrilläre Knäuel, die aus Aggregaten einer hyperphosphorylierten Form des Mikrotubuli-assoziierten Proteins Tau (MAPT) bestehen, im Vergleich zu löslichem Tau eine vernachlässigbare Neurotoxizität ausüben (Oddo et al., 2006 Santacruz et al., 2005). Kürzlich wurde berichtet, dass eine Fehllokalisierung von Tau in dendritische Dornen eine synaptische Dysfunktion vermittelt, die mit einer beeinträchtigten Gehirnfunktion in den präklinischen Krankheitsstadien, die der Neurodegeneration unmittelbar vorausgehen, verbunden ist.Die Anhäufung von hyperphosphoryliertem Tau innerhalb intakter dendritischer Dornen beeinträchtigt den Glutamatrezeptortransport oder die synaptische Verankerung (Hoover et al., 2010). Bei Patienten mit ALS und FTLD zeigen betroffene Neuronen eine auffallende Umverteilung des TAR-DNA-bindenden Proteins (TARDBP, auch bekannt als TDP43) oder des ALS-assoziierten Proteins, das im Sarkom (FUS) fusioniert ist, vom Zellkern zum Zytoplasma (Neumann et al. , 2006). Interessanterweise zeigte eine kürzlich durchgeführte Studie, dass die TDP43-vermittelte Neurotoxizität mit einer erhöhten zytoplasmatischen Lokalisation dieses Proteins verbunden war, während TDP43-Einschlusskörperchen für die Toxizität nicht notwendig waren und das Risiko des Zelltods nicht beeinflussten (Barmada et al., 2010 Kwiatkowski et al., 2009 Lagier-Tourenne und Cleveland, 2009 Vance et al., 2009).

Die Aggregation amyloidogener Proteine ​​kann zur Sequestrierung und damit zu einer abweichenden Lokalisation zahlreicher Proteine ​​führen, darunter Importin alpha und phosphoryliertes SMAD3, was auf eine funktionelle Beeinträchtigung des Nuklearhandels bei der Alzheimer-Krankheit hindeutet (Chalmers und Love, 2007 Zhu et al. , 2002). Es wurde vermutet, dass eine veränderte Lokalisation von Transkriptionsfaktoren wie NF-κB, aktivierender Transkriptionsfaktor 2 (ATF2), cAMP-Response-Element-Bindung (CREB), p53, E2F-Transkriptionsfaktor und NF-E2-related Faktor 2 (NRF2) könnte bei mehreren neurodegenerativen Erkrankungen zum Zelltod beitragen (Chu et al., 2007).

Wachstum und Metastasierung (Kau et al., 2004 Wang und Hung, 2005). Mehrere wichtige Tumorsuppressoren erfordern die Fähigkeit, sich im Zellkern zu lokalisieren, um ihre Funktion zu erfüllen, und ihre zytoplasmatische Lokalisierung kann als Inaktivierungsmechanismus dienen, der zu einer unkontrollierten Zellproliferation und dem Ausbruch von Krankheiten führt (Fabbro und Henderson, 2003, Salmena und Pandolfi, 2007). Turner und Sullivan, 2008, Yashiroda und Yoshida, 2003). Folglich wurde die Fehllokalisierung von nuklearen Proteinen im Zytoplasma als allgemeiner Mechanismus für die Inaktivierung von Tumorsuppressoren vorgeschlagen (Kau et al., 2004, Salmena und Pandolfi, 2007).

Der Transkriptionsfaktor Forkhead Box O3a (FOXO3a), ein Mitglied der Forkhead-Proteinfamilie, ist ein Beispiel für einen Tumorsuppressor, dessen Funktion durch Fehllokalisation verändert wird. FOXO3a reguliert die Expression beispielsweise der apoptotischen Proteine ​​FasL (Brunet et al., 1999) und Bim (Gilley et al., 2003) und des Zellzyklusinhibitors p27 (Dijkers et al., 2000). Es wurde gezeigt, dass die zytoplasmatische Lokalisation von FOXO3a mit einem schlechten Überleben bei Brustkrebs korreliert (Hu et al., 2004), während die nukleäre Lokalisation mit einer erhöhten Strahlenempfindlichkeit korreliert (Chen et al., 2008). Es wurde gezeigt, dass drei Onkokinasen die FOXO3a-Lokalisierung regulieren: AKT (Brunet et al., 1999), IKK (Hu et al., 2004) und extrazelluläre signalregulierte Kinase 1/2 (ERK1/2) (Yang et al., 2008 ). Während alle drei Kinasen FOXO3a an unterschiedlichen Resten phosphorylieren (AKT an T32, S253 und S315, IKK an S644 und ERK1/2 an S294, S344 und S425), ist das Ergebnis das gleiche, nämlich der Export von FOXO3 aus dem Zellkern und der anschließende Abbau.

Die Rollen der Zellzyklusinhibitoren p21 und p27 werden auch durch ihre zelluläre Lokalisation reguliert. p21 und p27 gelten traditionell als Tumorsuppressoren, die im Zellkern wirken und bei Lokalisation im Zytoplasma onkogen werden. Es wurde ursprünglich gezeigt, dass p21 die Tumorentstehung hemmt und wurde als guter Kandidat für eine Gentherapie vorgeschlagen (Katayose et al., 1995 Yang et al., 1995). Später stellte sich jedoch heraus, dass p21 auch mit anti-apoptotischen Funktionen assoziiert ist, wenn es im Zytosol lokalisiert ist. Es konnte gezeigt werden, dass die Bindung von p21 an die Mitogen-aktivierte Proteinkinase (MAPK) Kinasekinase 5 (MAP3K5, auch bekannt als ASK1) im Zytoplasma die MAPK-Kaskade hemmt (Asada et al., 1999 Huang et al., 2003). Darüber hinaus induziert die Phosphorylierung von p21 auf T145 durch AKT den Kernexport von p21, was das Zellwachstum fördert (Li et al., 2002 Rossig et al., 2001 Zhou et al., 2001). Darüber hinaus wurde festgestellt, dass zytoplasmatisches p21 eine onkogene Rolle bei der Tumorentstehung und -metastase der Brustdrüse in vivo spielt (Cheng et al., 2010). Die physiologische Relevanz von p21 im Zytoplasma wird weiter durch die klinische Beobachtung unterstrichen, dass die zytoplasmatische Lokalisation von p21 ein schlechter prognostischer Marker für Brustkrebs ist (Xia et al., 2004), an der Vermittlung von Resistenzen gegen Krebsmedikamente beteiligt ist (Koster et al. , 2010 Ruan et al., 1999 Zhang et al., 1995) und hat gezeigt, dass es zu einem schlechten Ansprechen auf Tamoxifen führt (Pérez-Tenorio et al., 2006).

Ähnlich wie p21 wurde gefunden, dass der Zellzyklusinhibitor p27 onkogene Rollen hat, wenn er im Zytoplasma lokalisiert ist. AKT phosphoryliert p27 auf T157, was den nuklearen Import von p27 blockiert (Liang et al., 2002 Shin et al., 2002 Viglietto et al., 2002). Es wurde auch gezeigt, dass die Phosphorylierung von p27 auf S10 eine zytoplasmatische Lokalisierung von p27 induziert, ohne zu dessen Abbau zu führen (Rodier et al., 2001). Wie im Fall von p21 hat sich die zytoplasmatische Lokalisation von p27 als schlechter prognostischer Faktor bei Krebserkrankungen erwiesen, einschließlich Brustkrebs (Liang et al., 2002), Leberzellkrebs (Nan et al., 2004), Dickdarm (Ogino et al.) ., 2009) und Eierstockkrebs (Rosen et al., 2005) und Barrett-Karzinom (Singh et al., 1998).

Neben Tumorsuppressoren wurde nach und nach klar, dass auch Rezeptortyrosinkinasen (RTKs), die traditionell als zellmembrangebundene Proteine ​​angesehen werden, in der Lage sind, in den Zellkern zu translozieren und dort zu funktionieren (Carpenter und Liao, 2009 Gomes et al. , 2008 Reilly und Maher, 2001 Sehat et al., 2010 Stachowiak et al., 1997 Wang und Hung, 2009). Vor kurzem wurde über einen neuen Transportmechanismus für EGFR von der Zelloberfläche zum Zellkern berichtet. Der Handel mit EGFR beinhaltet Endozytose, gefolgt von einem retrograden Handel vom Golgi zum ER durch COPI-vermittelten vesikulären Transport. Der Rezeptor wird dann durch das ER in den Kern transloziert, wo SEC61B ihn aus der inneren Kernmembran freisetzen kann (Wang et al., 2010a Wang et al., 2010b). Es ist erwähnenswert, dass der EGFR während des gesamten Transportweges von der Zelloberfläche bis zum Zellkern membrangebunden bleibt. Die nukleäre Lokalisation von EGFR korreliert mit vielen Tumorarten (Hadzisejdic et al., 2010 Hoshino et al., 2007 Lo et al., 2005a Psyrri et al., 2008 Xia et al., 2009) und ist nachweislich an Vermittlung von Resistenzen gegen die Krebsmedikamente Cetuximab (Li et al., 2009) und Cisplatin (Hsu et al., 2009). Konsequenterweise wurde nuklearer EGFR mit Zellproliferation, DNA-Reparatur, Arzneimittelresistenz in Verbindung gebracht, und nuklearer EGFR und ERBB2 binden an Promotoren und aktivieren die Transkription (Hanada et al., 2006 Hung et al., 2008 Lin et al., 2001 Lo et al., 2005b Wang et al., 2004).


<p>Dieser Abschnitt enthält Informationen zur Expression eines Gens auf mRNA- oder Proteinebene in Zellen oder Geweben mehrzelliger Organismen.<p><a href='/help/expression_section' target='_top'>Mehr. </a></p> Ausdruck i

<p>Dieser Unterabschnitt des Abschnitts 'Expression' liefert Informationen über die Expression eines Gens auf mRNA- oder Proteinebene in Zellen oder in Geweben mehrzelliger Organismen. Standardmäßig stammen die Informationen aus Experimenten auf mRNA-Ebene, sofern nicht „auf Proteinebene“ angegeben.<br></br>Beispiele: <a href="http://www.uniprot.org/uniprot/P92958#expression" >P92958</a>, <a href="http://www.uniprot.org/uniprot/Q8TDN4#expression">Q8TDN4</a>, <a href="http://www.uniprot.org/uniprot/O14734# expression">O14734</a><p><a href='/help/tissue_specificity' target='_top'>Mehr. </a></p> Gewebespezifität i

Manuelle Behauptung basierend auf Experiment in i

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Vorlesung 19: Zelltransport und Proteinlokalisierung

Professor Imperiali spricht über Menschenhandel oder wie Dinge in einer Zelle dorthin gelangen, wo sie sein müssen. Sie wird die Mechanismen diskutieren, durch die Proteine ​​sehr früh in ihrer Biogenese kodiert werden, um an bestimmte Orte in oder aus der Zelle zu gelangen.

Lehrer: Barbara Imperiali

Vorlesung 1: Willkommen Introdu.

Vorlesung 2: Chemische Bindung.

Vorlesung 3: Strukturen von Am.

Vorlesung 4: Enzyme und Meta.

Vorlesung 5: Kohlenhydrate an.

Vorlesung 9: Chromatin-Remode.

Vorlesung 11:Zellen, Die Simpl.

Vorlesung 16: Rekombinante DNA.

Vorlesung 17: Genome und DNA.

Vorlesung 18: SNPs und Mensch .

Vorlesung 19: Zellverkehr.

Vorlesung 20: Zellsignalisierung .

Vorlesung 21: Zellsignalisierung .

Vorlesung 22: Neuronen, Aktion.

Vorlesung 23: Zellzyklus und .

Vorlesung 24: Stammzellen, Apo.

Vorlesung 27: Visualisierung des Lebens.

Vorlesung 28: Visualisierung des Lebens.

Vorlesung 29: Zellbildgebung Te.

Vorlesung 32: Infektionskrankheit.

Vorlesung 33: Bakterien und An.

Vorlesung 34: Viren und Ameisen.

Vorlesung 35: Reproduktive Kl.

BARBARA IMPERIALI: Ich erinnere Sie immer gerne daran, dass die sechste – es ist eine Art Auftrag, aber die Zahlen – wir werden dieses Kurznachrichtenprojekt machen, bei dem es sich um ein Teamwork-Projekt handelt, wenn Sie möchten. Wenn Sie sich das Stück ansehen, das Sie jetzt in Ihren Händen halten, werden Sie nach ein paar Informationen gefragt, mit wem Sie arbeiten werden, wenn Sie sich entscheiden, mit jemandem zu arbeiten. Oder Sie arbeiten alleine. Das ist in Ordnung.

Und wir suchen nach einem News-Briefing, das für die Forschung in den Life Sciences von Bedeutung ist. Und ich habe Ihnen-- es gibt ein paar Links in der Seitenleiste der Website, also gute Orte, an denen Sie interessantes Material finden können. Was mich für Sie als Gruppe, in der viele von Ihnen in den Ingenieurwissenschaften tätig sind, sehr interessiert, ist, etwas wirklich Cooles an der Schnittstelle zwischen den Lebenswissenschaften und den Ingenieurwissenschaften zu finden, wo die Ingenieurwissenschaften einen großen Einfluss auf die Lebenswissenschaften haben.

Sie haben Alternativen. Sie können die Koordinaten eines Proteins herunterladen und auf einem 3D-Drucker ausdrucken und uns eine Zusammenfassung dessen geben, was das Protein ist, was es tut, und Ihren 3D-Druck einreichen. Ich gebe es dir nachher zurück, wenn wir es uns angesehen haben. Aber tatsächlich den 3D-Druck einreichen.

Und dann ist die andere Gelegenheit - ich denke, Sie erinnern sich noch daran, als wir über die Molekularbiologie der Zelle sprachen. Ich habe eine Art klobige Demo am Anfang der Klasse gemacht, überhaupt nichts wie die von Professor Martin. Das war ich mit den Ethernet-Kabeln, die Ihnen zeigen, was Topoisomerase getan hat. Aber in meiner Demo habe ich Ihnen nicht gezeigt, wie Topo auch einen DNA-Strang schneidet, ihn hält, während sich das Supercoiling abwickelt, und ihn dann zusammenfügt. Also dachte ich, dass einige der Ingenieure vielleicht etwas finden könnten, das für mich, für uns, nächstes Jahr im Unterricht wirklich besser war. Also lege ich die Herausforderung dort wirklich hin.

Also ich mag Dinge in den Nachrichten immer. Ich fand es irgendwie interessant, dass sich die ersten Wirbeltiere in seichten Gewässern entwickelten. Ich dachte, das wären wirklich coole erste Wirbeltiere. Ich würde gerne einen davon in ein Aquarium stecken und ihn behalten. Aber egal, das ist es.

Es ist wirklich erstaunlich, was Sie in den wissenschaftlichen Berichten und Kurznachrichten sehen können. Ich schaue sie mir an, wenn sie reinkommen. Ich bekomme die Post alle zwei oder drei Tage. Und es freut mich zu sehen, dass es viele Dinge gibt, die in diesen Kurznachrichten enthalten sind, die wir Ihnen aufgrund dessen, was wir in der Klasse behandeln, mit einiger Anerkennung ermöglichen.

Was wir jetzt also tun, ist hier wirklich einen Sprung nach vorne in Zellen und Organismen zu machen, in Bezug auf das Verständnis, wie Struktur und Funktion einzelner Makromoleküle, Proteine, Nukleinsäuren, Zucker das Leben bestimmen, die Dynamik des Lebens bestimmen sind für einen Organismus notwendig, um wirklich einen Lebenszyklus zu durchlaufen, sich zu teilen, Zellen zu teilen, vorwärts zu gehen, Zellen zu bewegen. Worüber wir also in den nächsten Vorträgen, Abschnitt 6, sprechen werden, ist Mobilfunk und Signalisierung. In der ersten Vorlesung, die wir jetzt 19 haben – also haben wir die Mitte überschritten –, werde ich über Menschenhandel sprechen. Auf diese Weise gelangen die Dinge innerhalb einer Zelle dorthin, wo sie sein müssen, oder sie werden aus einer Zelle exportiert.

Weil alle Aktionen einer Zelle-- ich mag es wirklich, die Zelle als eine Platine zu betrachten, auf der es einen Empfänger gibt, der Informationen erhält. Und dann bestimmt die komplexe Schaltung, welches Ergebnis Sie am Ende des Tages erhalten. So viele der Proteine, über die wir gesprochen haben, müssen sich an bestimmten Stellen befinden, damit die Zelle funktioniert.

Wir müssen DNA-Polymerase im Zellkern haben. Es wird im Zytoplasma nicht nützlich sein. Wir brauchen einen Transkriptionsfaktor, der der Transkription hilft, zum richtigen Zeitpunkt in den Zellkern zu gelangen, damit die Transkription stattfinden kann. Aber wir wollen es nicht die ganze Zeit da haben, denn sonst hättest du die ganze Zeit das Licht an. Das wäre nicht sinnvoll. Wir müssen also regulieren, wo sich bestimmte Makromoleküle befinden. Wir brauchen die Empfänger auf der Oberfläche der Zelle, um Signale von außen zu empfangen.

Dies gilt nicht nur für vielzellige Organismen. Für einzellige Organismen ist es wichtig, dass sie ihre Umgebung wahrnehmen und wissen, was um sie herum passiert. Ändert sich die Salzkonzentration? Wird es sehr heiß? Wird es kalt? Gibt es genug Sauerstoff? Auch Einzeller müssen Signale empfangen und darauf reagieren.

Vielzellige Organismen sind viel komplizierter. Denn Sie müssen Organe und verschiedene Teile eines vielzelligen Organismus aufbauen, die eine spezialisierte Funktion haben. Beim Handel geht es also wirklich darum, was passiert, nachdem Sie eine replizierte DNA im Zellkern hergestellt, transkribiert, einen ausgereiften Botenstoff hergestellt haben, der in den meisten Fällen ins Zytoplasma gelangt. Wir werden über die Ausnahmen in diesem Fall sprechen.

Und dann im Zytoplasma, wenn Proteine ​​exprimiert werden, all die verschiedenen Dinge, die passieren, die garantieren, dass das Protein seinen richtigen Bestimmungsort für seine Funktion erreicht. Und einige davon sind ziemlich kompliziert. Denn denken Sie daran, wenn ich einen Empfänger in der Zellmembran parken will, bei dem die Signale von außen eingefangen werden, muss ich das Zytoplasma zuverlässig verlassen.

In den Vorlesungen 20 und 21 spreche ich mit Ihnen über zelluläre Signalübertragung mit Fokus auf Säugerzellen und die Arten von Signalprozessen, die in Zellen schief gehen können, zum Beispiel proliferierende Zellen. Und dann wird sich Professor Martin in Vorlesung 22 wirklich auf neuronale Zellen, Optogenetik, konzentrieren. Mit diesem Bundle können Sie also wirklich das bisher Gelernte abrufen und in viel faszinierenderen und komplexeren Situationen anwenden.

Hier ist also eine wundervolle, alberne Zeichnung einer dreieckigen Zelle. Es gibt immer einen Witz unter Zellbiologen, wenn sie versuchen, mit Mathematikern zu sprechen und Mathematiker alles vereinfachen wollen. Und so wird alles-- stellen Sie sich eine Zelle vor, und da wird diese Box auf einem Bildschirm angezeigt. Wir alle wissen, dass Zellen nicht dreieckig oder kastenförmig sind. Aber trotzdem fand ich dieses hier besonders cool.

Und so geht es beim Handel, dem Prozess des Handels, wirklich darum, wo die in das Protein kodierten Informationen sind, die sicherstellen, dass das Protein dort ist, wo es für die Dynamik, die wir in lebenden Systemen beobachten, benötigt wird? Wir haben viel über statische Dinge gesprochen. Wir machen das Protein. Hier ist das Protein. Das Protein faltet sich.

Wir haben viel über Dinge gesprochen, die in Zeit und Raum festgelegt sind. Aber was wir tun wollen, ist zu verstehen, was eine Zelle dazu bringt, eine neue Funktion zu durchlaufen. Zum Beispiel müssen wir bei etwas so Einfachem wie der Zellteilung eine Vielzahl von Aktivitäten orchestrieren, damit der Zellteilungsprozess beginnen kann. Etwas so einfach wie eine Zellmobilität, denken Sie darüber nach, wie sich Zellen bewegen? Sie bewegen sich nicht die ganze Zeit, aber manchmal bewegen sie sich auf ein Signal zu. Was löst solche Interaktionen aus?

Beim Betrachten der Zelle sind dies einige der älteren Bilder, auf denen zum Beispiel bestimmte Organellen gefärbt sind, damit Sie sie sehen können. Peroxisomen sind also der Ort, an dem der Abbau stattfindet. Der Golgi und der ER sind Teil des sogenannten Endomembransystems. Sie werden viel darüber im späteren Teil der Klasse sehen, wo wir darüber sprechen, wie die Dinge durch das Endomembransystem aus der Zelle gelangen.

Da ist die Oberflächenplasmamembran. Das Zytoplasma ist nicht wirklich wässrig - es ist ein offener Raum. Aber es ist wirklich nicht geöffnet. Es ist stark überfüllt mit allen Arten von Molekülen, allen Arten von Strukturproteinen und so weiter. Stellen Sie sich das Zytoplasma also nicht als Lösung vor, sondern als eine viel eher gelartige Struktur, in der viele Dinge passieren.

Der Zellkern selbst ist ebenso wie das Endomembransystem von einer Membran umgeben. Das wäre also die Kernhülle. Innerhalb des Kerns gibt es eine Struktur namens Nukleolus, in der Aspekte der für die Proteinbiosynthese notwendigen Nukleinsäuren hergestellt werden. Dann gibt es Strukturproteine ​​wie Mikrotubuli und Aktin.

Aber jetzt, in der heutigen Zeit, müssen wir uns nicht mit diesen Vanillebildern befassen. Wir können die Methoden, die Sie im letzten Abschnitt, rekombinante Biologie, kennengelernt haben, tatsächlich verwenden, um neue Versionen von Proteinen zu erstellen, die zusammen mit ihrer Sequenz einen Marker haben, der ihnen einen fluoreszenzfarbenen Marker verleiht. Wir werden also später im Semester drei Vorlesungen über Fluoreszenz und zelluläre Bildgebung verbringen, in denen Sie mehr über diese fabelhaften Proteine ​​erfahren, als nur zu sagen, dass wir ein grünes und ein rotes haben. Wir werden Ihnen den gesamten Hintergrund über das Protein-Engineering geben, das es ermöglichte, Werkzeuge für die Biologie zu werden.

Aber jetzt zeige ich Ihnen nur, wie viel interessanter die Bilder der subzellulären Strukturen sind, wenn Sie beispielsweise ein bestimmtes Protein, das ausschließlich zum Nukleolus gelangt, mit einem blau fluoreszierenden Protein markiert haben, oder Mitochondrien. Denken Sie daran, Professor Martin hat Ihnen gesagt, dass wir das immer als-- und ich werde die Liegestütze nicht machen. Ich werde es nur sagen, Kraftpaket der Zelle. Ich mache nicht-- [LACHT] Ich bin nicht so toll mit Liegestützen, um ehrlich zu sein.

Aber Sie sehen diese Art von mehr verworrenen, ausgedehnten Strukturen. Vimentin ist eher ein Strukturprotein. Hier befinden sich der Golgi, das endoplasmatische Retikulum und der Zellkern.

Die farbigen Fluorophor-Proteine ​​oder die fluoreszierenden Fluorophor-Proteine ​​ermöglichen es uns also tatsächlich, Dynamiken in Echtzeit zu beobachten. Wenn ein Protein einmal hergestellt ist, wohin geht es? Wenn wir der Zelle einen Auslöser hinzufügen, um eine Interaktion zu bewirken, können wir beobachten, wie das Protein beispielsweise zur Plasmamembran wandert. Können wir beobachten, wie Proteine ​​durch das ER gebildet werden? Eine Vielzahl verschiedener Dinge, die es uns in der modernen Biologie ermöglichen, Dynamiken zu betrachten, nicht nur statische Informationen.

Worüber ich mit Ihnen sprechen werde, ist die Art und Weise, wie Proteine ​​sehr früh in ihrer Genese, in ihrer Biogenese, kodiert werden, um an bestimmte Orte innerhalb der Zelle zu gelangen. Lassen Sie mich Ihnen hier nur eine kleine Roadmap mit einem Protein geben. Und wo die Dinge beginnen können – wir haben also einige Optionen.Wollen wir das Protein aus der Zelle schicken oder in der Zelle behalten?

Offensichtlich gibt es zwei große Standardunterschiede, wenn Sie zu einem bestimmten Ort in der Zelle gehen. Bleiben wir einfach im Zytosol? Das ist eine Art einfaches – eigentlich ist das die Standardposition. Denn Sie möchten sich daran erinnern, dass die meisten Proteine ​​an Ribosomen im Zytosol der Zelle hergestellt werden.

Aber die Statistik besagt, dass etwa 50% der Proteine ​​anderswo als im Zytoplasma landen. Sie können in einer Organelle, wieder im Zellkern an der Oberfläche enden oder abgesondert werden. Es gibt also eine Menge – also sind es gute, solide 50%, die nicht im Zytosol bleiben, wo sie ursprünglich hergestellt wurden.

Ihre Alternative besteht darin, zu Organellen zu gehen. Und wenn Sie zu einer Organelle gehen, denken Sie daran, dass das Ribosom keine Membran ist. Es hat keinen Membranumfang. Aber viele der Organellen haben Membranperimeter.

Wir sprechen hier also von den Mitochondrien. Das ist ein viel zu langes Wort. Der Kern – also werde ich Dinge wie Peroxisomen oder verschiedene membranumrandete Organellen abkürzen, wo wir herausfinden müssen, wenn etwas im Zytoplasma hergestellt wird, wie kommt es in diese Organellen?

Jetzt haben wir ein wenig darüber gesprochen, dass einige Proteine ​​in den Mitochondrien hergestellt werden. Ich komme gleich darauf zurück. Aber nicht alle Proteine ​​in den Mitochondrien werden in den Mitochondrien hergestellt. Einige von ihnen werden eingeliefert.

Erinnern Sie sich an die Endosymbiontentheorie, wo wir sagten, dass Mitochondrien von Bakterien stammen und von Zellen verschlungen wurden. Diese Bakterien waren offensichtlich ursprünglich autark. Aber viele der Proteine, die in den Mitochondrien exprimiert wurden, wurden weggelassen, und Mitochondrien verwenden jetzt Proteine, die von der nuklearen DNA anstelle der mitochondrialen kodiert werden. Aber bis heute bleiben einige Proteine ​​in den Mitochondrien kodiert.

Das sind also Möglichkeiten, wo das sein kann. Und ich werde ganz konkret über Signale sprechen, die Proteine ​​in die Mitochondrien und in den Zellkern bringen können. Und es stellt sich heraus, dass die Barrieren um diese Organellen ziemlich unterschiedlich sind. Ich komme gleich darauf zurück, wenn wir zur nächsten Folie kommen.

Bezüglich des Verlassens der Zelle gibt es zwei Möglichkeiten. Eine Möglichkeit besteht darin, dass das Protein in der Plasmamembran verbleibt, jedoch mit einem Teil seiner Struktur außerhalb der Zelle. Die andere Möglichkeit besteht darin, dass das Protein tatsächlich als lösliche Einheit aus der Zelle ausgespuckt wird, die sich beispielsweise im Blutkreislauf um einen Organismus herum bewegen und an einen entfernten Ort gelangen kann. Und das wird bei der Signalisierung sehr wichtig. Wir würden diese Proteine ​​also sezerniert und löslich nennen.

Diese wären also membrangebunden. Diese würden am Ende lösliche Proteine ​​sein. Schauen wir uns die Struktur der Zelle an und schauen wir uns an, wo sich diese verschiedenen Komponenten befinden.

Wenn Sie also diese Punkte sehen, sind das freie Ribosomen im Zytoplasma. Sie würden beginnen, verschiedene Proteine ​​zu exprimieren. Im Ribosom werden viele Proteine ​​exprimiert. In einigen Fällen werden Proteine ​​jedoch auf Ribosomen exprimiert, die mit dem endoplasmatischen Retikulum assoziiert sind. Und deshalb starten Sie einen Prozess, bei dem Proteine ​​​​nach außen aus der Zelle transportiert werden.

Wo Sie also hier die Sprenkel sehen, das freie Ribosom und dann die Ribosomen, die an das raue endoplasmatische Retikulum gebunden sind, hier sind Ihre Schicksale auf der rechten Seite dieses Bildes. Und hier endet das Schicksal dieser Proteine ​​auf der linken Seite dieser Art von Stammbaum, den ich Ihnen zeige. Es gibt offensichtlich noch einen weiteren Ort, an dem Proteine ​​hergestellt werden, und das sind die Mitochondrien.

Und wenn Sie sich an die erste Frage in Ihrer Prüfung erinnern, beschrieb sie die DNA, die sich in den Mitochondrien befindet. Zurück zur Endosymbiontentheorie, das ist ein kreisförmiges Stück DNA. Und es zeichnet es aus. Und die Ribosomen in den Mitochondrien ähneln eher bakteriellen Ribosomen als euch eukaryotischen Ribosomen. Denken Sie also daran, dass wir die ganze Zeit versuchen werden, in der zweiten Hälfte des Kurses das Wissen, das wir Ihnen beigebracht haben, zurückzubringen, aber Sie erinnern Sie in gewisser Weise endlos daran, das große Ganze im Auge zu behalten. Weil wir bereits mit Ihnen darüber gesprochen haben.

Dies ist nun eine schöne bildliche Vision dessen, was ich Ihnen gerade beschrieben habe. Und ich werde zuallererst über Proteine ​​sprechen, die im Zytoplasma hergestellt werden und zu verschiedenen Organellen transportiert werden können, und wie das erreicht wird. Und dann werde ich im zweiten Teil der Klasse darüber sprechen, wie Proteine ​​an die Zelloberfläche transportiert oder aus der Zelle ausgestoßen werden.

Die Schlüsselmechanismen, mit denen Proteine ​​an neue Orte transportiert werden, bestehen daher zunächst in der Verwendung von Targeting-Sequenzen, die Teil der Proteinsequenz sind. Und dies ist eine sehr verbreitete Art, wie Proteine ​​gehandelt werden. Sie sind Teil der Sequenz. Sie können sich am Amino- oder Carboxyterminus befinden. Aber sie sind in die Struktur Ihres Proteins eingewoben.

Ihr Protein wird also mit einem Barcode geliefert, der sagt, wo es unbedingt landen wird. Und für die Mitochondrien und Peroxisomen im Kern haben die Menschen beispielsweise umfangreiche Arbeit mit der Bioinformatik geleistet, um im Wesentlichen Proteinsequenzen nachzuschlagen und gemeinsame Themen bestimmter Sequenzen zu finden, die möglicherweise gemeinsam sind, wo ein Satz von Proteinen enden kann. Manchmal sind diese Sequenzen auf den ersten Blick nicht leicht zu erkennen. Aber jetzt gibt es Websites, auf denen Sie Ihre Proteinsequenz sehr, sehr einfach in die Website einfügen können, und es wird angezeigt, dass sie eine nukleäre Lokalisierungssequenz oder eine mitochondriale Targeting-Sequenz enthält. Wir können dies also entweder mit den Augen tun oder wir können die Informatikanalyse verwenden.

Die Informatikanalyse ist sehr wertvoll, da Informationen manchmal etwas verschlüsselter sind. Und es kann ein echter Kampf sein, sich durch viele Sequenzen zu kämpfen. So kann man sich durch die Bioinformatik wirklich über die Targeting-Sequenzen informieren. Denn heute sind die Genome von Dutzenden und Tausenden von Organismen leicht online verfügbar. Und Sie können buchstäblich Informationen aus den genomischen Informationen herauslesen, die Ihnen die proteomischen Informationen liefern.

Das ist also eine Möglichkeit, also mit Sequenzen, die gezielt sind. In einigen Fällen bleiben diese Targeting-Sequenzen Teil des Proteins. In anderen Fällen werden die Targeting-Sequenzen jedoch entfernt, um sicherzustellen, dass das Protein an Ort und Stelle bleibt. Das ist also ein weiterer wichtiger Punkt. Sie können die Targeting-Sequenz behalten oder sie durch die Wirkung eines anderen Enzyms verlieren, das die Targeting-Sequenz abschneidet, wenn das Ziel erreicht wurde.

Nun gibt es einen zweiten Weg, wie wir programmieren können, wohin ein Protein gehen kann. Und das sind ziemlich nützliche Transformationen, die die Dinge noch dynamischer machen. Lassen Sie mich Sie durch ein Konzept führen.

Wenn Sie an ein Protein denken, das auf dem Ribosom hergestellt wird, hat es eine Targeting-Sequenz. Um dieses Protein an seinen Bestimmungsort zu bringen, müssen Sie eine neue Proteincharge herstellen, die an seinen Bestimmungsort gelangt. Es wird in den Mitochondrien landen. Du musst das Protein de novo machen.

Manchmal, wenn wir die Aktion einer Zelle brauchen, können wir nicht so lange warten. Wir können Dinge schnell erledigen und erwarten, dass die Zelle plötzlich ändert, was sie tut. Weil wir herumsitzen und darauf warten, dass das Ribosom neue Kopien des Proteins anfertigt. Der zweite Weg, auf dem Proteine ​​zu neuen Zielen gelangen, sind also sogenannte posttranslationale Modifikationen.

Das ist so unfair, Adam. Ich habe gesehen, wie du die mittleren Bretter benutzt hast, aber es sah so viel einfacher aus.

Die zweite Möglichkeit, ein Protein zu einem Ziel zu bringen, ist die posttranslationale Modifikation. Was bedeutet das? Es bedeutet, dass das Protein hergestellt wird. Es ist fertig. Es wartet. Aber wir haben uns noch nicht mit seinem endgültigen Schicksal beschäftigt. Wir haben es nicht ausgelöst, um dorthin zu gehen, wo es sein muss. Aber wir warten darauf, dass ein Enzym nur eine scheinbar geringfügige Modifikation dieses Proteins vornimmt. Und dann wird das Protein zu seinem Schicksal gehen.

Und ich habe Ihnen hier Beispiele für drei Arten von Modifikationen gezeigt. Eine, über die wir heute sprechen werden, weil sie sehr einfach zu verstehen ist, die Lipidierung. Und dann die anderen beiden, über die wir beim nächsten Mal sprechen werden, Phosphorylierung und Ubiquitinierung.

Und das sind alles sogenannte PTMs, Post-Translational Modifications. Und es sind Veränderungen, die an einer Aminosäure-Seitenkette innerhalb eines bereits hergestellten Proteins stattfinden, um sein Schicksal zu ändern. Und ich möchte zuerst über die Lipidierung sprechen, weil ich Sie an Zellmembranen erinnern darf. Denken Sie also daran, wir haben über diese semipermeablen Barrieren gesprochen, die sich um Organellen und um Zellen herum befinden.

Und sagen wir, das ist eine Membran – ich muss sagen –, die zwischen dem Zytoplasma und der Außenseite einer Zelle existiert. Und sagen wir, ich habe ein Protein im Zytoplasma, aber ich brauche es an der Membran. Ich brauche es, um an einem Signalisierungsprozess teilzunehmen. Und ich brauche es jetzt, um da zu sein.

Wenn ich ein lösliches Protein habe, ist es nicht mit der Membran verbunden. Aber ich kann ein anderes Enzym verwenden, um einen hydrophoben, fettigen Schwanz an dieses Protein zu binden. Was es also wirklich tun möchte, ist, an die hydrophobe Membran zu gelangen. Lipidierung ist eine solche Modifikation.

Es ist nur die Modifikation mit einer langkettigen, oft C16-, C18-Fettsäure, die das Protein dann lipophil macht und dazu bringt, sich zu bewegen und diesen lipophilen Schwanz in die Membran einzufügen und das Protein der Plasmamembran zu teilen. Die Informationen sind also immer noch innerhalb des Proteins kodiert.

Wie konnte das passieren? Wie konnte ich diese Information im Protein haben? Was könnte dort die Strategie sein? Es ist noch verschlüsselt, aber es ist geheim. Es ist kryptisch. Irgendwelche Ideen?

Ich werde diese Gruppe also nicht nur auf ein Protein beschränken. Ich werde es an einer bestimmten Stelle platzieren. Und so treten Lipidierungsreaktionen oft ortsspezifisch an bestimmten Stellen innerhalb einer Sequenz auf, und ein Enzym erkennt diese Stelle und überträgt das Lipidmolekül darauf.

So kann beispielsweise am Aminoterminus eines Proteins tatsächlich eine Lipidierung erfolgen. Wenn dieses Protein jedoch bestimmte Merkmale aufweist, können Sie die Lipidgruppe anhängen. Mit Hilfe der Bioinformatik können Sie sich also wieder das interessierende Zielprotein ansehen und vorhersagen, dass es das Ziel einer posttranslationalen Modifikationsreaktion ist.

Die Informationen sind also wieder in die Sequenz einprogrammiert, aber es ist ziemlich kryptisch. Es könnte in der Mitte der Sequenz sein. Es konnte nur vielleicht ein paar Anhaltspunkte geben. Aber es gibt trotzdem Hinweise, die durch Computerlernen und Screening von Sequenzen analysiert werden können, um zu sagen, dass dies ein Ziel für die Lipidierung oder Phosphorylierung oder dergleichen ist.

Ist das den Leuten klar? Ist das sinnvoll? Die Informationen sind verschlüsselt, aber Sie können nicht sehen, dass sie vorhanden sind. Der Vorteil der posttranslationalen Modifikationen besteht jedoch darin, dass sie bei Bedarf erfolgen, anstatt ein neues Protein de novo herzustellen und es dann an einen bestimmten zellulären Ort zu bringen.

Wenn wir später über Phosphorylierung sprechen, werden Sie sehen, dass Phosphorylierung das Brot und Butter der zellulären Signalübertragung ist. Es ist der Lichtschalter in jedem Raum der Zelle, der sich ein- und ausschaltet, um Funktionen innerhalb der Zelle auszuführen. Und das ist eine wirklich große, dynamische posttranslationale Modifikation, die eine bedeutende Bedeutung hat.

Der Grund für dieses kleine Bild - ich wollte Ihnen nur die Membran zeigen und Sie nur daran erinnern, dass die Membran eine supramolekulare Struktur ist, die mit einem hydrophoben Kern und polaren Kopfgruppen auf beiden Seiten zusammengebaut ist, wie ich es irgendwie angedeutet habe diese Karikatur. Beginnen wir also mit Sequenzen, die uns zum Kern führen könnten.

Nun, die Kernmembran ist ein ziemlich seltsames Wesen. Denn die Kernmembran ist keine einfache Membran wie die Plasmamembran. Es ist eigentlich eine doppellagige Membran. Wenn Sie sich also eine Kernmembran ansehen - und ich werde nur einen Teil der Kernmembran zeigen.

Innerhalb der Kernmembran gibt es Poren, ziemlich Startöffnungen. Und die Membran ist eigentlich eine Doppelmembran mit all diesen Lipiddoppelschichten. Es ist also keine einzelne Membran. Es ist eine Doppelmembran mit großen Öffnungen.

Und Sie könnten sagen, na ja, das nützt nichts. Es gibt nur diese großen, klaffenden Löcher im Kern. Alles kann kommen und gehen, wenn es will. Aber die Kernporen sind eine besondere Struktur. Weil sie ein irgendwie ungeordnetes Protein haben, das ein verworrenes Netzwerk erzeugt. Das bedeutet, dass diese Pore nicht ganz offen ist, aber es gibt einiges, das etwas passieren muss, um von einer Seite zur anderen zu gelangen.

Und mein Kollege Thomas Schwartz in der Biologie arbeitet an der makromolekularen Struktur von Kernporen, um diese Strukturen zu verstehen. Denn diese werden auch durch die vielen Proteine ​​hergestellt, die dazu beitragen, diese Struktur zu schaffen. Andernfalls würde diese Membran nicht in ihrem richtigen Format bleiben.

Damit ein Protein also in den Kern gelangen kann, wenn es nötig ist, oder den Kern verlassen, muss es einen Mechanismus haben, um durch diese Struktur zu gelangen, die die Kernpore verstopft. Dies wäre also das Innere des Kerns. Und das wäre das Zytoplasma.

Wie auf dieser Folie gezeigt, gibt es im Kern eine bestimmte Proteinsequenz, die an ein Protein angehängt wird. Das ist als Nuclear Localization Sequence oder NLS bekannt. Und was eine NLS-Sequenz ist, ist eine kurze Sequenz von Aminosäuren, die es einem Protein ermöglicht, an seinen richtigen Bestimmungsort zu gelangen.

Und diese Sequenzen werden recht gut erkannt. Sie können am Ende sehr einfache Sequenzen sein. Ein Beispiel für ein NLS wäre also Lys – es ist nicht sehr aufregend, aber es geht einfach weiter, Lys, Lys, Lys, Arginin, Lysin. Und es kann durch hydrophobe Reste oder andere Typen begrenzt sein. Das wäre also eine typische NLS-Sequenz, die sich in einem Protein befindet.

Und ich möchte Sie daran erinnern, dass Lysin und Arginin alle Seitenketten haben, die bei physiologischem pH-Wert positiv geladen sind. Die nukleäre Lokalisierungssequenz ist also etwas, das aufgrund dieser kurzen Sequenz, die sich am N- oder C-Terminus befinden kann, leicht zu erkennen ist. Ich denke, es gibt beide Möglichkeiten. Aber es ist eine ganz klare Reihenfolge. Sie könnten sich Ihre Proteinsequenz ansehen und sagen, dass diese Sequenz ein NLS enthält.

Und es ist allein die NLS-Sequenz, die dafür verantwortlich ist, dass die Proteine ​​in die Kernpore hinein und aus ihr herauskommen. Konzentrieren wir uns hauptsächlich darauf, in den Kern zu gelangen. Grundsätzlich haben Sie eine Proteinstruktur, die an einem Terminus eine NLS-Sequenz aufweist. Und diese NLS-Sequenz bindet an ein anderes Protein.

Kreativ hattest du die Möglichkeit, Proteine ​​in der Prüfung zu benennen. Es heißt Importin. Es ist also ein Importprotein, das an das NLS bindet und infolgedessen Fracht trägt. Es wird die Fracht in den Zellkern eskortieren. Und es schickt es durch dieses Geflecht von Proteinen.

Das ist ein sehr lockeres Maschenwerk von Proteinen. Und sie sind keine geordneten Proteine. Sie sind stark ungeordnete Proteine. Sie machen also eher einen Filter als einen Stopfen. Aber sie sind definitiv etwas, das es keinem alten Protein erlaubt, durch diese Kernpore zu gehen.

NLS-Tags sind wiederum durch bioinformatische Analysen sehr leicht zu erkennen. Und was wirklich cool ist, ist, dass Sie ein Protein so umprogrammieren können, dass Sie es wollen, indem Sie das NLS manipulieren. Dies ist also eher eine schöne Reihe von Experimenten.

Nehmen wir an, wir haben ein Protein, das wir in das Zytoplasma der Zelle mikroinjizieren. Und wir wollen es so programmieren, dass es entweder in den Kern geht oder außerhalb des Kerns bleibt. Dies kann leicht erfolgen, indem eine nukleäre Lokalisierungssequenz zusammen mit einem Fluorophor-Farbstoff oder einem fluoreszierenden Protein an ein Protein angehängt wird, das es Ihnen ermöglicht, dieses Experiment zu beobachten. Wenn Sie in das Zytoplasma mikroinjizieren, wird das Protein, das ein NLS hat, durch Assoziation des NLS mit Importin in den Zellkern geleitet. Aber wenn Sie das NLS hacken, bleibt das Protein, das feststeckt, im Zytoplasma.

Nehmen wir an, Sie möchten ein neues Protein untersuchen. Ich möchte Ihnen nur zeigen, dass diese NLS-Sequenzen völlig unabhängig von der Fracht sind, die sie tragen. Sie können einfach ein NLS auf Ihr Lieblingsprotein kleben, das Sie befragen möchten.

Nehmen wir Pyruvatkinase. Es hat nichts mit dem spezifischen Transport zum Zellkern zu tun. Aber dennoch, wenn Sie sagen - wenn es kein NLS hat, ist es fluoreszierend markiert, es bleibt draußen im Zytoplasma. Aber wenn Sie eine Analyse darauf erstellen, konzentrieren Sie sich auf diesen Bereich der Zelle.

Diese Experimente zeigen Ihnen also, dass das, was wir über diese Targeting-Sequenzen wissen, manipuliert und verwendet werden kann, um es Ihnen zu ermöglichen, Dinge in der Zelle zu bewegen. Das ist also eine besondere Art von Mechanismus. Der nächste Mechanismus, den ich Ihnen beschreiben möchte, ist der Mechanismus, der für mitochondriale Transporte verwendet wird. Und es ist ein bisschen anders in seiner Strategie.

Um in die Mitochondrien zu gelangen, gibt es also wieder eine Erkennungssequenz, in diesem Fall eine mitochondriale Lokalisierungssequenz, die besondere Eigenschaften hat. In diesem Fall die mitochondriale Lokalisierungssequenz, sagen wir, sie befindet sich am N-Terminus Ihres Proteins. Und es wäre etwas, das eine Mischung aus Gebühren sein könnte. Etwas Arg, Glu, Arg, Glu. Das ist also eine typische MLS-Sequenz.

Und in diesem Fall unterscheidet sich die Ladung bei physiologischem pH-Wert von der nuklearen Lokalisierungssequenz, weil es sich um eine abwechselnde positive und negative Ladung handelt. Das ist also ziemlich anders. Es sagt nicht Bioinformatik, um das herauszufinden. So können Sie dann mitochondriale Lokalisierungssequenzen heraussuchen.

Denken Sie in diesem Fall daran, dass Mitochondrien einige ihrer eigenen Proteine ​​​​auf ihrer zirkulären DNA herstellen. Aber sie haben aufgegeben, alle Proteine ​​zu exprimieren, die in den Mitochondrien benötigt werden. Und einige Proteine ​​werden mit dieser Art von Sequenzen in die Mitochondrien transportiert. Aber der Ansatz, die Strategie, ist anders als der Einstieg in den Nukleus.

In diesem Fall assoziiert die MLS-Sequenz mit einem Proteinkanal, der sich in einem geschlossenen Zustand befindet. Hier ist also eine Membran. Hier ist das Zeug zu einem Kanal. Aber es ist in einem geschlossenen Zustand.

Aber sobald das Protein mit der NLS-Sequenz daran bindet, öffnet sich dieser Kanal. Es wird durch die Bindung dieser Sequenz an einen Teil des Proteins ausgelöst, der sich außerhalb dieser Membran befindet. Dadurch kann das Protein entfaltet und in die Mitochondrien transportiert werden, wo diese Sequenz entfernt werden kann. Und dann faltet sich das Protein in den Mitochondrien neu.

Es ist also eine ganz andere Strategie dafür und die nukleare Lokalisierungssequenz. Sie werden also feststellen, dass es für viele verschiedene Organellen in der Zelle sehr spezifische Lokalisierungssequenzen gibt, die Sie nachschlagen und lernen können. Aber eine Sache, die ich Ihnen erwähnen möchte, ist, dass diese Lokalisierungsdetails sehr wichtig sind. Und viele Krankheiten in Zellen sind eine Folge davon, dass Proteine ​​nicht an der richtigen Stelle lokalisiert werden.

Wenn Sie nicht zur richtigen Zeit am richtigen Ort sind, werden die Signale oder die Prozesse der Zelle schief gehen. Krankheiten sind daher häufig mit Fehllokalisierungen verbunden. Was wir jetzt also tun werden, ist im Grunde genommen zu sagen, dass wir uns darum gekümmert haben, die Dinge zu verstehen, die in der Zelle gemacht wurden. Sie bleiben entweder im Zytosol oder gehen zu Organellen, basierend auf bestimmten Arten von Strategien, die weitgehend von kurzen Markierungssequenzen abhängig sind, in anderen Fällen jedoch von posttranslationaler Modifikation abhängig sein können.

Gut. Hier ist also eine Karikatur. Aber eigentlich möchte ich etwas etwas anderes machen, wenn es nicht zu lange dauert.

Als wir zum ersten Mal über die Translation am Ribosom sprachen, sehen Sie dort in Grün und Gelb das Ribosom. Die dunkle Bande ist eine Boten-RNA. Die dunkelblauen sind Transfer-RNAs, denen mit Elongationsfaktoren geholfen wird, zum Ribosom zu gelangen. Aber was ich hier hervorheben möchte, ist die entstehende Polypeptidsequenz, die durch einen Tunnel am Ribosom herauskommt.

Wenn nun ein Protein außerhalb der Zelle bestimmt ist, wird es mit einer sogenannten Signalsequenz exprimiert. Es handelt sich um eine Sequenz mit 20 Aminosäureresten, die vom Signalerkennungspartikel erkannt wird. Dann verlangsamt sich die Translation und klemmt das Ribosom an die Membran des endoplasmatischen Retikulums, sodass das neue Peptid durch das sogenannte Translokon in das endoplasmatische Retikulum eingefädelt wird. Sie senden das Protein jetzt also nicht in das Zytoplasma, sondern eher in das endoplasmatische Retikulum. Und Sie schicken es auch über diesen Zweig des Proteinbiosynthesewegs.

Sie sehen, wie dieses Stück Protein entsteht. Dieser schraffierte Teil ist das Zytoplasma. Der graue Teil ist das endoplasmatische Retikulum. Es ist also eine komplexe Maschinerie im Spiel, die es ermöglicht, Proteine ​​im Zytoplasma herzustellen, aber jetzt an einen völlig neuen Ort gerichtet. Und das sind die Proteine, die dazu bestimmt sind, entweder in der Plasmamembran zu bleiben oder von der Zelle abgesondert zu werden.

Und diese Ansicht hier gibt Ihnen ein bisschen mehr als der Cartoon. Ribosom – ein Signalpeptid wird hergestellt, das eine grüne Peptidsequenz ist, die etwa 20 Aminosäuren lang ist. Das nennt man eigentlich ein Signalpeptid. Es signalisiert die Synthese durch das Endomembran-Netzwerk.

Dadurch docken die Ribosomen an die Zytosol-ER-Membran an und werden weiter synthetisiert, sodass Proteine ​​in dieses Endomembransystem eingebaut werden. Und Sie können sich dieses höhlenartige Endomembransystem als Ihre Tunnel aus einer Zelle vorstellen, die entweder auf der Oberfläche der Zelle angezeigt oder vollständig in Vesikeln abgesondert wird. Schauen wir uns also an, wie das geschieht.

Wenn Sie auf diese Weise ein Protein herstellen, sehen Sie die dunklen Punkte, das raue ER? Dies sind Ribosomen, die an der Membran befestigt sind. Proteine ​​werden in die Membran eingebaut. Und dann ist das Endomembransystem nicht wirklich nur ein Tunnel oder ein Labyrinth. Aber tatsächlich spuckt jede dieser Schichten Vesikel aus, die mit den nächsten Schichten verschmelzen, um nach und nach aus den Zellen herauszukommen.

Hier sehen Sie also, dass es Vesikel gibt. Sie halten immer Proteine, die mit der Membran verbunden sind, während Sie das Endomembransystem durchlaufen. Und hier ist ein Vesikel, das Protein enthält. Es kann es entweder an die Außenseite der Zelle abgeben oder das Protein kann mit der Membran des Vesikels assoziiert sein und in der Plasmamembran geparkt bleiben.

Deshalb möchte ich Ihnen nur eine letzte Folie geben, in der ich über die Biogenese von Membranproteinen spreche. Nun, das ist ziemlich kompliziert. Denn man muss sich daran erinnern, was drinnen und draußen ist. Ich habe also mehr Zeit in diesen Cartoon investiert, als ich hätte haben sollen, um Ihnen zu zeigen, welches Ende des Proteins außerhalb der Zelle und welches innerhalb der Zelle landet und wie Sie Multimembran-übergreifende Proteine ​​herstellen.

Schauen wir uns das jetzt im Detail an, schauen wir uns das Ribosom an. Hier entsteht das Protein. Wenn dort eine Signalsequenz vorhanden ist, dockt dieses Ribosom an der Membran an und beginnt, das Protein mit dem Aminoterminus zuerst in das endoplasmatische Retikulum zu übersetzen. Damit kommen wir alle zurecht.

Wenn die Synthese fortschreitet, können wir das Stoppcodon auf der Boten-RNA erreichen. Und was passieren kann, ist, dass das Protein mit der Membran verbunden bleiben kann. Der Aminoterminus befindet sich im ER. Und der C-Terminus bleibt auf der anderen Seite. Es gibt verschiedene Konfigurationen.

Aber wenn wir anfangen wollen, dieses Protein an die Oberfläche der Zelle zu transportieren, bleibt es mit der Membran verbunden, aber nicht in Form der flachen Membran, in die es geliefert wurde. Aber diese Membran kann sich zu einem kugelförmigen Vesikel abschnüren. Aber Sie haben immer noch den C-Terminus außen und den N-Terminus innen. Das wird sich dann durch das Endomembransystem durcharbeiten und schließlich mit dem Zytosol fusionieren. Dies ist der wirklich lustige Teil.

Und dann, sobald es mit dem Zytosol fusioniert ist, kann es auf der Außenseite der Zelle angezeigt werden. Wieso den? Sie haben ein Protein. Der N-Terminus befindet sich außen. Der C-Terminus befindet sich auf der Innenseite.

Das zeigt Ihnen also die Biogenese des Zelloberflächenproteins, das durch seine membranassoziierte Domäne in der Membran steckt. Wenn Sie nicht bei der Membran bleiben möchten, können Sie diese tatsächlich auch einfach in das Vesikel abgeben, um ein lösliches Protein freizusetzen. Ich werde das nicht durchmachen. Aber es gibt wundersame Schritte, die in der Biogenese von Multi-Transmembran-Proteinen enden.

Weil jede dieser Transmembrandomänen im Translokon hergestellt und seitwärts bewegt wird. Und Sie beginnen, Transmembrandomänen anzuhäufen, die die Membran überspannen. Und im nächsten Kurs werden wir sehen, wie nützlich diese Proteine ​​für die zelluläre Signalübertragung sind. Das sind also sehr wichtige Proteine, über die man nachdenken sollte.

Eine letzte Sache – also denken wir darüber nach. Wann definieren wir für jede Konfiguration, entweder posttranslationale Modifikation oder die Verwendung von Targeting-Sequenzen, wo das Protein enden wird? Wo werden die Informationen zuerst definiert? Will mir jemand antworten und erklären warum? Jawohl?

PUBLIKUM: Wäre es B, die mRNA-Sequenz, weil diese einen erheblichen Teil des Spleißens ausmachen würde?

BARBARA IMPERIALI: Es ist ein guter Versuch. Aber Sie möchten sich erinnern, ja, Spleißen ist wichtig. Doch wann befand sich die Sequenz eigentlich in der gesamten prä-mRNA? Wann wäre das definiert worden? Ja? Es tut uns leid. Carmen?

PUBLIKUM: Liegt es an der genomischen DNA-Sequenz?

BARBARA IMPERIALI: Ja. Weil Sie nie Informationen in der RNA haben, die nicht in der DNA waren. Die DNA hat also die Informationen dort. Ja, es kann ein wenig Spleißen erfordern, um die Dinge an die richtige Stelle zu bringen. Aber die Informationen sind in der DNA vorhanden.

Sie sollten sich also daran erinnern, dass all diese Targeting-Informationen am häufigsten in den genomischen Informationen enthalten sind. Es sind die genomischen Informationen, die die Muster von Sequenzen für die posttranslationale Modifikation aufweisen. Es sind die genomischen Informationen, die Dinge wie NLSes und MLSes enthalten. Sie sind schon da.

Aber sie sind oft verschlüsselt. Und es gab einen sehr schönen Punkt. Wenn Sie senden möchten, um einen einzelnen Abschnitt eines Genoms herzustellen, das entweder ein Protein codiert, das über den sekretorischen Weg exportiert wird oder im Zytosol verbleibt, können Sie eine Signalsequenz ein- oder ausspleißen. Das ist also ein wirklich guter Weg, unter Verwendung der gleichen ursprünglichen DNA-Sequenz tatsächlich zu Proteinen zu gelangen, die verschiedene endgültige Schicksale innerhalb der Zelle erfüllen. Also werden wir das nächste Mal über Signalisierung sprechen. Es wird ein Knaller.


Expression, Modifikation und Lokalisierung des Fushi-Tarazu-Proteins in Drosophila-Embryonen.

Das Protein Fushi Tarazu (ftz) von Drosophila wird während der Embryogenese für den Prozess der Körpersegmentierung benötigt. Um die biochemischen Eigenschaften des ftz-Proteins zu untersuchen, wurde ftz-cDNA in Escherichia coli exprimiert und das Protein bis zur Homogenität gereinigt. Gegen das gereinigte Protein erzeugte polyklonale Antikörper wurden verwendet, um das Protein während der Embryogenese zu lokalisieren und zu quantifizieren. Es wurden drei zeitlich und räumlich unterschiedliche Expressionsphasen beobachtet, die eine zuvor unentdeckte Phase später in der Embryogenese einschließen. Während dieser letzten Phase ist das Protein hauptsächlich im sich entwickelnden Enddarm lokalisiert. Die Analyse des embryonalen ftz-Proteins auf Western-Blots erlaubte uns, die Anzahl der Proteinmoleküle pro Kern zu ungefähren. Während der Entwicklungsphase des Blastoderms, wenn das Ftz-Protein am häufigsten vorkommt, schätzen wir, dass ungefähr 20.000 Proteinmoleküle pro ftz-exprimierendem Kern vorhanden sind. Das embryonale ftz-Protein wandert auf SDS-Polyacrylamidgelen langsamer als Protein, das in vitro entweder in E. coli oder in einem Retikulozyten-Lysatsystem hergestellt wurde, was darauf hindeutet, dass es im Embryo modifiziert wird. Um die Charakterisierung des in Embryonen hergestellten ftz-Proteins zu erleichtern, wurde ein in Drosophila funktionierendes ftz-Überexpressionssystem entwickelt. Bei Fusion mit einem hsp70-Hitzeschock-Promotor und Einführung in die Keimbahn durch P-Element-vermittelte Transformation konnte ftz in allen Entwicklungsstadien durch Hitzeschock überexprimiert werden. Dieses Protein ist im Kern lokalisiert und wandert auf SDS-Polyacrylamidgelen mit endogenem ftz-Protein. Zweidimensionale Gelelektrophorese gefolgt von Western-Blotting löst das überexprimierte Protein in eine Reihe von Isoformen auf, die sich in Ladung und elektrophoretischer Mobilität unterscheiden. Posttranslationale Modifikation kann die biochemischen Eigenschaften und Funktionen des ftz-Proteins während der Embryogenese beeinflussen.


Schau das Video: What is a Protein? from PDB-101 (August 2022).