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12.2: Immunoassays für Krankheiten - Biologie

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12.2: Immunassays für Krankheiten

Oberflächenverstärkte Raman-Streuungs-basierte Immunoassay-Technologien zum Nachweis von Krankheitsbiomarkern

Der Nachweis von Biomarkern ist von entscheidender Bedeutung für die Erkennung, das Management und die Überwachung der therapeutischen Wirksamkeit. Umfangreiche Anstrengungen wurden der Entwicklung neuartiger Diagnosemethoden gewidmet, die Biomarker mit höherer Sensitivität und Zuverlässigkeit erkennen und quantifizieren und so zu einer besseren Diagnose und Prognose von Krankheiten beitragen. Wenn es um so verheerende Krankheiten wie Krebs geht, ermöglichen diese neuartigen, leistungsstarken Methoden das Stadium der Erkrankung sowie die Erkennung von Krebs in sehr frühen Stadien. In den letzten zehn Jahren wurden einige Fortschritte bei der Entwicklung von Plattformen für die Biomarkererkennung von Krankheiten erzielt. Der Schwerpunkt hat sich in letzter Zeit auf die Entwicklung einfacher und zuverlässiger diagnostischer Tests verlagert, die kostengünstig und genau sind und den Krankheitsverlauf und das Therapieansprechen eines Patienten verfolgen können. Der individualisierte Ansatz beim Nachweis von Biomarkern wurde auch durch den Nachweis mehrerer Biomarker in Körperflüssigkeiten wie Blut und Urin betont. Dieser Übersichtsartikel behandelt die Entwicklungen im Bereich der oberflächenverstärkten Raman-Streuung (SERS) und verwandter Technologien mit dem primären Fokus auf Immunoassays. Einschränkungen und Vorteile der SERS-basierten Immunoassay-Plattform werden diskutiert. Der Artikel beschreibt ausführlich alle Komponenten des SERS-Immunoassays und hebt die überlegenen Fähigkeiten der SERS-Auslesestrategie hervor, wie z. B. hohe Sensitivität und gleichzeitige Detektion einer Vielzahl von Biomarkern. Schließlich werden kürzlich entwickelte Strategien für die In-vivo-Biomarker-Detektion mit SERS vorgestellt.

Schlüsselwörter: Oberflächenverstärkte Raman-Streuungs-Biomarker-Immunoassay-Nanodiagnostik.

Interessenkonflikt-Erklärung

Die Autoren geben keinen Interessenkonflikt an.

Figuren

Schematische Darstellung der Immunoassay-Detektion…

Schematische Darstellung der Immunoassay-Nachweisplattform. ( EIN ) Das Fangsubstrat ist…

Immunoassay vom Sandwich-Typ mit SERS-Substrat…

Immunoassay vom Sandwich-Typ mit SERS-Substrat, hergestellt aus auf dem Glasobjektträger immobilisierten AuNPs…

SERS-basierter Sandwich-Immunoassay. ( EIN…

SERS-basierter Sandwich-Immunoassay. ( EIN ) Capture-Substrat aus einem dünnen, glatten…

Abhängigkeit des LSPR-Peaks von der Form…

LSPR-Peak-Abhängigkeit von Form und Zusammensetzung plasmonischer Tags. ( EIN )…

Schutz von SERS-basierten Immunoassays. (…

Schutz von SERS-basierten Immunoassays. ( EIN ) Zeitabhängigkeit der Signalintensität…

Proof-of-Principle Multiplex-Assay mit drei…

Proof-of-Principle-Multiplex-Assay mit drei verschiedenen Raman-Reporter-Molekülen. Einzelne Raman-Spektren überlagert…

Linkes Feld: schematische Darstellung von…

Linkes Panel: Schematische Darstellung verschiedener SERS-Tags, bestehend aus Ein-, Zwei- und…


Immunoassays

N. Alice Lee , Ivan R. Kennedy , in der Analyse von Lebensmitteltoxinen , 2007

1 Übersicht Immunoassays

Die Untersuchung der Antigenität kleiner Moleküle durch Landsteiner im Jahr 1917 hat den Rahmen für die Entwicklung immunologischer Assays zum Nachweis niedermolekularer Verbindungen geschaffen. Landsteiner stellte fest, dass die Spezifität des ursprünglichen Trägerproteins durch die neu eingeführten Gruppen verändert wurde, die selbst nicht immunogen waren [ 1 ]. Seine wichtigste Erkenntnis bezog sich auf die exquisite Spezifität von Antiseren, die durch seine klassischen Studien mit L-, D- und meso-Weinsäure, und m- Aminobenzoat [ 1–3 ]. Die ersten kompetitiven Bindungsassays mit radioaktiv markierten Liganden wurden 1959 von Berson und Yallow entwickelt [4]. Seitdem wurden Immunoassays in einer Vielzahl von wissenschaftlichen Disziplinen wie Endokrinologie, biomedizinische und klinische Chemie angewendet, was durch die Vereinfachung der Testformate, die Verfügbarkeit elektronischer Instrumente und die Entwicklung der monoklonalen Technologie durch Kohler und Milstein im Jahr 1975 erleichtert wurde [ 5 ] . Ihre Anwendung in der analytischen Chemie, insbesondere in der Lebensmittelkontaminationsanalytik, begann erst in den letzten drei Jahrzehnten und die Methode wurde zunehmend als leistungsfähiges analytisches Werkzeug anerkannt.

1.1 Vorteile von Immunoassays

Immunoassays bieten eine Reihe von Vorteilen bei der Analyse von Lebensmittelkontaminanten gegenüber herkömmlichen Methoden wie HPLC und GC. Immunoassays können eine schnelle, einfache und kostengünstige Nachweismethode bieten, deren Sensitivität und Spezifität vergleichbar oder (in einigen Fällen) besser ist als die herkömmlicher Methoden. Noch wichtiger ist, dass mit Immunoassays eine Vor-Ort-Analyse möglich ist [ 6 ]. Die einfache Automatisierung und die Vielseitigkeit in den Anwendungen des Immunoassays haben diese Methode in den letzten Jahren auch populärer gemacht.

Einer der Hauptvorteile des Immunoassays ist die Geschwindigkeit der Analyse. Bei instrumentellen Methoden kann eine umfangreiche Probenreinigung erforderlich sein, um Interferenzen zu beseitigen, und dies kann oft der geschwindigkeitsbestimmende Schritt bei der Rückstandsanalyse sein. Die für die instrumentelle Analyse erforderliche mühsame Probenvorbereitung schränkt ihre Einsatzmöglichkeiten in Situationen ein, in denen eine große Anzahl von Analysen erforderlich ist, auch wenn die tatsächliche Zeit für jede einzelne Analyse am Gerät vergleichsweise kurz sein kann. Immunoassays haben eine Kapazität für einen hohen Durchsatz und zahlreiche Proben können gleichzeitig analysiert werden, was die durchschnittliche Analysezeit erheblich verkürzt. Als Beispiel ist in Tabelle 1 ein Vergleich instrumenteller Methoden und Immunoassays für Aflatoxine angegeben.

Tabelle 1 . Vergleich verschiedener Techniken zur Analyse von Lebensmittelkontaminanten

MykotoxinMinispalteTLCHPLCIACELISA
Nachweisgrenze (ng/g)55& 1methodenabhängig1-5
Reinigung pro Probe (min)60-12060-12060-12010-3010-30
Detektion pro Probe (min)30120-36012015-3010
Quantifizierung pro Probe (min)1-510305-301-5
Gesamtzeit (min)151 - 15549027045 – 9015 - 50

DC = Dünnschichtchromatographie

HPLC = Hochleistungsflüssigkeitschromatographie

IAC = Immunoaffinitätschromatographie

ELISA = Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay

Zu den Hauptkosten, die bei der Analyse von Lebensmittelverunreinigungen durch instrumentelle Verfahren anfallen, gehören chemische Reagenzien, Lösungsmittel, die Arbeit des technischen Personals und die Investitionskosten von Instrumenten. Infolgedessen sind Immunoassays, sofern verfügbar, bei begrenzten Mitteln und begrenzter Infrastruktur wahrscheinlich kosteneffektiver. Die Kapitalkosten für die Einrichtung eines Immunoassay-Labors sind vergleichsweise um ein Vielfaches niedriger, daher sind die Hauptkosten beim Immunoassay größtenteils die Zeit des Analytikers. Die geschätzten Kosten pro Probe sind bei Immunoassays häufig bis zu zehnmal niedriger als bei instrumentellen Analysen. Daher können mit Immunoassays mehr Proben analysiert werden, was ein zwingender Faktor für zuverlässige Ergebnisse sein kann.

Die Sensitivität des Immunoassays ist oft genauso gut oder besser als die der instrumentellen Methoden. Immunoassays erfordern eine geringere Konzentration von Analyten in festen Matrices wie Lebensmitteln, während Wasserproben im Allgemeinen ohne Vorkonzentration analysiert werden. Empfindliche Immunoassays für jene Pestizide und Mykotoxine, die ansonsten für die instrumentelle Analyse derivatisiert werden müssen, wurden entwickelt und eliminieren effektiv den Derivatisierungsschritt. Einige Beispiele für Immunoassays für Pestizide sind 2,4-D [ 7–9 ], Diuron [ 10–12] und Permethrin [ 13 , 14 ]. Beispiele für Mykotoxine sind Aflatoxine [ 15 , 16 ] und Fumonisine [ 17 ].

Immunoassays, die für Lebensmittelkontaminanten entwickelt wurden, können entweder verbindungsspezifisch oder gruppenspezifisch oder spezifisch für eine bestimmte chemische Konfiguration sein. Während das Screening einer Klasse von Verbindungen mit einem gruppenspezifischen Immunoassay mit breiter Spezifität, der auf eine gemeinsame chemische Einheit gerichtet ist, möglich ist, ermöglicht die Fähigkeit eines Antikörpers, spezifisch an die Verbindung zu binden, die Verwendung des Immunoassays für die quantitative Analyse eines spezifischen Analyten. Es ist sogar möglich, einen Immunoassay zu entwickeln, der für ein einzelnes Stereoisomer spezifisch ist und den Nachweis nur des insektiziden aktiven Isomers ermöglicht. Beispiele für eine solch hohe Stereospezifität sind Immunoassays, die für S-Bioallethrin [ 18 , 19 ], Bioresmethrin [ 20 ] und Deltamethrin [ 21 ] entwickelt wurden. Ein spezifischer Antikörper für ein Kongener ist ebenfalls möglich und gute Beispiele sind Aflatoxin B1 [ 16 ] und Ochratoxin A [ 22 ].

Die Vor-Ort-Analyse möglicher Schadstoffe hat in den letzten Jahren in der Agrar- und Lebensmittelindustrie an Bedeutung gewonnen. Beispielsweise wurden Pestizidverluste durch Verflüchtigung oder Abbau während der Lagerung und des Transports zum analytischen Labor beobachtet [ 23 ]. Die Untersuchung auf Veterinärrückstände in Schlachthöfen oder die Aussonderung von mykotoxinbelasteten Produkten in den Annahmebuchten [ 24 ] sind heute fester Bestandteil des Kontaminationsmanagements. Für Lebensmittelverunreinigungen wurden benutzerfreundliche einfache Feldimmunoassays entwickelt und einige kommerzialisiert. Beispiele hierfür sind Atrazin [ 25 ], 2,4-D [ 26 ], Cyclodien [ 27 ], Aflatoxin B1 [ 28 , 29 ] und Fumonisine [ 30 ]. Die in letzter Zeit weit verbreitete Einführung der Immunchromatographie-Technik in der Kontaminationsanalyse ist das Ergebnis der steigenden Nachfrage nach Werkzeugen zur schnellen Entscheidungsunterstützung, die eine minimale Probenvorbereitung erfordern. Offensichtlich wären schnelle Antikörper-basierte Tests wie diese oder modifizierte Formen für Landwirte, Berater und Aufsichtsbehörden bei ihrer Entscheidungsfindung zum Kontaminantenmanagement von großem Nutzen.

1.2 Nachteile von Immunoassays

Obwohl der Immunoassay, wie oben diskutiert, viele Vorteile bietet, ist er auch durch eine Reihe von Unzulänglichkeiten begrenzt. Diese sind:

die lange Entwicklungszeit, die erforderlich ist, um Immunreagenzien für neue Analyten vorzubereiten

Ungeeignet für die Mehrrückstandsanalyse, da Immunoassays meist nur etwa zwei bis fünf verwandte Verbindungen nachweisen können

die begrenzte Menge an Informationen, die in Assays geliefert werden

sehr wenige Immunoassays haben offiziellen Status

Eine neue Analysemethode auf Basis von GC oder HPLC kann in der Regel in mehreren Wochen entwickelt und validiert werden. Die Entwicklung eines validierten Immunoassays dauert jedoch mehrere Monate bis über ein Jahr. Die Verfahren bei der Entwicklung von Immunoassays sind komplizierter als bei GC- oder HPLC-Methoden. Die mit dieser Entwicklung verbundenen Kosten können im Vergleich zur Entwicklung von GC- oder HPLC-Methoden, für die bereits Geräte verfügbar sind, ebenfalls hoch sein. Daher ist eine sorgfältige Überlegung erforderlich, bevor mit der Immunoassay-Entwicklung fortgefahren wird.

Die Mehrfachrückstandsanalyse in Immunoassays hat nicht dieselbe Bedeutung wie bei instrumentellen Verfahren. Sie sind in der Regel in der Lage, zwei bis fünf Verbindungen mit ähnlicher Struktur derselben Pestizidklasse nachzuweisen, jedoch keine strukturell unterschiedlichen Verbindungen - zum Beispiel weisen Immunoassays, die für chlororganische Insektizide entwickelt wurden, keine Organophosphat-Insektizide nach [ 27 ]. Die GC- oder HPLC-Methoden hängen von der Reaktion des Instruments ab, um ein Analytsignal als Peak bei einer bestimmten Retentionszeit zu erzeugen, was eine quantitative Analyse jeder Verbindung ermöglicht. Im Gegensatz dazu liefert das Nachweissystem des Immunoassays nicht immer eine quantitative Analyse, außer wenn der Nachweis jeder Verbindung in einer Gruppe von gleicher Empfindlichkeit ist, eine sehr seltene Situation. So sind beispielsweise Immunoassays für Cyclodien-Insektizide [ 27 ], Sulfonylharnstoff-Herbizide [ 31 ] und Sulfonamid-Antibiotika [ 32 ] aufgrund ihrer unterschiedlichen Affinität zu einzelnen Verbindungen nur als Screening-Tools geeignet. Der Nachweis einer einzelnen interessierenden Verbindung kann auch aus einem Pool unbekannter Kontaminanten schwierig sein, und das Vorhandensein von Verbindungen mit ähnlicher Struktur in der Probe kann zu einer erheblichen Anzahl falsch positiver Ergebnisse führen. Dennoch können mit zusätzlichen Informationen, wie z. B. dem Wissen darüber, welche Verbindungen in letzter Zeit angewendet wurden, in der Regel nützliche Schlussfolgerungen aus den Daten gezogen werden.

Derzeit haben nur wenige Immunoassay-Methoden offiziellen Status und dies sind überwiegend Mykotoxin-ELISAs. Da Immunoassays auf die Verwendung biologischer Reagenzien wie Antikörper und Enzymkonjugate angewiesen sind, wird ELISA von vielen Analytikern, die an chemische Methoden gewöhnt sind, oft fälschlicherweise als biologische Methode beschrieben. Darüber hinaus hat das Fehlen einer umfassenden Validierung von Immunoassays mit Daten aus angefallenen und natürlich kontaminierten Proben ihr Potenzial in vielen Labors verlangsamt, obwohl inzwischen Immunoassays für die meisten der wichtigsten Lebensmittelkontaminanten entwickelt wurden ( Tabelle 2 ) und in verschiedenen Situationen.

Tabelle 2 . ELISAs für Pestizide, Mykotoxine und Tierarzneimittel entwickelt.


Ein Chemilumineszenz-Immunoassay zum schnellen Nachweis von E2-Antikörpern gegen das klassische Schweinepestvirus in Schweineserumproben

Staatliches Schlüssellabor für Veterinärätiologische Biologie, Nationales Referenzlabor für Maul- und Klauenseuche, Lanzhou Veterinary Research Institute, Chinesische Akademie für Agrarwissenschaften, Lanzhou, Gansu, China

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Jiangsu Co-Innovation Center for the Prevention and Control of wichtigen Tierinfektionskrankheiten und Zoonosen, Yangzhou, Jiangsu, China

Li Pan und Yongguang Zhang, Staatliches Schlüssellabor für Veterinärätiologische Biologie, Nationales Referenzlabor für Maul- und Klauenseuche, Lanzhou Veterinary Research Institute, Chinesische Akademie für Agrarwissenschaften, Lanzhou, Gansu, China.

Staatliches Schlüssellabor für Veterinärätiologische Biologie, Nationales Referenzlabor für Maul- und Klauenseuche, Lanzhou Veterinary Research Institute, Chinesische Akademie für Agrarwissenschaften, Lanzhou, Gansu, China

Jiangsu Co-Innovation Center zur Prävention und Bekämpfung wichtiger Tierinfektionskrankheiten und Zoonosen, Yangzhou, Jiangsu, China

Li Pan und Yongguang Zhang, Staatliches Schlüssellabor für Veterinärätiologische Biologie, Nationales Referenzlabor für Maul- und Klauenseuche, Lanzhou Veterinary Research Institute, Chinesische Akademie für Agrarwissenschaften, Lanzhou, Gansu, China.

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Abstrakt

Die hohe Leistungsfähigkeit von Chemilumineszenz-Immunoassays (CLIAs) in der Diagnostik wurde in den letzten Jahren nach und nach erkannt, über ihre Anwendung in der Diagnostik der klassischen Schweinepest (CSF) wurde jedoch nicht berichtet. Hier wurde ein rekombinantes E2-(rE2)-Protein und ein Peroxidase-konjugierter monoklonaler Antikörper (MAb G5) verwendet, um einen kompetitiven Chemilumineszenz-Immunoassay (cCLIA) zum schnellen und genauen Nachweis von E2-spezifischen Antikörpern in Schweineserum zu entwickeln. Um die Durchführbarkeit von cCLIA in der CSF-Diagnostik zu bewerten, haben wir als Kontrolle einen kompetitiven Enzyme-linked Immunosorbent Assay (cELISA) entwickelt. Unter den optimalen Testbedingungen zeigte cCLIA ein höheres Signal-Rausch-Verhältnis als der Kontroll-cELISA. Die besten Signal-Rausch-Verhältnisse von cCLIA und cELISA betrugen 70 bzw. 17. Anschließend wurde die diagnostische Leistung der beiden Assays durch Untersuchung einer Reihe von Schweineserumproben (n = 285) mit einem bestätigten Status, und cCLIA zeigte höhere diagnostische Sensitivität (Dn) und diagnostische Spezifität (Dp) als die des cELISA. Die Dn und Dp von cCLIA betrugen 97,49 % bzw. 96,08 % und die von cELISA betrugen 93,97 % bzw. 94,12 %. Darüber hinaus kann cCLIA innerhalb von 20 Minuten Ergebnisse liefern, während der Kontroll-cELISA mindestens 1 Stunde benötigt. Demnach hat das neu entwickelte cCLIA eine potenzielle Anwendung in der Liquordiagnostik und bietet einen alternativen Ansatz für den effizienten und schnellen Nachweis von E2-spezifischen Antikörpern.


Inhalt

Als analytischer biochemischer Assay und als "Wet-Lab"-Technik beinhaltet ELISA den Nachweis eines Analyten (dh der spezifischen Substanz, deren Vorhandensein quantitativ oder qualitativ analysiert wird) in einer flüssigen Probe durch ein Verfahren, bei dem während der Analyse weiterhin flüssige Reagenzien verwendet werden (dh kontrollierte Abfolge biochemischer Reaktionen, die ein Signal erzeugen, das leicht quantifiziert und als Maß für die Menge des Analyten in der Probe interpretiert werden kann), das flüssig bleibt und in einer Reaktionskammer oder gut benötigt wird, um die Reaktanten enthalten zu halten. [2] [3] Dies steht im Gegensatz zu "Trockenlabor"-Techniken, die Trockenstreifen verwenden. Selbst wenn die Probe flüssig ist (z. B. ein kleiner gemessener Tropfen), beinhaltet der letzte Nachweisschritt bei der "trockenen" Analyse das Ablesen eines getrockneten Streifens durch Methoden wie Reflektometrie und benötigt keine Reaktionskammer, um ein Überlaufen oder Vermischen zwischen den Proben zu verhindern . [4]

Als heterogener Assay trennt ELISA einige Komponenten des analytischen Reaktionsgemisches durch Adsorption bestimmter Komponenten an eine feste Phase, die physikalisch immobilisiert ist. Beim ELISA wird eine flüssige Probe auf eine stationäre Festphase mit speziellen Bindungseigenschaften gegeben, gefolgt von mehreren flüssigen Reagenzien, die nacheinander zugegeben, inkubiert und gewaschen werden, gefolgt von einer optischen Veränderung (z. B. Farbentwicklung durch das Produkt eines Enzyms). Reaktion) in der endgültigen Flüssigkeit in der Vertiefung, aus der die Menge des Analyten gemessen wird. Die quantitative "Ablesung" basiert normalerweise auf der Detektion der Intensität des durchgelassenen Lichts durch Spektrophotometrie, was die Quantifizierung der Transmission einer bestimmten Lichtwellenlänge durch die Flüssigkeit (sowie des transparenten Bodens der Vertiefung im Plattenformat mit mehreren Vertiefungen) beinhaltet. . [2] [3] Die Nachweisempfindlichkeit hängt von der Verstärkung des Signals während der analytischen Reaktionen ab. Da Enzymreaktionen sehr bekannte Amplifikationsverfahren sind, wird das Signal von Enzymen erzeugt, die in festen Anteilen an die Nachweisreagenzien gebunden sind, um eine genaue Quantifizierung zu ermöglichen, und daher der Name "enzyme-linked". [5]

Der Analyt wird auch Ligand genannt, da er spezifisch an ein Nachweisreagenz bindet oder daran ligiert, daher fällt ELISA in die größere Kategorie von Ligandenbindungsassays. [2] Das ligandenspezifische Bindungsreagenz wird "immobilisiert", dh normalerweise auf den transparenten Boden und manchmal auch die Seitenwand einer Vertiefung aufgetragen und getrocknet [6] (hier die stationäre "feste Phase"/"festes Substrat" bis hin zu festen Mikropartikeln/Beads, die weggespült werden können), die normalerweise als Multi-Well-Platte aufgebaut ist, die als "ELISA-Platte" bekannt ist. Herkömmlicherweise wird, wie bei anderen Formen von Immunoassays, die Spezifität einer Reaktion vom Antigen-Antikörper-Typ verwendet, da es leicht ist, einen Antikörper spezifisch gegen ein Antigen in großen Mengen als Reagens herzustellen. Wenn der Analyt selbst ein Antikörper ist, kann alternativ dessen Zielantigen als Bindungsreagenz verwendet werden. [7]

Vor der Entwicklung des ELISA war die einzige Möglichkeit, einen Immunoassay durchzuführen, der Radioimmunoassay, eine Technik, bei der radioaktiv markierte Antigene oder Antikörper verwendet werden. Beim Radioimmunoassay liefert die Radioaktivität das Signal, das anzeigt, ob ein spezifisches Antigen oder Antikörper in der Probe vorhanden ist. Der Radioimmunoassay wurde erstmals 1960 in einer wissenschaftlichen Arbeit von Rosalyn Sussman Yalow und Solomon Berson beschrieben. [8]

Da Radioaktivität eine potenzielle Gesundheitsgefahr darstellt, wurde nach einer sichereren Alternative gesucht. Eine geeignete Alternative zum Radioimmunoassay würde das radioaktive Signal durch ein nichtradioaktives Signal ersetzen. Wenn Enzyme (wie Meerrettichperoxidase) mit geeigneten Substraten (wie ABTS oder TMB) reagieren, kommt es zu einer Farbänderung, die als Signal verwendet wird. Allerdings muss das Signal mit der Anwesenheit von Antikörper oder Antigen in Verbindung gebracht werden, weshalb das Enzym an einen geeigneten Antikörper gebunden werden muss. Dieser Verknüpfungsprozess wurde unabhängig von Stratis Avrameas und G. B. Pierce entwickelt. [9] Da es notwendig ist, ungebundene Antikörper oder Antigene durch Waschen zu entfernen, muss der Antikörper oder das Antigen an der Oberfläche des Behälters fixiert werden, d. h. das Immunsorbens muss hergestellt werden. Eine Technik, um dies zu erreichen, wurde 1966 von Wide und Jerker Porath veröffentlicht. [10]

1971 veröffentlichten Peter Perlmann und Eva Engvall von der Universität Stockholm in Schweden sowie Anton Schuurs und Bauke van Weemen in den Niederlanden unabhängig voneinander Veröffentlichungen, die dieses Wissen in Methoden zur Durchführung von EIA/ELISA synthetisierten. [11] [12]

Herkömmliche ELISA beinhalten typischerweise chromogene Reporter und Substrate, die irgendeine Art von beobachtbarem Farbwechsel erzeugen, um das Vorhandensein von Antigen oder Analyt anzuzeigen. Neuere ELISA-ähnliche Techniken verwenden fluorogene, elektrochemilumineszente und quantitaoppositionive PCR-Reporter, um quantifizierbare Signale zu erzeugen. Diese neuen Reporter können verschiedene Vorteile haben, darunter höhere Empfindlichkeiten und Multiplexing. [13] [14] Neuere Assays dieser Art sind technisch gesehen keine reinen ELISAs, da sie nicht „enzyme-linked“, sondern mit einem nichtenzymatischen Reporter verknüpft sind. Da die allgemeinen Prinzipien dieser Assays jedoch weitgehend ähnlich sind, werden sie oft in dieselbe Kategorie wie ELISAs eingeordnet.

Im Jahr 2012 konnte ein ultrasensitiver, enzymbasierter ELISA-Test unter Verwendung von Nanopartikeln als chromogener Reporter ein Farbsignal mit bloßem Auge aus dem Nachweis von bloßen Attogrammen des Analyten liefern. Bei positiven Ergebnissen erscheint eine blaue Farbe und bei negativen rot. Beachten Sie, dass dieser Nachweis nur die Anwesenheit oder Abwesenheit von Analyten bestätigen kann, nicht die tatsächliche Konzentration. [fünfzehn]

Es gibt viele ELISA-Tests für bestimmte Moleküle, die die passenden Antikörper verwenden. ELISA-Tests werden in verschiedene Testtypen unterteilt, je nachdem, wie die Analyten und Antikörper gebunden und verwendet werden. [16] [17] Die wichtigsten Typen werden hier beschrieben. [18]

Direkte ELISA-Bearbeitung

Die Schritte des direkten ELISA [19] folgen dem folgenden Mechanismus:

  • In jedes Well (meist 96-Well-Platten) einer Mikrotiterplatte wird eine gepufferte Lösung des zu testenden Antigens gegeben, wo es Zeit erhält, durch Ladungswechselwirkungen am Kunststoff zu haften.
  • Eine Lösung von nicht-reagierendem Protein, wie Rinderserumalbumin oder Kasein, wird in jede Vertiefung gegeben, um jede Plastikoberfläche in der Vertiefung zu bedecken, die von dem Antigen nicht beschichtet bleibt.
  • Der Primärantikörper mit einem angehängten (konjugierten) Enzym wird hinzugefügt, das spezifisch an das Testantigen bindet, das die Vertiefung bedeckt.
  • Anschließend wird ein Substrat für dieses Enzym zugegeben. Häufig ändert dieses Substrat bei Reaktion mit dem Enzym seine Farbe.
  • Je höher die Konzentration des im Serum vorhandenen Primärantikörpers ist, desto stärker ist der Farbumschlag. Oft wird ein Spektrometer verwendet, um quantitative Werte für die Farbstärke zu erhalten.

Das Enzym wirkt als Verstärker selbst wenn nur wenige enzymgebundene Antikörper gebunden bleiben, produzieren die Enzymmoleküle viele Signalmoleküle. Innerhalb der Grenzen des gesunden Menschenverstands kann das Enzym unbegrenzt Farbe produzieren, aber je mehr Antikörper gebunden sind, desto schneller entwickelt sich die Farbe. Ein wesentlicher Nachteil des direkten ELISAs besteht darin, dass die Methode der Antigenimmobilisierung nicht spezifisch ist, wenn Serum als Quelle des Testantigens verwendet wird, alle Proteine ​​in der Probe können gut an der Mikrotiterplatte haften, sodass geringe Analytkonzentrationen im Serum konkurrieren müssen mit anderen Serumproteinen beim Binden an die Well-Oberfläche. Der Sandwich- oder indirekte ELISA bietet eine Lösung für dieses Problem, indem ein für das Testantigen spezifischer "Einfang"-Antikörper verwendet wird, um es aus der molekularen Mischung des Serums herauszuziehen. [ Zitat benötigt ]

ELISA kann in einem qualitativen oder quantitativen Format durchgeführt werden. Qualitative Ergebnisse liefern ein einfaches positives oder negatives Ergebnis (ja oder nein) für eine Probe. Der Cutoff zwischen positiv und negativ wird vom Analysten bestimmt und kann statistisch sein. Das Zwei- oder Dreifache der Standardabweichung (einer Test inhärenter Fehler) wird oft verwendet, um positive von negativen Proben zu unterscheiden. Beim quantitativen ELISA wird die optische Dichte (OD) der Probe mit einer Standardkurve verglichen, die typischerweise eine serielle Verdünnung einer Lösung des Zielmoleküls bekannter Konzentration ist. Wenn beispielsweise eine Testprobe eine OD von 1,0 liefert, muss der Punkt auf der Standardkurve, der OD = 1,0 ergab, dieselbe Analytkonzentration wie die Probe aufweisen. [ Zitat benötigt ]

Die Verwendung und Bedeutung der Bezeichnungen "indirekter ELISA" und "direkter ELISA" unterscheidet sich in der Literatur und auf Websites je nach Versuchskontext. Wenn das Vorhandensein eines Antigens analysiert wird, bezieht sich der Name "direkter ELISA" auf einen ELISA, bei dem nur ein markierter Primärantikörper verwendet wird, und der Begriff "indirekter ELISA" bezieht sich auf einen ELISA, bei dem das Antigen durch den Primärantikörper gebunden wird die dann durch einen markierten sekundären Antikörper nachgewiesen wird. Im letzteren Fall unterscheidet sich ein Sandwich-ELISA deutlich von einem indirekten ELISA. Wenn der "primäre" Antikörper von Interesse ist, z.B. bei Immunisierungsanalysen wird dieser Antikörper direkt vom Sekundärantikörper nachgewiesen und der Begriff "indirekter ELISA" gilt für eine Einstellung mit zwei Antikörpern. [ Zitat benötigt ]

Sandwich-ELISA Bearbeiten

Ein "Sandwich"-ELISA wird verwendet, um das Probenantigen nachzuweisen. [20] Die Schritte sind:

  1. Es wird eine Oberfläche hergestellt, an die eine bekannte Menge an Fängerantikörper gebunden ist.
  2. Alle unspezifischen Bindungsstellen auf der Oberfläche werden blockiert.
  3. Die antigenhaltige Probe wird auf die Platte aufgetragen und durch Antikörper eingefangen.
  4. Die Platte wird gewaschen, um ungebundenes Antigen zu entfernen.
  5. Ein spezifischer Antikörper wird hinzugefügt und bindet an das Antigen (daher das „Sandwich“: das Antigen steckt zwischen zwei Antikörpern). Dieser primäre Antikörper könnte sich auch im Serum eines Spenders befinden, der auf Reaktivität gegenüber dem Antigen getestet werden soll.
  6. Als Nachweisantikörper werden enzymgekoppelte Sekundärantikörper eingesetzt, die ebenfalls spezifisch an die Fc-Region des Antikörpers binden (unspezifisch).
  7. Die Platte wird gewaschen, um die ungebundenen Antikörper-Enzym-Konjugate zu entfernen.
  8. Eine Chemikalie wird hinzugefügt, um durch das Enzym in ein Farb- oder Fluoreszenz- oder elektrochemisches Signal umgewandelt zu werden.
  9. Die Extinktion oder Fluoreszenz oder das elektrochemische Signal (z. B. Strom) der Plattenvertiefungen wird gemessen, um das Vorhandensein und die Menge des Antigens zu bestimmen.

Das rechte Bild zeigt die Verwendung eines an ein Enzym konjugierten sekundären Antikörpers, obwohl dies im technischen Sinne nicht erforderlich ist, wenn der primäre Antikörper an ein Enzym konjugiert ist (was ein direkter ELISA wäre). Die Verwendung eines Sekundärantikörper-Konjugats vermeidet jedoch den teuren Prozess der Herstellung enzymgebundener Antikörper für jedes Antigen, das man möglicherweise nachweisen möchte. Durch Verwendung eines enzymgebundenen Antikörpers, der die Fc-Region anderer Antikörper bindet, kann dieser gleiche enzymgebundene Antikörper in einer Vielzahl von Situationen verwendet werden. Ohne die erste Schicht des "Einfang"-Antikörpers können alle Proteine ​​in der Probe (einschließlich Serumproteine) kompetitiv an der Plattenoberfläche adsorbieren, wodurch die Menge des immobilisierten Antigens verringert wird. Die Verwendung des gereinigten spezifischen Antikörpers, um das Antigen an den Kunststoff zu binden, macht es überflüssig, das Antigen vor der Messung aus komplizierten Mischungen zu reinigen, was den Assay vereinfacht und die Spezifität und Sensitivität des Assays erhöht. Ein zu Forschungszwecken verwendeter Sandwich-ELISA muss aufgrund des Risikos falsch positiver Ergebnisse oft validiert werden. [21]

Wettbewerbs-ELISA Bearbeiten

Eine dritte Verwendung von ELISA besteht in der kompetitiven Bindung. Die Schritte für diesen ELISA unterscheiden sich etwas von den ersten beiden Beispielen:

Unmarkierter Antikörper wird in Gegenwart seines Antigens (Probe) inkubiert.

  1. Diese gebundenen Antikörper/Antigen-Komplexe werden dann in eine Antigen-beschichtete Vertiefung gegeben.
  2. Die Platte wird gewaschen, damit ungebundene Antikörper entfernt werden. (Je mehr Antigen in der Probe enthalten ist, desto mehr Ag-Ab-Komplexe werden gebildet und somit stehen weniger ungebundene Antikörper zur Verfügung, um an das Antigen in der Vertiefung zu binden, daher "Kompetition".)
  3. Der für den Primärantikörper spezifische Sekundärantikörper wird zugegeben. Dieser zweite Antikörper ist an das Enzym gekoppelt.
  4. Ein Substrat wird hinzugefügt, und verbleibende Enzyme rufen ein chromogenes oder fluoreszierendes Signal hervor.
  5. Die Reaktion wird gestoppt, um eine eventuelle Sättigung des Signals zu verhindern.

Einige kompetitive ELISA-Kits enthalten eher enzymgebundene Antigene als enzymgebundene Antikörper. Das markierte Antigen konkurriert mit dem Probenantigen (unmarkiert) um primäre Antikörperbindungsstellen. Je weniger Antigen in der Probe enthalten ist, desto mehr markiertes Antigen wird in der Vertiefung zurückgehalten und desto stärker ist das Signal.

Üblicherweise wird das Antigen nicht zuerst in der Vertiefung positioniert.

Zum Nachweis von HIV-Antikörpern werden die Vertiefungen der Mikrotiterplatte mit dem HIV-Antigen beschichtet. Es werden zwei spezifische Antikörper verwendet, von denen einer mit Enzym konjugiert ist und der andere im Serum vorhanden ist (wenn das Serum für den Antikörper positiv ist). Zwischen den beiden Antikörpern tritt eine kumulative Konkurrenz um das gleiche Antigen auf, wodurch ein stärkeres Signal sichtbar wird. Zu testende Seren werden in diese Vertiefungen gegeben und bei 37 °C inkubiert und dann gewaschen. Wenn Antikörper vorhanden sind, tritt die Antigen-Antikörper-Reaktion auf. Für die enzymmarkierten spezifischen HIV-Antikörper bleibt kein Antigen übrig. Diese Antikörper bleiben bei der Zugabe frei und werden beim Waschen abgewaschen. Substrat wird zugegeben, aber es gibt kein Enzym, das darauf einwirkt, so dass ein positives Ergebnis keine Farbänderung zeigt.

Reverse ELISA Bearbeiten

Ein vierter ELISA-Test verwendet nicht die traditionellen Wells. This test leaves the antigens suspended in the test fluid. [22] [23]

  1. Unlabeled antibody is incubated in the presence of its antigen (sample)
  2. A sufficient incubation period is provided to allow the antibodies to bind to the antigens.
  3. The sample is then passed through the Scavenger container. This can be a test tube or a specifically designed flow through channel. The surface of the Scavenger container or channel has “Scavenger Antigens” bound to it. These can be identical or sufficiently similar to the primary antigens that the free antibodies will bind.
  4. The Scavenger container must have sufficient surface area and sufficient time to allow the Scavenger Antigens to bind to all the excess Antibodies introduced into the sample.
  5. The sample, that now contains the tagged and bound antibodies, is passed through a detector. This device can be a flow cytometer or other device that illuminates the tags and registers the response. [24]

This test allows multiple antigens to be tagged and counted at the same time. This allows specific strains of bacteria to be identified by two (or more) different color tags. If both tags are present on a cell, then the cell is that specific strain. If only one is present, it is not.

This test is done, generally, one test at a time and cannot be done with the microtiter plate. The equipment needed is usually less complicated and can be used in the field.

The following table lists the enzymatic markers commonly used in ELISA assays, which allow the results of the assay to be measured upon completion.

  • OPD (Ö-phenylenediamine dihydrochloride) turns amber to detect HRP (Horseradish Peroxidase), which is often used to as a conjugated protein. [25]
  • TMB (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine) turns blue when detecting HRP and turns yellow after the addition of sulfuric or phosphoric acid. [25]
  • ABTS (2,2'-Azinobis [3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid]-diammonium salt) turns green when detecting HRP. [25]
  • PNPP (P-Nitrophenyl Phosphate, Disodium Salt) turns yellow when detecting alkaline phosphatase. [25]

Because the ELISA can be performed to evaluate either the presence of antigen or the presence of antibody in a sample, it is a useful tool for determining serum antibody concentrations (such as with the HIV test [26] or West Nile virus). It has also found applications in the food industry in detecting potential food allergens, such as milk, peanuts, walnuts, almonds, and eggs [27] and as serological blood test for coeliac disease. [28] [29] ELISA can also be used in toxicology as a rapid presumptive screen for certain classes of drugs.

The ELISA was the first screening test widely used for HIV because of its high sensitivity. In an ELISA, a person's serum is diluted 400 times and applied to a plate to which HIV antigens are attached. If antibodies to HIV are present in the serum, they may bind to these HIV antigens. The plate is then washed to remove all other components of the serum. A specially prepared "secondary antibody"—an antibody that binds to other antibodies—is then applied to the plate, followed by another wash. This secondary antibody is chemically linked in advance to an enzyme.

Thus, the plate will contain enzyme in proportion to the amount of secondary antibody bound to the plate. A substrate for the enzyme is applied, and catalysis by the enzyme leads to a change in color or fluorescence. ELISA results are reported as a number the most controversial aspect of this test is determining the "cut-off" point between a positive and a negative result.

A cut-off point may be determined by comparing it with a known standard. If an ELISA test is used for drug screening at workplace, a cut-off concentration, 50 ng/ml, for example, is established, and a sample containing the standard concentration of analyte will be prepared. Unknowns that generate a stronger signal than the known sample are "positive." Those that generate weaker signal are "negative".

There are ELISA tests to detect various kind of diseases, such as dengue, malaria, Chagas disease [30] , Johne's disease, and others. [31] ELISA tests also are extensively employed for in vitro diagnostics in medical laboratories. The other uses of ELISA include:


Potent mouse monoclonal antibodies that block SARS-CoV-2 infection

Coronavirus disease 2019 (COVID-19), caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2), has developed into a global pandemic since its first outbreak in the winter of 2019. An extensive investigation of SARS-CoV-2 is critical for disease control. Various recombinant monoclonal antibodies of human origin that neutralize SARS-CoV-2 infection have been isolated from convalescent patients and will be applied as therapies and prophylaxis. However, the need for dedicated monoclonal antibodies suitable for molecular pathology research is not fully addressed. Here, we produced six mouse anti-SARS-CoV-2 spike monoclonal antibodies that exhibit not only robust performance in immunoassays including western blotting, ELISA, immunofluorescence, and immunoprecipitation, but also demonstrate neutralizing activity against SARS-CoV-2 infection to VeroE6/TMPRSS2 cells. Due to their mouse origin, our monoclonal antibodies are compatible with the experimental immunoassay setups commonly used in basic molecular biology research laboratories, providing a useful tool for future research. Furthermore, in the hope of applying the antibodies of clinical setting, we determined the variable regions of the antibodies and used them to produce recombinant human/mouse chimeric antibodies.

Schlüsselwörter: SARS-CoV-2 mouse monoclonal antibody neutralizing antibody spike.

Copyright © 2021 The Authors. Published by Elsevier Inc. All rights reserved.

Interessenkonflikt-Erklärung

The authors declare that they have no conflicts of interest with the contents of this article.


Recombinase polymerase amplification-nucleic acid lateral flow immunoassays for Newcastle disease virus and infectious bronchitis virus detection

Newcastle disease virus (NDV) and infectious bronchitis virus (IBV) are two poultry pathogens affecting the respiratory tract of chickens, and cause major economic losses in the industry. Rapid detection of these viruses is crucial to inform implementation of appropriate control measures. The objective of our study is developing a simple, rapid and field applicable recombinase polymerase amplification (RPA)-nucleic acid lateral flow (NALF) immunoassay for detection of NDV and IBV. Isothermal amplification of the matrix protein (M) gene of NDV and the nucleoprotein (N) gene of IBV was implemented via recombinase polymerase amplification at 38 °C for 40 min and 20 min, respectively using modified labeled primers. NALF device used in this study utilizes antibodies for detection of labeled RPA amplicons. The results revealed that RPA-NALF immunoassays can detect both viruses after 40 min at 38 °C and only NDV after 20 min. The limit of detection (LOD) was 10 genomic copies/RPA reaction. The assays results on clinical samples collected from diseased chicken farms demonstrated a good performance in comparison with quantitative real time reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR). The assays established in this study can facilitate rapid, on-site molecular diagnosis of suspected cases of ND and IB viral infections as the results can be detected by the naked eye without the need for measuring fluorescence. Furthermore, the NALF device could be adapted to detect other infectious agents.

Schlüsselwörter: Infectious bronchitis virus Newcastle disease virus Nucleic acid lateral flow immunoassay Recombinase polymerase amplification.

Interessenkonflikt-Erklärung

The authors declare that they have no conflict of interest.

Figuren

Schematic representation of PCRD nucleic…

Schematic representation of PCRD nucleic acid detector design. At the conjugate pad, the…

Results showing identification of RPA…

Results showing identification of RPA amplicons after incubation for period of 40 min…

Results showing identification of RPA…

Results showing identification of RPA amplicons after incubation for period of 20 min…

The limit of detection (LOD)…

The limit of detection (LOD) for both NDV ( ein ) and IBV…

Performance of RT-RPA-NALF assays on…

Performance of RT-RPA-NALF assays on clinical samples for IBV and NDV detection: ein…


Danksagung

The authors would like to thank Gert Zimmer (Institute of Virology and Immunology, Mittelhäusern/Switzerland), Stefan Pöhlmann, and Markus Hoffmann (both German Primate Center, Infection Biology Unit, Goettingen/Germany) for providing the reagents required for VSV pseudotype generation. Eliseo Albert holds a Río Hortega research contract from the Carlos III Health Institute (Ref. CM18/00221). Ron Geller holds a Ramón y Cajal fellowship from the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness (RYC-2015-17517). This study was supported by Valencian Government grant IDIFEDER/2018/056 to Jesús Rodríguez-Díaz, Generalitat Valenciana grant Covid_19-SCI to Roberto Gozalbo-Rovira, Spanish National Research Council grant CSIC-COV19-082, and Fondo Supera Covid-19 grant BlockAce to Roberto Gozalbo-Rovira.


Handbook of Immunoassay Technologies

Handbook of Immunoassay Technologies: Approaches, Performances, and Applications unravels the role of immunoassays in the biochemical sciences. During the last four decades, a wide range of immunoassays has been developed, ranging from the conventional enzyme-linked immunosorbent assays, to the smartphone-based point-of-care formats. The advances in rapid biochemical procedures, novel biosensing schemes, fully integrated lab-on-a-chip platforms, prolonged biomolecular storage strategies, device miniaturization and interfacing, and emerging smart system technologies equipped with personalized mobile healthcare tools are paving the way to next-generation immunoassays, and are all discussed in this comprehensive text.

Immunoassays play a prominent role in clinical diagnostics as they are the eyes of healthcare professionals, helping them make informed clinical decisions via confirmed disease diagnosis, and thus enabling favorable health outcomes. The faster and reliable diagnosis of infections will further control their spread to uninfected persons. Similarly, immunoassays play a prominent role in veterinary diagnostics, food analysis, environmental monitoring, defense and security, and other bioanalytical settings. Therefore, they enable the detection of a plethora of analytes, which includes disease biomarkers, pathogens, drug impurities, environmental contaminants, allergens, food adulterants, drugs of abuse and various biomolecules.

Handbook of Immunoassay Technologies: Approaches, Performances, and Applications unravels the role of immunoassays in the biochemical sciences. During the last four decades, a wide range of immunoassays has been developed, ranging from the conventional enzyme-linked immunosorbent assays, to the smartphone-based point-of-care formats. The advances in rapid biochemical procedures, novel biosensing schemes, fully integrated lab-on-a-chip platforms, prolonged biomolecular storage strategies, device miniaturization and interfacing, and emerging smart system technologies equipped with personalized mobile healthcare tools are paving the way to next-generation immunoassays, and are all discussed in this comprehensive text.

Immunoassays play a prominent role in clinical diagnostics as they are the eyes of healthcare professionals, helping them make informed clinical decisions via confirmed disease diagnosis, and thus enabling favorable health outcomes. The faster and reliable diagnosis of infections will further control their spread to uninfected persons. Similarly, immunoassays play a prominent role in veterinary diagnostics, food analysis, environmental monitoring, defense and security, and other bioanalytical settings. Therefore, they enable the detection of a plethora of analytes, which includes disease biomarkers, pathogens, drug impurities, environmental contaminants, allergens, food adulterants, drugs of abuse and various biomolecules.


Danksagung

The NRL would like to thank the following people:

All the participating laboratories for their willingness to provide specimens and their open collaboration:

Dr Tim Brooks Dr Amanda Semper, Rare and Imported Pathogen Laboratory, Public Health England, Porton Down, UK

Ms Jennie Burke, Australian Biologics Testing Services, Sydney, Australia

Dr Bernie Hudson Mr Bruce Wong, NSW Health Pathology, Royal North Shore Hospital, Sydney, Australia

Australian Red Cross Blood Service, Australia

Dr Jennifer M Robson, Sullivan Nicolaides Pathology, Brisbane, Australia

Dr Armin Schwarbach, ArminLabs Augsburg, Germany

Dr Jyotsna Shah, IGeneX Inc. California, USA

NRL staff for their significant contribution in specimen handling, testing and recording the results for this study:

Dr Kate Zhang, Ms Jing Jing Cai, Ms Nilukshi Arachchi, Ms Tamara McDonald, Ms Jenny Catimel


Schau das Video: What is an Immunoassay? (Juli 2022).


Bemerkungen:

  1. Rushkin

    Stimmen Sie dem vorherigen Beitrag absolut zu

  2. Akigar

    Interessant! Subscribed to the blog!

  3. Zuluzragore

    Ich gratuliere, welche Worte ..., der bewundernswerte Gedanke

  4. Worthington

    Diese Option passt nicht zu mir.

  5. Cadmus

    Es ist nicht so einfach, wie es scheint

  6. Aingeru

    Ich denke, dass du nicht Recht hast. Lass uns diskutieren. Schreiben Sie mir in PM, wir werden reden.



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