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Gen- vs. Protein-Expressionsassays

Gen- vs. Protein-Expressionsassays


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Sind die Bedingungen Genexpressionsassays und Proteinexpressionsassays in der Molekularbiologie synonym verwendet? Oder wird von Ihnen erwartet, zwischen den beiden Begriffen zu unterscheiden.

Wenn ich zum Beispiel die DNA-Sequenz eines interessierenden Gens durch die GFP-DNA ersetze; und anschließend die Fluoreszenzwerte quantifizieren, messe ich die Genexpression des interessierenden Gens ODER die Proteinexpression?


Genexpression ist die Produktion eines funktionellen Genprodukts aus einem Gen. Die Proteinexpression ist also ein funktionelles Auslesen der Genexpression für Genloci, die Proteine ​​kodieren.

Die Genexpression wird jedoch häufig und fälschlicherweise verwendet, um sich auf Messungen von mRNA-Spiegeln zu beziehen. Die Produktion von mRNA ist ein Voraussetzung für die Proteinproduktion aus einem Gen und liefert Informationen über die Transkriptionsaktivität eines Genloci.

Die Translation von mRNA ist ein stark regulierter Prozess und globale Assays zeigen, dass die mRNA-Transkriptspiegel weniger als die Hälfte der Variation der Proteinkonzentrationen erklären.

Wenn ich zum Beispiel die DNA-Sequenz eines interessierenden Gens durch die GFP-DNA ersetze; und anschließend die Fluoreszenzwerte quantifizieren, messe ich die Genexpression des interessierenden Gens ODER die Proteinexpression?

Sie messen sowohl die Genexpression als auch die Proteinexpression von den Promotor + GFP-Genloci. Wenn Sie an der Transkription vom Promotor interessiert sind, bietet die Messung des Transkripts eine direktere Messung.


Genexpression und Proteinexpression sind absolut nicht das gleiche. Während die mRNA-Spiegel für ein bestimmtes Gen gezählt werden können geben einen Hinweis darauf, wie viel Protein vorhanden ist, oft ist dies nicht der Fall. In ähnlicher Weise bedeutet die Quantifizierung von Proteinspiegeln nicht notwendigerweise, dass die relativen Spiegel von mRNA ähnlich sind. Es gibt viele Punkte für die Regulierung zwischen der RNA-Polymerase, die entlang des Gens rollt und der Bildung der prä-mRNA und dem Protein, das aus dem Ribosom kommt, gefaltet und an seinen richtigen Platz in der Zelle transportiert wird. mRNA kann durch eine Reihe von Mechanismen zum Schweigen gebracht, abgebaut oder an der Translation gehindert werden. Proteine ​​selbst unterliegen umfangreich Regulierung, mit Halbwertszeiten, die von Sekunden bis Wochen variieren können. Natürlich werden auch Gene auf viele verschiedene Arten reguliert, von Repressorproteinen über methylierte DNA bis hin zu chemisch modifizierten Histonen, und auch die Anzahl der Polymerasekomplexe auf der DNA und ihre relative Transkriptionsgeschwindigkeit stehen unter regulatorischer Kontrolle.

Wenn ich die DNA-Sequenz eines interessierenden Gens durch die GFP-DNA ersetze; und anschließend die Fluoreszenzwerte quantifizieren, messe ich die Genexpression des interessierenden Gens ODER die Proteinexpression?

Sie quantifizieren den Proteingehalt von GFP. mRNAs können einer sequenzspezifischen Regulierung unterliegen (z. B. siRNA), sodass Sie nicht einfach sagen können, dass die GFP-Spiegel Ihrem interessierenden Genprodukt entsprechen. Oft sind sie proportional, manchmal aber auch nicht. Sie müssen also eine Reihe anderer Experimente durchführen, um Ihre Ergebnisse zu überprüfen.


Genexpressions-Workflow.

Forscher können eine Genexpressionsanalyse auf einer von mehreren verschiedenen Ebenen durchführen, auf denen die Genexpression reguliert wird: transkriptional, posttranskriptionell, translational und posttranslational
Proteinmodifikation.

Die Transkription, der Prozess der Erstellung einer komplementären RNA-Kopie einer DNA-Sequenz, kann auf verschiedene Weise reguliert werden. Transkriptionelle Regulationsprozesse werden in typischen Experimenten zur Genexpressionsanalyse am häufigsten untersucht und manipuliert.

Die Bindung regulatorischer Proteine ​​an DNA-Bindungsstellen ist die direkteste Methode, durch die die Transkription auf natürliche Weise moduliert wird. Alternativ können regulatorische Prozesse auch mit der Transkriptionsmaschinerie einer Zelle interagieren. In jüngerer Zeit wurde der Einfluss der epigenetischen Regulation, wie der Einfluss variabler DNA-Methylierung auf die Genexpression, als ein wirksames Werkzeug für die Erstellung von Genexpressionsprofilen entdeckt. Es ist bekannt, dass unterschiedliche Methylierungsgrade die Chromatinfaltung beeinflussen und die Zugänglichkeit von Genen für die aktive Transkription stark beeinflussen.

Nach der Transkription wird eukaryotische RNA typischerweise gespleißt, um nichtkodierende Intronsequenzen zu entfernen und mit einem Poly(A)-Schwanz versehen. Auf dieser posttranskriptionellen Ebene hat die RNA-Stabilität einen signifikanten Einfluss auf die funktionelle Genexpression, dh die Produktion von funktionellem Protein. Small interfering RNA (siRNA) besteht aus doppelsträngigen Nukleinsäuremolekülen, die am RNA-Interferenzweg beteiligt sind, bei dem die Expression bestimmter Gene moduliert wird (typischerweise durch abnehmende Aktivität). Wie genau diese Modulation erreicht wird, ist noch nicht vollständig verstanden. Ein wachsendes Feld der Genexpressionsanalyse liegt im Bereich der microRNAs (miRNAs), kurzen RNA-Molekülen, die auch als eukaryotische posttranskriptionelle Regulatoren und Gene-Silencing-Agenten fungieren.


Was ist ein Gen?

Gregor Mendel hat als erster die Existenz von Genen und deren Vererbungsmuster beschrieben. Er erklärte die Vererbung von Merkmalen in Bezug auf vererbte Merkmale und verwendete den Begriff „Gen“ nicht. Der Begriff „Gen“ ist in letzter Zeit mit der Entwicklung der Genetik entstanden. Gen ist ein DNA-Segment, das Anweisungen zur Bildung von Proteinen enthält. Jedes Gen hat eine bestimmte Sequenz von Basenpaaren, die die Struktur und Funktion eines bestimmten Proteins bestimmt. Gene sind die Blaupausen aller Eigenschaften im Körper. Sie bestimmen die meisten charakteristischen Merkmale von Organismen und sind in der Lage, diese charakteristischen Merkmale an die nächsten Generationen weiterzugeben, den sogenannten Vererbungsprozess. Diese charakteristischen Merkmale werden als Merkmale bezeichnet, von denen einige sichtbar sind und andere nicht.


Biolumineszierende Firefly Luciferase Assays

Glühwürmchen-Luciferase ist ein weit verbreiteter biolumineszenter Reporter zur Untersuchung der Genregulation und -funktion. Es ist ein sehr empfindlicher genetischer Reporter aufgrund des Fehlens endogener Luciferase-Aktivität in Säugerzellen oder -geweben. Glühwürmchen-Luciferase ist ein Protein mit 62.000 Dalton, das als Monomer aktiv ist und für seine Aktivität keine weitere Verarbeitung erfordert. Das Enzym katalysiert die ATP-abhängige D-Luciferin-Oxidation zu Oxyluciferin und erzeugt eine bei 560 nm zentrierte Lichtemission. Das von der Reaktion emittierte Licht ist direkt proportional zur Anzahl der Luciferase-Enzymmoleküle.

Abbildung 1. Luciferase-Assay-Prinzip. Die durch Glühwürmchen-Luciferase katalysierte Biolumineszenzreaktion erzeugt Licht.

Was ist der Unterschied zwischen Biolumineszenz und Fluoreszenz?

Biolumineszenz ist ein chemischer Prozess, bei dem ein Enzym ein Substrat (wie Luciferase und D-Luciferin) abbaut und eines der Nebenprodukte dieser Reaktion Licht ist. Biolumineszenz kommt in der Natur natürlicherweise in verschiedenen Algen, Bakterien, Pilzen und einigen Wassertieren wie Quallen vor. Fluoreszenz ist ein physikalischer Prozess, bei dem Licht Elektronen im Fluorophor in einen höheren Energiezustand anregt, und wenn dieses Elektron in seinen Grundzustand zurückfällt, emittiert es ein Photon.

Wie funktionieren Luciferase-Assays?

Firefly-Luciferase-Assays (SCT151, SCT154, LUC1, LUCASSY-RO) wurden für die einfache und effiziente Quantifizierung der Firefly-Luciferase-Reporterenzymaktivität aus kultivierten Zellen mit hoher Sensitivität und Linearität entwickelt. Dies ist ein Lumineszenzassay vom Flash-Typ, bei dem das Signal unmittelbar nach Zugabe der Arbeitslösung zu den Proben gemessen werden muss. Das Lumineszenzsignal nimmt im Verlauf von etwa 10 Minuten Reaktionszeit ab, obwohl die Signalhalbwertszeit je nach Luciferase-Expressionsniveau variieren kann.

Die aus der Luciferase-Reaktion resultierende Lichtproduktion führt zur Bildung von suizidalem Adenyl-Oxyluciferin an der Enzymoberfläche. Dies führt zu einer sehr kurzen Halbwertszeit der Lichtemission mit einer blitzartigen Kinetik. Der Firefly Luciferase HTS Assay (SCT150) wurde mit einem proprietären Gemisch von Substanzen entwickelt, die die enzymatische Reaktion modifizieren, um ein lang anhaltendes Signal (dauerhaftes Leuchten) zu erzeugen, indem die Bildung von Adenyloxyluciferin an der Enzymoberfläche verhindert wird. Es ist ein homogenes, hochempfindliches Firefly-Luciferase-Reportergen-Assay-Kit zur Quantifizierung der Firefly-Luciferase-Expression in Säugerzellen mit einer Signalhalbwertszeit von etwa 3 Stunden (Figur 2). Luciferase-Assays vom Glow-Typ haben ein niedrigeres Lumineszenzsignal im Vergleich zu Assays vom Flash-Typ. Die Sensitivität und die Nachweisgrenze des Assays hängen von den Luciferase-Expressionsniveaus in Ihrem experimentellen System sowie der Luminometer-Empfindlichkeit ab.

Figur 2. Titration von rekombinanter Glühwürmchen-Luciferase im Glühwürmchen-Luciferase-Assay. A) Rekombinante Luciferase wurde in 1X Firefly Lysis Buffer mit 1 Mg/ml BSA seriell verdünnt und im Assay gemessen. B) Der Firefly Luciferase HTS Assay ist ein konstant leuchtendes, hochempfindliches Firefly Luciferase Reportergen-Assay-Kit zur Quantifizierung der Firefly Luciferase Expression in Säugerzellen mit einer Signalhalbwertszeit von etwa 3 Stunden.

Was ist der Unterschied zwischen Firefly und Renilla Luziferase?

Firefly Luciferase Assays verwenden Luciferin in Gegenwart von Sauerstoff, ATP und Magnesium, um Licht zu erzeugen (Grün/Gelb, 550-70 nM), während Renilla Luciferase-Assays (SCT153) benötigen nur Coelenterazin und Sauerstoff, um Licht (Blau, 480 nM) zu erzeugen. Renilla Luciferase wurde als Reportergen zur Untersuchung der Genregulation und -funktion verwendet in vitro und in vivo. Es wird üblicherweise in Multiplex-Transkriptions-Reporter-Assays oder als normalisierende Transfektionskontrolle für Glühwürmchen-Luciferase-Assays verwendet. Das Enzym erfordert keine posttranslationale Modifikation für seine Aktivität und kann unmittelbar nach der Translation als genetischer Reporter fungieren. Coelenterazin, Substrat für Renilla Luciferase, emittiert auch Licht aus einer enzymunabhängigen Oxidation, einem Prozess, der als Autolumineszenz bekannt ist. Die Autolumineszenz wird durch Superoxidanion und Peroxynitrit in Zellen und Geweben verstärkt.

Figur 3. Glühwürmchen gegen Renilla Luciferase. Biolumineszenzreaktionen, katalysiert durch Glühwürmchen-Luciferase und Renilla-Luciferase.

Was sind die Vorteile von Dual Luciferase Assays?

Das Glühwürmchen/Renilla Dual Luciferase Assay (SCT152) ermöglicht die Messung von Firefly und Renilla Luciferase-Aktivität in derselben Probe mit hoher Sensitivität und Linearität. Die Glühwürmchen-Luciferase-Aktivität wird zuerst gemessen, dann wird Renilla-Luciferase-Testpuffer 2.0 zugegeben, um gleichzeitig die Glühwürmchen-Luciferase-Aktivität zu löschen und die Renilla-Luciferase-Aktivität zu messen. Renilla Luciferase Assay Buffer 2.0 löscht die Glühwürmchen-Luciferase-Aktivität auf das Niveau von nicht transfizierten Zellen, was eine sequentielle Messung der Glühwürmchen- und Renilla-Luciferase-Aktivität in derselben Probe ermöglicht. Dies ist ein Flash-Assay, bei dem die Lumineszenz unmittelbar nach Zugabe der Nachweisreagenzien zur Luciferaseprobe gemessen werden muss. Das Firefly-Signal lässt im Laufe von etwa 12 Minuten nach, während das Renilla-Signal im Laufe von etwa 2 Minuten abklingt, obwohl dies je nach Enzymspiegel variieren kann.

Figur 4. Übersicht über den Dual-Luciferase-Assay. Beispiel für den Nachweis von Firefly- und Renilla-Luciferase unter Verwendung von Lysaten aus nicht transfizierten HeLa-Zellen oder Zellen, die entweder mit Glühwürmchen-Luciferase allein (Firefly Only) transfiziert oder mit Glühwürmchen- und Renilla-Luciferasen (Firefly + Renilla) co-transfiziert wurden. In Zellen, die nur mit Glühwürmchen transfiziert wurden, ist das Renilla-Signal die verbleibende Glühwürmchen-Lumineszenz nach Zugabe von Renilla-Arbeitslösung zur Reaktion.

Was sind die Anwendungen von Luciferase-Assays?

Genetische Reporter werden als Indikatoren verwendet, um zelluläre Ereignisse zu untersuchen, die an die Genexpression gekoppelt sind. Typischerweise wird ein Reportergen mit einer interessierenden DNA-Sequenz in einen Expressionsvektor (der ein Luciferase-Gen trägt) kloniert, der dann in Zellen transferiert wird. Nach dem Transfer werden die Zellen auf die Anwesenheit des Reporters getestet, indem das Reporterprotein selbst oder die enzymatische Luciferaseaktivität direkt gemessen wird. Ein gutes Reportergen kann leicht identifiziert und quantitativ gemessen werden, wenn es exprimiert wird (im Organismus oder in den interessierenden Zellen).

Sigma und SwitchGear Genomics™ haben sich beispielsweise zusammengetan, um exklusiv eine genomweite Sammlung von über 10.000 3′UTR-Regionen in unserem optimierten Lentivirus-Luciferase-Reportervektorsystem anzubieten. Bei der Durchführung von Experimenten mit MISSION ® 3′UTR Lenti GoClones ermöglicht die Einbeziehung der richtigen Kontrollen eine genaue Interpretation der experimentellen Genexpressionsergebnisse.

Zelllebensfähigkeit durch ATP-Erkennung

Da ATP ein Indikator für metabolisch aktive Zellen ist, kann die Anzahl der lebensfähigen Zellen anhand der verfügbaren ATP-Menge bestimmt werden. Der ATP Cell Viability Luciferase Assay (SCT149, 11699709001) bietet einen hochempfindlichen homogenen Assay zur Quantifizierung von ATP in Zellkulturen. Dieses Kit nutzt die Verwendung von ATP durch die Firefly-Luciferase zur Oxidation von D-Luciferin und die daraus resultierende Lichtproduktion, um die in Zellkulturen verfügbare ATP-Menge zu bestimmen. Das empfindliche Assay-Verfahren beinhaltet eine einzelne Zugabe eines ATP-Nachweiscocktails direkt zu Zellen, die in einem serumergänzten Medium kultiviert wurden. Es ist kein Waschen der Zellen, keine Entfernung des Mediums und kein mehrfaches Pipettieren erforderlich. Das Kit kann verwendet werden, um nur eine einzelne Zelle oder 0,01 Picomol ATP nachzuweisen. Das erzeugte Signal ist innerhalb von 6 Größenordnungen linear. Indem die ATP-Menge mit der Anzahl lebensfähiger Zellen in Beziehung gesetzt wird, hat der Assay breite Anwendungen, die von der Bestimmung der Anzahl lebensfähiger Zellen über die Zellproliferation bis hin zur Zellzytotoxizität reichen.

Abbildung 5. ATP-Zelllebensfähigkeitsassay. Die Verwendung von ATP durch die Glühwürmchen-Luciferase zur Oxidation von D-Luciferin und die daraus resultierende Lichtproduktion, um die verfügbare ATP-Menge zu beurteilen, die mit der Zellzahl und Lebensfähigkeit korreliert.

In vivo Bildgebung

Die Biolumineszenz-Bildgebung (BLI) hat sich zu einer beliebten Technik zur optischen Verfolgung von Zellen in kleinen Labortieren wie Mäusen entwickelt. Zusammen mit der geringen Hintergrundautofluoreszenz und zellulären Toxizitäten kann BLI die gleichzeitige Visualisierung der Überwachung der Expression zweier divergenter Luciferase-Proteine ​​durch Verwendung ihrer spezifischen Substrate ermöglichen. Die bildgebenden dualen Luciferase-Gen-Aktivitäten (rotes Codon-optimierte Glühwürmchen-Luciferase und eine grüne Klickkäfer-Luciferase) bei denselben Tieren könnten Abweichungen von individuellen Unterschieden der Versuchstiere reduzieren.


Expressionsanalyse und Bindungsassays in der chemosensorischen Proteingenfamilie weisen auf mehrere Rollen in Helicoverpa armigera

Chemosensorische Proteine ​​(CSPs) wurden vorgeschlagen, hydrophobe Chemikalien einzufangen und zu Rezeptoren auf sensorischen Neuronen zu transportieren. Wir haben 24 . identifiziert und geklont CSP Gene zum besseren Verständnis der physiologischen Funktion von CSPs in Helicoverpa armigera. Quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktionsassays zeigen, dass CSP Gene werden bei Erwachsenen ubiquitär exprimiert H. armigera Gewebe. Breite Expressionsmuster in adulten Geweben deuten darauf hin, dass CSPs an einer Vielzahl von zellulären Prozessen beteiligt sind, einschließlich der Chemosensation sowie anderer Funktionen, die nicht mit der Chemosensation zusammenhängen. Die H. armigera CSPs, die in Sinnesorganen oder Pheromondrüsen hoch transkribiert wurden (SchadenCSPS 6, 9, 18, 19), wurden in Bakterien rekombinant exprimiert, um ihre Funktion zu untersuchen. Fluoreszenzkompetitive Bindungsassays wurden verwendet, um die Bindungsaffinitäten dieser CSPs gegen 85 flüchtige Pflanzenstoffe und 4 Pheromonkomponenten zu messen. HarmCSP6 zeigt eine hohe Bindungsaffinität für Pheromonkomponenten, wohingegen die anderen drei Proteine ​​keine Affinität für irgendeine der getesteten Verbindungen zeigen. SchadenCSP6 wird in zahlreichen Zellen exprimiert, die sich in oder in der Nähe der langen Sensillentrichodea auf den Antennen von Männchen und Weibchen befinden. Diese Ergebnisse legen nahe, dass HarmCSP6 am Transport weiblicher Sexualpheromone in H. armigera.

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Vergleichsweise: Gen- vs. Protein-Expressionsstudien

Was ist der Unterschied zwischen Gen- und Proteinexpressionsstudien zur Bewertung der Wirksamkeit kosmetischer Produkte? In dieser Ausgabe unserer Kolumne "Comparatively Speaking" hat Tony O&rsquoLenick Nava Dayan, Ph.D., nach ihren Gedanken zu diesem Thema gefragt. Dies ist ihre Antwort:

Als Wissenschaftler weltweit begannen, an der Kartierung des gesamten menschlichen Genoms zusammenzuarbeiten, hatten sie den Eindruck, dass wir mehr als die etwa 25.000 Gene haben, die wir tatsächlich tragen. Vielleicht war es menschliche Arroganz zu glauben, dass wir anderen Spezies irgendwie biologisch überlegen sind, als wir es wirklich sind. Bei der Entschlüsselung unseres gesamten Genomprofils kamen wir zu der Erkenntnis, dass wir den Genen mehr Kontrolle zuschrieben, als sie tatsächlich haben.

Das „zentrale Dogma der Molekularbiologie&rdquo, das 1958 von Francis Crick geprägt wurde–dass eine DNA in eine RNA translatiert wird und eine RNA in ein Protein mit einer Funktion übersetzt wird, hat sich als ungenau erwiesen. In Wirklichkeit hat das Epigenom (wobei &ldquoepi&rdquo weiter oben bedeutet) mehr bei der Kontrolle der biologischen Funktion zu tun als das Genom.

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In unserer Branche führen Unternehmen Genexpressionsstudien durch und präsentieren diese, um Gewissheit über die Wirkung ihrer Rohstoffe und Formulierungen auf die Biologie der Haut zu implizieren. Es ist wichtig, die Grenzen solcher Datensätze zu verstehen und sie im richtigen Kontext zu betrachten. Der Fachbegriff „Expression&rdquo bedeutet lediglich, dass eine DNA-Sequenz im Zellkern in Boten-RNA (mRNA) übersetzt wird. Wenn ein bestimmtes Gen „up-reguliert ist&rdquo, bedeutet dies, dass die Menge an mRNA, die von dieser Sequenz erzeugt wird, höher als normal ist, wenn es „herunterreguliert&rdquo ist, bedeutet dies, dass sie im Vergleich zu einem normalen Zustand geringer ist.

Die Nomenklatur für Gene und Protein ist ähnlich und setzt sich aus einer Kombination von Buchstaben und Zahlen zusammen, beispielsweise wird Interleukin 1 alpha mit IL-1a abgekürzt und Tumornekrosefaktor wird mit TNF-a abgekürzt. Die Translation von DNA in mRNA ist ein Schritt zur Produktion von Peptiden und Proteinen. RNA kann in ein Protein übersetzt werden oder nicht. Die Peptide und Proteine ​​sind kleine bzw. größere Sequenzen von Aminosäuren und sind die „Arbeitspferde“ unseres Körpers. Sie fungieren als Zytokine, um Botschaften zu übermitteln, als Enzyme, um energieeffiziente biochemische Kaskaden zu ermöglichen und als Rezeptoren, um zwischen verschiedenen Zellkompartimenten und zwischen der Zelle und ihrer Umgebung zu kommunizieren.

Mit den heutigen technologischen Werkzeugen können wir die Expression von Genen und Proteinen quantifizieren und qualifizieren. Es ist jedoch ein Schlüssel zu verstehen, dass ein exprimiertes Gen die Aktivität nicht vollständig gleicht, da es weiter in ein Protein übersetzt werden muss. Darüber hinaus benötigt das Protein, selbst wenn es hergestellt wird, eine angemessene Umgebung, um diese geeignete Aktivität zu verleihen. Die bloße 3-D-Struktur eines Proteins, die von seiner Umgebung diktiert wird, beeinflusst seine &ldquopost-translationalen Modifikationen&rdquo, die durch die Umgebung bestimmt werden, in der es sich befindet.

Daher sollten bei der Durchführung einer In-vitro-Studie zum Wirksamkeitsscreening die verwendeten Methoden in Betracht gezogen und in Kenntnis ihrer Vorteile und Grenzen bewertet werden. Mit den heutigen Technologien und Tools kann eine kostengünstige und aussagekräftige Studie maßgeschneidert werden, um die Leistung zu maximieren.


  • Während der chemischen Biotin-Markierung kann das Protein aufgrund einer zufälligen Biotinylierung der Proteinoberfläche durch die Anlagerung von Biotin an katalytische oder bindende Domänen des Proteins inaktiviert werden. Mit Avi-Tag kann praktisch jedes Protein einfach und effizient in vivo oder in vitro unter Verwendung der einzigen, einzigartigen AviTag-Stelle biotinyliert werden.
  • Die Biotinylierung mit Avi-Tag erfolgt enzymatisch, was zu schonenden Reaktionsbedingungen und hochspezifischer Markierung führt.
  • Biotin-AviTag hat 15 Aminosäuren, was einem Fünftel der Masse alternativer Biotinylierungs-Tag-Sequenzen entspricht, die über 85 Aminosäurereste lang sind, ein wichtiger Gesichtspunkt, wenn sterische Konflikte minimiert werden sollen.

Abbildung 1. OmicsLink ORF-cDNA-Expressionsklone mit N- und C-terminalem AviTag in verschiedenen Säugetier-Vektorsystemen.

Wie es funktioniert


Reportergen-Assays

Ein Reportergen, wie Luciferase, dient normalerweise als Indikator für die Transkription innerhalb von Zellen, wo der Nachweis des Reporterproteins oder seiner enzymatischen Aktivität gemessen wird. Die Wirkung von Promotoren oder Enhancer-Regionen auf die Genexpression kann durch den Nachweis des Reporters in einem spezifischen Assay bestimmt werden, der idealerweise ein niedriges Hintergrundsignal, eine hohe Sensitivität und natürlich schnell, genau und sicher wäre. Im Fall eines Luciferase-Assays wird die Photonenemission gemessen, die aus der Katalyse einer chemischen Reaktion resultiert, die Luciferin, ATP und Sauerstoff als Substrate benötigt. Die Photonenproduktion durch diesen biolumineszenten Reporter erfolgt aufgrund der Art der chemischen Reaktion im Vergleich zur Verwendung eines hochintensiven Lasers zur schnellen Anregung von GFP langsamer als bei fluoreszenzbasierten Methoden wie der Anregung von Green Fluorescent Protein (GFP). Aufgrund der unterschiedlichen Mechanismen zur Photonenerzeugung sind chemilumineszierende Reporter im Allgemeinen weniger hell als fluoreszierende Proteine, haben jedoch den Vorteil geringerer Hintergrundwerte und verbesserter Signalempfindlichkeit, da Photonen einfach gemessen werden – sie werden nicht benötigt, um die Reaktion auszulösen. Tabelle 1 vergleicht einige allgemeine Vor- und Nachteile von Lumineszenz gegenüber Fluoreszenz.

Tabelle 1: Eigenschaften von Lumineszenz gegenüber Fluoreszenz

Lumineszenz Fluoreszenz
Quelle der emittierten Photonen Chemische Reaktion Hochenergetische Photonen
Kinetik der Photonenerzeugung Langsamer Schneller
Cofaktoren/Substrate Erforderlich Nicht benötigt
Signalstärke Untere Höher
Empfindlichkeit Höher Untere
Hintergrund Untere Höher
Posttranslationale Modifikation Nicht benötigt Erforderlich
Photobleichen/Phototoxizität Nicht anfällig Anfällig
Subzelluläre Bildgebung Verbesserung Etabliert
Hochdurchsatz-Assays Verbesserung Etabliert


Rekombinante Proteinproduktion mit hohem Titer

Henry Chiou Ph.D. Stellvertretender Direktor Thermo Fisher Scientific
Jonathan F. Zmuda Ph.D. Direktor von R&D Thermo Fisher Scientific
Maya Yovcheva R&D-Wissenschaftlerin und R&D-Leiterin Thermo Fisher Scientific
Kenneth Thompson Ph.D. R&D Wissenschaftler Thermo Fisher Scientific
Sara Barnes R&D Wissenschaftlerin Thermo Fisher Scientific
Katalyn Irvin R&D Wissenschaftler Thermo Fisher Scientific
Melissa Cross R&D Wissenschaftler Thermo Fisher Scientific
Natasha Lucki Ph.D. Produktmanager Thermo Fisher Scientific

Einsatz des ExpiSf™ chemisch definierten Sf9-Insektenzell-Expressionssystems

Das Baculovirus-Expressionsvektorsystem (BEVS) bietet eine vielseitige Plattform für die Expression einzelner rekombinanter Proteine ​​sowie multimerer Proteinkomplexe, virusähnlicher Partikel, Membranproteine ​​und Proteine, die für Säugerzellen toxisch sind. Kürzlich hat BEVS einen besonderen Nutzen bei der Herstellung von Impfstoffen im kommerziellen Maßstab für Human- und Veterinäranwendungen gezeigt.

Zu den Vorteilen von BEVS zählen die Fähigkeit, Proteine ​​mit verbesserten posttranslationalen Modifikationen im Vergleich zu Bakterien zu exprimieren, niedrigere Reagenzienkosten und weniger Gerätebedarf im Vergleich zur Expression bei Säugetieren sowie eine nachgewiesene Skalierbarkeit für die kommerzielle Produktion von Impfstoffen und Zelltherapiereagenzien . 1

BEVS-Plattformen weisen jedoch weiterhin eine Reihe von Mängeln im Vergleich zu Plasmid-basierten transienten Säugetiersystemen auf, darunter: Variabilität der Expressionsmedien von Charge zu Charge aufgrund des Vorhandenseins undefinierter Komponenten wie Hefeolat, niedrigere Proteintiter und insgesamt länger Zeit zum Eiweiß. Diese Faktoren können die Produktentwicklung in einer Zeit erheblich behindern, in der die Hersteller ständig unter Druck stehen, Impfstoffe und andere Biologika schneller und effizienter zu entwickeln.

Im Gegensatz zu vielen Säuger-Expressionssystemen, die vor mehr als einem Jahrzehnt zu chemisch definierten Medienformulierungen übergegangen sind, verlassen sich Insektenexpressionssysteme weiterhin auf schlecht definierte, Hefeolat enthaltende Medienformulierungen, die dem Zellwachstum, Baculovirus . eine signifikante Variabilität von Charge zu Charge verleihen können Produktion und Proteinexpression.

Yeastolat-haltige Medien sind in ihrer Fähigkeit, ein Zellwachstum mit hoher Zelldichte aufrechtzuerhalten und folglich Baculovirus-Infektionen mit hoher Zelldichte zu unterstützen, weiter eingeschränkt, zwei kritische Aspekte, die erforderlich sind, um die Biomasse zu erhöhen und die Proteintiter pro Volumen zu verbessern.

Im Vergleich zur transienten Proteinexpression bei Säugetieren ist die Zeit vom Gen zum Protein für Insektensysteme signifikant länger, typischerweise in der Größenordnung von 3–4 Wochen, hauptsächlich aufgrund der Zeit, die erforderlich ist, um einen Baculovirus-Stock unter Verwendung adhärenter Sf9-Zellen zu erzeugen, gefolgt von einer anschließenden Amplifikation von Virus durch P1-, P2- und/oder P3-Vorräte, um ausreichend Virus für Proteinexpressionsläufe zu erhalten.

Eliminieren von Variabilität

Um die Mängel traditioneller Insektenexpressionssysteme zu beheben, wurde das ExpiSf™ Expressionssystem entwickelt, um die mit Hefeolat-haltigem Kulturmedium verbundene Variabilität zu eliminieren, die Proteintiter zu erhöhen und die Gesamtzeit bis zur Proteinaufnahme zu verkürzen – alles um die Forschung wie die Impfstoffentwicklung zu rationalisieren Von der Bank in die Klinik.

Ähnlich wie bei den Säugetier-Expressionssystemen Expi293 und ExpiCHO wurde bei der Entwicklung des ExpiSf-Expressionssystems ein systembasierter Ansatz verwendet.

Als erster Schritt in diesem Prozess wurde das erste chemisch definierte (CD), Hefeolat-freie Insektenzellkulturmedium, ExpiSf CD Medium, entwickelt, um ein hochdichtes Zellwachstum, eine Virusproduktion mit hohem Titer und eine verbesserte Proteinexpression zu unterstützen. Mehrere Chargen von ExpiSf CD-Medium wurden formuliert und hinsichtlich Zellwachstum und Proteinexpressionsniveaus konsistenter Wachstumskinetik verglichen (Abbildung 1A) und Proteintiter (Abbildung 1B) wurden über vier verschiedene Chargen von ExpiSf CD Medium erhalten.

Als nächstes wurden Gibco Sf9-Zellen in ExpiSf-CD-Medium durch extensive Langzeitpassage adaptiert, um die hochdichte ExpiSf9-Zelllinie zu erzeugen. Die Wachstumseigenschaften von ExpiSf9-Zellen wurden mit herkömmlichen Sf9-Zellen verglichen, indem Sf9-Zellen in verschiedenen Hefeolat-enthaltenden Medien für mindestens 10 Passagen kultiviert wurden, um die Anpassung sicherzustellen.

Im Vergleich zu Sf9-Zellen, die in Hefeolat-haltigem Medium gezüchtet wurden, erreichten in ExpiSf-CD-Medium gezüchtete ExpiSf9-Zellen höhere lebensfähige Spitzenzelldichten in Standard-Schüttelkolbenkulturen (>20 × 10 6 Zellen/ml vs. 2–10 × 10 6 Zellen/ml Abbildung 1C), ungefähr das Doppelte der Spitzendichte der Medienformulierung mit der nächsthöheren Dichte. ExpiSf9-Zellen besaßen auch einen breiten log-Phasen-Wachstumsbereich von ungefähr 4–12 × 10 6 lebensfähigen Zellen/ml mit einer stabilen Verdopplungszeit von

Unter Ausnutzung der höheren Dichten, die ExpiSf9-Zellen in ExpiSf-CD-Medium erreichen, wurde ein Expressionsverstärker (ExpiSf-Enhancer) entwickelt, der zusammen mit dem ExpiSf-CD-Medium eine konsistente Infektion von ExpiSf9-Zellen mit hoher Dichte bei 5 × 10 6 . ermöglicht Zellen/ml, was zu einer mehrfachen Verbesserung der Proteintiter im Vergleich zu herkömmlichen Sf9-Arbeitsabläufen führt, bei denen Zellen mit 1–2 × 10 6 Zellen/ml in Hefeolat-haltigem Medium infiziert werden (Abbildung 1D).

Da angenommen wird, dass eine optimale Baculovirus-Infektion von Sf9-Zellen auftritt, wenn sich die Zellen in der logarithmischen Phase befinden, ermöglicht der erweiterte logarithmische Wachstumsbereich der ExpiSf9-Zellen in Verbindung mit dem ExpiSf Enhancer eine Infektion von ExpiSf9-Zellen mit deutlich höheren Dichten als herkömmliche Insekten-Workflows, wodurch die Proteintiter pro Volumen erhöht werden.

Schließlich wurde das ExpiFectamine™ Sf-Transfektionsreagenz entwickelt, um die Gesamtzeit bis zur Proteinaufnahme zu verkürzen, um eine schonende, nicht toxische Transfektion von ExpiSf9-Suspensionskulturen hoher Dichte mit großer Bacmid-DNA zu ermöglichen. Die Integration einer Transfektion auf Suspensionsbasis für die Baculovirus-Erzeugung ermöglichte die einfache Herstellung von 100 ml (oder mehr) hochtitrigem (1–5 × 10 9 infektiöse Viruspartikel/ml), hochwertigem P0-Virus, wodurch die Notwendigkeit einer zusätzlichen Virusamplifikation für typische Liter- und Subliter-Workflows.

Darüber hinaus verkürzt die Bacmid-Transfektion auf Suspensionsbasis die Gesamtzeit bis zur Proteinaufnahme um bis zu 50 % (Abbildung 1E) durch Eliminierung der Notwendigkeit einer Virusamplifikation bei gleichzeitiger Eliminierung des Risikos schädlicher Viruspassageeffekte (wobei die Geneinbau-/Proteinexpressionsniveaus während der Erzeugung von P1+-Virusbeständen abnehmen), wodurch sichergestellt wird, dass Baculovirus höchster Qualität für die Proteinexpression verwendet wird läuft.

Abbildung 1. Leistungsmerkmale des ExpiSf Expression Systems. (A) Vier verschiedene Chargen von ExpiSf CD Medium zeigten ein konsistentes Wachstum von ExpiSf9-Zellen mit maximalen lebensfähigen Zelldichten (VCDs) von

20 × 106 Zellen/ml. (B) Die Titer des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) waren in allen getesteten Chargen von ExpiSf CD-Medium 4–5-fach höher im Vergleich zu einem herkömmlichen Sf9-Workflow mit Hefeolat-haltigem (YC) Medium. (C) ExpiSf9-Zellen in ExpiSf-CD-Medium zeigten im Vergleich zu fünf Hefeolat-enthaltenden Insektenzellmedien ein überlegenes Zellwachstum. (D) ExpiSf Enhancer, verwendet in Verbindung mit ExpiSf CD-Medium und ExpiSf9-Zellen, erzeugte 3-fach höhere GFP-Titer als ein herkömmlicher Sf9-Workflow. (E) Das ExpiSf-Expressionssystem reduzierte die Zeit, die erforderlich ist, um von der Bacmid-DNA zur Proteinexpression zu gelangen, um die Hälfte, indem die Notwendigkeit einer Virusamplifikation über die direkte Erzeugung von P0-Virusbeständen mit hohem Volumen und hohem Titer eliminiert wurde.



Vergleich von ExpiSf mit herkömmlichen Sf9-basierten Workflows

Die Expressionsniveaus von drei verschiedenen Proteinen – grünes Fluoreszenzprotein, humanes Fc-Fusionsprotein und Tumornekrosefaktor-alpha (TNF-a) – wurden zwischen dem ExpiSf-System und einem traditionellen Sf9-Workflow verglichen, bei dem Zellen bei 1–2 × infiziert werden 10 6 Zellen/ml in Hefeolat-haltigem Medium.

Im Vergleich zu fünf verschiedenen Hefeolat-haltigen Medien, die mit herkömmlichen Sf9-Workflows getestet wurden, erzielte das ExpiSf-Expressionssystem mit hoher Dichte eine 3- bis 5-fache Verbesserung der Expressionsniveaus der drei getesteten Proteine ​​(Abbildung 2A).

G-Protein-gekoppelte Rezeptoren werden häufig in Insektenzellen exprimiert, teilweise aufgrund des Toxizitätspotentials in Säugerzellen sowie des Wunsches nach einer reduzierten Glykosylierung für strukturbiologische Studien. Cannabinoid-Rezeptor 2 (CB2) wurde im ExpiSf-System und in einem traditionellen Sf9-Workflow exprimiert.

Die optimale Zellerntezeit wurde als 48 Stunden nach der Infektion im ExpiSf bestimmt, was einer Zelllebensfähigkeit von 70 % zum Zeitpunkt der Ernte entspricht.Abbildungen 2B & 2C). Die CB2-Expression (gemessen anhand der Gesamtzahl der CB2-Moleküle pro Zelle mittels quantitativer Durchflusszytometrie) war im ExpiSf-Expressionssystem im Vergleich zum herkömmlichen Sf9-Workflow (Abbildung 2D).

Diese Verbesserung war sowohl auf die Erhöhung der Expressionsniveaus pro Zelle als auch auf die signifikant höhere Dichte von ExpiSf9-Zellen in einem bestimmten Volumen im Vergleich zum herkömmlichen Sf9-Workflow zurückzuführen.

Abbildung 2. Vergleich des ExpiSf-Expressionssystems mit herkömmlichen Sf9-Workflows unter Verwendung verschiedener Hefeolat-haltiger Medien. (A) Expression levels of an Fc fusion protein, green fluorescent protein (GFP), and tumor necrosis factor-alpha (TNF-a) were on average >4, >3, or >5-fold higher in the ExpiSf expression system than those obtained using various yeastolate-containing media in a traditional Sf9 workflow. (B) Optimization of CB2 G-protein-coupled chemokine receptor harvest time and (C) post-infection viability kinetics in the ExpiSf Expression System. (D) Increased total CB2 expression levels obtained in the ExpiSf Expression System compared to traditional Sf9 workflow in Sf-900 II medium increased expression of CB2 is due to both higher per cell expression as well as greater cell density in a given volume for the ExpiSf Expression System.



Glycosylation Patterns and Protein Functionality

Although high protein yields are desirable, resultant proteins are less valuable if they are aggregated, misfolded, degraded, or improperly glycosylated. The quality of the proteins expressed in the ExpiSf system was compared to the quality of the same proteins expressed using a traditional Sf9 workflow with yeastolate-containing medium.

Using secreted alkaline phosphatase (SEAP) as a model protein, glycosylation patterns generated in the ExpiSf were shown to be highly comparable to those of a traditional Sf9 insect workflow, with the predominate glycoforms being Man3, Man3F, and Man6 in both instances (Figure 3A). SDS-PAGE showed a single band with a molecular weight of

57 kD for both workflows (Figure 3B).

The biological activity of TNF-α expressed in the ExpiSf system and by traditional Sf9 workflow was assessed using an NF-κB luciferase reporter gene assay. HIS-tagged TNF-a was expressed and purified by Ni-NTA, and its concentration was determined by A280. TNF-a was expressed at >4-fold higher levels in ExpiSf compared to the traditional Sf9 workflow (Figure 3C) reporter gene assay results demonstrated equivalent biological activity (relative luminescence units RLUs) for the proteins, respectively (Figure 3D).

In summary, the ExpiSf Expression System represents a significant advance in insect cell protein expression in terms of media consistency, protein yield, and time. It enables researchers to streamline protein expression and vaccine development to shorten time lines from bench to clinic.

Figure 3. Comparison of glycosylation patterns and biological activity for proteins expressed in the ExpiSf Expression System and by traditional Sf9 workflow. (A) Glycosylation patterns of secreted alkaline phosphatase (SEAP) were highly similar in the ExpiSf Expression System and in a traditional insect workflow using Sf900-II medium. (B) SDS-PAGE of SEAP purified from the ExpiSf Expression System and a traditional Sf9 workflow using Sf900-II medium. (C) The ExpiSf Expression System generated >4-fold higher TNF-a expression levels compared to a traditional Sf9 workflow. (D) TNF-a activity, as measured by luciferase-based NF?B reporter gene assay, showed equivalent biological response for protein generated in the ExpiSf Expression System and by traditional Sf9 workflow.


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How is a gene structured?

The genome is not simply a chain of protein-coding genes one after the other. Even within one gene, the protein-coding sequences are interrupted by non-coding regions. These non-coding interruptions are known as intervening sequences or Introns. Conversely, the coding sequences that are actually expressed are called Exons.

Most, but not all structural eukaryote genes contain introns. Importantly, these introns are initially transcribed with the exons to form the pre-mRNA, however, they are cut out of the transcript and the remaining exons are joined together before the mRNA is finished being processed. This process is called RNA splicing. This completed, processed mRNA is called the mature mRNA.

Generally, the more complex organisms have more and larger introns. One reason for the existence of the intron/exon structure is that exons can code for different functional regions of proteins, so with the inclusion/exclusion of certain exons, genes can produce various forms of their protein for in different tissues or at different times. This is because the transcription machinery can skip certain exons and include other ones, creating transcripts with different sequences. Dieser Vorgang heißt alternative splicing, and represents an important layer of controlling the proteins that are produced in cells.

Genexpression

Genes encode proteins and proteins dictate cell function. Therefore, the combination of genes that are active in a particular cell determine the identity of the cell and the tasks it is carrying out. The activation of genes is called Genexpression, and it is tightly regulated at several points, from the initial process of transcription, to splicing, to the translation of the proteins and the modifications to the final protein structures. These processes are tightly controlled at every step to closely monitor and maintain cell types with the required characteristics.

How is gene expression regulated?

The main control point for gene expression is usually at the start of transcription. That is, controlling the signal that tells the cell to produce this mRNA and make this protein.

Transcript processing provides an additional level of regulation. This level of regulation includes splicing, where alternative transcripts can be produced depending on the needs of the cell. Additionally, newly synthesized transcripts can be enzymatically broken down to control protein levels in the cell in response to different cues.

The variety of cell types that exist in a multicellular organism comes from the complexity brought about by variety of potential gene expression profiles. Different cell types possess distinct sets of regulators that initiate or repress the production of different transcripts and proteins

Regulatory elements

As mentioned previously, a large proportion of the genome codes for important regulators. That is, the sequences do not make a protein, but the sequences are key in modulating the expression of other genes.

Transcription usually starts when RNA polymerase binds to an important regulatory region called the Gen-Promotor. This sequence is usually located just upstream from the starting point for transcription. The binding of specific proteins to the promoter is usually required for the gene to be transcribed. Thus, the cell can regulate whether the gene is expressed or not through these regulatory factors, which can be general or cell-type specific.

More recently, another type of regulatory elements have been discovered, called enhancer sequences. These also represent a binding site for other regulatory proteins, and they help to control and fine-tune the expression of a gene. There is no strict criteria for what defines an enhancer region, and the landscape of enhancers in the genome is hugely complicated. Enhancers can also only be active in certain cell types of conditions, or can be active all the time. One interesting feature of enhancers is they can be located thousands of nucleotides away from the gene they control. Further complicating things, some regulatory elements or proteins can affect the transcription of multiple genes, and some regulatory proteins can even have different roles for different genes!

The timed turning off/on of genes in a cell represents on layer of control of the content of proteins in a cell, and thus the Identität of that cell. The complexity of the genome in eukaryotes is due to the presence of multiple regulators on the DNA. The concerted actions of regulatory sequences in the DNA, the presence of regulatory factors, and the post-transcriptional/translational processing of a transcript or a protein allows fine-tuning of the gene expression patterns in a cell. This allows cells to perform their required tasks and to respond quickly to changes in the environment.



Bemerkungen:

  1. Fenriramar

    Ja, das ist Fiktion

  2. Abdul-Karim

    Ich stimme zu, eine sehr nützliche Nachricht

  3. Nik

    Du hast nicht recht. Ich bin sicher. Wir werden diskutieren.

  4. Pepin

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    Vom Regen in die Traufe.

  6. Gustav

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