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Warum können wir keine Plasmide verwenden, um uns selbst Gene hinzuzufügen?

Warum können wir keine Plasmide verwenden, um uns selbst Gene hinzuzufügen?


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Wenn ich diese Antworten lese, frage ich mich, warum "Gentherapie" keine eigenständigen Plasmide verwendet, anstatt zu versuchen, eine Länge in ein Chromosom zu spleißen?


Erstens integrieren sich Plasmide normalerweise nicht in die Chromosomen menschlicher Zellen. Im Labor können Plasmide in das Zytosol von Zellen eingebracht werden, Plasmid-DNA wird dann von der Wirtszelle "gelesen" und beispielsweise zur Herstellung neuer Proteine ​​verwendet. Plasmide bleiben jedoch meist getrennt von der zelleigenen DNA und sind in diesem Sinne für die Gentherapie nicht wirksam.

Zweitens sind unsere Zellen ziemlich gut darin, Plasmide sowie andere fremde DNA zu erkennen und zu zerstören. Dies ist ein Selbstverteidigungsmechanismus, der entwickelt wurde, um Viren und andere böse Parasiten loszuwerden, die versuchen könnten, die Zelle zu entführen. Im Labor, wo wir mit isolierten Zellen in einer Kulturschale ohne Immunsystem arbeiten, werden Plasmide typischerweise toleriert. Aber beim Menschen sind Immunzellen, die sich auf die Erkennung von Eindringlingen spezialisiert haben, sehr kompetent darin, solche Manipulationen zu erkennen, und sie werden schnell Alarm schlagen und verheerenden Schaden anrichten… Wenn also Plasmide in den Körper injiziert werden, werden sie schnell erkannt und zerstört.

Die Forschung in der Gentherapie zielt darauf ab, effizientere Wege zu finden, um die DNA menschlicher Zellen zu "bearbeiten", um letztendlich sicher im Körper angewendet werden zu können. Eine solche Technik existiert noch nicht. Das neueste Gen-Editiersystem CRISPR-Cas9 ist ein phänomenales Werkzeug und sehr effizient, um in die DNA menschlicher Zellen einzudringen; aber die CRISPR-Cas9-Proteine ​​müssen selbst in die Zelle eingebracht werden, wofür typischerweise ein Virus benötigt wird, und dies würde im menschlichen Körper erneut Immunreaktionen auslösen.


Ich glaube, wir könnten die Plasmid-Insertion verwenden, um die Gentherapie zu unterstützen. EBV kann ein Plasmid in den Zellen aufrechterhalten, die es infiziert, und die Plasmide können sich effektiv replizieren. Mit einem besseren Verständnis der Latenz und der Auswirkungen des Einfügens von Genen mit EBV könnte es möglich sein, dass die Gentherapie über Gene auf einem Plasmid erfolgt. Referenzen: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2562867/ http://jvi.asm.org/content/65/1/483.full.pdf


Kapitel 3 Gentechnik

Gene enthalten kodierte Informationen, die zur Produktion von Proteinen führen. Proteine ​​wiederum sind dafür verantwortlich, die Merkmale zu erzeugen, die einzelne Organismen charakterisieren. Wenn also ein Weg gefunden werden könnte, Gene von einem Organismus auf einen anderen zu übertragen, könnten Kreaturen mit Eigenschaften hergestellt werden, die sie noch nie zuvor gezeigt hatten. Basierend auf der Beschreibung der DNA-Struktur von Watson und Crick begannen die Forscher, nach einer Möglichkeit zu suchen, Gene aus der DNA eines Organismus zu schneiden und in einen anderen einzufügen. In den 1970er Jahren hatten sie die Antwort und die Wissenschaft der Gentechnik war geboren. Es war ein riesiger Schritt nach vorne. Heute, nur dreißig Jahre später, ist es möglich, Gene zwischen einer Pflanze und einer anderen und zwischen einem Tier und einem anderen auszutauschen. Es ist sogar möglich, Gene zwischen Pflanzen und Tieren zu transponieren. Kein Organismus—von primitiven Lebensformen, wie Bakterien, bis hin zu Tieren höherer Ordnung, wie dem Menschen—ist von diesem genetischen Austausch ausgenommen. Die Gentechnik hat zu gewaltigen Fortschritten in Medizin und Landwirtschaft geführt, aber auch zu einem Sturm der Kontroversen und Debatten über die Grenzen des menschlichen Eindringens in die natürliche Ordnung der Dinge geführt.


IRA FLATOW: Das ist Wissenschafts-Freitag. Ich bin Ira Flatow. Eines der mächtigsten Werkzeuge, die Biologen heute verwenden, ist kein neuer DNA-Sequenzer. Es ist auch kein Gendrucker. Tatsächlich haben wir Menschen es überhaupt nicht erfunden.

Es ist etwas, das wir von Bakterien geliehen haben, eine ausgeklügelte Selbstverteidigung, die sie haben, eine molekulare Maschine, die eindringende Viren zerkleinert, um eine Infektion zu stoppen. Das Tool heißt CRISPR-cas9 und ermöglicht es Wissenschaftlern, DNA zu bearbeiten, Gene zu modifizieren oder zu löschen und auch neue hinzuzufügen. Es wird bereits verwendet, um neue Medikamente zu entwickeln. Und seine Vielseitigkeit ist nicht unumstritten.

Sollten Sie beispielsweise CRISPR verwenden, um die Gene in einem menschlichen Embryo zu bearbeiten? Sollten Sie es verwenden, um Mücken so zu modifizieren, dass sie keine Malaria übertragen können? Viele große Fragen.

Aber bevor wir uns selbst überholen, sagt mein nächster Gast, dass diese Gen-Editing-Technologie nicht so einfach zu bedienen ist oder ein garantierter Home-Run ist, wie wir glauben gemacht haben. Carmela Haynes ist Assistenzprofessorin an der School of Biology and Health Systems Engineering der Arizona State University in Tempe. Willkommen zurück zum Wissenschafts-Freitag.

CARMELA HAYNES: Hallo, Ira. Es ist großartig, hier zu sein. Dankeschön.

IRA FLATOW: Sie sind willkommen. Wir haben eine Art Herausforderung gelesen, wie einfach CRISPR zu verwenden ist. Rudolf Jaenisch vom MIT sagte Zitat, “jeder Idiot könnte es tun”. Und das wurde irgendwie auf die Probe gestellt und herausgefunden, dass es wirklich kein Idiot so einfach tun konnte.

CARMELA HAYNES: Richtig, ja, definitiv. Daher verbringt unser Labor viel Zeit damit, ein System zu untersuchen, das für jedes Lebewesen einzigartig ist, das im Wesentlichen aus mehr als einer Zelle besteht. Und der Haken an der Sache ist, dass jeder Idiot es tun könnte, wenn man davon ausgeht, dass es keine Straßensperren oder spezielle Dinge gibt, die die CRISPR verhindern würden um einzudringen und tatsächlich auf das Zielgen zuzugreifen.

IRA FLATOW: Also zum Beispiel sind diese Zellen in menschlichen Embryonen ziemlich gut zusammengerollt?

CARMELA HAYNES: In der Tat, ja. Und die Sache mit der CRISPR-Maschinerie ist, ich meine, sie ist fantastisch. Es ist sehr gut in dem, was es tut. Aber im Laufe der Jahrmillionen, in denen es sich entwickelt hat, hat es in Bakterien in einem Raum funktioniert, in dem wir nicht die gleiche Art von DNA-Aufwicklung und -Verpackung sehen, die wir in einer Zelle wie in einer menschlichen Zelle sehen Embryo.

Insbesondere die DNA in embryonalen Zellen hat also viele Wechselwirkungen tief im Inneren des Zellkerns, die bestimmte Gene bündeln und vom Rest der Umgebung trennen. Dies stellt also tatsächlich eine kleine molekulare Herausforderung für die CRISPR-Maschinerie dar, wenn es darum geht, auf das Ziel zuzugreifen, das Sie verfolgen.

CARMELA HAYNES: Immer wenn wir über CRISPR sprechen, viel in der Show, weil es sich um eine so hochmoderne Technologie handelt, die mit ethischen Entscheidungen behaftet ist. Und je mehr ich mit Leuten in der Umgebung rede, sagen sie, du weißt, es klingt ziemlich einfach.

Aber was Sie nicht hören, sind viele fehlgeschlagene Versuche, es zu benutzen. Viel Versuch und Irrtum und so weiter. Würden Sie dem zustimmen?

CARMELA HAYNES: Dem würde ich auf jeden Fall zustimmen. Wenn Wissenschaftler also veröffentlichen, erhalten diese Erfolgsgeschichten eine höhere Priorität. Wenn es also ein bestimmtes Gen gibt, das in der medizinischen Forschung eine große Bedeutung hat, wird viel Arbeit investiert, um genau die richtige Stelle auf diesem Gen auszuwählen, die wir durch Versuch und Irrtum feststellen, dass CRISPR sehr gut ist beim Schneiden. Was Sie in vielen Veröffentlichungen sehen werden, sind Beispiele dafür, wo es funktioniert.

Aber aufgrund der Art und Weise, wie Publikationen strukturiert sind und unserer allgemeinen Kultur, über Erfolge und weniger über Misserfolge zu berichten, gibt es viele Informationen im wissenschaftlichen Wissen, die uns sagen, dass es nicht immer so funktioniert gut, wie wir es erwarten.

IRA FLATOW: Es ist CRISPR selbst, die ganze Verbindung zu Bakterien ist einfach, es ist so faszinierend, nicht wahr? Dass Bakterien diesen Kampf mit Viren bekämpft haben, jedes Bakterium hat ein Virus, das es essen will, und hat sich diesen Mechanismus einfallen lassen, um es abzuwehren. Und dann nehmen wir es hier irgendwie an.

CARMELA HAYNES: Oh, ja, definitiv. Das ist ein faszinierender Aspekt der Nutzung des Systems. Ich denke, als Wissenschaftler anfingen, herauszufinden, wie das System funktioniert, haben sie sofort über Anwendungen nachgedacht. Es gibt ähnliche Dinge in der Forschungsgemeinschaft, wie zum Beispiel Restriktionsenzyme, die ebenfalls aus Bakterien stammen, die DNA sehr gut zerschneiden können.

Aber ich denke, ein anderer – Apropos Abwehrmechanismen, die Zellen höherer Organismen haben sozusagen ein System, das nicht unbedingt darauf beruht, eindringende DNA zu schneiden. Was Zellen wie menschliche Zellen gerne tun, ist, nachdem die DNA ihren Weg in den Zellkern gefunden hat, was in vielen Fällen passiert ist oder zumindest haben wir viele Beweise dafür, dass spezielle Proteine ​​​​mit dem DNA innerhalb eines Zellkerns nimmt die DNA auf, verpackt sie und hüllt sie in eine sehr enge Struktur ein. Damit diese eindringenden DNA-Stücke sich nicht replizieren und ausschneiden und sich bewegen und unseren genetischen Code durcheinander bringen können. Menschliche Zellen haben also ihren eigenen Abwehrmechanismus, von dem ich denke, dass wir in den frühen Stadien der Entwicklung von CRISPR als Werkzeug noch nicht ganz damit begonnen hatten, diese Herausforderung anzugehen.

IRA FLATOW: Aber Sie denken, es ist eine adressierbare Herausforderung?

CARMELA HAYNES: Oh definitiv. Vor etwas mehr als zwei Jahren haben meine Doktorandin und ich, eine fantastische Doktorandin, Renee Dare, mit einigen anderen Professoren zusammengearbeitet, um einen Kurs über synthetische Biologie zu unterrichten. Das ist also mein Feld. Wir überlegen, wie wir aus der Biologie geliehene Kleinigkeiten zusammensetzen und sehr nützliche Werkzeuge herstellen können.

Also machten wir uns daran, einen Kurs am Cold Spring Harbor Laboratory zu entwickeln. Und wir haben uns entschieden, uns auf den Unterricht über CRISPR für angehende synthetische Biologen zu konzentrieren. Also setzten wir uns hin und überlegten, wie wir diese Lektion aufbauen sollten. Und wir wollten es sehr interessant machen.

Also fingen wir an, in CRISPR zu suchen, und wurden sehr neugierig, da unsere Spezialität in der DNA-Verpackung liegt und wie man das entwickelt, und wir begannen uns zu fragen, nun, wissen Sie, da CRISPR von einem bakteriellen System stammt. Es wurde in einer Umgebung entwickelt, in der es noch nicht all diesen komplexen Verpackungsmaschinen ausgesetzt war. Was wäre, wenn wir CRISPR tatsächlich mit einem Paketsystem herausfordern würden?

Wir hatten also zufällig eine sehr schöne manipulierte, humane kultivierte Zelllinie, die wir im Labor verwenden, um Fragen zur Entwicklung von DNA-Verpackungen zu untersuchen. Und was wir gemacht haben, war, dass wir ein ziemlich einfaches Experiment durchgeführt haben, bei dem wir eine Zielsequenz künstlich in die Zellen verpackt haben. Und dann CRISPR eingeführt und gemessen, wie gut es beim Schneiden war.

Und wir haben festgestellt, dass Sie in einigen Fällen das CRISPR-Schneiden vollständig eliminieren oder vollständig blockieren können, wenn dieses Zielgen verpackt ist. Eines der netten Dinge an unserem künstlichen System ist, dass es auf der gleichen Maschinerie aufgebaut ist, die Stammzellen verwenden, um die Aktivität bestimmter Gene zu unterbrechen, die an der Umwandlung der Stammzelle in eine spezialisierte Zelle wie eine Muskelzelle oder eine Nervenzelle beteiligt sind. Unser künstliches System überlappt sich also, obwohl es künstlich ist. Es verwendet viele der gleichen Proteinteile, die Stammzellen verwenden, um ihre Gene unzugänglich zu machen. Ja, wir denken, dass unser Ergebnis, das wir gerade in ACS Synthetic Biology veröffentlicht haben, äußerst relevant ist, um tiefer in die Herausforderungen einzugehen, die mit dem praktischen Einsatz von CRISPR als Werkzeug verbunden sind.

IRA FLATOW: Lass mich sehen, ob ich schnell einen Anruf bekomme, bevor wir gehen müssen. Lass uns nach Panama City, Florida, fahren. Matthew, willkommen zum Wissenschafts-Freitag.

MATTHEW: Meine Güte, danke, Ira. Wie viele Idioten verwenden das auf der ganzen Welt? Um es mir vor Augen zu führen, gibt es Hunderte von Labors, gibt es Tausende von Laboren?

IRA FLATOW: Hey, ist das fair&8211 danke, danke für den Anruf. Ist das eine berechtigte Frage, Carmela?

CARMELA HAYNES: Nun, ich denke, der richtige Weg, darüber nachzudenken, ist, über die Schritte nachzudenken, die mit der Verwendung von CRISPR verbunden sind. Es ist also– ich stimme zu, dass die Technologie selbst sehr zugänglich ist, wie morgen, wenn ich beschließen würde, meinen Unterrichtsplan hier an der ASU zu ändern, könnte ich ein Tutorial entwickeln, das es den Schülern ermöglicht, sich einen öffentlich anzusehen verfügbare menschliche DNA-Sequenz online auf einer Website wie NCBI und sehen Sie sich eine Sequenz an. Bringen Sie ihnen einige Grundregeln bei, wie CRISPR auf eine Site ausgerichtet wird, und geben Sie ihnen Anweisungen zum Entwerfen eines CRISPR.

Dies ist also ein anpassbares System, mit dem Sie Nukleotidsequenzen ändern können, die mit der CRISPR-Maschinerie verbunden sind, um dem Ziel zu entsprechen, das Sie verfolgen und bearbeiten möchten. So könnte ich diesen Studenten sicherlich beibringen, wie es auf dem Papier funktioniert. Wir könnten sogar durchgehen, OK, nun, wie würden Sie die DNA von einem Unternehmen bestellen, einem DNA-Syntheseunternehmen, um Ihr eigenes maßgeschneidertes CRISPR-Tool zu bauen?

Aber dann die riesige Barriere– man kann alles auf Papier abbilden. Sie können Algorithmen ausführen, um genau das richtige Ziel zu suchen, aber wenn es dann darum geht, Zellen oder einen Organismus tatsächlich zu nehmen und dann auszudrücken und zu bekommen, was Sie wollen, sind viele komplizierte Schritte erforderlich. Während CRISPR für jeden zugänglich sein kann und es leicht zu erlernen ist, wie man es benutzt, ist es tatsächlich eine Herausforderung, es zu implementieren.

IRA FLATOW: Wir werden also noch kein CRISPR-Heimkit für Ihr Wohnzimmer sehen. Aber man weiß nie, wie bald. Ja genau.

IRA FLATOW: Dr. Haynes, vielen Dank, dass Sie sich heute Zeit für uns genommen haben. Carmela Haynes ist Assistenzprofessorin an der School of Biological and Health Systems Engineering der Arizona State University in Tempe, Arizona.


Transformation von Escherichia coli mit pGLO-Plasmid

ABSTRAKT:
Dieses Experiment konzentriert sich auf die Gentechnik und die Transformation von Bakterien. Die Eigenschaften von Bakterien werden von einer externen Quelle verändert, damit sie ein neues Merkmal ausdrücken können, in diesem Fall eine Antibiotikaresistenz. In diesem Experiment wird fremde DNA in Escherichia coli inseriert, um deren Phänotyp zu verändern. Ziel des Experiments ist es, E. coli mit dem pGLO-Plasmid, das ein Gen für Ampicillinresistenz trägt, zu transformieren und die Transformationseffizienz zu bestimmen.

Die Bakterien werden durch eine Kombination von Calciumchlorid und Hitzeschock umgewandelt. Wenn die Bakterien auf Eis inkubiert werden, wird die flüssige Zellmembran verlangsamt und dann erhöht der Hitzeschock die Durchlässigkeit der Membran. Die in dem Experiment erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass die mit pGLO transformierten E. coli in der Lage waren, Ampicillin zu widerstehen und in seiner Gegenwart zu wachsen. Diese Ergebnisse legen nahe, dass Mikroorganismen gentechnisch verändert werden können, um bestimmten Schadstoffen selektiv zu widerstehen, was bedeutet, dass sie möglicherweise zum menschlichen Nutzen verwendet werden können, um die Umwelt oder sogar den menschlichen Körper von unerwünschten Giftstoffen zu befreien.

Transformation tritt auf, wenn veränderte genetische Eigenschaften von Bakterien aus einer anderen Quelle erworben werden. Plasmide werden zur Transformation von Bakterien verwendet, da sie kleine DNA-Stücke sind, die sich unabhängig replizieren und daher ihre (oft nützlichen) Eigenschaften auf die Bakterien übertragen können. Ziel der genetischen Transformation in diesem Experiment ist es, dass das Bakterium Escherichia coli eine Antibiotikaresistenz gegen Ampicillin erhält, die physikalisch beobachtet werden kann, wenn das Bakterium das Reportergen Green Fluorescent Protein (GFP) exprimiert, da die transformierten Bakterien unter UV-Licht grün leuchten wenn in Gegenwart von Arabinose. Das Gen für GFP kommt natürlicherweise in einer biolumineszenten Qualle vor und lässt sie im Dunkeln leuchten. Das zur Transformation der Bakterien verwendete Plasmid enthält die Antibiotikaresistenz sowie ein Gen, das für das fluoreszierende Protein kodiert.

Das Ziel dieses Experiments ist es, Ampicillin-resistente E. coli durch Transformation mit einem Plasmid, das ein Antibiotikaresistenzgen und ein für GFP kodierendes Gen enthält, genetisch zu verändern und die Transformationseffizienz zu berechnen. Dadurch wird der Phänotyp durch Einfügen fremder DNA verändert. Dieses Experiment ist wichtig, weil es eine Technik demonstriert, die praktische Anwendungen in Bereichen wie Umweltbelangen hat. Bakterien, die gentechnisch verändert wurden, können Eigenschaften erhalten, die es ermöglichen, giftige Verbindungen (z. Einige Umweltschadstoffe sind für Mikroorganismen, wie Bakterien, tatsächlich toxisch und deaktivieren die Zellen, wodurch ihre Fähigkeit zum Abbau der Schadstoffe aufgehoben wird (Pieper, 2000). Aus diesem Grund sind Bakterien vorzuziehen, die gegen bestimmte Toxine resistent sind, und es wäre wünschenswert, ihre DNA – das Resistenzgen spezifisch – zu replizieren und zu verwenden, um eine solche Resistenz in anderen Organismen zu erzeugen. Diese Forschung baut direkt auf dem Wissen auf, das in diesem Experiment zur Transformation von E. coli verwendet wurde.

Die Hypothesen für dieses Experiment sind, dass die Bakterien durch das Plasmid transformiert werden, um eine Antibiotikaresistenz zu entwickeln und trotz der Anwesenheit von Ampicillin wachsen. Wenn dem durch das Plasmid transformierten Bakterienstamm Arabinosezucker zugesetzt wird, exprimiert er außerdem GFP und leuchtet unter UV-Licht grün.

Die Methoden und Verfahren zur Transformation von Bakterien in diesem Experiment wurden nach Spilios (2013) durchgeführt. Bakterienstämme von E. coli wurden genetisch mit einem Plasmid transformiert, um Ampicillinresistenz zu tragen. 250 Mikroliter einer CaCl2-Transformationslösung wurden in geschlossene Reagenzgläser pipettiert, die dann auf Eis gestellt wurden. Eine Starterplatte mit E. coli-Kolonien wurde beobachtet und zwei Kolonien wurden in die CaCl2-Röhrchen überführt, jeweils eine Kolonie, und durch Mischen gleichmäßig in der Lösung verteilt. Die Röhrchen wurden dann wieder auf Eis gestellt. Zehn Nanogramm pGLO-DNA-Lösung wurden dann in eines der Röhrchen gegeben und die Röhrchen wurden auf inkubiert
Eis für zehn Minuten. Während die Röhrchen inkubiert wurden, wurden vier Platten mit LB-Nähragar erhalten, eine enthielt nur LB, zwei ebenfalls mit Ampicillin und eine ebenfalls mit Ampicillin und Arabinose. Die Teströhrchen wurden nach den zehn Minuten für 50 Sekunden in einem Wasserbad von 42 Grad Celsius inkubiert und dann für weitere zwei Minuten auf das Eis zurückgestellt. Die Röhrchen wurden dann vom Eis genommen und 250 Mikroliter LB-Nährlösung wurden jedem Röhrchen zugesetzt, das dann weitere zehn Minuten bei Raumtemperatur inkubiert wurde. 100 Mikroliter der Lösung in dem pGLO enthaltenden Röhrchen wurden auf eine Platte mit nur LB-Agar und Ampicillin und auf die Platte mit Ampicillin und Arabinose gegeben. 100 Mikroliter der Lösung im Röhrchen ohne pGLO wurden zu der anderen Platte, die LB und Ampicillin enthielt, sowie zu der Platte, die nur LB enthielt, gegeben. Die Lösung wurde um die Oberfläche jedes Agars verteilt, wobei für jede Platte eine neue sterile Öse verwendet wurde. Die Platten wurden dann bei 37 Grad Celsius inkubiert und die Ergebnisse wurden beobachtet und nach 27 Stunden aufgezeichnet.

ERGEBNISSE:
Teller
Beobachtungen
Wachstum
„+pGLO LB/Amp“
Gelbe Kolonien bleiben unter UV-Licht gelb
Jawohl
„+pGLO LB/amp/ara“
Gelbe Kolonien leuchten unter UV-Licht grün
Jawohl
Tabelle 1. Transformierte Platten nach der Inkubation zeigt das Wachstum transformierter Bakterien und ihre beobachtbaren Eigenschaften.

Teller
Beobachtungen
Wachstum
„-pGLO LB/Ampere“
Nichts
Nein
„-pGLO LB“
Gelbe Kolonien bleiben unter UV-Licht gelb
Jawohl
Tabelle 2. Kontrollplatten nach der Inkubation zeigt, ob E. coli ohne Anwesenheit des pGLO-Plasmids nach Ampicillin-Exposition gewachsen war.

Die transformierten Bakterien zeigten trotz der Anwesenheit von Ampicillin Wachstum (Tabelle 1), während die Kontrollplatte mit Ampicillin kein Wachstum zeigte und die Kontrollplatte mit nur LB-Agar die Bildung eines Bakterienrasens (Tabelle 2) zeigte. Die transformierten Bakterien auf der Platte mit LB, Ampicillin und Arabinose unterschieden sich von der transformierten Platte ohne Arabinose dadurch, dass sie unter UV-Licht grün leuchteten. Die Bakterien ohne Arabinose behielten unter UV-Licht ein unverändertes Aussehen bei. Die Transformationseffizienz für die transformierten Bakterien betrug 5,2 × 10 4 Transformanten pro Mikrogramm DNA.

DISKUSSION:
In diesem Experiment bestand das Ziel darin, E. coli mit dem pGLO-Plasmid zu transformieren und die Transformationseffizienz zu berechnen. Die Hypothesen waren, dass die Platte mit nur LB-Agar und nicht transformierten E. coli einen Rasen wachsen würde die Kontrollplatte mit nicht transformierten Bakterien mit LB und Ampicillin würde kein Wachstum erfahren die transformierte Platte mit nur LB und Ampicillin würde Bakterienkolonien wachsen lassen, aber nicht unter UV-Licht grün leuchten und die transformierte Platte mit LB, Ampicillin und Arabinose würde Kolonien wachsen lassen, die unter UV-Licht grün leuchten würden. Die gefundenen Ergebnisse unterstützten jede dieser Hypothesen, da die Bakterien wie vorhergesagt wuchsen. Die untransformierten Bakterien wuchsen auf der LB-Platte schnell, da keines von ihnen durch das Ampicillin gehemmt wurde, aber sie wuchsen nicht, wenn sie Ampicillin auf der anderen Kontrollplatte ausgesetzt wurden, da sie nicht das Gen für Antibiotikaresistenz aufwies. Die transformierten Platten trugen beide das Gen zur Resistenz gegen Ampicillin aus dem pGLO-Plasmid, sodass sie Kolonien züchten konnten, die die Nachkommen der genetisch transformierten E. coli waren. Auf der Platte, die auch Arabinose enthielt, wuchsen Bakterienkolonien, die das Gen enthielten, das nicht nur Ampicillin widersteht, sondern auch GFP exprimiert und die Bakterien unter UV-Licht grün leuchten lässt. Das Arabinose-Operon in E. coli ist a
Reihe von Genen, die nur aktiv werden, wenn der Zucker Arabinose vorhanden ist (Spilios, 2013). Gene werden transkribiert und übersetzt, um Arabinose für Energie abzubauen. Die Expression von Enzymen, die Arabinose abbauen, kann ein- oder ausgeschaltet werden. Im pGLO-Plasmid hat das GFP-Gen Gene ersetzt, die für den Abbau von Arabinose kodieren. In diesem Experiment fungierte die zugegebene Arabinose als „Einschalter“, um das Operon zur Produktion von GFP zu veranlassen. Die für die Ergebnisse berechnete Transformationseffizienz betrug 5,2 × 10 4 transformierte Zellen pro Mikrogramm verwendeter DNA. Dies liegt etwas unter der Standard-Transformationseffizienz in der veröffentlichten Standardforschung. Hanahans (1983)-Experiment besagt, dass er die unter Standardbedingungen beobachteten Effizienzniveaus um das 100- bis 1000-Fache verbesserte, mit einer berichteten Effizienz von 5 × 108 Transformanten pro Mikrogramm Plasmid. Die Art des Wachstums- oder Nährmediums hat keinen großen Einfluss auf die Transformationseffizienz, aber die Konzentrationen an Komponenten, die die Wachstumsrate in den Medien erhöhen, neigen dazu, die Transformation zu unterstützen (Hanahan, 1983). Daher kann es sich als vorteilhaft erweisen, ein Wachstumsmedium mit höheren Konzentrationen von Mg2+ in das experimentelle Design einzubauen, um eine etwas höhere Transformationseffizienz zu erreichen. Zukünftige Experimente könnten sich darauf konzentrieren, die Transformationseffizienz von E. coli zu steigern (Chung, 1989). Dies kann dazu beitragen, Kosten zu senken und die Zuverlässigkeit zu erhöhen, um bestehende Verfahren zu ersetzen. Wie bereits erwähnt, hilft die Entwicklung von Arbeitswissen und Verständnis von Gentechnik bei der Bewältigung von Umwelt- und Gesundheitsproblemen. Mikroorganismen könnten verwendet werden, um bestimmte Schadstoffe oder Toxine in der Umwelt oder im menschlichen Körper gezielt anzugreifen.

ZITIERTE LITERATUR:
Chung CT. 1989. Einstufige Herstellung von kompetenten Escherichia coli: Transformation und Lagerung von Bakterienzellen in derselben Lösung. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 86:2172-2175.

Hanahan D. 1983. Studien zur Transformation von Escherichia coli mit Plasmiden. Journal of Molecular Biology, 166: 557–580.

Pieper DH. 2000. Engineering von Bakterien für die Bioremediation. Aktuelle Meinung in
Biotechnologie, 11.3:262-270.

Spilios K (Hrsg.). 2013. Prinzipien der Biologie, II. Hayden-McNeil Publishing, Plymouth, MI. Modul #6, S. 119-127.


Warum können wir keine Plasmide verwenden, um uns selbst Gene hinzuzufügen? - Biologie

Fühlen Sie sich blau? Diese Bakterien sind zu und das lässt uns molekulare Kloner blau werden, weil es bedeutet, dass unser Gen in das zirkuläre DNA-Stück namens Plasmid gelangt ist, das wir dort einfügen, damit die Bakterien Kopien des Gens für uns herstellen können. Aber die gute Nachricht ist, das Blau-Weiß-Screening-System macht es leicht zu erkennen &ndash so können wir das Blau vermeiden und stattdessen eine weiße Kolonie auswählen, bei der das molekulare Klonen gut lief!

Ein Überblick in Reimen, dann wird es Zeit! Wenn der Plasmidvektor Ihr Insert hackt, fehlt den Bakterien das blau färbende Protein! Das Plasmid hat die Sequenz, die die Bakterien benötigen, aber Sie würden dies wissen, wenn Ihre Klonierung erfolgreich ist. Wenn Sie das Gen einfügen, brechen Sie diese Sequenz und verstärken das funktionelle Protein, das die Bakterien nie herstellen. Wenn die Kolonie weiß ist, wissen Sie, dass alles richtig gelaufen ist, aber wenn die Kolonie blau ist, müssen Sie es wiederholen

Jeder der Punkte auf dieser Platte ist ein Klumpen genetisch identischer Bakterien, die wir eine Kolonie nennen. Sie sind genetisch identisch, weil Bakterien sich vermehren, indem sie ihr Inneres (einschließlich ihrer DNA) verdoppeln und dann in zwei Hälften teilen, wodurch jeder Tochterzelle ein vollständiger Satz von allem gegeben wird.

Zusätzlich zu ihrer eigenen DNA besitzen diese Bakterien ein „extra&rdquo zirkuläres DNA-Stück, das als Plasmid bezeichnet wird. Ich weiß, dass diese Bakterien das gewünschte Plasmid haben, weil das Plasmid über Antibiotikaresistenzgene verfügt, die es ihm ermöglichen zu überleben, obwohl ich die Bakteriennahrung (Medien) mit den entsprechenden Antibiotika versetzt habe. Dies ist eine Form der AUSWAHL und nur Bakterien mit dem darin enthaltenen Plasmid können auf diesen Platten wachsen.

Aber abgesehen von der Auswahl gegen zufällige Bakterien, die versuchen, auf unseren Platten zu wachsen, ist das Plasmid wirklich nur dazu da, als Vehikel oder VEKTOR zu fungieren, um es uns zu ermöglichen, &bdquojedes&rdquo-Gen, das wir wollen, in die Bakterien einzufügen &ndash, also zum Beispiel, sie können viele Kopien davon für uns machen. Da wir DNA-Stücke rekombinieren, wenn wir die Vektor/Insert-Kombination durchführen, ist eine Form REKOMBINANTER DNA. Und da die Bakterien viele Kopien davon machen und jede Tochterzelle bei der Teilung ein genetischer Klon der Elternzelle ist, nennen wir diesen allgemeinen Prozess MOLEKULARKLONIEREN.

Der grundlegende Kern des molekularen Klonens ist: Stecken Sie ein Gen, das Sie untersuchen möchten, in ein zirkuläres Stück DNA, das als Plasmidvektor bezeichnet wird, und stecken Sie dieses Plasmid in Bakterien, um mehr von diesem Gen und/oder dem Protein, für das es kodiert, zu machen (möglich, weil die genetischen Code ist universell, sodass jeder Organismus ihn lesen kann). Es ist ein leistungsstarkes Werkzeug, das die Molekularbiologie und die Biochemie revolutioniert hat. ABER es funktioniert immer richtig, also müssen wir das überprüfen

  1. die Bakterien nahmen tatsächlich das Plasmid auf UND
  2. unser Gen wurde tatsächlich in das Plasmid eingefügt

Wir können AUSWAHLMARKER wie Antibiotikaresistenzgene verwenden, um das Vorhandensein des Plasmids (1) zu überprüfen, z.B. Wenn das Plasmid ein Ampicilin (Amp)-Resistenzgen aufweist, die Wirtsbakterien jedoch nicht keimen, können nur Bakterien, die das Plasmid aufweisen, in Gegenwart von Amp wachsen. Alle Bakterienkolonien, die wachsen, weisen das Plasmid auf. ABER enthält dieses Plasmid Ihr Gen (2)? Sie wissen es immer noch nicht, aber es gibt einige Möglichkeiten, es herauszufinden.

Einige Optionen, die wir uns angesehen haben, sind der DIAGNOSTIC DIGEST (auch bekannt als analytischer Digest). http://bit.ly/30Npa8o & COLONY PCR http://bit.ly/39cADmK . Diese entweder CUT (im Verdau) oder COPY (in der PCR) des Plasmids unterschiedlich, wenn Ihr Gen vorhanden ist oder fehlt, und dies gibt Ihnen DNA-Stücke unterschiedlicher Größe. Um diese Stücke zu sehen, müssen Sie sie mit Agarosegelelektrophorese nach Größe trennen. Und für den Verdau müssen Sie die Plasmid-DNA reinigen, bevor Sie sie überhaupt testen können. Obwohl diese Methoden (größtenteils) funktionieren, können sie eine Weile dauern.

BLAU-WEISS-SCREENING (SW-Screening) ist eine Möglichkeit, das Vorhandensein eines Inserts zu überprüfen, ohne die Kolonien überhaupt berühren zu müssen! Sie müssen nur schauen!

Es verwendet Protein namens BETA-GALACTOSIDASE (B-gal), ein Enzym, das die Hydrolyse (auf Wasser basierende Aufspaltung) von LACTOSE (einem Disaccharid (2 verknüpfte Zuckereinheiten)) in die Monosaccharide (individuell) katalysiert (beschleunigt). Zuckereinheiten) GLUKOSE & GALAKTOSE. Das GEN für B-gal wird lacZ genannt.

B-gal fungiert als Homotetramer (4 identische Kopien kleben zusammen). Zuerst bildet es Dimere (Paare) und dann paaren sich diese Paare, um Tetramere zu bilden. Sie brauchen alle vier, weil Teile der verschiedenen Kopien &ldquoüberkreuzen&rdquo, um zu den &ldquoaktiven Stellen&rdquo beizutragen, an denen die Funktion auftritt

Diese Paarpaarung (Dimer zu Tetramer) erfolgt unter Verwendung des Anfangsteils des Proteins (N-Terminus). Wenn Sie diesen Teil entfernen, können sich immer noch Dimere bilden, ABER Tetramere können sich bilden, sodass funktionelle Proteine ​​hergestellt werden können. ABER Sie können diesen Anfang wiederherstellen, indem Sie den benötigten Teil, das Alpha (a)-Peptid, zurück &ldquoin TRANS&rdquo (als separates Molekül) hinzufügen. Dies wird als a-Komplementation bezeichnet.

In B-W SCREENING verwenden Sie bakterielle Wirtszellen mit einer verkürzten B-Gal (LacZ&Deltam15), der einige der ersten 41 Aminosäuren des Proteins „Buchstaben&rdquo (11&ndash41) fehlen. (&Delta ist der griechische Buchstabe &ldquodelta&rdquo und wird im Protein-/Gen-Jargon oft verwendet, um fehlende Teile anzuzeigen). Diesen LacZ&Deltam15 fehlt der N-Terminus-Teil und haben nur das „übrige&rdquo &ldquo-ω-Fragment, das Tetramere bilden kann.

Damit es Tetramere bildet, braucht es diese Anfangsbuchstaben &ndash das &ldquo&alpha-Peptid &ndash & das Plasmid hat das in trans zu bieten (Plasmid’s Art, Miete zu zahlen?). Sie brauchen also beides, um B-gal zu machen. Aber woher wissen Sie, ob B-Gal tatsächlich hergestellt wird?

B-gal-übliche Produkte (Glukose & Galaktose) sind gefärbt, damit wir sie sehen können. ABER B-gal kümmert sich hauptsächlich um den Galactose-Teil und ist nicht zu wählerisch, was auf der anderen Seite der glykosidischen Bindung liegt. So können wir die Glukose gegen etwas austauschen, das uns ein Produkt gibt, das wir sehen können.

X-gal (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-b-D-galactosid) weist Galactose auf, die mit 5-Brom-4-chlor-3-hydroxyindol verbunden ist. &beta-gal spaltet es in Galactose & 5-Brom-4-chlor-3-hydroxyindol, das dimerisiert (paart) & oxidiert zu 5,5&prime-Dibrom-4,4&prime-Dichlor-Indigo, das unlöslich ist & BLAU! Also wird die Kolonie blau.

Das scheint aber zu sinnvoll zu sein&hellip Wir wollen in erster Linie nur mit unserem Plasmid Kolonien züchten, deshalb besitzt unser Plasmid ALSO einen Selektionsmarker in Form eines Antibiotikaresistenzgens. Es wäre also überflüssig, Plasmide enthaltende Kolonien blau zu färben. Sagen Sie uns, was wir bereits wissen.

Die wahre Stärke der Blau-Weiß-Rasterung besteht darin, sie NICHT BLAU zu machen. Um dies zu tun, verwenden Sie Plasmide, die eine multiple Klonierungsstelle (MCS) haben (die Stelle, die Sie in Ihr Gen einfügen) INNERHALB des Gens für das &alpha-Peptid. Auf diese Weise unterbricht das Einfügen Ihres Gens das > -> Kolonie bleibt weiß

  • WHITE COLONIES haben Einsatz (an der richtigen Stelle)
  • BLUE COLONIES don&rsquot haben Einsatz oder haben es an der falschen Stelle

⚠️whiteness zeigt an, dass ETWAS eingefügt wurde. ABER Sie wissen nicht, dass dieses Etwas das ist, was Sie wollen - Sie müssen es sequenzieren, um sicher zu sein

Diese SW-Vorführung funktioniert natürlich nur, wenn &beta-gal gemacht wird! & bacteria don&rsquot want to waste time & resources making &beta-gal if they can&rsquot use it &ndash so we have to trick them into using it

When lactose isn&rsquot around, a REPRESSOR protein sits on & &ldquohides&rdquo the part of the &beta-gall gene (lacZ) where the DNA-to-RNA copier RNA POLYMERASE (RNA Pol) binds to start making an mRNA copy of the gene that can then get read by ribosomes and translated into the protein. So, NO lactose -> no &beta-gal mRNA made -> no &beta-gal made (not even the monomers&hellip)

BUT when lactose is present, B-gal &ldquomoonlights&rdquo as a transglycosylator &ndash it converts lactose into ALLOLACTOSE by changing the glycosidic linkage site between the glucose & galactose units (just shifts things around a little to give you an isomer of lactose &ndash same atoms, different linking). Allolactose binds the repressor causing the repressor to change shape (undergo a conformational change) & fall off -> RNA Pol binds -> &beta-gal mRNA made -> &beta-gal made

So you&rsquod think, why not just add some lactose, or allolactose if we want to do B-W screening? Problem is, &beta-gal can also hydrolyze (split) our de-repressor allolactose. So, we&rsquod have to constantly add more if we wanted to have continuous &beta-gal making. So, instead, we trick the bacteria by using IPTG Isopropyl (&beta-D-1-thiogalactopyranoside). This is an allolactose analog (mimic) that can also de-repress the lac promoter, so &beta-gal is made. BUT unlike lactose it doesn&rsquot get hydrolyzed b y&beta-gal, so it sticks around.

note: if you move the lac promoter in front of a gene for something else, you can use IPTG to trick the bacteria into making that something else on cue. we looked at such &ldquoinduction&rdquo in yesterday&rsquos post on recombinant protein expression in bacteria: http://bit.ly/3cPVhLO

So, in practice, it works something like this.

  1. put your gene in the plasmid. (molecular cloning step)
  2. put the plasmid in the bacteria (transformation step)
  3. plate the bacteria on an agar plate (you&rsquore classic &ldquoPetri dish&rdquo w/food, antibiotic, IPTG, & X-gal
  4. stick it in a nice warm incubator
  5. wait for the bacteria to grow
  6. wait for blue color to show

If you come back the next day & all your colonies are white, don&rsquot get too excited yet &ndash It takes a while (16-20h) for &beta-gal to be expressed (remember it has to get de-repressed & everything first) & get to work. So the blue starts showing up gradually. Sometimes it&rsquos hard to tell early on, but the more you work w/this system, the more of a &ldquosense&rdquo you get for it. The white ones usually look kinda &ldquodifferent&rdquo &ndash they grow bigger & look &ldquogoopier&rdquo

If you come back the next next day & all the colonies are still white, definitely don&rsquot get excited &ndash get suspicious, because cloning is rarely that efficient. Did you forget the IPTG? the X-gal?

note: X-gal is the &ldquoclassic&rdquo chromogenic (color-producing) B-gal substrate, but you can change up that indoxyl part to change the absorbance and therefore the color you see. Our lab uses Bluo-gal, which is really similar but doesn&rsquot have the chlorine . This gives a darker blue product that&rsquos easier to see. You can also do things like move the Cl to a different position to get Magenta-gal (5-bromo-6-chloro-3-indolyl-&beta-D-galactopyranoside). Remove the Br from that and you get the more salmon-colored (thus aptly named) Salmon-gal (S-gal, 6-chloro-3-indolyl-&beta-D-galactopyranoside). The color differences come from the different molecular arrangements absorbing different wavelengths of light. And if you want to know more: http://bit.ly/2RDLVY4

Technical terminology talk time: Color chemistry-ly speaking, &ldquoDYE&rdquo is usually used for *soluble* colored things whereas &ldquoPIGMENT&rdquo implies *nonsoluble*. Since X-gal&rsquos product is insoluble, it&rsquod technically be a *pigment* not a *dye* but in biology, we tend to use the terms interchangeably

Technical terminology talk time 2: B-W is a form of SCREENING as opposed to SELECTION. SELECTION (like w/antibiotic resistance gene) does all the work for you (all the products are &ldquogood&rdquo in the aspect you selected for) BUT w/a screen you have to do some work (even if it&rsquos just looking) &ndash the &ldquoduds&rdquo are still there, they&rsquore just easier to see.

It&rsquos like you&rsquore looking to hire some people &ndash with screening, you go through all the apps & separate them into yes/no piles but keep both for someone else to deal with. With selection, you toss the no pile, so the next person only sees the yeses.

Now for a couple caveats: Firstly, screening isn&rsquot always yes/no. You can have &ldquomaybes&rdquo like if you&rsquore screening for drugs that might work for something & some work really well, some don&rsquot work at all, but some are &ldquopotentials&rdquo

Secondly, only certain bacterial hosts & plasmids are designed for blue-white screening. Some that are:


Geographic Isolation Drives Evolution Of Hot Springs Microbe

Sulfolobus islandicus, a microbe that can live in boiling acid, is offering up its secrets to researchers hardy enough to capture it from the volcanic hot springs where it thrives. In a new study, researchers report that populations of S. islandicus are more diverse than previously thought, and that their diversity is driven largely by geographic isolation.

The findings open a new window on microbial evolution, demonstrating for the first time that geography can trump other factors that influence the makeup of genes an organism hosts.

S. islandicus belongs to the archaea, a group of single-celled organisms that live in a variety of habitats including some of the most forbidding environments on the planet. Once lumped together with bacteria, archaea are now classified as a separate domain of life.

"Archaea are really different from bacteria &ndash as different from bacteria as we are," said University of Illinois microbiology professor Rachel Whitaker, who led the study.

Whitaker has spent almost a decade studying the genetic characteristics of S. islandicus. The new study, in the Proceedings of the National Academy of Sciences, compares three populations of S. islandicus, from hot springs in Yellowstone National Park, Lassen National Park in California and the Mutnovsky Volcano on the Kamchatka Peninsula, in eastern Russia.

The extreme physical needs of S. islandicus make it an ideal organism for studying the impact of geographic isolation. It can live only at temperatures that approach the boiling point of water and in an environment that has the pH of battery acid. It breathes oxygen, eats volcanic gases and expels sulfuric acid. It is unlikely that it can survive even a short distance from the hot springs where it is found.

By comparing the genetic characteristics of individuals from each of the three locations, Whitaker and her colleagues were able to see how each of the S. islandicus populations had evolved since they were isolated from one another more than 900,000 years ago.

The complete genetic package, or genome, of S. islandicus contains a set of core genes that are shared among all members of this group, with some minor differences in the sequence of nucleotides that spell out individual genes. But it also contains a variable genome, with groups of genes that differ &ndash sometimes dramatically &ndash from one subset, or strain, to another.

Whitaker's team found that the variable genome in individual strains of S. islandicus is evolving at a rapid rate, with high levels of variation even between two or three individuals in the same location.

"Some people think that these variable genes are the way that microbes are adapting to new environments," Whitaker said. "You land in a new place, you need a new function in that new place, you pick up that set of genes from whoever's there or we don't know who from, and now you can survive there. We have shown that does not occur."

"This tells you that there's a lot more diversity than we thought," Whitaker said. "Each hot spring region has its own genome and its own genome components and is evolving in its own unique way. And if each place is evolving in its own unique way, then each one is different and there's this amazing diversity. I mean, beetles are nothing compared to the diversity of microbes."

Archaea, like bacteria, can transfer genes to one another, but they also obtain new genes from free-floating genetic elements, called plasmids, or from viruses that infect the cells and insert their own genes into the archaeal DNA. What did vary in the genomes of S. islandicus could be traced back to plasmids and viruses, Whitaker said. There were also a lot of lost genes, with much variation in the genes lost between the strains.

"Most of the genes that are coming and going, at least on Sulfolobus, seem to be on viruses and plasmids," Whitaker said. The researchers found that about one-third of the variable genes were specific to a geographic location. The viruses and plasmids that had lent their genes to Sulfolobus in one site were different from those found in another. Also, much of the variation was found in genes devoted to the microbe's immune system, indicating that S. islandicus is evolving largely in response to the assault of local pathogens such as viruses.

These findings challenge the idea that microbes draw whatever they may need from a near-universal pool of available genetic material, Whitaker said. It appears instead that S. islandicus, at least, acquires new genes from a very limited genetic reservoir stored in viruses and other genetic elements that are constrained to each geographic location on Earth.


To Sing Fung and Ding Xiang Liu
Vol. 73, 2019

Abstrakt

Human coronavirus (HCoV) infection causes respiratory diseases with mild to severe outcomes. In the last 15 years, we have witnessed the emergence of two zoonotic, highly pathogenic HCoVs: severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV) and . Weiterlesen

Figure 1: Taxonomy of HCoVs: the updated classification scheme of HCoV and other coronaviruses. The six known HCoVs are in blue. Abbreviations: BtCoV, bat coronavirus BuCoV, bulbul coronavirus HCoV.

Figure 2: Genome structure of human coronaviruses (HCoVs). Schematic diagram showing the genome structure of six known HCoVs (not to scale). The 5′-cap structure (5′-C) and 3′-polyadenylation (AnAOH-3.

Figure 3: Replication cycle of human coronaviruses (HCoVs). Schematic diagram showing the general replication cycle of HCoVs. Infection starts with the attachment of HCoVs to the cognate cellular rece.

Figure 4: Induction and modulation of autophagy by HCoV infection. Schematic diagram showing the signaling pathway of autophagy and the modulatory mechanisms utilized by HCoV. Viruses and viral compon.

Figure 5: Apoptosis induced by HCoV infection and modulatory mechanisms. Schematic diagram showing the signaling pathway of intrinsic and extrinsic apoptosis induction and the modulatory mechanisms ut.

Figure 6: Induction and modulation of unfolded protein response by HCoV infection. Schematic diagram showing the three branches of UPR signaling pathway activated and regulated by HCoV infection. Viru.

Figure 7: Activation and modulation of MAPK signaling pathways by HCoV infection. Schematic diagram showing the activation and modulation of MAPK signaling pathway by HCoV infection. Viruses and viral.

Figure 8: Type I interferon induction and signaling during HCoV infection and modulatory mechanisms. Schematic diagram showing the induction and signaling pathways of type I interferon during HCoV inf.


Cloning DNA into a vector, step by step

To introduce foreign DNA into a circular vector, scientists carry out a three-step process:

Scientists first remove their gene of interest from the DNA sequences on either side of it. They can use restriction enzymes to do the cutting. These enzymes, which came originally from bacteria, cut DNA at specific sites in the sequence. If there’s not enough DNA for successful cutting or no suitable restriction enzyme recognition sites around the gene, scientists first use polymerase chain reaction (PCR) to make many more copies. By designing their PCR primers carefully, they can introduce new restriction sites on either side of the copied DNA sequence.

Opening up the vector

Next, scientists make a cut in the circular DNA sequence of the vector. They use the same restriction enzymes as they used to cut out the gene in step 1. This turns the vector into a linear molecule and makes it ready to accept the new piece of DNA.

Sticking the vector and the gene together

The final step in cloning is to incorporate the DNA of interest into the vector. Scientists mix the gene and the opened vector together with a bacterial enzyme called DNA ligase . The ligase sticks DNA ends together to form a single circular molecule that includes both the vector and the gene.

Find out more in these articles:


How the DNA Revolution Is Changing Us

The ability to quickly alter the code of life has given us unprecedented power over the natural world. Should we use it?

If you took a glance around Anthony James’s office, it wouldn’t be hard to guess what he does for a living. The walls are covered with drawings of mosquitoes. Mosquito books line the shelves.

Hanging next to his desk is a banner with renderings of one particular species—Aedes aegypti—in every stage of development, from egg to pupa to fully grown, enlarged to sizes that would even make fans of Jurassic Park blanch. His license plates have a single word on them: AEDES.

“I have been obsessed with mosquitoes for 30 years,” says James, a molecular geneticist at the University of California, Irvine.

There are approximately 3,500 species of mosquito, but James pays attention to just a few, each of which ranks among the deadliest creatures on Earth. Sie beinhalten Anopheles gambiae, which transmits the malaria parasite that kills hundreds of thousands of people each year. For much of his career, however, James has focused on Aedes. Historians believe the mosquito arrived in the New World on slave ships from Africa in the 17th century, bringing with it yellow fever, which has killed millions of people. Today the mosquito also carries dengue fever, which infects as many as 400 million people a year, as well as such increasingly threatening pathogens as chikungunya, West Nile virus, and Zika.

In a widening outbreak that began last year in Brazil, Zika appears to have caused a variety of neurological disorders, including a rare defect called microcephaly, where babies are born with abnormally small heads and underdeveloped brains.

The goal of James’s lab, and of his career, has been to find a way to manipulate mosquito genes so that the insects can no longer spread such diseases. Until recently, it has been a long, lonely, and largely theoretical road. But by combining a revolutionary new technology called CRISPR-Cas9 with a natural system known as a gene drive, theory is rapidly becoming reality.

CRISPR places an entirely new kind of power into human hands. For the first time, scientists can quickly and precisely alter, delete, and rearrange the DNA of nearly any living organism, including us. In the past three years, the technology has transformed biology. Working with animal models, researchers in laboratories around the world have already used CRISPR to correct major genetic flaws, including the mutations responsible for muscular dystrophy, cystic fibrosis, and one form of hepatitis. Recently several teams have deployed CRISPR in an attempt to eliminate HIV from the DNA of human cells. The results have been only partially successful, but many scientists remain convinced that the technology may contribute to a cure for AIDS.

In experiments, scientists have also used CRISPR to rid pigs of the viruses that prevent their organs from being transplanted into humans. Ecologists are exploring ways for the technology to help protect endangered species. Moreover, plant biologists, working with a wide variety of crops, have embarked on efforts to delete genes that attract pests. That way, by relying on biology rather than on chemicals, CRISPR could help reduce our dependence on toxic pesticides.

No scientific discovery of the past century holds more promise—or raises more troubling ethical questions. Most provocatively, if CRISPR were used to edit a human embryo’s germ line—cells that contain genetic material that can be inherited by the next generation—either to correct a genetic flaw or to enhance a desired trait, the change would then pass to that person’s children, and their children, in perpetuity. The full implications of changes that profound are difficult, if not impossible, to foresee.

“This is a remarkable technology, with many great uses. But if you are going to do anything as fateful as rewriting the germ line, you’d better be able to tell me there is a strong reason to do it,” said Eric Lander, who is director of the Broad Institute of Harvard and MIT and who served as leader of the Human Genome Project. “And you’d better be able to say that society made a choice to do this—that unless there’s broad agreement, it is not going to happen.”

No discovery of the past century holds more promise—or raises more troubling ethical questions.

“Scientists do not have standing to answer these questions,” Lander told me. “And I am not sure who does.”

CRISPR-Cas9 has two components. The first is an enzyme—Cas9—that functions as a cellular scalpel to cut DNA. (In nature, bacteria use it to sever and disarm the genetic code of invading viruses.) The other consists of an RNA guide that leads the scalpel to the precise nucleotides—the chemical letters of DNA—it has been sent to cut. (Researchers rarely include the term “Cas9” in conversation, or the inelegant terminology that CRISPR stands for: “clustered regularly interspaced short palindromic repeats.”)

The guide’s accuracy is uncanny scientists can dispatch a synthetic replacement part to any location in a genome made of billions of nucleotides. When it reaches its destination, the Cas9 enzyme snips out the unwanted DNA sequence. To patch the break, the cell inserts the chain of nucleotides that has been delivered in the CRISPR package.

By the time the Zika outbreak in Puerto Rico comes to an end, the U.S. Centers for Disease Control and Prevention estimates that, based on patterns of other mosquito-borne illnesses, at least a quarter of the 3.5 million people in Puerto Rico may contract Zika. That means thousands of pregnant women are likely to become infected.

Currently the only truly effective response to Zika would involve bathing the island in insecticide. James and others say that editing mosquitoes with CRISPR—and using a gene drive to make those changes permanent—offers a far better approach.

Gene drives have the power to override the traditional rules of inheritance. Ordinarily the progeny of any sexually reproductive animal receives one copy of a gene from each parent. Some genes, however, are “selfish”: Evolution has bestowed on them a better than 50 percent chance of being inherited. Theoretically, scientists could combine CRISPR with a gene drive to alter the genetic code of a species by attaching a desired DNA sequence onto such a favored gene before releasing the animals to mate naturally. Together the tools could force almost any genetic trait through a population.

Last year, in a study published in the Proceedings of the National Academy of Sciences, James used CRISPR to engineer a version of Anopheles mosquitoes that makes them incapable of spreading the malaria parasite. “We added a small package of genes that allows the mosquitoes to function as they always have,” he explained. “Except for one slight change.” That change prevents the deadly parasite from being transmitted by the mosquitoes.

“I’d been laboring in obscurity for decades. Not anymore, though—the phone hasn’t stopped ringing for weeks,” James said, nodding at a sheaf of messages on his desk.

Combating the Ae. aegypti mosquito, which carries so many different pathogens, would require a slightly different approach. “What you would need to do,” he told me, “is engineer a gene drive that makes the insects sterile. It doesn’t make sense to build a mosquito resistant to Zika if it could still transmit dengue and other diseases.”

To fight off dengue, James and his colleagues have designed CRISPR packages that could simply delete a natural gene from the wild parent and replace it with a version that would confer sterility in the offspring. If enough of those mosquitoes were released to mate, in a few generations (which typically last just two or three weeks each) entire species would carry the engineered version.

James is acutely aware that releasing a mutation designed to spread quickly through a wild population could have unanticipated consequences that might not be easy to reverse. “There are certainly risks associated with releasing insects that you have edited in a lab,” he said. “But I believe the dangers of not doing it are far greater.”

It has been more than 40 Jahre since scientists discovered how to cut nucleotides from the genes of one organism and paste them into the genes of another to introduce desired traits. Molecular biologists were thrilled by the possibilities this practice, referred to as recombinant DNA, opened for their research. From the start, however, scientists also realized that if they could transfer DNA between species, they might inadvertently shift viruses and other pathogens too. That could cause unanticipated diseases, for which there would be no natural protection, treatment, or cure.

This possibility frightened no one more than the scientists themselves. In 1975, molecular biologists from around the world gathered at the Asilomar Conference Grounds, along California’s central coast, to discuss the challenges presented by this new technology. The group emerged from the meeting having agreed to a series of safeguards, including levels of laboratory security that escalated along with the potential risks posed by the experiments.

It soon became clear that the protections seemed to work and that the possible benefits were enormous. Genetic engineering began to improve the lives of millions. Diabetics, for example, could count on steady supplies of genetically engineered insulin, made in the lab by placing human insulin genes into bacteria and then growing it in giant vats. Genetically engineered crops, yielding more and resisting herbicides and insects, began to transform much of the world’s agricultural landscape.

Yet while genetically engineered medicine has been widely accepted, crops produced in a similar fashion have not, despite scores of studies showing that such products are no more dangerous to eat than any other food. As the furor over the labeling of GMOs (genetically modified organisms) demonstrates, it doesn’t matter whether a product is safe if people refuse to eat it.

CRISPR may provide a way out of this scientific and cultural quagmire. From the beginning of the recombinant era, the definitions of the word “transgenic” and the term “GMO” have been based on the practice of combining in a laboratory the DNA of species that could never mate in nature. But scientists hope that using CRISPR to alter DNA could appease the opposition. It gives researchers the ability to redesign specific genes without having to introduce DNA from another species.

Golden rice, for example, is a GMO engineered to contain genes necessary to produce vitamin A in the edible part of the grain—something that doesn’t happen naturally in rice plants. Each year up to half a million children in the developing world go blind for lack of vitamin A—but anti-GMO activists have interfered with research and prevented any commercial production of the rice. With CRISPR, scientists could almost certainly achieve the same result simply by altering genes that are already active in rice plants.

Scientists in Japan have used CRISPR to extend the life of tomatoes by turning off genes that control ripening. By deleting all three copies of one wheat gene, Caixia Gao and her team at the Chinese Academy of Sciences in Beijing have created a strain that is resistant to powdery mildew.

Without regulation, the tremendous potential of this revolution could be overshadowed by fear.

Farmers have been adjusting genes in single species—by crossbreeding them—for thousands of years. CRISPR simply offers a more precise way to do the same thing. In some countries, including Germany, Sweden, and Argentina, regulators have made a distinction between GMOs and editing with tools such as CRISPR. There have been signs that the U.S. Food and Drug Administration might follow suit, which could make CRISPR-created products more readily available and easily regulated than any other form of genetically modified food or drug. Whether the public will take advantage of them remains to be seen.

The potential for CRISPR Forschung to improve human medicine would be hard to overstate. The technology has already transformed cancer research by making it easier to engineer tumor cells in the laboratory, then test various drugs to see which can stop them from growing. Soon doctors may be able to use CRISPR to treat some diseases directly.

Stem cells taken from people with hemophilia, for example, could be edited outside of the body to correct the genetic flaw that causes the disease, and then the normal cells could be inserted to repopulate a patient’s bloodstream.

In the next two years we may see an even more dramatic medical advance. There are 120,000 Americans on waiting lists to receive organ transplants, and there will never be enough for all of them. Thousands of people die every year before reaching the top of the list. Hundreds of thousands never even meet the criteria to be placed on the list.

For years, scientists have searched for a way to use animal organs to ease the donor shortage. Pigs have long been considered the mammal of choice, in part because their organs are similar in size to ours. But a pig’s genome is riddled with viruses called PERVs (porcine endogenous retroviruses), which are similar to the virus that causes AIDS and have been shown to be capable of infecting human cells. No regulatory agency would permit transplants with infected organs. And until recently, nobody has been able to rid the pig of its retroviruses.

Now, by using CRISPR to edit the genome in pig organs, researchers seem well on their way to solving that problem. A group led by George Church, a professor at Harvard Medical School and MIT, used the tool to remove all 62 occurrences of PERV genes from a pig’s kidney cell. It was the first time that so many cellular changes had been orchestrated into a genome at once.

When the scientists mixed those edited cells with human cells in a laboratory, none of the human cells became infected. The team also modified, in another set of pig cells, 20 genes that are known to cause reactions in the human immune system. That too would be a critical part of making this kind of transplant work.

Church has now cloned those cells and begun growing them in pig embryos. He expects to start primate trials within a year or two. If the organs function properly and are not rejected by the animals’ immune systems, the next step would be human trials. Church told me he thinks this could happen in as few as 18 months, adding that for many people the alternative to the risk of the trial would surely be death.

Church has always wanted to find a way to provide transplants for people who aren’t considered healthy enough to receive them. “The closest thing we have to death panels in this country are the decisions made about who gets transplants,” he said. “A lot of these decisions are being made based on what else is wrong with you. Many people are rejected because they have infectious diseases or problems with substance abuse—a whole host of reasons. And the conceit is that these people would not benefit from a transplant. But of course they would benefit. And if you had an abundance of organs, you could do it for everyone.”

The black-footed ferret is one of the most endangered mammals in North America. Twice in the past 50 years, wildlife ecologists assumed that the animals, which were once plentiful throughout the Great Plains, had gone extinct. They came close every black-footed ferret alive today descends from one of seven ancestors discovered in 1981 on a cattle ranch near Meeteetse, Wyoming.

But the ferrets, inbred for generations, lack genetic diversity, which makes it harder for any species to survive.

“The ferrets are a classic example of an entire species that could be saved by genomic technology,” said Ryan Phelan of the group Revive & Restore, which is coordinating efforts to apply genomics to conservation. Working with Oliver Ryder at the San Diego Frozen Zoo, Phelan and her colleagues are attempting to increase the diversity of the ferrets by introducing more variable DNA into their genomes from two specimens preserved 30 years ago.

Phelan’s work can address two immediate and interlocking threats. The first is lack of food: Prairie dogs, the ferrets’ main prey, have been decimated by sylvatic plague, which is caused by the same bacterium that gives rise to bubonic plague in humans. And the plague is also fatal to the ferrets themselves, which become infected by eating prairie dogs that have died of the disease. A vaccine against human plague developed in the 1990s appears to provide lifelong immunity in ferrets. Teams from the Fish and Wildlife Service have captured, vaccinated, and released as many of the ferrets (a few hundred exist in the wild) as they can. But such a ferret-by-ferret approach cannot protect the species.

A more sophisticated solution has been proposed by Kevin Esvelt, an assistant professor at the MIT Media Lab, who developed some of the CRISPR and gene drive technology with Church. Esvelt describes his work as sculpting evolution. “All you need to do is provide resistance,” he explained—by encoding antibodies generated by vaccination and then editing them into the ferrets’ DNA.

With gene drives and CRISPR
we now have a power over species of all kinds that we never thought possible.

Esvelt believes a similar approach could not only help the ferrets resist plague but could also help eradicate Lyme disease, which is caused by a bacterium transmitted by ticks that commonly feed on white-footed mice.

If resistance to Lyme could be edited into the mice’s DNA with CRISPR and spread through the wild population, the disease might be reduced or eliminated with little visible ecological impact. Esvelt and Church, however, both feel strongly that no such experiment should be attempted without public participation and unless the scientists who carry it out have developed a reversal system, a kind of antidote. Should the original edits have unforeseen ecological consequences, they could drive the antidote through a population to cancel them out.

Black-footed ferrets are hardly the only endangered animals that could be saved through a CRISPR gene drive. The avian population of Hawaii is rapidly disappearing, largely because of a type of malaria that infects birds. Before whalers brought mosquitoes in the early 19th century, birds in the Hawaiian Islands had no exposure to the diseases that mosquitoes carry, and therefore no immunity. Now only 42 of more than a hundred species of birds endemic to Hawaii remain, and three-quarters of those are listed as endangered. The American Bird Conservancy has referred to Hawaii as “the bird extinction capital of the world.” Avian malaria is not the only threat to what remains of Hawaii’s native birds, but if it cannot be stopped—and gene editing seems to be the best way to do that—they will likely all disappear.

Jack Newman is a former chief science officer at Amyris, which pioneered development of a synthetic form of artemisinin, the only genuinely effective drug available to treat malaria in humans. Now he focuses much of his attention on eliminating mosquito-borne disease in birds. The only current method of protecting birds from malaria is to kill the mosquitoes by spreading powerful chemicals over an enormous region. Even that is only partially successful.

“In order to kill a mosquito,” Newman says, “the insecticide actually has to touch it.” Many of these insects live and breed deep in the hollows of trees or in the recessed crags of rock faces. To reach them with insecticides almost certainly would require poisoning much of the natural life in Hawaii’s rain forests. But gene editing, which would result in sterile mosquitoes, could help save the birds without destroying their surroundings. “Using genetics to save these species is just an incredibly targeted way to address a variety of environmental ills,” Newman says. “Avian malaria is destroying the wildlife of Hawaii, and there is a way to stop it. Are we really willing to just sit there and watch?”

In February of this year, U.S. Director of National Intelligence James Clapper warned in his annual report to the Senate that technologies like CRISPR ought to be regarded as possible weapons of mass destruction. Many scientists considered the comments unfounded, or at least a bit extreme. There are easier ways for terrorists to attack people than to conjure up new crop plagues or deadly viruses.

Nevertheless, it would be shortsighted to pretend that the possibility for harm (including, and perhaps especially, accidental harm) does not exist with these new molecular tools. The scientists most responsible for advances like CRISPR agree that when we begin to tinker with the genetic heritage of other species, not to mention our own, it may not be easy, or even possible, to turn back.

“What are the unintended consequences of genome editing?” asked Jennifer Doudna, as we spoke in her office at the University of California, Berkeley, where she is professor of chemistry and molecular biology. In 2012, Doudna and her French colleague Emmanuelle Charpentier were the first to demonstrate that scientists could use CRISPR to edit purified DNA in lab dishes. “I don’t know that we know enough about the human genome, or maybe any other genome, to fully answer that question. But people will use the technology whether we know enough about it or not.”

The more rapidly science propels humanity forward, the more frightening it seems. This has always been true. Do-it-yourself biology is already a reality soon it will almost certainly be possible to experiment with a CRISPR kit in the same way that previous generations of garage-based tinkerers played with ham radios or rudimentary computers. It makes sense to be apprehensive about the prospect of amateurs using tools that can alter the fundamental genetics of plants and animals.

But the benefits of these tools are also real, and so are the risks of ignoring them. Mosquitoes cause immense agony throughout the world every year, and eradicating malaria or another disease they carry would rank among medicine’s greatest achievements. Although it is clearly too soon to contemplate using CRISPR in viable human embryos, there are other ways of editing the human germ line that could cure diseases without changing the genetic lineage of our species.

Children born with Tay-Sachs disease, for instance, lack a critical enzyme necessary for the body to metabolize a fatty waste substance found in the brain. The disease is very rare and occurs only when both parents transmit their defective version of the gene to a child. With CRISPR it would be easy to treat one parent’s contribution—say, the father’s sperm—to ensure that the child did not receive two copies of the faulty gene. Such an intervention would clearly save lives and reduce the chance of recurrence of the disease. A similar outcome can be achieved already through in vitro fertilization: Implanting an embryo free of the defective gene ensures that the child won’t pass the disorder on to a future generation.

When faced with risks that are hard to evaluate, we have a strong tendency to choose inaction. But with millions of lives at stake, inaction presents its own kind of danger. Last December scientists from around the world met in Washington to discuss the difficult ethics of these choices. More discussions are planned. There will never be simple answers, but without any regulatory guidance—and there is none yet for editing human DNA—the tremendous potential of this revolution could be overshadowed by fear.

“With gene drives and CRISPR we now have a power over species of all kinds that we never thought possible,” says Hank Greely, director of Stanford’s Center for Law and the Biosciences. “The potential good we can do is immense. But we need to acknowledge that we are dealing with a fundamentally new kind of power, and figure out a way to make sure we use it wisely. We are not currently equipped to do that, and we have no time to lose.”


Why can't we use plasmids to add genes to ourselves? - Biologie

When comparing prokaryotic cells to eukaryotic cells, prokaryotes are much simpler than eukaryotes in many of their features (Figure 1). Most prokaryotes contain a single, circular chromosome that is found in an area of the cytoplasm called the nucleoid.

Übungsfrage

Figure 1. A eukaryote contains a well-defined nucleus, whereas in prokaryotes, the chromosome lies in the cytoplasm in an area called the nucleoid.

In eukaryotic cells, DNA and RNA synthesis occur in a separate compartment from protein synthesis. In prokaryotic cells, both processes occur together. What advantages might there be to separating the processes?

The size of the genome in one of the most well-studied prokaryotes, E.coli, is 4.6 million base pairs (approximately 1.1 mm, if cut and stretched out). So how does this fit inside a small bacterial cell? The DNA is twisted by what is known as supercoiling. Supercoiling means that DNA is either under-wound (less than one turn of the helix per 10 base pairs) or over-wound (more than 1 turn per 10 base pairs) from its normal relaxed state. Some proteins are known to be involved in the supercoiling other proteins and enzymes such as DNA gyrase help in maintaining the supercoiled structure.

Eukaryotes, whose chromosomes each consist of a linear DNA molecule, employ a different type of packing strategy to fit their DNA inside the nucleus (Figure 2). At the most basic level, DNA is wrapped around proteins known as histones to form structures called nucleosomes. The histones are evolutionarily conserved proteins that are rich in basic amino acids and form an octamer. The DNA (which is negatively charged because of the phosphate groups) is wrapped tightly around the histone core. This nucleosome is linked to the next one with the help of a linker DNA. This is also known as the “beads on a string” structure. This is further compacted into a 30 nm fiber, which is the diameter of the structure. At the metaphase stage, the chromosomes are at their most compact, are approximately 700 nm in width, and are found in association with scaffold proteins.

In interphase, eukaryotic chromosomes have two distinct regions that can be distinguished by staining. The tightly packaged region is known as heterochromatin, and the less dense region is known as euchromatin. Heterochromatin usually contains genes that are not expressed, and is found in the regions of the centromere and telomeres. The euchromatin usually contains genes that are transcribed, with DNA packaged around nucleosomes but not further compacted.

Figure 2. These figures illustrate the compaction of the eukaryotic chromosome.



Bemerkungen:

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    Ich denke du liegst falsch. Ich bin sicher. Lassen Sie uns dies diskutieren.

  2. Sandor

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