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Warum ist es wünschenswert, die Chemieproduktion an das Wachstum zu koppeln?


Ich habe folgende Frage in der Systembiologie: a) Zeichnen Sie einen Graphen, der die Beziehung von Wachstum (Vbio) und Vefni für das System hier zeigt. (Die horizontale Achse repräsentiert Vbio und die vertikale Achse repräsentiert Vefni)

Mein erster Gedanke war, dass es einfach eine gerade Linie von (0.5,0.5) nach (1,0) wäre. Aber jetzt denke ich, dass ich auch V4 berücksichtigen muss.

b) Bestimmen Sie eine oder mehrere Reaktionen, bei denen die Produktion von M4 mit Wachstum gekoppelt ist (Wachstumskopplung). Zeichnen Sie ein Diagramm, das die Beziehung Vbio und Vefni für die Mutante zeigt.

Hier dachte ich, es wäre V1 und V4. Ich bin mir jedoch nicht sicher, weil ich keine gute Erklärung dafür gefunden habe, was Wachstumskopplung genau ist.

c) Warum ist es wünschenswert, die chemische Produktion an das Wachstum zu koppeln? d.h. welche Vorteile haben diese Systeme gegenüber denen, bei denen keine solche Kopplung vorhanden ist?

Hier habe ich keine Ahnung.


Warum ist es wünschenswert, die Chemieproduktion an das Wachstum zu koppeln?

Wenn man neue Stoffwechselwege für die chemische Produktion entwirft, muss man bedenken, dass deren Zweck darin besteht, skaliert zu werden (d.h. Industriegröße zu erreichen).

Aus industrieller Sicht gilt: Je schneller/einfacher ein Prozess ist, desto besser. Durch die wachstumsgekoppelte chemische Produktion ist nur ein Schritt notwendig, um das gewünschte Produkt (vor nachgelagerten Prozessen) herzustellen. Andernfalls müsste man zuerst die Biomasse produzieren (Wachstumsschritt) und dann zum chemischen Produktionsschritt übergehen. Ein Schritt ist billiger und schneller als zwei, ganz zu schweigen von den eventuell notwendigen Zwischenschritten (Waschen der Zellen, Zentrifugation, Filtration…).

Der Hauptnachteil der wachstumsgekoppelten chemischen Produktion besteht darin, dass die Endausbeute ($mol_{Endprodukt}/mol_{Substrat}$) durch die Biomasseproduktion behindert wird. Dies kann ein echtes Problem sein, wenn das Substrat teuer ist.


32.3: Asexuelle Fortpflanzung

  • Beigetragen von OpenStax
  • Allgemeine Biologie bei OpenStax CNX
  • Vergleichen Sie die Mechanismen und Methoden der natürlichen und künstlichen asexuellen Fortpflanzung
  • Beschreiben Sie die Vor- und Nachteile der natürlichen und künstlichen asexuellen Fortpflanzung
  • Besprechen Sie die Lebensdauer von Pflanzen

Viele Pflanzen können sich durch ungeschlechtliche Fortpflanzung vermehren. Diese Methode erfordert keine Investitionen, die erforderlich sind, um eine Blüte zu produzieren, Bestäuber anzulocken oder ein Mittel zur Samenverbreitung zu finden. Durch die ungeschlechtliche Vermehrung entstehen Pflanzen, die mit der Mutterpflanze genetisch identisch sind, da keine Vermischung von männlichen und weiblichen Gameten stattfindet. Traditionell überleben diese Pflanzen unter stabilen Umweltbedingungen im Vergleich zu Pflanzen, die durch sexuelle Fortpflanzung erzeugt werden, gut, da sie Gene tragen, die mit denen ihrer Eltern identisch sind.

Viele verschiedene Wurzelarten weisen eine ungeschlechtliche Fortpflanzung auf Abbildung (PageIndex<1>). Die Knolle wird von Gladiolen und Knoblauch verwendet. Zwiebeln, wie eine schuppige Zwiebel bei Lilien und eine Mantelzwiebel bei Narzissen, sind weitere gängige Beispiele. Eine Kartoffel ist eine Stängelknolle, während sich Pastinake aus einer Pfahlwurzel vermehrt. Ingwer und Iris produzieren Rhizome, während Efeu eine Adventivwurzel verwendet (eine Wurzel, die aus einem anderen Pflanzenteil als der Haupt- oder Primärwurzel entsteht) und die Erdbeerpflanze einen Ausläufer hat, der auch als Läufer bezeichnet wird.

Abbildung (PageIndex<1>): Verschiedene Arten von Stängeln ermöglichen eine ungeschlechtliche Fortpflanzung. (a) Die Knolle einer Knoblauchpflanze ähnelt (b) einer Tulpenzwiebel, aber die Knolle ist festes Gewebe, während die Knolle aus Schichten modifizierter Blätter besteht, die einen unterirdischen Stiel umgeben. Sowohl Knollen als auch Zwiebeln können sich selbst vermehren, wodurch neue Pflanzen entstehen. (c) Ingwer bildet Massen von Stängeln, die als Rhizome bezeichnet werden und aus denen mehrere Pflanzen entstehen können. (d) Kartoffelpflanzen bilden fleischige Stängelknollen. Jedes Auge in der Stängelknolle kann eine neue Pflanze hervorbringen. (e) Erdbeerpflanzen bilden Ausläufer: Stängel, die an der Bodenoberfläche oder knapp unter der Erde wachsen und neue Pflanzen hervorbringen können. (Kredit a: Änderung der Arbeit von Dwight Sipler Kredit c: Änderung der Arbeit von Albert Cahalan, USDA ARS Kredit d: Änderung der Arbeit von Richard North Kredit e: Änderung der Arbeit von Julie Magro)

Einige Pflanzen können Samen ohne Düngung produzieren. Entweder die Samenanlage oder ein Teil des Eierstocks, der von Natur aus diploid ist, führt zu einem neuen Samen. Diese Fortpflanzungsmethode wird als Apomixis bezeichnet.

Ein Vorteil der ungeschlechtlichen Fortpflanzung besteht darin, dass die resultierende Pflanze schneller reif wird. Da die neue Pflanze aus einer erwachsenen Pflanze oder Pflanzenteilen hervorgeht, wird sie auch robuster als ein Sämling. Die ungeschlechtliche Fortpflanzung kann auf natürlichem oder künstlichem Wege (mit Hilfe des Menschen) erfolgen.


2 Bioenergetik der Ökosystementwicklung

Die Attribute 1 bis 5 in Tabelle 1 repräsentieren die Bioenergetik des Ökosystems. In den frühen Stadien der ökologischen Sukzession oder in junge Natur, sozusagen die Rate der Primärproduktion oder der gesamten (Brutto-)Photosynthese (P) überschreitet die Häufigkeit der Gemeinschaftsatmung (R), so dass das P/R-Verhältnis größer als 1 ist. Im Sonderfall der organischen Verschmutzung ist das P/R-Verhältnis typischerweise kleiner als 1. In beiden Fällen gilt jedoch die Theorie, dass P/R nähert sich 1, wenn eine Abfolge auftritt. Mit anderen Worten, die festgelegte Energie wird in der Regel durch die Energiekosten für die Instandhaltung (d Höhepunkt Ökosystem. Das P/R-Verhältnis sollte daher ein ausgezeichneter funktionaler Index der relativen Reife des Systems sein.

Solange P R überschreitet, reichern sich organische Stoffe und Biomasse (B) im System an (Tabelle 1, Punkt 6), mit dem Ergebnis, dass das Verhältnis P/B tendenziell abnimmt oder umgekehrt die B/P, B/ R- oder B/E-Verhältnisse (mit E=P/R) werden zunehmen (Tabelle 1, Punkte 2 und 3). Theoretisch steigt dann die Menge der durch den verfügbaren Energiefluss (E) unterstützten Bestandspflanzenbiomasse im Reife- oder Höhepunktstadium bis zu einem Maximum an (Tabelle 1, Punkt 3). Infolgedessen ist die Netto-Gemeinschaftsproduktion oder der Ertrag in einem Jahreszyklus in der jungen Natur groß und in der ausgewachsenen Natur klein oder null (Tabelle 1, Punkt 4).


Lebenszyklus und Anpassungsfähigkeit

Johnsongrass ist eine aggressive Staude. Entweder neue Triebe aus Rhizomen oder neue Sämlinge werden im frühen bis mittleren Frühjahr sprießen. Die Samen beginnen zu keimen, wenn die Bodentemperaturen 70 ° C erreichen, neue Triebe aus Rhizomen werden jedoch sprießen, wenn die Bodentemperaturen 60 ° C betragen. Sprossen aus Rhizomen entwickeln sich schneller als Sämlinge, indem sie die im Winter angesammelten Rhizomkohlenhydrate nutzen. Pflanzen beginnen, neue Rhizome zu produzieren, nachdem sich fünf bis sieben echte Blätter entwickelt haben. Dies geschieht etwa drei bis sechs Wochen nach dem Auflaufen. Die Blüte beginnt sechs bis neun Wochen nach dem Auflaufen und lebensfähige Samen werden zwei bis drei Wochen nach der Blüte produziert. Im Herbst hört das Johnsongrass-Wachstum auf, wenn die Bodentemperatur auf 60 ° F zurückgeht, wodurch die Pflanze in den Ruhezustand versetzt wird. In Oklahoma wird Johnsongrass Ende März wachsen, und Ende April werden sich neue Rhizome entwickeln. Die Blüte beginnt Anfang Juni und lebensfähige Samen erscheinen Ende Juni. Darüber hinaus werden bis Anfang November neue Rhizome, Blüten und Samen produziert, wenn die Pflanzen in den Ruhezustand übergehen.

Johnsongrass ist an eine Vielzahl von Bodentypen mit einem pH-Bereich von 5 bis 7,5 angepasst. Daher kommt Johnsongrass hauptsächlich in Ackerland, Obstplantagen, offenen Brachflächen, Straßenrändern, Weiden, bewässerten Kanälen und Gräben vor. Es wächst am besten in fruchtbaren Tieflandböden. Es ist nicht an schlecht entwässerte Lehmböden angepasst, verträgt aber kurze Überschwemmungen. Die Rhizomproduktion wird auch von der Bodenart beeinflusst. Eine größere Rhizomproduktion und -tiefe wird in leichter strukturierten Böden auftreten. Lehmböden erlauben beispielsweise nur die Hälfte der Rhizome, die in sandigen Lehmböden produziert werden können. Darüber hinaus erreichen die meisten Rhizome in Ton- und sandigen Lehmböden Tiefen von 3 bzw. 5 Zoll.


Metabolic Engineering zur Herstellung von bioregenerativen Kraftstoffen und Chemikalien: Beiträge der Synthetischen Biologie

Die Produktion von Kraftstoffen und Chemikalien durch mikrobielle Fermentation von Pflanzenmaterial ist eine wünschenswerte Alternative zur petrochemischen Produktion. Die fermentative Produktion von bioerneuerbaren Kraftstoffen und Chemikalien erfordert die Entwicklung von Biokatalysatoren, die Zucker schnell und effizient zu Zielprodukten zu einem Preis umwandeln können, der mit bestehenden petrochemischen Prozessen wettbewerbsfähig ist. Wichtig ist auch, dass Biokatalysatoren robust gegenüber extremen Fermentationsbedingungen, aus Biomasse gewonnenen Inhibitoren und deren Zielprodukten sind. Traditionelles Metabolic Engineering hat in diesem Bereich große Fortschritte gemacht, aber die synthetische Biologie hat dazu beigetragen und wird dies auch weiterhin tun, insbesondere mit Biokraftstoffen der nächsten Generation. Diese Arbeit befasst sich mit dem Einsatz von Metabolic Engineering und synthetischer Biologie im Biokatalysator-Engineering für die Herstellung von bioerneuerbaren Kraftstoffen und Chemikalien wie Ethanol, Butanol, Acetat, Laktat, Succinat, Alanin und Xylit. Wir untersuchen auch die bestehenden Herausforderungen in diesem Bereich und diskutieren Strategien zur Verbesserung der Biokatalysatortoleranz gegenüber chemischen Inhibitoren.

1. Einleitung

Die menschliche Gesellschaft war für Ernährung und Überleben immer auf Kohlenstoff und Energie aus Biomasse angewiesen. In der jüngeren Geschichte sind wir auch abhängig von erdölbasiertem Kohlenstoff und Energie für Grundchemikalien und Kraftstoffe geworden. Die nicht erneuerbare Natur von Erdöl steht jedoch in starkem Kontrast zu dem erneuerbaren Kohlenstoff und der in Biomasse vorhandenen Energie, wo Biomasse im Wesentlichen eine vorübergehende Speichereinheit für atmosphärischen Kohlenstoff und aus Sonnenlicht gewonnene Energie ist. Daher besteht zunehmend der Bedarf, Strategien zur Herstellung von Grundchemikalien und Kraftstoffen aus Biomasse anstelle von Erdöl zu entwickeln und umzusetzen. Insbesondere interessieren wir uns in dieser Arbeit für die mikrobielle Fermentation von Zuckern aus Biomasse zu Standardbrennstoffen und Chemikalien.

Damit ein Fermentationsverfahren mit bestehenden erdölbasierten Verfahren konkurrieren kann, muss die Zielchemikalie mit hoher Ausbeute, Titer und Produktivität hergestellt werden. Manchmal gibt es zusätzliche Einschränkungen für den Fermentationsprozess, wie das Vorhandensein potenter Inhibitoren im Biomassehydrolysat oder die Notwendigkeit, bei einem extremen pH-Wert oder einer extremen Temperatur zu arbeiten [1]. Diese Ziele können mit natürlich vorkommenden Mikroben schwer zu erreichen sein. Daher müssen Mikroorganismen mit diesen gewünschten Eigenschaften oft entwickelt werden, entweder durch Modifikation vorhandener Mikroben oder durch die de novo Design neuer Mikroben. Während erhebliche Fortschritte in Richtung de novo design [2, 3] konzentriert sich diese Arbeit auf die Modifikation bestehender Mikroben.

Die Menschheit verlässt sich seit langem auf mikrobielle Biokatalysatoren zur Herstellung von fermentierten Lebensmitteln und Getränken und auf eukaryontische Biokatalysatoren für Lebensmittel und Textilien. Wir haben diese Biokatalysatoren langsam modifiziert, indem wir nach wünschenswerten Eigenschaften selektiert haben, ohne die zugrunde liegenden biologischen Mechanismen zu verstehen. Aber nach der Aufklärung des biologischen Codes und der Entwicklung der rekombinanten DNA-Technologie verfügen wir nun über die Werkzeuge, um mehr zu tun, als nur nach beobachtbaren Merkmalen zu selektieren – wir sind nun in der Lage, Stoffwechselwege, Proteine ​​und sogar ganze Organismen rational zu modifizieren und zu entwerfen.

Ein Großteil dieser rationalen Modifikation erfolgte in Form von Metabolic Engineering. Metabolic Engineering wurde 1991 definiert [4, 5] und hier verwenden wir die Definition von „die gezielte Verbesserung von Produktion, Bildung oder zellulären Eigenschaften durch die Modifikation spezifischer biochemischer Reaktionen oder die Einführung neuer unter Einsatz rekombinanter DNA-Technologie “ [6]. Während Metabolic Engineering außergewöhnliche Fortschritte bei der Herstellung von Grundchemikalien und Kraftstoffen aus Biomasse ermöglicht hat, von denen einige in dieser Arbeit diskutiert werden, sind wir nun an einem Punkt angelangt, an dem biologische Funktionen erwünscht sind, die in der Natur nicht existieren. Die Synthetische Biologie zielt darauf ab, diese nichtnatürlichen biologischen Funktionen zu entwickeln und bereitzustellen.

Viele Jahre lang wurde der Begriff Synthetische Biologie verwendet, um Konzepte zu beschreiben, die heute als Metabolic Engineering klassifiziert werden würden [7]. In den letzten 10 Jahren wurden jedoch Begriffe wie „unnatürliche organische Moleküle“ [7], „unnatürliche chemische Systeme“ [8], „neuartige Verhaltensweisen“ [9], „künstliche, von der Biologie inspirierte Systeme“ [10] und „Funktionen“ verwendet die in der Natur nicht existieren“ [11] wurden verwendet, um die Synthetische Biologie zu beschreiben. Für diese Überprüfung werden wir die Definition der Synthetischen Biologie von „das Design und der Bau neuer biologischer Komponenten wie Enzyme, genetische Schaltkreise und Zellen oder das Redesign bestehender biologischer Systeme” [12].

Die synthetische Biologie findet auf vielen Gebieten Anwendung, darunter zellfreie Synthese [13], Gewebe- und Pflanzentechnik [14] und Wirkstoffforschung [15], aber hier interessieren wir uns für die Modifizierung von Mikroben für die bioerneuerbare Produktion von Grundchemikalien und Kraftstoffen . Auch andere neuere Übersichtsartikel haben sich mit diesem Thema beschäftigt [16-18].

Die synthetische Biologie zur Herstellung einer Zielverbindung kann als eine Abfolge der folgenden Ereignisse ausgedrückt werden, von denen jedes detaillierter diskutiert und unten gezeigt wird.

Entwerfen Sie die Stoffwechselwege und phänotypischen Eigenschaften des gewünschten Systems. Was sind die gewünschten Substrate und Produkte? Welche Umweltstressoren sind zu erwarten?

Wählen Sie einen geeigneten Wirtsorganismus (Chassis) basierend auf den folgenden Kriterien aus. Welche Organismen weisen zumindest einige der gewünschten Eigenschaften auf? Wie gut charakterisiert und annotiert sind diese Organismen? Gibt es molekularbiologische Werkzeuge zur Modifikation dieses Chassis?

Formulieren Sie einen Umsetzungsansatz. Welche Modifikationen sind notwendig, um die in Schritt identifizierten Wege und Eigenschaften zu erreichen? Müssen Stoffwechselwege hinzugefügt, entfernt oder angepasst werden? Existiert der gewünschte Signalweg oder Phänotyp in der Natur oder muss er entworfen werden? de novo?

Optimieren Sie das neu konzipierte System und bewerten Sie die Systemeigenschaften relativ zum Ideal. Kann das Chassis noch verbessert werden?

Selbst ein einfacher Biokatalysator, wie das Laborarbeitspferd Escherichia coli, ist ein komplexes System von geschätzten 4603 Genen, 2077 Reaktionen und 1039 einzigartigen Metaboliten [19, 20], und obwohl die oben beschriebenen Schritte relativ einfach sind, ist es immer noch schwierig, einen Biokatalysator schnell und zuverlässig so zu entwickeln, dass er das gewünschte Verhalten ausführt [ 21]. Die Systembiologie, die Standardisierung biologischer Systeme und die metabolische Evolution sind alle entscheidend, um diese Diskrepanz zwischen dem erwarteten und dem tatsächlichen Verhalten von Biokatalysatoren auszugleichen. Durch eine Kombination dieser leistungsstarken Techniken wurden Biokatalysatoren für die Produktion einer erstaunlichen Reihe von Rohstoffen und Chemikalien, sowohl natürlichen als auch unnatürlichen, neu entwickelt (Abbildung 1 und Tabelle 1). Hier diskutieren wir erfolgreiche Beispiele aus der Produktion von Standardkraftstoffen und Chemikalien mit einem Fokus auf D- und L-Lactat, L-Alanin, Succinat, Ethanol und Butanol.


2. Methoden und Werkzeuge für das Redesign von Biokatalysatoren

2.1. Chassis

Ein robustes und stabiles Chassis ermöglicht eine effiziente und wirtschaftliche Produktion von Kraftstoffen und Chemikalien auf industriellem Niveau. Da wir speziell an Biokatalysatoren interessiert sind, die Biomasse verwerten können, hat ein wünschenswertes Chassis die folgenden Eigenschaften: (1) Wachstum in Mineralsalzmedium mit kostengünstigen Kohlenstoffquellen, (2) Nutzung von Hexose- und Pentosezuckern, so dass alle Zuckerkomponenten in Lignozellulose-Biomasse kann in das gewünschte Produkt umgewandelt werden, (3) hohe Stoffwechselrate, wesentlich für eine hohe Produktivität, (4) einfacher Fermentationsprozess, um die Manipulationskosten zu reduzieren und Ausfallrisiken in der Großproduktion zu minimieren, (5) robuster Organismus (hohe Temperatur und niedriger pH-Wert, wenn möglich), um den Bedarf an externer Cellulase während des Zelluloseabbaus sowie die erforderliche Menge an Basenzugabe zu reduzieren, (6) einfache genetische Manipulation und genetische Stabilität, (7) Resistenz gegen produzierte Inhibitoren während des Biomasse-Vorbehandlungsverfahrens und (8) Toleranz gegenüber hohen Substrat- und Produktkonzentrationen, um hohe Titer der Zielverbindung zu erhalten.

Darmbakterien, besonders E coli, besitzen viele der oben genannten physiologischen Eigenschaften und sind somit ein hervorragendes Chassis für die synthetische Biologie. Die meisten der hier besprochenen Beispiele verwenden E coli, aber andere wichtige mikrobielle Modellsysteme wurden neu gestaltet, darunter Clostridium acetobutylicum [28], Corynebacterium glutamicum [29], Saccharomyces cerevisiae [30], und Aspergillus niger [31]. E coli wird seit Beginn der Gentechnik als Modellorganismus verwendet [32]. Während der K-12-Stamm MG1655 (ATCC# 47076) einer der am häufigsten verwendeten ist E coli Stämme [33] gibt es andere Linien wie B (ATCC# 11303), C (ATCC# 8739) und W (ATCC# 9637), die ebenfalls allgemein als sicher gelten, da sie den menschlichen Darm nicht besiedeln können [34]. Obwohl K-12 die am meisten charakterisierte und am häufigsten verwendete Sorte ist, E coli W (ATCC# 9637) und C (ATCC# 8739) haben sich als bessere Chassis für die Synthese von Kraftstoffen und Chemikalien erwiesen. Zum Beispiel waren von K-12 abgeleitete Stämme nicht in der Lage, 10% (Gew./Vol.) Glucose in komplexem oder mineralischem Salzmedium vollständig zu fermentieren [1, 35], während Derivate der Stämme W oder C mehr als 10% vollständig fermentieren können ( w/v) von Glucose mit höheren Zellwachstums- und Zuckerverwertungsraten als K-12. Zusätzlich, E coli W-Stämme haben die native Fähigkeit, Saccharose zu fermentieren [1, 36].

Fremdgene können in Wirtszellen aufgrund der durch mobile DNA-Elemente erleichterten Rekombination instabil sein und somit die mobilen DNA-Elemente in E coli K-12-Stamm wurden gelöscht [37]. Diese Strategie der minimalen Genomkonstruktion ist ein hervorragender Ansatz, um dieses Chassis für die Herstellung von Kraftstoffen und Chemikalien zu verbessern.

2.2. Tools für die Systembiologie
2.2.1. Genome-Scale-Modelle und In-Silico-Simulation

Angesichts der rationalen Grundlage von Metabolic Engineering und synthetischer Biologie sind Modelle und Simulationen wichtige Vorhersage- und Hilfsmittel. Genomsequenzierung und automatische Annotationswerkzeuge haben die Konstruktion von Stoffwechselmodellen auf Genomskala von fast 20 Mikroorganismen ermöglicht [38]. Diese einschränkungsbasierten Modelle und in silico Simulationen können verwendet werden, um die Umverteilung des metabolischen Flusses nach genetischer Manipulation vorherzusagen oder andere zelluläre Funktionen wie Substratpräferenz, Ergebnisse der adaptiven Evolution und Verschiebungen in Expressionsprofilen vorherzusagen [39]. Sie können auch beim Design von Signalwegen helfen, um gewünschte Phänotypen zu erhalten [40–42]. Zum Beispiel die E. coli istDas GSM-Modell JE660a wurde verwendet, um Knockouts einzelner und mehrerer Gene erfolgreich zu simulieren, um die Lycopinproduktion zu verbessern [42]. Der Berechnungsrahmen Optknock wurde entwickelt, um Gendeletionsziele für die Systemoptimierung zu identifizieren [41], und die Simulationsergebnisse für Gendeletionen für die Succinat-, Laktat- und 1,3-Propandiol-Produktion stimmten mit experimentellen Daten überein. Ein weiteres Simulationsprogramm, OptStrain, wurde entwickelt, um die Modifikation des Stoffwechselwegs für die Produktion der Zielverbindung zu steuern, sowohl durch die Hinzufügung heterologer Stoffwechselreaktionen als auch durch die Deletion nativer Reaktionen [40]. Die meisten aktuellen Modelle verfügen jedoch nur über stöchiometrische Informationen, während kinetische und regulatorische Effekte nicht berücksichtigt werden [38, 39]. Die Integration kinetischer und regulatorischer Informationen wird die Genauigkeit und Vorhersagekraft dieser Modelle verbessern.

2.2.2. Omics-Analyse mit hohem Durchsatz

Hochdurchsatz-Omics-Analysen wie Transkriptom, Proteom, Metabolom und Fluxom [43–45] helfen bei der Charakterisierung der Zellfunktion auf mehreren Ebenen und bieten daher eine „Debugging“-Fähigkeit zur Systemoptimierung [12, 45].

Genmanipulationen können das metabolische Gleichgewicht stören oder das Zellwachstum durch Erschöpfung wichtiger Vorstufen [46, 47], Akkumulation toxischer Zwischenprodukte [48] oder Redox-Ungleichgewicht [1] beeinträchtigen. Zum Beispiel hohe NADH-Werte in E coli für die Ethanolproduktion umgebaut, hemmte die Citrat-Synthase-Aktivität und begrenzte dadurch das Zellwachstum, indem es die Produktion des kritischen Metaboliten 2-Ketoglutarat senkte [49]. Metabolom- und Fluxomanalysen können die limitierenden Metaboliten oder eine veränderte metabolische Flussverteilung schnell identifizieren und die Grundlage für die Problemlösung liefern [45, 50]. Zum Beispiel Metabolitenmessungen von Aspergillus terreus wurden in das rationale metabolische Redesign zur erhöhten Produktion von Lovastatin implementiert [45, 50]. Veränderungen von mRNA- und Proteinprofilen können durch Transkriptom- und Proteomanalyse identifiziert werden, wodurch Gen-Targets für die weitere Entwicklung bereitgestellt werden [46, 47]. Die Arbeit von Choi et al. demonstrieren dieses Konzept: Transkriptomanalyse von E coli Herstellung des humanen insulinähnlichen Wachstumsfaktor-I-Fusionsproteins, das bei der Selektion nach Zielen für die Gendeletion unterstützt wird. Der resultierende neu gestaltete Stamm zeigte einen mehr als 2-fachen Anstieg des Produkttiters und der volumetrischen Produktivität [46, 47]. Darüber hinaus erleichtert die vergleichende Genomsequenzanalyse die Identifizierung mutierter Gene oder Regulatoren während der Evolution, und diese Mutationen können verwendet werden, um die Systeme für eine bessere Synthesefähigkeit umzugestalten. In einem Versuch, der als „genombasierte Stammrekonstruktion“ beschrieben wird, entwickelten sich beispielsweise Stämme von Corneybacterium glutamicum die für die L-Lysin-Produktion ausgewählt wurden, wurden mit dem Elternstamm verglichen, und es wurden Mutationen gefunden, die als vorteilhaft für die L-Lysin-Produktion vorgeschlagen wurden. Drei dieser Mutationen wurden in den Elternstamm eingeführt und ermöglichten die Produktion von bis zu 3,0 g/l/h L-Lysin [51].

2.3. Genetische Manipulationswerkzeuge
2.3.1. Genlöschung

Die Gendeletion kann den Kohlenstofffluss in Richtung des Zielprodukts umverteilen, indem sie Gene löscht, die für konkurrierende Stoffwechselwege entscheidend sind, und wird daher häufig in metabolischen Redesign-Strategien verwendet. Die homologe Rekombination ist die am häufigsten verwendete Strategie zur Gendeletion (Abbildung 2). Historisch wurden Plasmide mit einem selektierbaren Marker, flankiert von DNA-Fragmenten, die zum Zielgen homolog sind, und entweder temperaturempfindlichen oder konditionalen Replikons für eine effiziente Gendeletion in Bakterien benötigt [52] (Abbildung 2(a)). Im Gegensatz dazu können Gene in Hefe durch lineare PCR-Fragmente mit kurzen flankierenden DNA-Fragmenten, die zu chromosomaler DNA homolog sind, direkt zerstört werden. Lineare DNA ist nicht so einfach zu transformieren E coli wegen des intrazellulären Exonukleasesystems und der geringen Rekombinationseffizienz. Gendeletionssysteme auf Basis von Bakteriophagen

Rote Rekombinase erleichtert die chromosomale Gendeletion unter Verwendung eines linearen PCR-Fragments [53]. Bei dieser Methode wird das chromosomale Gen durch den selektierbaren Marker ersetzt, der von zwei FRT-Fragmenten (FLP-Erkennungsziel) flankiert wird (Abbildung 2(b)) und dann kann der Marker durch die FLP-Rekombinase entfernt werden [54]. Diese Methode hinterlässt jedoch nach jeder Exzision eine 68bp-FRT-Narbe auf dem Chromosom [52], was die Effizienz der Gendeletion weiter verringert. Die wiederholte Verwendung dieses FRT/FLP-Systems für spezifische Gendeletionen hat das Potenzial, große unbeabsichtigte Chromosomendeletionen zu erzeugen.


(ein)
(B)
(C)
(ein)
(B)
(C) Vergleich von Drei-Gen-Deletionsmethoden in E coli. Diese Verfahren können auch bei anderen Darmbakterien verwendet werden. Das erste und das dritte Verfahren können auch zur Genintegration in das Chromosom und zum Promotorersatz zur Abstimmung der Genexpression verwendet werden. 2(a) Plasmid-basierte Methode. Schritt

ist die Konstruktion des Deletionsplasmids, das zum Zielgen homologe DNA-Fragmente (h1 und h2), einen selektierbaren Marker und entweder ein temperaturempfindliches oder konditionelles Replikon enthält. Schritt

eine Double-Crossover-Rekombination ist, kann das Plasmid im Wirtsstamm nicht replizieren, und es werden antibiotikaresistente Kolonien selektiert. Im Schritt

, FRT, Replikon und Antibiotikaresistenzmarker werden durch FLP entfernt. 2(b) Lineare DNA-basierte Methode. Schritt

ist die Konstruktion des linearen DNA-Fragments durch PCR (H1-P1 und H2-P2 als Primer). H1 und H2 beziehen sich auf kurze DNA-Fragmente, die zum Zielgen homolog sind. Schritt

ist der Ersatz des Zielgens durch das Antibiotikaresistenzgen durch Crossover-Rekombination mit Hilfe der Red-Rekombinase. Schritt

ist die Entfernung von FRT und antibiotischem Marker durch FLP. 2(c) Zweistufige rekombinationsbasierte Methode, die in unserem Labor entwickelt wurde. Schritte

, 2, 3 und 5 beschreiben die Konstruktion der Plasmide und linearen DNA-Fragmente für die zweistufigen Rekombinationen. Schritt

beschreibt den ersten Rekombinationsschritt, bei dem die Katze, SackB Kassette wird in das Zielgen eingefügt. Schritt

Um sequentielle Gendeletionen zu erleichtern, hat unser Labor eine zweistufige Rekombinationsstrategie (Abbildung 2(c)) entwickelt, bei der die Sensitivität von E coli zu Saccharose, wenn Bacillus subtilis Levansaccharose (sackB) wird ausgedrückt [24, 27, 55]. Durch diese Methode erzeugte Gendeletionen hinterlassen keine fremde DNA, keine Antibiotikaresistenzmarker oder Narbensequenzen an der Stelle der Deletion. Bei der ersten Rekombination wird ein Teil des Zielgens durch eine DNA-Kassette ersetzt, die ein Chloramphenicol-Resistenzgen enthält (Katze) und das Levansucrase-Gen (sackB). In der zweiten Rekombination wird die Katze, SackB Die Kassette wird durch Selektion auf Saccharoseresistenz entfernt. Zellen, die die enthalten sackB Gen akkumulieren während der Inkubation mit Saccharose Levan und werden abgetötet [55]. Überlebende Rekombinanten sind hoch angereichert für den Verlust der Katze, SackB Kassette [24, 27].

2.3.2. Tuning der Genexpression

Wie Gendeletionen sind Plasmid-basierte Expressionssysteme allgegenwärtig für das metabolische Redesign. Plasmid-basierte Systeme haben jedoch mehrere Nachteile. (1) Die Plasmiderhaltung ist eine metabolische Belastung für die Wirtszelle, insbesondere für Plasmide mit hoher Kopienzahl [56]. Beachten Sie, dass hohe Kopienzahlen nicht unbedingt erforderlich sind, wenn man bedenkt, dass die meisten zentralen Stoffwechselenzyme von einem einzigen Gen kodiert werden (2) Die Plasmid-basierte Expression hängt von der Plasmidstabilität ab, wobei nur wenige natürliche Einheitskopie-Plasmide die gewünschte Stabilität aufweisen [12] ( 3) nur Plasmide mit niedriger Kopienzahl haben eine Replikation, die mit dem Zellzyklus zeitlich abgestimmt ist, und daher ist die Aufrechterhaltung einer konsistenten Kopienzahl in allen Zellen eine Herausforderung [12] (4) metabolisches Redesign kann den Aufbau eines komplexen heterologen Weges erfordern, und somit mehrere Gene, die in großen DNA-Stücken kodiert sind, müssen eingebaut werden. Die meisten kommerziellen Plasmide haben Schwierigkeiten, große DNA-Fragmente zu tragen.

Die chromosomale Integration der Zielgene gefolgt von einer Feinabstimmung ihrer Expression könnte diese Plasmid-assoziierten Probleme beseitigen. Die oben erwähnte zweistufige Rekombinationsstrategie zur Gendeletion kann auch zur Genintegration oder zum Promotorersatz verwendet werden (Abbildung 2).

Die Genexpression in Prokaryoten wird hauptsächlich auf der Transkriptionsebene kontrolliert, und daher ist der Promotor das am besten abstimmbare Element. Während induzierbare Promotoren, wie z lac und ara, traditionell verwendet wurden, um die Genexpression zu modulieren, ist der Einsatz von Induktoren in großem Maßstab für die Herstellung von Kraftstoffen und Massenchemikalien unerschwinglich. Es wurden jedoch mehrere Strategien entwickelt, um konstitutive Promotorbibliotheken für die Feinabstimmung der Genexpression zu konstruieren. Einige Verfahren beruhen auf der Verwendung natürlicher Promotoren. Zum Beispiel, Zymomonas mobilis genomische DNA wurde verwendet, um eine Promotorbibliothek zum Screenen der optimalen Expression von . zu konstruieren Erwinia Chrysantheme Endoglucanase-Gene (celY und celZ) in Klebsiella oxytoca P2, um die Ethanolproduktion aus Cellulose zu verbessern [57]. Andere Methoden beruhen auf einer zufälligen Modifikation bestehender Promotoren, wie der Randomisierung der Spacersequenzen zwischen den Konsensussequenzen [58] oder der Mutagenese eines konstitutiven Promotors [59]. Diese Promotor-Modifikationsmethode wurde verwendet, um den Einfluss der Phosphoenolpyruvat-Carboxylase-Spiegel auf die Zellausbeute und die Desoxy-Xylulose-P-Synthase-Spiegel auf die Lycopin-Produktion zu bewerten, und die optimalen Expressionsspiegel dieser Gene wurden für den maximal gewünschten Phänotyp identifiziert [59]. Diese synthetischen Promotorbibliotheken könnten auch direkt in das Chromosom integriert werden, was die Expressionsmodulation chromosomaler Gene erleichtern könnte [60, 61].

Die oben beschriebenen Feinabstimmungsverfahren beruhen auf der Auswahl des besten natürlichen Promotors oder einer zufälligen Veränderung bestehender Promotoren. Eines der Ziele der synthetischen Biologie ist die Konstruktion von Standardteilen, und posttranskriptionelle Prozesse wie Transkriptionstermination, mRNA-Abbau und Translationsinitiation wurden mit diesem Ziel im Hinterkopf entwickelt. Beispiele hierfür sind die Konstruktion einer synthetischen Bibliothek von 5'-Sekundärstrukturen zur erfolgreichen Manipulation der mRNA-Stabilität [62] und die Modulation der Ribosomenbindungsstelle (RBS) sowie von Shine-Dalgarno (SD) und AU-reichen Sequenzen, um die Genexpression auf abzustimmen der Translationsinitiierungsprozess [60, 63]. Riboregulatoren wurden auch entwickelt, um die Genexpression über RNA-RNA-Interaktionen abzustimmen [64]. Eine letzte Methode zur Feinabstimmung der Genexpression ist die Codon-Optimierung, die die Translation fremder Gene verbessern kann [65]. Diese optimierten Gensequenzen sind in der Natur oft nicht vorhanden und müssen unter Verwendung von DNA-Synthesetechniken erzeugt werden.

In vielen Fällen muss mehr als ein Gen in das Chassis eingeführt werden und die Expression dieser Gene muss koordiniert werden, um die gewünschte Biokatalysatorleistung zu erreichen. Eine solche Methode ist die Modulation der Expression jedes einzelnen Gens über seinen eigenen Promotor. Es ist jedoch schwierig, das geeignete Expressionsniveau jedes Gens vorherzusagen. Eine andere Möglichkeit besteht darin, mehrere Gene zu einem synthetischen Operon mit einem einzigen Promotor zu kombinieren und die Expression jedes Gens durch posttranskriptionelle Prozesse [12] mit einstellbaren Kontrollelementen (wie mRNA-Sekundärstruktur, RNase-Schnittstellen, Ribosomenbindungsstellen und Sequestrierungssequenzen) an intergenischen Regionen. Bibliotheken von abstimmbaren intergenen Regionen (TIGRs) wurden erstellt und gescreent, um die Expression mehrerer Gene in einem Operon abzustimmen [48]. Diese Methode wurde verwendet, um die Expression von drei Genen in einem Operon zu koordinieren, das einen heterologen Mevalonat-Biosyntheseweg kodiert, was die Mevalonat-Produktion um das Siebenfache verbessert [48]. Eine andere Methode zur Kontrolle der Expression von mehr als einem Gen besteht darin, eine globale Transkriptionsmaschinerie durch zufällige Mutagenese von Transkriptionsfaktoren zu konstruieren [66, 67]. Es wurde gezeigt, dass diese Methode die Toleranz gegenüber toxischen Verbindungen und die Produktion von Metaboliten effizient verbessert und Phänotypen verändert [66, 67].

2.3.3. Protein-Engineering

Natürliche Proteine ​​erfüllen möglicherweise nicht die erforderlichen Kriterien für eine spezifische und effiziente Systemleistung, und daher kann eine Änderung für eine spezifische Anwendung erforderlich sein. Die gerichtete Evolution von Proteinen bietet eine Möglichkeit, Enzyme auch ohne strukturelle oder mechanistische Informationen schnell zu optimieren [68]. Für die gerichtete Evolution wird üblicherweise eine Proteinbibliothek durch Zufallsmutagenese [68], Rekombination eines Zielgens [69] oder einer Familie verwandter Gene [70] erzeugt und anschließend durch Hochdurchsatz-Screening analysiert. Diese Methode wurde verwendet, um die Enzymaktivität erfolgreich zu erhöhen [71, 72], die Proteinlöslichkeit und -expression zu erhöhen, die Enantioselektivität umzukehren und die Stabilität und Aktivität in ungewöhnlichen Umgebungen zu erhöhen [68]. Zum Beispiel eine Mutationsbibliothek der Gen-kodierenden Geranylgeranyldiphosphat-Synthase von Archaeoglobus fulgidus wurde generiert, um nach Mutanten mit höherer Aktivität zu suchen, was die Lycopinproduktion in ermöglicht E coli. Das Screening von mehr als 2.000 Varianten identifizierte acht mit erhöhter Aktivität, von denen eine die Lycopinproduktion um 100 % erhöhte [71].

Von besonderer Relevanz für das Gebiet der synthetischen Biologie ist die Schaffung neuer enzymatischer Aktivität durch Protein-Engineering [73, 74]. Zum Beispiel die unnatürliche Isomerisierung von α-Alanin zu β-Alanin wurde durch die Entwicklung einer Lysin-2,3-Aminomutase erhalten, um seine Substratspezifität zu erweitern, um α-Alanin [73].

Rational Design ist ein weiteres mächtiges Werkzeug, um Proteineigenschaften zu verbessern, insbesondere mit Hilfe von Computeranalysen [75, 76]. Basierend auf der Kenntnis der Proteinstruktur und -funktion kann man vorhersagen, welche Aminosäure(n) geändert werden müssen, um die gewünschte Funktion zu erhalten. Bei der Neugestaltung von Lactobacillus brevis zur Herstellung sekundärer Alkohole war es erwünscht, die Cofaktor-Präferenz der R-spezifischen Alkoholdehydrogenase von NADPH auf NADH zu ändern. Ein strukturbasiertes Computermodell wurde verwendet, um potenziell vorteilhafte Aminosäuresubstitutionen zu identifizieren, und eine dieser Änderungen erhöhte die NADH-abhängige Aktivität um das Vierfache [77].

Während diese Beispiele die Leistungsfähigkeit des rationalen Enzym-(Neu-)Designs demonstrieren, erfordert dieser Ansatz detaillierte Informationen über die Proteinstruktur und den Mechanismus, während die Zufallsmutagenese dies nicht tut. Jüngste Fortschritte haben gerichtete Evolution und rationales Design in einem sogenannten „semi-rationalen“ Ansatz kombiniert, um die Enzymaktivität erfolgreich zu verbessern, wenn nur begrenzte Informationen verfügbar sind [78, 79]. Wenn die Mutagenese auf bestimmte Reste beschränkt ist, die aus dem vorhandenen strukturellen oder funktionellen Wissen ausgewählt werden, führen diese „intelligenten“ Bibliotheken eher zu positiven Ergebnissen [79]. Beispielsweise wurde die katalytische Aktivität der Pyranose-2-Oxidase durch Mutagenese des bekannten aktiven Zentrums verbessert [80].

Während die 20 natürlichen Aminosäuren Enzyme mit einem breiten Wirkungsspektrum versorgen, kann dieses Spektrum durch den Einsatz von unnatürlichen Aminosäuren (UAAs) noch erweitert werden. Derzeit sind mehr als 40 UAAs verfügbar und sie wurden verwendet, um die Proteinfunktion zu untersuchen, kritische Reste zu photokäfigen und die Eigenschaften von Metalloproteinen zu verändern [81, 82]. Während sich diese Technologie noch im Entwicklungsstadium befindet, hat mindestens eine Studie eine Verbesserung der Enzymaktivität nach dem Einbringen von UAAs gezeigt. Seite 124 von E colis Nitroreduktase wurde durch eine Vielzahl natürlicher und nichtnatürlicher Aminosäuren ersetzt und bestimmte UAA-Varianten hatten eine mehr als 2-fache Aktivitätssteigerung gegenüber der besten natürlichen Aminosäurevariante [83]. Dieser biomimetische Ansatz wurde auf andere Metaboliten wie Kohlenhydrate [84] und Lipide [85] ausgedehnt.

2.4. Evolution

Wie oben beschrieben, ist ein robuster Biokatalysator mit hoher Ausbeute, Titer und Produktivität entscheidend, damit ein Fermentationsprozess mit der petrochemischen Produktion konkurrieren kann. Aktuelle Modelle und Simulationswerkzeuge bieten einen Rahmen angesichts der Einschränkungen bekannter Proteinfunktionen. Aber die vielen Reaktionen und Enzyme, die uncharakterisiert bleiben, können in diese theoretische Analyse nicht einbezogen werden. Daher führen rationale Designmethoden oft zu einem Biokatalysator, der im Vergleich zum Modell schlecht abschneidet. Die metabolische Evolution bietet einen komplementären Ansatz zur Verbesserung der Produktivität und Robustheit von Biokatalysatoren, abhängig von der Gestaltung eines geeigneten Selektionsdrucks. Wo möglich, kann die Synthese der Zielverbindung an die Produktion von ATP, Redox-Gleichgewicht oder Schlüsselmetaboliten, die für das Wachstum essentiell sind, gekoppelt werden, und die Selektion auf Wachstumsverbesserungen während der metabolischen Evolution (serielle Transfers) kann verwendet werden, um für höhere Raten zu selektieren oder Titer von Zielverbindungen (Abbildung 3). Sowohl das Redoxgleichgewicht als auch die Netto-ATP-Produktion in einem solchen synthetischen System sind Voraussetzungen für eine erfolgreiche Evolution.


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(C)
(ein)
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(C) Metabolische Evolution zur Verbesserung der L-Alanin-Produktion in E coli [27]. 3(a) Neu gestalteter Stoffwechselweg für die L-Alanin-Produktion: Die ATP-Produktion und das Zellwachstum sind an die NADH-Oxidation und die L-Alanin-Produktion gekoppelt. 3(b) Die gerichtete Evolution verbessert das Zellwachstum. Der Elternstamm XZ112 erreicht nach 48 Stunden Fermentation eine maximale Zellmasse von 0,7 gL -1 Der entwickelte Stamm XZ113 erreicht nach 24 Stunden 0,7 gL -1 und nach 48 Stunden ein Maximum von 0,9 gL -1 3(c) Stoffwechselentwicklung zur Verbesserung des Zellwachstums verbessert auch die Alaninproduktion. Der Elternstamm XZ112 produziert 355 mM Alanin nach 72 Stunden Fermentation Der entwickelte Stamm XZ113 produziert 484 mM in 48 Stunden.

Wir haben diese metabolische Evolutionsstrategie verwendet, um Biokatalysatoren zu optimieren, die für die Produktion mehrerer Fermentationsprodukte neu konzipiert wurden [1], darunter Ethanol, D-Lactat, L-Lactat, L-Alanin (Abbildung 3) und Succinat, wie unten ausführlicher beschrieben. Ein häufig verwendetes Designschema besteht darin, die Synthese des Zielprodukts an das Wachstum zu koppeln, indem konkurrierende NADH-verbrauchende Wege inaktiviert werden. Somit besteht der einzige Weg für Zellen, NAD + für die Glykolyse zu regenerieren, darin, die Zielverbindung zu produzieren. Erhöhtes Zellwachstum, unterstützt durch eine höhere ATP-Produktionsrate während der Glykolyse, ist mit einer höheren NADH-Oxidationsrate gekoppelt und somit eng mit der Synthese des Zielprodukts gekoppelt. Diese Evolutionsstrategie steigert nachweislich die Produktivität um bis zu zwei Größenordnungen.

Rechengerüste auf der Grundlage von Stoffwechselmodellen auf Genomskala wurden verwendet, um Biokatalysatoren zu konstruieren, die die Biomassebildung mit der chemischen Produktion koppeln [40, 41] und somit eine Grundlage für den Selektionsdruck für eine hohe Produktivität bieten. Optknock identifizierte beispielsweise Gendeletionsziele für die Konstruktion von Laktat-produzierenden E coli, und dann verbesserte die gerichtete Evolution die Produktionsfähigkeit [86]. Obwohl das rationale Design von Stoffwechselwegen basierend auf aktuellen Stoffwechselmodellen eine gängige Methode zur Maximierung der Ausbeute der Zielverbindung ist, ist diese Methode aufgrund unseres begrenzten Verständnisses des komplizierten Stoffwechselnetzwerks und der dynamischen Kinetik jeder Reaktion nicht immer die beste Strategie. Die metabolische Evolution bietet eine ausgezeichnete alternative Methode zur Stammverbesserung, durch die Reaktionen, die derzeit nicht vorhersagbar sind, ausgewählt würden, um die Leistung des Biokatalysators zu verbessern [87]. Da sich unser Wissen über das Verhalten und den Stoffwechsel von Biokatalysatoren verbessert, werden Vorhersagemodelle noch leistungsfähiger.

3. Neugestaltung durch Modifikation bestehender Pfade

In diesem Abschnitt heben wir Projekte hervor, bei denen ein Chassis umgestaltet wurde, um Zielverbindungen mit hoher Ausbeute und hohem Titer ohne Einführung fremder Wege herzustellen. Im nächsten Abschnitt beschreiben wir die Neugestaltung von Biokatalysatoren, die fremde oder nichtnatürliche Wege nutzten.

3.1. Succinat

Succinat, eine Vier-Kohlenstoff-Dicarbonsäure, wird derzeit als Spezialchemikalie in der Lebensmittel-, Agrar- und Pharmaindustrie eingesetzt [88], kann aber auch als Ausgangspunkt für die Synthese von Grundchemikalien für Kunststoffe und Lösungsmittel dienen, mit einem Potenzial Weltmarkt von 15 Milliarden US-Dollar [89]. Succinat wird hauptsächlich aus Erdöl hergestellt und es besteht großes Interesse an der fermentativen Herstellung von Succinat aus Zuckern [89].

Mehrere Pansenbakterien können mit hoher Ausbeute und Produktivität Succinat aus Zucker herstellen [90–92], benötigen aber komplexe Nährstoffe. Alternativ können native Stämme von E coli Glukose effektiv in einfachen Mineralsalzen fermentieren, aber Succinat nur als Nebenprodukt produzieren [93]. Deswegen E coli Stamm C (ATCC 8739) wurde für die Succinatproduktion mit hoher Ausbeute, Titer und Produktivität umgestaltet [94].

Die anfängliche Umgestaltungsstrategie konzentrierte sich auf die Inaktivierung kompetitiver Signalwege, insbesondere die Deletion der Laktatdehydrogenase (ldhA), Alkohol/Aldehyd-Dehydrogenase (adhE) und Acetatkinase (ackA).Der resultierende Stamm wuchs jedoch unter anaeroben Bedingungen im Mineralsalzmedium schlecht und akkumulierte nur Spuren von Succinat. Da die NADH-Oxidation bei diesem Stamm an die Succinatsynthese gekoppelt ist, wurde die metabolische Evolution genutzt, um sowohl das Zellwachstum als auch die Succinatproduktion zu verbessern. Nach Inaktivierung von Pyruvat-Formiat-Lyase und Methylglyoxal-Synthase zur Eliminierung der Formiat- und Laktat-Produktion produzierte der letzte Stamm, KJ073, in Mineralsalz-Medium mit hoher Ausbeute (1,2 mol/mol Glucose) fast 670 mM Succinat (80 g/l) und hohe Produktivität (0,82 g/L/h) [94]. Inaktivierung der Threonin-Decarboxylase (tdcD), 2-Ketobutyratformiat-Lyase (tdcE) und Aspartataminotransferase (aspC) erhöhte die Succinatausbeute (1,5 mol/mol Glucose), den Titer (700 mM) und die Produktivität (0,9 g/l/h) weiter [24].

Trotz ihrer Leistungsfähigkeit bei der Verbesserung der Biokatalysatorleistung hat die metabolische Evolution die unerwünschte Eigenschaft, eine Black-Box zu sein. evolvierte Stämme zeigen die gewünschten Biokatalysatoreigenschaften, aber der metabolische Evolutionsprozess verbessert unser Verständnis des Biokatalysators nicht. Daher kann uns das Reverse Engineering weiterentwickelter Stämme helfen, Schlüsselmutationen zu identifizieren, die dann rational auf andere Biokatalysatoren angewendet werden können. Reverse Engineering des Succinat-produzierenden Stammes zeigte zwei signifikante Veränderungen im Zellstoffwechsel, die die Energieeffizienz erhöhten [87]. Die erste Änderung ist, dass die PEP-Carboxykinase (pck), das normalerweise bei der Gluconeogenese während des oxidativen Metabolismus organischer Säuren wirkt [90, 95, 96], wurde zum wichtigsten Carboxylierungsweg für die Succinatproduktion. Hohe Expression von PCK-dominiertem CO2 Fixierung und erhöhte ATP-Ausbeute (1 ATP pro hergestelltem Oxalacetat). Die zweite Änderung besteht darin, dass das native Phosphoenolpyruvat-(PEP-)abhängige Phosphotransferase-System für die Glukoseaufnahme inaktiviert und durch einen alternativen Glukoseaufnahmeweg ersetzt wurde: GalP-Permease (galP) und Glucokinase (glk). Diese Änderungen erhöhten den PEP-Pool, der für die Aufrechterhaltung des Redoxgleichgewichts zur Verfügung stand, sowie die Erhöhung der Energieeffizienz, indem die Notwendigkeit beseitigt wurde, zusätzliches PEP aus Pyruvat herzustellen, eine Reaktion, die zwei ATP-Äquivalente erfordert [97].

Während rationales Design auf der Grundlage des aktuellen metabolischen Verständnisses eine Schlüsselkomponente des Metabolic Engineering und der synthetischen Biologie ist, kann unser begrenztes Verständnis des komplizierten metabolischen Netzwerks und der dynamischen Kinetik jeder Reaktion zum Versagen von Vorhersagemodellen führen. In diesem Beispiel wurde die metabolische Evolution als hervorragende alternative Methode zur Stammverbesserung demonstriert, durch die derzeit unvorhersehbare Reaktionen ausgewählt würden, um die zelluläre Stoffwechselkapazität zu erweitern [87]. Durch das Verständnis der Mutationen, die die wünschenswerte Leistung des Succinat-produzierenden Stamms ermöglichten, stehen uns mehr Optionen für die Neugestaltung zukünftiger Systeme zur Verfügung. Um dies zu demonstrieren, E coli wurde basierend auf den Erkenntnissen aus dem evolvierten Stamm erneut überarbeitet [98]. Diesmal verlagerte sich die Designstrategie von der Inaktivierung kompetitiver Fermentationswege hin zur Rekrutierung energiesparender Wege für eine effiziente Succinatproduktion (Abbildung 4(e)). Nach Erhöhung pck Genexpression und Inaktivierung des nativen Glucose-PTS-Systems, das native E coli metabolisches System wurde in ein effizientes Succinat-Synthesesystem umgewandelt, das dem nativen Weg der Succinat-produzierenden Pansenbakterien entspricht [98].


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(e) Synthesewege von E coli zur Herstellung von Kraftstoffen und Chemikalien in unserem Labor: 4(a) Native Stoffwechselwege der Glukosefermentation in E coli 4(b) Synthesewege zur Herstellung von D-Lactat, Ethanol, L-Lactat und L-Alanin 4(c) Synthesewege zur Herstellung von Pyruvat und Acetat 4(d) Syntheseweg zur Herstellung von Xylit, 4(e) synthetisch Herstellungsweg von Succinat. ★ weisen auf eine Gendeletion hin. Gene und Enzyme: ackA, Acetatkinase adhAB, Alkoholdehydrogenase (Z. mobilis) adhE, Alkohol/Aldehyd-Dehydrogenase ein Junge, L-Alanin-Dehydrogenase (G. stearothermophilus) crr, Glucose-spezifische Phosphotransferase-Enzym-IIA-Komponente frd, Fumaratreduktase scheiße, fumarase galP, Galaktose-Proton-Symporter (Glukosepermease) glk, Glucokinase ldhA, D-Lactat-Dehydrogenase ldhL, L-Lactat-Dehydrogenase (P. acidilactici) mdh, Malatdehydrogenase pdc, Pyruvatdecarboxylase pflB, Pyruvatformiat-Lyase ppc, Phosphoenolpyruvatcarboxylase pta, Phosphatacetyltransferase ptsG, Glucose-spezifische EIICB-Komponente des PTS-Systems ptsH, Phosphoträgerprotein HPr ptsI, Phosphoenolpyruvat-Protein-Phosphotransferase (Phosphotransferase-System, Enzym I) pyk, Pyruvatkinase xrd, Xylosereduktase (C. boidinii) xylB, Xylulokinase. Metaboliten: G6P, Glucose-6-Phosphat G3P, Glycerin-3-Phosphat PEP, Phosphoenolpyruvat X5P, D-Xylulose-5-Phosphat.
3.2. D-Laktat

D-Lactat wird häufig als Spezialchemikalie in der Lebensmittel- und Pharmaindustrie verwendet. Es kann auch mit L-Lactat zur Herstellung von Polymilchsäure (PLA) kombiniert werden, einem immer beliebter werdenden biologisch erneuerbaren und biologisch abbaubaren Kunststoff [99, 100], dessen kommerzieller Erfolg offensichtlich von den Produktionskosten abhängt. Obwohl Glucose das gegenwärtige Substrat für die fermentative Herstellung von Lactat ist, ist es wünschenswert, diese Grundchemikalie aus lignozellulosehaltigem Ausgangsmaterial herzustellen, das eine Mischung von Zuckern enthält. Einige Milchsäurebakterien haben die wünschenswerte native Fähigkeit, unter niedrigen pH-Bedingungen große Mengen an D-Lactat zu produzieren, wobei der niedrige pH-Wert die Prozesskosten senkt [101, 102]. Diese Milchsäurebakterien benötigen jedoch komplexe Nährstoffe, und vielen von ihnen fehlt die Fähigkeit, Pentosezucker zu fermentieren. Die Milchsäurebakterien, die Pentosezucker fermentieren, produzieren leider eine Mischung aus Laktat und Acetat und sind daher kein gutes Chassis für die kommerzielle Produktion von D-Laktat. Während E coli kann viele Zucker in einem einfachen Mineralsalzmedium effektiv fermentieren, die inhärente D-Lactat-Produktivität ist gering und es werden auch andere unerwünschte Metaboliten produziert [103]. deshalb, die E coli metabolisches System wurde umgestaltet, um die gewünschten Eigenschaften einer hohen Ausbeute und Produktivität von D-Lactat zu erreichen.

E coli Stamm W3110 wurde als Chassis für die D-Lactat-Produktion mit einer Redesign-Strategie verwendet, die sich auf die Inaktivierung kompetitiver Fermentationswege konzentrierte [104]. Nach dem Löschen der Gene, die für die Fumarat-Reduktase (frdABCD), Alkohol/Aldehyd-Dehydrogenase (adhE), Pyruvatformiat-Lyase (pflB) und Acetatkinase (ackA), kann der resultierende Stamm, SZ63, NADH nur über die D-Lactat-Synthese oxidieren (Abbildung 4(b)). Obwohl dieser Stamm 5 % (w/v) Glucose in einem Mineralsalzmedium mit einer Ausbeute nahe dem theoretischen Maximum (96 %) vollständig verwerten konnte, war die volumetrische D-Lactat-Produktivität von 0,42 g/l/h im Vergleich zu Milchsäure relativ niedrig Bakterien [35]. Darüber hinaus kann dieser Stamm weder Saccharose noch 10 % (w/v) Zucker vollständig verwerten [35]. Daher ein E coli W-Derivat-Stamm wurde als Chassis für eine robustere D-Lactat-Produktion gewählt [35, 105]. Nachdem der zentrale Stoffwechsel so umgestaltet wurde, dass die D-Lactat-Produktion das einzige Mittel zur Oxidation von NADH war, wurde die metabolische Evolution genutzt, um das Zellwachstum und die D-Lactat-Produktivität weiter zu verbessern. Der resultierende Stamm, SZ194, verbrauchte effizient 12 % (w/v) Glucose in Mineralsalzmedium und produzierte 110 g/l D-Lactat [105] mit einer volumetrischen Produktivität von 2,14 g/l/h, eine 5-fache Steigerung gegenüber das W3110-Derivat. Der Biokatalysator wurde durch Deletion des Methylglyoxal-Synthase-Gens weiter optimiert (mgsA), um die L-Lactat-Produktion zu eliminieren und durch metabolische Evolution den Ertrag und die Produktivität zu steigern. Der endgültige D-Lactat-produzierende Stamm, TG114, konnte 12% (w/v) Glucose in 118 g/L D-Lactat mit einer ausgezeichneten Ausbeute (98%) und Produktivität (2,88 g/L/h) umwandeln [22].

3.3. Acetat

Acetat ist eine Grundchemikalie, deren weltweite Produktion im Jahr 2001 auf 6,8 Millionen Tonnen geschätzt wird [23]. Die biologische Produktion von Acetat macht nur 10 % der Weltproduktion aus, hauptsächlich in Form von Essig, während der Rest der Produktion auf petrochemischen Wegen erfolgt [106–108]. Die biologische Produktion von Grundchemikalien hat sich in der Vergangenheit auf die anaerobe Produktion von reduzierten Produkten konzentriert, da Substratverlust in Form von Zellmasse und CO2 ist minimal und die Produktausbeuten sind hoch. Im Gegensatz dazu ist Acetat eine oxidierte Chemikalie, und die traditionelle biologische Produktion umfasst einen komplexen zweistufigen Prozess: Fermentation von Zuckern zu Ethanol durch Saccharomyces, gefolgt von der aeroben Oxidation von Ethanol zu Acetat durch Acetobacter [106–108]. Um die mikrobielle Produktion redoxneutraler oder oxidierter Produkte mit hoher Ausbeute zu ermöglichen, muss der Biokatalysatorstoffwechsel neu gestaltet werden, um Eigenschaften sowohl des fermentativen als auch des oxidativen Stoffwechsels zu kombinieren.

Neugestaltung von E coli Der W3110-Metabolismus für die Acetatproduktion konzentrierte sich auf drei Hauptwege: den fermentativen Stoffwechsel, den oxidativen Stoffwechsel und die Energieversorgung (Abbildung 4(c)) [23]. Die kompetitiven Fermentationswege (pflB, ldhA, frd, adhE) wurden inaktiviert, um den Verbrauch der gemeinsamen Vorstufe Pyruvat zu verhindern, und der oxidative Tricarbonsäure(TCA)-Zyklus wurde unterbrochen, um den Kohlenstoffverlust als CO . zu reduzieren2. Schließlich wurde die oxidative Phosphorylierung gestört (atpFH), um die ATP-Produktion zu reduzieren, während die Fähigkeit zur Oxidation von NADH durch das Elektronentransportsystem beibehalten wird, wodurch der glykolytische Fluss für mehr ATP-Produktion durch Phosphorylierung auf Substratebene erhöht wird. Obwohl rational entworfen, hatte der resultierende Stamm, TC32, einen unerwünschten auxotrophen Bedarf an Succinat während des Wachstums in Glucose-minimalem Medium. Evolution wurde verwendet, um diese Auxotrophie zu beseitigen, und der letzte Stamm, TC36, produzierte 878 mM Acetat (53 g/l) in Mineralsalzmedium mit 75% der maximalen theoretischen Ausbeute. Dies ist zwar ein niedrigerer Titer als Acetat, das durch Ethanoloxidation durch Acetobacter, TC36 hat eine zweifach höhere Produktionsrate, benötigt nur Mineralsalze als Medium und kann eine Vielzahl von Kohlenstoffquellen in einem einfachen einstufigen Prozess metabolisieren [23].

3.4. Andere

Butanol ist ein ausgezeichneter alternativer Kraftstoff für den Verkehr mit mehreren Vorteilen im Vergleich zu Ethanol, einschließlich eines höheren Energiegehalts, einer geringeren Flüchtigkeit, einer geringeren Hydroskopie und einer geringeren Korrosivität [109]. Neugestaltung von E coli für die Butanolherstellung wird unten diskutiert. C. acetobutylicum ATCC 824 produziert auf natürliche Weise Butanol und wurde überarbeitet, um die Butanolproduktion zu steigern und die Anhäufung von Nebenprodukten zu verringern. Modifikationen vom Metabolic-Engineering-Typ, wie die Überexpression des Acetonbildungsweges zur Erhöhung der Bildung der Butanol-Vorstufe Butyryl-CoA, die Inaktivierung des Transkriptionsrepressors SolR und die Überexpression der Alkohol/Aldehyd-Dehydrogenase erhöhten alle die Butanolproduktion [110-112]. In einem hervorragenden Beispiel für Anwendungen vom Typ der synthetischen Biologie wurde die Expression des Butyratkinase-Gens durch eine rational entworfene Antisense-RNA fein abgestimmt, um die Butanolproduktion zu erhöhen [113].

1,2-Propandiol (1,2-PD) ist eine wichtige Grundchemikalie, die derzeit aus Propylen gewonnen wird. E coli produziert von Natur aus geringe Mengen an 1,2-PD, weshalb sein Metabolismus so umgestaltet wurde, dass er 1,2-PD mit hoher Ausbeute und hohem Titer aus Glucose produziert. Dies wurde durch Inaktivierung konkurrierender Stoffwechselwege (Laktatdehydrogenase und Glyoxalase I) und Überexpression von . erreicht essentielle Gene des 1,2-PD-Synthesewegs (Methylglyoxal-Synthase, Glycerin-Dehydrogenase und 1,2-PD-Oxidoreduktase) [114]. Evolution wurde auch in Kombination mit rationalem Design für eine erhöhte 1,2-PD-Produktion verwendet [115].

L-Valin, eine essentielle hydrophobe und verzweigtkettige Aminosäure, wird in Kosmetika, Pharmazeutika und Tierfutterzusätzen verwendet [116]. E coli wurde für die L-Valin-Produktion mit hoher Ausbeute und hohem Titer aus Glucose durch eine Kombination aus traditionellem Metabolic Engineering und synthetischer Biologie neu entwickelt. Traditionelles metabolisches Engineering wurde verwendet, um konkurrierende Stoffwechselwege zu inaktivieren und Acetohydroxysäure-Synthase I zu überexprimieren (ilvBN), Teil des Valin-Biosyntheseweges. Leider ist die E coli Chassis hat regulatorische Elemente, die die L-Valin-Biosynthese streng kontrollieren, was die Produktion von Valin mit hoher Ausbeute und hohem Titer erschwert. Die Rückkopplungshemmung wurde durch rationale ortsgerichtete Mutagenese der Acetohydroxysäure-Synthase III beseitigt. In einer ausgezeichneten Demonstration der oben diskutierten Techniken zur Optimierung der Genexpression wurde die transkriptionale Attenuierung von Valin-Biosynthesegenen ilvGMEDA wurde eliminiert, indem die Attenuator-Leader-Region durch die konstitutive ersetzt wurde tac Promoter. Transkriptomanalyse und in silico simulationsgesteuerte Auswahl zusätzlicher Zielgene für Amplifikation und Deletion, und der endgültige Biokatalysator produzierte 0,378 g L-Valin pro g Glukose, was einen Titer von 7,55 g/L Valin aus 20 % (w/v) Glukose ergab [116]. Eine ähnliche Strategie wurde auch für die L-Threonin-Produktion verwendet [117].

4. Neugestaltung durch Einführung fremder oder nichtnatürlicher Wege

4.1. Fremde Wege
4.1.1. Ethanol

Ethanol ist ein erneuerbarer Kraftstoff für den Verkehr. Der Ersatz von Benzin durch Ethanol würde die Abhängigkeit von US-Ölimporten deutlich verringern, die nationale Sicherheit erhöhen und die Umweltverschmutzung verringern [118]. Im Jahr 2008 wurden jedoch nur 9 Milliarden Gallonen Ethanol produziert, und alle stammten aus Maisproduktion. Lignocellulose wird allgemein als eine ausgezeichnete Zuckerquelle für die Umwandlung in Kraftstoffethanol angesehen. Es ist daher wünschenswert, Biokatalysatoren zu entwickeln oder zu erhalten, die alle Zuckerkomponenten in Lignocellulose nutzen und sie mit hoher Ausbeute und Produktivität in Mineralsalzmedium in Ethanol umwandeln können. Einheimisch S. cerevisiae und Z. mobilis Stämme können Glukose effizient in Ethanol umwandeln, aber Pentosezucker nicht verwerten. Im Gegensatz, E coli Stämme können alle Zuckerkomponenten von Lignocellulosen verwerten, aber Ethanol ist nur ein untergeordnetes Fermentationsprodukt, wobei sich gemischte Säuren als das wichtigste Fermentationsprodukt ansammeln [103]. Während die jüngsten Fortschritte bei der Entwicklung der nativen E coli Stoffwechselwege für die Ethanolproduktion [119], das erfolgreichste Beispiel nutzte einen fremden Stoffwechselweg, um die Ethanolproduktion aus E coli Stamm W (ATCC# 9637) [1].

Das Redesign für die Ethanolproduktion wurde in drei Teile entkoppelt: Aufbau eines Stoffwechselwegs zur Herstellung von Ethanol als Hauptfermentationsprodukt, Eliminierung kompetitiver NADH-Oxidationswege und Unterbrechung der Nebenproduktbildung. Die Z. mobilis Der Homoethanolweg (Pyruvatdecarboxylase und Alkoholdehydrogenase) wurde als ein fremder Weg eingeführt, der eine redoxbalancierte Produktion von Ethanol in hoher Ausbeute ermöglicht [120] (Abbildung 4(b)). Dann Fumaratreduktase (frd) wurde aufgebrochen, um die Ethanolausbeute zu erhöhen. Der resultierende Stamm, KO11, produzierte Ethanol in einer Ausbeute von 95 % in einem komplexen Medium [121]. Dieser Stamm wurde zu Beginn des Metabolic Engineering entwickelt und wurde verwendet, um Ethanol aus einer Vielzahl von Lignocellulosematerialien herzustellen, wie in [1] beschrieben.

Obwohl die Ethanolproduktionsrate von KO11 so hoch war wie bei Hefe, entsprachen die Ethanoltoleranz und die Leistung in Minimalmedium nicht den gewünschten Standards. Daher wurde der Stamm SZ110, ein Derivat von KO11, das für die Laktatproduktion in Mineralsalzmedien modifiziert wurde [35], für die Ethanolproduktion umgestaltet [122]. Wie beim Design von KO11 war das Redesign von SZ110 entkoppelt vom Aufbau eines Synthesewegs für Ethanol, der Eliminierung kompetitiver NADH-Oxidationswege und der Blockierung der Nebenproduktbildung. Diese Neugestaltungsstrategie beinhaltete jedoch auch die Beschleunigung der Mitverwendung von Mischzucker. Der Lactat-Produktionsweg wurde unterbrochen und die Z. mobilis Der Homoethanolweg wurde durch zufällige Insertion in das Chromosom integriert, um eine optimale Expression zu selektieren. Die Pseudomonas putida kurzkettige Esterase (estZ) [123] wurde eingeführt, um den Ethylacetatgehalt in der Fermentationsbrühe zu senken und die Kosten für die nachgeschaltete Reinigung zu senken. Auch Methylglyoxal-Synthase (mgsA) wurde inaktiviert, was zu einem Kom-Metabolismus von Glucose und Xylose führte und den Metabolismus eines 5-Zucker-Gemischs (Mannose, Glucose, Arabinose, Xylose und Galactose) zu Ethanol beschleunigte [25]. Nachdem die Evolution zur Steigerung des Zellwachstums und der Zellproduktion genutzt wurde, konnte der letzte Stamm, LY168, gleichzeitig eine komplexe Kombination der fünf Hauptzucker, die in lignocellulosehaltiger Biomasse vorhanden sind, mit hoher Ausbeute und Produktivität in Mineralsalzen metabolisieren [25].

4.1.2. L-Laktat

Wie oben beschrieben, ist L-Lactat der Hauptbestandteil des biologisch abbaubaren Kunststoffs PLA. Obwohl viele Milchsäurebakterien L-Lactat mit hoher Ausbeute und Produktivität produzieren [124], benötigen sie in der Regel komplexe Nährstoffe. E coli hat keinen nativen Weg für die L-Lactat-Produktion, und daher war die Einführung eines fremden Weges notwendig.

Die Strategie zur Neugestaltung E coli W3110 für die L-Lactat-Produktion sollte kompetitive NADH-Oxidationswege eliminieren und dann den gewünschten L-Lactat-Syntheseweg aufbauen (Abbildung 4(b)) [125]. Der L-Lactat-Produktionsweg, die L-Lactat-Dehydrogenase (ldhL) von Pediococcus acidilactici, verwendet und seine kodierende Region und sein Terminator wurden in die E coli Chromosom an der ldhA Website, damit ldhL könnte unter dem nativen ausgedrückt werden ldhA Promoter. Außerdem, da die ldhL Gen enthält eine schwache ribosomale Bindungsregion, diese Region wurde rational durch . ersetzt ldhA's RBS [125]. Nach einer Periode metabolischer Evolution synthetisierte der resultierende Stamm, SZ85, 45 g/l L-Lactat in einem Mineralsalzmedium mit einer Ausbeute nahe dem theoretischen Maximum (94%). Dieser Stamm war jedoch ein K-12-Derivat und zeigte die gleichen Probleme wie der oben beschriebene K12-basierte D-Lactat-produzierende Stamm, was bedeutet, dass er hohe Zuckerkonzentrationen nicht vollständig fermentieren konnte und eine geringe Produktivität aufwies (0,65 g/ L/h). Daher wurde die gleiche Designstrategie in einem E coli W (ATCC# 9637)-Derivat. Nach weiterem Löschen mgsA Gen, um die chirale Reinheit zu verbessern, und die metabolische Evolution zur Verbesserung des Zellwachstums und der Produktivität zu nutzen, konnte der endgültige L-Lactat-produzierende Stamm, TG108, 12% Glucose in 116 g/L L-Lactat mit einer ausgezeichneten Ausbeute (98%) und Produktivität umwandeln (2,29 g/l/h) [22].

4.1.3. Xylit

Der Pentahydroxy-Zuckeralkohol Xylit wird häufig verwendet, um Saccharose in Lebensmitteln zu ersetzen und als natürlicher, nicht nahrhafter Süßstoff, der Zahnkaries hemmt [126]. Xylit kann auch als Baustein zur Synthese neuer Polymere verwendet werden [127]. Die derzeitige kommerzielle Produktion von Xylit umfasst die Hydrierung von von Hemicellulose abgeleiteter Xylose mit einem aktiven Metallkatalysator [127]. Kürzlich wurden auch biologisch basierte Verfahren entwickelt, aber obwohl von einigen Hefen hohe Xylit-Titer erreicht wurden, erfordert das Verfahren ein komplexes Medium mit zahlreichen teuren Vitaminzusätzen [128]. Während E coli nicht die native Fähigkeit besitzt, Xylit zu synthetisieren, wurde eine Redesign-Strategie für den Stamm W3110 vorgeschlagen, die einen fremden Stoffwechselweg beinhaltet [26].In der vorgeschlagenen Neugestaltung würde Glucose das Zellwachstum unterstützen und reduzierende Äquivalente liefern, während Xylose als Substrat für die Xylitsynthese verwendet würde (Abbildung 4(d)). Die Designstrategie bestand aus drei Hauptkomponenten: Ermöglichung der gemeinsamen Nutzung von Glucose und Xylose, Trennung des Xylose-Metabolismus vom zentralen Metabolismus und Aufbau eines Xylit-Produktionsweges (Abbildung 4(d)). Um eine gemeinsame Nutzung von Glukose und Xylose zu ermöglichen, wurde die Glukose-vermittelte Unterdrückung des Xylose-Stoffwechsels eliminiert, indem das native crp Gen mit einer cAMP-unabhängigen Mutante (CRP*). Der Xylosemetabolismus wurde vom zentralen Metabolismus getrennt, indem die Xylulokinase (xylB)-Gen, das den Verlust von Xylose-Kohlenstoff an den zentralen Stoffwechsel verhindert. Schließlich wurden Xylose-Reduktase und Xylit-Dehydrogenase aus mehreren Mikroorganismen auf ihre Fähigkeit zur Synthese von Xylit getestet, und die NADPH-abhängige Xylose-Reduktase aus C. boidinii (CbXR) unterstützt eine optimale Xylitproduktion. Der letzte Stamm, PC09 (CbXR), konnte 250 mM (38 g/l) Xylit in Mineralsalzmedium produzieren. Die Ausbeute betrug 1,7 mol Xylit pro mol verbrauchter Glucose, die durch Verwendung von ruhenden Zellen auf 4,7 mol/mol verbessert wurde. Es wurde vorgeschlagen, dass die Xylitproduktion durch eine Erhöhung des Angebots an Reduktionsäquivalenten weiter verbessert werden könnte [129].

4.1.4. L-Alanin

L-Alanin kann mit anderen L-Aminosäuren als prä- und postoperative Ernährungstherapie in pharmazeutischen und veterinärmedizinischen Anwendungen eingesetzt werden [130]. Wegen seines süßen Geschmacks wird es auch als Lebensmittelzusatzstoff verwendet. Die jährliche weltweite Produktion von L-Alanin beträgt etwa 500 Tonnen [131] und dieser Markt ist derzeit durch die Produktionskosten begrenzt. Der derzeitige kommerzielle Produktionsprozess wandelt Aspartat über Aspartat-Decarboxylase in Alanin um, wobei Aspartat aus Fumarat durch Aspartat-Ammoniak-Lyase-Katalyse hergestellt wird [27]. Ein effizienter Fermentationsprozess mit einem erneuerbaren Rohstoff wie Glukose bietet das Potenzial, die L-Alanin-Kosten zu senken und eine breite Ausweitung des Alanin-Marktes auf andere Produkte zu ermöglichen.

SZ194, ein Derivat von E coli W (ATCC# 9637), das zuvor für die D-Lactat-Produktion entwickelt wurde, wurde als Chassis für die L-Alanin-Produktion verwendet [27] (Abbildung 4(b)). Die Alaninproduktion im nativen Stamm verwendet Glutamat- und NADPH-abhängige Glutamat-Pyruvat-Aminotransferase. Es ist vorzuziehen, L-Alanin direkt aus Pyruvat und Ammoniak unter Verwendung eines NADH-abhängigen Enzyms herzustellen, und daher L-Alanin-Dehydrogenase (ein Junge) von Geobacillus stearothermophilus war angestellt. Die native Ribosomenbindungsstelle, die kodierende Region und der Terminator von ein Junge Gen wurden in die E coli Chromosom an der ldhA Website, so dass der Ausdruck von ein Junge könnte durch den nativen Promotor von gesteuert werden ldhA, ein Promotor, der wie oben beschrieben gut für die Produktion von D- und L-Lactat funktioniert hat. Weiteres Redesign konzentrierte sich auf die Eliminierung von Spurenmengen an Laktat und die Erhöhung der chiralen Reinheit von L-Alanin durch Löschen mgsA und das Haupt-Alanin-Racemase-Gen (PapaX). Die metabolische Evolution erhöhte den Endtiter und die Produktivität um das 15- bzw. 30-Fache (Abbildung 3). Der neueste L-Alanin produzierende Stamm, XZ132, wandelte 12% Glucose in 114 g/L L-Alanin mit einer Ausbeute von 95% und der ausgezeichneten volumetrischen Produktivität von 2,38 g/L/h um [27].

4.1.5. Kombinieren mehrerer Fremdpfade in einem einzigen Gehäuse

Obwohl die oben beschriebene Arbeit auf der Einführung eines einzigen fremden Weges beruhte, gibt es andere ausgezeichnete Beispiele, die Wege von mehr als einem Organismus in einem einzigen Wirt verwenden.

E coli wurde für die 1,3-Propandiol-Produktion mit S. cerevisiae Weg zur Umwandlung von Glukose in Glycerin und a K. Lungenentzündung Weg zur Umwandlung von Glycerin in 1,3-Propandiol [132]. E coli wurde auch für die Isopropanol-Produktion durch die Kombination von Acetyl-CoA-Acetyltransferase (thl) und Acetoacetatdecarboxylase (adc) von C. acetobutylicum mit der zweiten Alkoholdehydrogenase (adha) von C. beijerinckii und E coli's eigene Acetoacetyl-CoA-Transferase (eine Kröte) [133]. Artemisinsäure, eine Vorstufe des Malariamittels Artemisin, wurde von E coli nach der Kombination eines Mevalonat-Wegs aus S. cerevisiae und E coli, Amorphadien-Synthase und eine neuartige Cytochrom-P450-Monooxygenase (CYP71AV1) aus Artemisia annua [12, 134].

S. cerevisiae wurde für die Flavanon-Produktion durch Kombination neu entwickelt Arabidopsis thaliana Cinnamat-4-hydroxylase (C4H), Petroselinum Crispum 4-Cumaroyl: CoA-Ligase (4CL) und Petunie Chalkonsynthase (CHS), Petunie Chalkon-Isomerase (CHI) [135]. Ein ähnliches synthetisches System, das hydroxylierte Flavonole produziert, wurde auch in konstruiert E coli mit zusätzlicher Verstärkung von C. roseus P450-Flavonoid

-Hydroxylase (F H) fusioniert mit P450-Reduktase, Malus Domestica Flavanon 3β-Hydroxylase (FHT) und Arabidopsis thaliana Flavonol-Synthase (FLS) [136]. Die Flavonoidproduktion wurde durch weitere Neugestaltung des zentralen Stoffwechselsystems von E coli Vorläufer erhöhen (Malonyl-CoA) Versorgung [137].

4.2. Modifikation natürlicher Wege zur Herstellung nichtnatürlicher Verbindungen

Eines der Ziele der synthetischen Biologie ist es, neue genetische Schaltkreise zu entwerfen oder zu konstruieren. In den bisher angeführten Beispielen wurden bestehende biologische Teile wieder zusammengesetzt, um einen Biokatalysator zu entwickeln, der effizient ein Produkt herstellt, das bereits in der Natur existiert. Es können jedoch auch Stoffwechselwege konstruiert werden, um unnatürliche Verbindungen herzustellen.

Wie oben diskutiert, kann die gerichtete Evolution von Proteinen ihre Aktivität so verändern, dass neue Substrate erkannt oder neue Produkte gebildet werden [138]. Zum Beispiel wurden neue Carotinoid-Verbindungen durch die Evolution von zwei Schlüsselenzymen der Carotinoid-Synthese erzeugt, der Phytoen-Desaturase und der Lycopin-Cyclase [139]. Darüber hinaus kann auch die kombinatorische Biosynthese, die Gene verschiedener Organismen zu einem heterologen Wirt kombiniert, neue Produkte generieren [140]. Beispielsweise wurden vier bisher unbekannte Carotinoide durch kombinatorische Biosynthese in E coli [141].

4.3. Design des De Novo-Pfads

Um den verfügbaren Biosyntheseraum zu erweitern, ist es unerlässlich, über die natürlichen Pfade und Designpfade hinauszugehen de novo [142]. Obwohl diese spannende Designstrategie noch viele Herausforderungen birgt, wurden mehrere erfolgreiche Beispiele gemeldet.

Beispielsweise wurde ein Syntheseweg für die Herstellung von 3-Hydroxypropionsäure (3-HP) entwickelt, der die nichtnatürliche Isomerisierung von α-Alanin zu β-Alanin, wie oben erwähnt. In diesem Beispiel nutzten die Forscher die gerichtete Evolution, um die Substratspezifität der Lysin-2,3-Aminomutase zu erweitern und α-Alanin [73]. Das resultierende β-Alanin kann dann über bestehende Stoffwechselwege in 3-HP umgewandelt werden.

Unnatürliche Wege für eine höhere Alkoholproduktion in E coli wurden durch die Kombination der Synthesewege nativer Aminosäuren mit einer 2-Ketosäure-Decarboxylase aus Lactococcus lactis und Alkoholdehydrogenase aus S. cerevisiae [143]. Die 2-Ketosäure-Zwischenprodukte in Aminosäurebiosynthesewegen wurden von der Aminosäureproduktion zur Alkoholproduktion umgeleitet, was die Produktion von 3-Methyl-1-pentanol ermöglicht. Dieser Weg wurde dann durch rationales Redesign von zwei Enzymen auf die Produktion nichtnatürlicher Alkohole erweitert, wobei die resultierenden Biokatalysatoren die Fähigkeit besitzen, verschiedene nichtnatürliche Alkohole mit einer Länge von fünf bis acht Kohlenstoffatomen zu synthetisieren [144].

4.4. Technische Toleranz gegenüber inhibitorischen Verbindungen

Da unser Repertoire an biologisch hergestellten Verbindungen wächst, wird die Toleranz gegenüber hohen Produkttitern immer wichtiger. Biokraftstoffe wie Ethanol und Butanol können das Wachstum des Biokatalysators hemmen, daher muss die Verträglichkeit des Biokatalysators verbessert werden [145–147]. Wie oben beschrieben, ist es unser Ziel, lignozellulosehaltige Biomasse als Substrat für die Produktion von Rohstoffen und Chemikalien zu verwenden. Leider produzieren die Prozesse zur Umwandlung von Biomasse in lösliche Zucker auch eine Mischung von Nebenprodukten wie Furfural und Essigsäure, die den Stoffwechsel des Biokatalysators hemmen [148]. Obwohl die meisten dieser Inhibitoren durch Entgiftung entfernt werden könnten [149], würde dieser zusätzliche Prozess die Betriebskosten erhöhen. Es ist daher wünschenswert, Mikroorganismen zu erhalten, die gegenüber diesen Inhibitoren tolerant sind und Hemicellulosehydrolysat direkt fermentieren können.

Ein Ansatz zur Erhöhung der Toleranz besteht darin, den Mechanismus der Hemmung zu verstehen. Die Transkriptomanalyse wurde verwendet, um die Reaktion auf Ethanol [145, 150], Furfural [151] und Butanol [147] zu untersuchen. Ein anderer Ansatz ist die gerichtete Evolution, wie das folgende Beispiel zeigt. Ethanologen E coli Stamm LY180 (ein Derivat von LY168 mit wiederhergestellter Lactose-Verwertung und Integration einer Endoglucanase und Cellobiose-Verwertung) wurde als Chassis verwendet, um durch Evolution auf Furfuralresistenz zu selektieren [148]. Der entwickelte Stamm, EMFR9, hatte eine signifikant erhöhte Furfuralresistenz. Reverse-Engineering-Bemühungen, einschließlich Transkriptomanalyse, führten die Furfural-Resistenz auf die stumme Expression mehrerer Oxidoreduktasen zurück. Diese Oxidoreduktasen verwenden NADPH zur Furfuralreduktion, wodurch die verfügbaren Pools für die Biosynthese erschöpft werden. Somit kann die Furfural-vermittelte Wachstumshemmung der NADPH-Verarmung zugeschrieben werden [148], eine Erkenntnis, die auf andere Biokatalysator-Designprojekte übertragen werden kann.

5. Perspektiven

Obwohl viele Biokatalysatoren durch traditionelles Metabolic Engineering erfolgreich für die Herstellung industriell wichtiger Kraftstoffe und Chemikalien umgebaut wurden, sehen wir gerade erst das Potenzial der synthetischen Biologie in diesem Bereich. Eines der vorrangigen Ziele in unserem Labor ist die Verbesserung von Biokatalysatoren für die Biomassenutzung. Um dieses Ziel zu erreichen, muss die Toleranz gegenüber von Hydrolysat abgeleiteten Inhibitoren verbessert werden. Bei allen Anwendungen ist auch die Toleranz gegenüber hohen Substrat- und Produkttitern wichtig. Dieses Ziel der Neugestaltung des Phänotyps eines Biokatalysators, d. h. der Toleranz, ist nicht so klar wie die Neugestaltung des Stoffwechsels, und eine rationale Neugestaltungsstrategie ist besonders schwierig, wenn der Hemmmechanismus nicht bekannt ist.

Da sich das Verständnis unserer Biokatalysatoren verbessert, insbesondere durch Reverse Engineering weiterentwickelter Stämme, können Modelle im Genommaßstab verbessert werden. Die Einbeziehung kinetischer und regulatorischer Effekte wird auch die Genauigkeit und Vorhersagekraft dieser Modelle verbessern. Beachten Sie, dass in letzter Zeit einige Modelle entwickelt wurden, die jedoch die Notwendigkeit kinetischer Daten umgehen [152]. Da Enzyme den wichtigsten funktionellen Teil der metabolischen Synthese darstellen, werden verbesserte Protein-Engineering-Werkzeuge und neue katalytische Fähigkeiten von Proteinen den Fortschritt auf diesem Gebiet unterstützen. Es ist wichtig, qualitativ hochwertige Protein-Mutagenese-Bibliotheken (relativ kleine Bibliotheken mit einer hohen Enzymvielfalt) zu generieren, um effiziente Screening-Bemühungen zu ermöglichen [138]. Ein direktes Screening aus metagenomischen Bibliotheken von Umweltproben kann bei der Isolierung von Enzymen mit neuen Funktionen helfen, die mit den traditionellen Methoden zur Stammisolierung nicht erhalten werden können [153]. Enzyme können sogar durch eine rationale Designstrategie mit Computerhilfe von Grund auf neu synthetisiert werden [154]. Endlich neue Tools zum Besseren de novo Synthesewege müssen entwickelt werden. Mehrere Datenbanken wie BNICE (Biochemical Network Integrated Computational Explorer) [155] und ReBiT (Retro-Biosynthesis Tool) [142] wurden bereits eingerichtet, um die Identifizierung von Enzymen zu erleichtern, um einen vollständigen Syntheseweg zur Herstellung von Zielverbindungen zu konstruieren. Es ist wichtig, Richtlinien wie Redoxbilanz, Energieproduktion und thermodynamische Durchführbarkeit festzulegen, um unter diesen enormen Pfaden die optimalen Routen zu durchsuchen.

Durch die Einbeziehung von Instrumenten der synthetischen Biologie in Metabolic-Engineering-Projekte und umgekehrt können diese beiden Bereiche den Ersatz von aus Erdöl gewonnenen Rohstoffprodukten durch solche, die aus bioerneuerbarem Kohlenstoff und Energie hergestellt werden, erheblich voranbringen.

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Copyright © 2010 Laura R. Jarboe et al. Dies ist ein Open-Access-Artikel, der unter der Creative Commons Attribution License vertrieben wird und die uneingeschränkte Verwendung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium erlaubt, vorausgesetzt, das Originalwerk wird ordnungsgemäß zitiert.


Zukünftige Höhenkontrolltechniken

Mechanische Konditionierung. Es ist seit langem bekannt, dass mechanische Belastungen wie wiederholtes Bürsten, Schütteln oder Bücken durch Luftbewegungen oder Kontakt mit belebten oder unbelebten Gegenständen das Pflanzenwachstum reduzieren können. Jüngste Forschungen von Dr. Joyce Latimer an der University of Georgia haben das kommerzielle Potenzial dieser Technik zur Kontrolle der Höhe von Gemüsetransplantaten, insbesondere von Tomaten, gezeigt. Diese Arbeit wurde teilweise durch die Tatsache angeregt, dass B-Nine nicht mehr für die Verwendung bei essbaren Pflanzen registriert ist. Ein an gewerbliche Gewächshäuser angepasstes mechanisches Konditionierungssystem besteht darin, einen Balken über die

Abbildung 2. Das Wachstum der Ringelblume wird beeinflusst, wenn Dünger zu verschiedenen Zeiten während der Ernte für kurze Zeit zurückgehalten wird.

Spitzen der Pflanzen ein- bis zweimal täglich. Der Balken ist niedrig genug eingestellt, um die Pflanzen zu berühren, aber nicht so niedrig, dass die Pflanzen verletzt oder entwurzelt werden. Dreißig bis 40 % Höhenverringerung wurden mit diesem System gemeldet. Andere Systeme beinhalten periodisches Schütteln, Blasluftbehandlungen oder Wassersprühen. Damit dies für Blumenzüchter nützlich ist, ist Forschung erforderlich, um die Reaktion von Blumenkulturen zu bestimmen.

Lichtfilter. Pflanzenphysiologen haben herausgefunden, dass eine Änderung des Verhältnisses von rotem zu dunkelrotem Licht die Stängelverlängerung und Verzweigung beeinflussen kann. Rotes Licht hemmt die Stängelverlängerung im Vergleich zu dunkelrotem Licht, das die Stängelverlängerung fördert. Rotes Licht fördert auch die Verzweigung, indem es das seitliche Knospenwachstum stimuliert. In der Natur gibt es tägliche und saisonale Veränderungen des Rot:Dunkelrot-Verhältnisses. Natürliches Licht zur Mittagszeit und im Sommer hat einen höheren Rotanteil als Sonnenauf- und -untergang und der Winter. Auch die Abschattungswirkung von Pflanzendächern verändert das Verhältnis und erhöht den Anteil an tiefrotem Licht. Dies ist ein wichtiger Faktor dafür, warum sich Pflanzen dehnen, wenn sie zu eng beabstandet sind. Die aktuelle Forschung richtet sich auf die Entwicklung von Gewächshausabdeckungen, die das Rot:Far-Rot-Gleichgewicht verändern, um Pflanzenhöhe und Verzweigung zu kontrollieren.


Warum ist es wünschenswert, die Chemieproduktion an das Wachstum zu koppeln? - Biologie

Lebewesen wachsen und sie vermehren sich. Wachstum ist ein Weg, um die Materialien für die Reproduktion zu erzeugen. Die Fortpflanzung ist ein Weg, um neue Organismen zu erschaffen, die wachsen können. Somit besteht das scheinbare „Ziel“ jedes Organismus darin, die verfügbare Welt mit seinen Nachkommen, das heißt mit „Selbst“, zu füllen. Es wurde vermutet, dass jede Erbeinheit selbst, jedes Gen auf diese Weise egoistisch ist. Es wirkt so, dass es seine Chancen erhöht, sich auf alle verfügbaren Individuen einer Population auszubreiten. Wenn andere Gene dabei hilfreich sind, gut. Wenn nicht, kooperieren Sie nicht.

Der gedankenlose Drang zur Expansion, der das Markenzeichen von Lebewesen ist, ist ein Programm, das früh in der Lebensgeschichte erfunden wurde. Es hat sich als sehr erfolgreich erwiesen. (Es wurde vom freien Markt als erfolgreiches Programm für in der Wirtschaftswelt lebende Organisationen neu erfunden.) Das Ziel des Programms kann nie erreicht werden, da Organismen in ihrer Existenz aufeinander angewiesen sind. Somit gibt es eine "negative Rückkopplung" auf das Wachstum jedes Organismus, die die Dinge sozusagen im Gleichgewicht hält. Der Mensch war in letzter Zeit besonders erfolgreich darin, negative Rückkopplungen auf das Bevölkerungswachstum (wie Krankheiten oder Nahrungsmangel) zu vermeiden oder zu neutralisieren. Als Ergebnis haben sie festgestellt, dass die Umwelt durch die Besiedlung mit Menschen wünschenswerte Eigenschaften verliert und Ressourcen knapp werden. Diese Entdeckung hat zu dem Begriff der "nachhaltigen Entwicklung" geführt, der mit "Wachstum ohne negative Folgen" übersetzt werden kann. Es bleibt abzuwarten, ob der gedankenlose Expansionsdrang, den wir mit allen anderen Organismen teilen, durch intelligentes internes Feedback aufgehalten werden kann, bevor er durch Ressourcenmangel gestoppt wird.

Alles Wachstum hängt von der Aneignung äußerer Materie ab, das heißt vom "Essen" in irgendeiner Weise. Ökologen haben die verschiedenen Arten der Nahrungsaufnahme von Organismen klassifiziert (alle auf Griechisch, für Stil):

Organismen, die andere fressen (Other-Esser) werden als "Heterotrophen" bezeichnet. Geschieht dies in einer sauerstoffreichen Umgebung und wird Sauerstoff zum „Verbrennen“ der Nahrung verwendet, spricht man von „aerober Atmung“. Wir Menschen sind Heterotrophe und nutzen die aerobe Atmung, um unseren Körper zu erhalten. (Wir atmen Sauerstoff ein und Kohlendioxid aus.) Andere Heterotrophe können anaerobe Atmung verwenden, um Nahrung zu verarbeiten (sie entziehen Molekülen wie Nitrat oder Sulfat den Sauerstoff) oder sie können Fermentation verwenden (sie zerhacken die organischen Moleküle und ordnen die Teile neu an, ebenso wie Hefe). Organismen, die sich mit Sonnenlicht ernähren, um neues organisches Material aufzubauen (Selbstfresser), werden als Photo-Autotrophs bezeichnet. Normalerweise entsteht dabei Sauerstoff ("oxygene Photosynthese"), wie es die Photosynthesegleichung beschreibt. Ein dritter Weg, seinen Lebensunterhalt zu verdienen, außer andere zu essen oder sich mit Sonnenlicht zu ernähren, besteht darin, chemische Gradienten als Energiequelle für die Synthese zu verwenden (anstelle von Sonnenlicht). Solche Organismen werden "Chemo-Autotrophen" genannt. Sie alle sind Mikroben einer besonderen Bakterienklasse im weiteren Sinne ("Archea") und haben besondere Anpassungen an chemisch ungewöhnliche Umgebungen (stark sauer, schwefelreich etc.). Es gibt solche, die „anaerob“ sind (d. h. es ist kein molekularer Sauerstoff verfügbar) und solche, die „aerob“ sind (d. h. sie verwenden verfügbaren molekularen Sauerstoff, um die lokale Chemie zu verändern und Energie zu erzeugen). Zu den anaeroben Formen zählen beispielsweise Methan- und Sulfidbildner. (Methan wird in den Eingeweiden von Rindern gebildet Sulfid erzeugt den Geruch nach faulen Eiern). Zu den aeroben Formen gehören Sulfid-Oxidationsmittel und Eisen-Oxidationsmittel. (Erste produzieren den sauren Abfluss aus Minen. Letztere erzeugen Rost auf nassem Gestein.)


Sind Sie es leid, Butterblume auf Ihrer Weide zu sehen?

Haben Sie es satt, jeden Frühling über Ihre Weiden/Heufelder zu blicken und das „gelbe Meer“ zu sehen? Eines der Anzeichen dafür, dass der Frühling gekommen ist, ist, wenn die gelben Blüten der Butterblume erscheinen, aber während der Wintermonate findet das vegetative Wachstum der Butterblume statt. Als Unkraut für die kühle Jahreszeit gedeiht diese Pflanze oft auf überweideten Weideflächen mit schlechten Beständen an wünschenswertem Futter. Tatsächlich handelt es sich bei vielen Feldern mit dichter Butterblumenpopulation um Felder, die im Herbst bis in die frühen Frühlingsmonate stark von Tieren beweidet werden. Butterblumen werden manchmal als kurzlebige Stauden klassifiziert, wachsen aber oft als Wintereinjährige.

Butterblume ist für alle Tierarten giftig. Das Toxin Protanemonin wird freigesetzt, wenn die Pflanze gekaut oder anderweitig verletzt wird und ist in allen Teilen der Pflanze vorhanden. Tiere, die Hahnenfuß essen, können an Blasenbildung im Mund und inneren Teilen des Magen-Darm-Trakts, Durchfall, Koliken und in schweren Fällen zum Tod leiden. Glücklicherweise fressen die meisten Tiere keine Butterblume, weil sie ungenießbar ist. Das Toxin wird beim Trocknen inaktiviert, sodass Butterblume im Heu kein Problem darstellt.

Die meisten Hahnenfuß-Pflanzen entstehen im Herbst oder in den späten Wintermonaten aus Samen. Daher sind Weidemanagementpraktiken, die das Wachstum wünschenswerter Pflanzen während dieser Monate verbessern und fördern, eine der besten Methoden, um gegen das Auflaufen und das Wachstum dieser Pflanze zu konkurrieren. Das Mähen von Feldern oder das Schneiden von Pflanzen in Bodennähe im zeitigen Frühjahr, bevor Butterblumenpflanzen Blüten produzieren können, kann dazu beitragen, die Menge an neuem Saatgut zu reduzieren, aber das Mähen allein wird die Samenproduktion nicht vollständig beseitigen.

Zur chemischen Bekämpfung werden Herbizide, die für die Verwendung auf Grasweiden registriert sind und 2,4-D enthalten, Butterblume wirksam bekämpfen. Abhängig von anderen vorhandenen Unkräutern können auch Produkte verwendet werden, die Dicamba+2,4-D (z. B. Weedmaster), Aminopyralid (z. B. ForeFront, Milestone), Triclopyr (z. B. PastureGard, Crossbow) oder Metsulfuron (z. B. Cimarron) enthalten . Leguminosen wie Klee, die mit Grasweiden durchsetzt sind, können jedoch durch diese Herbizidprodukte schwer verletzt oder getötet werden. Um optimale Ergebnisse zu erzielen, wenden Sie im zeitigen Frühjahr (Februar –. April) ein Herbizid an, bevor die Blüten beobachtet werden, wenn die Butterblumenpflanzen noch klein sind und aktiv wachsen. Um die beste Herbizidwirkung zu erzielen, warten Sie, bis die Tageslufttemperaturen an zwei bis drei aufeinanderfolgenden Tagen höher als 50 ° C sind. Wenn Sie bestimmen, welches Produkt für Ihren Betrieb am besten geeignet ist, lesen Sie unbedingt die Produktetiketten, um die Details zu den Beschränkungen für Weiden und Heuen zu erfahren, da diese zwischen diesen Produkten stark variieren

Ein wirksames Unkrautbekämpfungsprogramm ist für die Einrichtung und Erhaltung hochproduktiver Weiden und der Leistungsfähigkeit der Tiere unerlässlich. Wir müssen uns daran erinnern, dass “Ein Gramm Vorbeugung ist ein Pfund Heilung wert.” Wählen Sie gut angepasste Gras- und/oder Hülsenfrüchtearten, die schnell wachsen und sich etablieren. Dies minimiert die Zeit, in der Unkraut leicht eindringen kann. Kalken und düngen Sie gemäß den Empfehlungen des Bodentests. Der richtige pH-Wert und der richtige Nährstoffstatus tragen dazu bei, dass das Futter schnell wächst und mit Unkraut konkurrenzfähiger ist. Beweidung richtig managen. Überweidung ist eine häufige Ursache für Unkrautprobleme. Starker Weidedruck kann das Wachstum von Unkraut gegenüber Gras begünstigen. Identifizieren Sie Unkrautprobleme und den Standort und wählen Sie aus, welche Option oder Kombination von Optionen Sie für die Unkrautbekämpfung verwenden möchten (mechanische, chemische oder Beweidung), aber das Wichtigste ist, sie in die Praxis umzusetzen und das Ergebnis zu bewerten.

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Saccharosemolekül

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Abbildung 1. Saccharose wird aus der chemischen Reaktion zwischen zwei einfachen Zuckern namens Glucose und Fructose hergestellt.

Anthony Fernandez

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Figur 2. Raumfüllendes Modell eines Saccharosemoleküls

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In einem Zuckerkristall sind die Saccharosemoleküle in einem sich wiederholenden Muster angeordnet, das sich in alle drei Dimensionen erstreckt, und alle diese Moleküle werden durch intermolekulare Kräfte zueinander angezogen – eine Art von Wechselwirkung, die Moleküle miteinander verbindet und schwächer ist als die Bindungen zwischen Atome in einem Molekül.

Wenn man Wasser mit Kristallzucker versetzt, beginnen sich einige der Saccharosemoleküle voneinander zu trennen, weil sie von den Wassermolekülen angezogen werden (Abb. 3). Wenn Wasser- und Saccharosemoleküle nahe beieinander liegen, interagieren sie durch intermolekulare Kräfte, die den intermolekularen Kräften zwischen Saccharosemolekülen ähnlich sind.

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Figur 3. Wenn Kristallzucker zu Wasser hinzugefügt wird, zerbricht er, weil die Wassermoleküle durch intermolekulare Kräfte von den Saccharosemolekülen angezogen werden. Dadurch wird jedes Saccharosemolekül von Wassermolekülen umgeben und in die Lösung mitgerissen.

Der Auflösungsprozess umfasst zwei Schritte: Erstens binden die Wassermoleküle an die Saccharosemoleküle und zweitens ziehen die Wassermoleküle die Saccharosemoleküle vom Kristall weg und in die Lösung.

Im Allgemeinen kann bei gegebenem Volumen und Temperatur nur eine bestimmte Menge eines Feststoffs in Wasser gelöst werden. Wenn wir mehr als diese Menge hinzufügen, wird sich kein Feststoff mehr auflösen. In diesem Stadium sagen wir, dass die Lösung gesättigt. Der zusätzliche Feststoff fällt einfach auf den Boden des Behälters.

Warum ist das so? Wenn Sie die Moleküle von Saccharose und Wasser sehen könnten, würden Sie feststellen, dass am Anfang, wenn Sie dem Wasser eine kleine Menge Kristallzucker hinzufügen, die meisten Saccharose-Moleküle die Zuckerkristalle verlassen, von den Wassermoleküle. Sie würden auch feststellen, dass einige der gelösten Saccharosemoleküle auch kristallisieren, d. h. nicht nur Saccharosemoleküle verlassen die Zuckerkristalle, sondern auch andere Saccharosemoleküle vereinigen sich wieder mit den Zuckerkristallen (Abb. 4). Der Grund dafür ist, dass sich Saccharosemoleküle in der Lösung ständig bewegen, sodass einige von ihnen nicht daran gehindert werden, sich wieder an Saccharosemoleküle in den Zuckerkristallen zu binden. Allerdings ist die Auflösungsgeschwindigkeit größer als die Kristallisationsgeschwindigkeit – zumindest bis die Lösung gesättigt ist –, so dass die Zuckerkristalle insgesamt im Wasser gelöst bleiben.

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Figur 4. Wenn ein Zuckerkristall in eine Tasse Wasser gegeben wird, trennen sich einige Saccharosemoleküle vom Kristall, während andere sich dem Kristall anschließen. Ob sich der Kristall in Wasser auflöst oder an Größe zunimmt, wird durch Vergleich der relativen Anzahl von Saccharosemolekülen, die sich auflösen und den Kristall verlassen, mit der Anzahl von Saccharosemolekülen, die die Lösung verlassen und sich mit dem Kristall verbinden, bestimmt.

Wenn wir der Lösung mehr Kristallzucker hinzufügen, nimmt die Auflösungsgeschwindigkeit ab und die Kristallisationsgeschwindigkeit zu, sodass irgendwann beide Geschwindigkeiten gleich sind. Mit anderen Worten, die Anzahl der Saccharosemoleküle Verlassen die Kristalle sind gleich der Anzahl der Saccharosemoleküle beitreten die Kristalle. Dies geschieht, wenn die Lösung gesättigt ist.

Als Ergebnis wird der Auflösungsprozess nach diesem Punkt fortgesetzt, wenn wir mehr Zuckerkristalle hinzufügen, aber er wird durch den Rekristallisationsprozess genau ausgeglichen. Die Zuckerkristalle können sich also nicht mehr im Wasser auflösen. In diesem Fall befinden sich die Kristalle und die Lösung im dynamischen Gleichgewicht. Dies bedeutet, dass die Größe der Kristalle gleich bleibt, obwohl die Saccharosemoleküle ständig ihre Plätze zwischen der Lösung und den Kristallen tauschen.

Um Kandiszucker herzustellen, haben wir anfangs mehr Zucker verwendet, als sich bei Raumtemperatur in Wasser auflösen konnte (drei Tassen Zucker für eine Tasse Wasser). Der einzige Weg, um den gesamten Zucker aufzulösen, besteht darin, das Wasser zu erhitzen, da eine Erhöhung der Temperatur dazu führt, dass sich mehr Zucker im Wasser auflöst. Mit anderen Worten, das dynamische Gleichgewicht wird durch eine Temperaturänderung beeinflusst. Wenn wir die Temperatur erhöhen, erhöhen wir den Auflösungsprozess, und wenn wir die Temperatur senken, verringern wir den Auflösungsprozess.

Der Kristallisationsprozess wird durch das Prinzip von Le Châtelier erklärt, das besagt, dass ein aus dem Gleichgewicht verschobenes System das Gleichgewicht wiederherstellt, indem es gegen die Verschiebung reagiert. Eine Temperaturerhöhung führt also dazu, dass das System die Energie verringert, um die Temperatur zu senken. Da das Aufbrechen chemischer Bindungen immer Energie absorbiert, kühlt es das System ab, sodass mehr Saccharosemoleküle auseinanderbrechen und sich in der Lösung auflösen.

Was passiert, wenn die Lösung abkühlt? An dieser Stelle sehen wir, wie sich Zuckerkristalle bilden. Dies erklärt sich auch durch das Prinzip von Le Châtelier: Eine Temperatursenkung bewirkt, dass ein System Energie erzeugt, um die Temperatur zu erhöhen. Da die Bildung chemischer Bindungen immer Energie freisetzt, schließen sich mehr Saccharosemoleküle dem Kristall an, um die Temperatur zu erhöhen. Dies erklärt, warum sich Kristalle bilden, wenn die Temperatur sinkt.

Sobald die gesättigte Lösung abzukühlen beginnt, wird sie übersättigt. Eine übersättigte Lösung ist instabil – sie enthält mehr gelöste Stoffe (in diesem Fall Zucker) als in Lösung bleiben kann – so dass bei sinkender Temperatur der Zucker aus der Lösung austritt und Kristalle bildet. Je niedriger die Temperatur, desto mehr Moleküle verbinden sich mit den Zuckerkristallen und so entsteht Kandiszucker.


Was bedeutet das für Anleger?

Wenn Sie einen Schritt zurücktreten und jede Behauptung von Intrexon über seine Gasfermentationsplattform bewerten, verliert der versprochene bahnbrechende Status der Technologie an Glanz. Das Unternehmen macht schlechte Vergleiche mit bestehenden Technologien und scheint keinen wirklichen Vorteil zu haben, wenn es mindestens drei der vier Chemikalien, die es derzeit entwickelt, herstellt.

Bis das Unternehmen in den nächsten Jahren im Produktionsmaßstab für 1,4-BDO und 2,3-BDO ist, ist es wahrscheinlich, dass die bestehenden Verfahren mit traditioneller Fermentation bereits erhebliche Marktanteile gewonnen und ihre Prozesskosten unter die Marke gesenkt haben denen konventioneller petrochemischer Verfahren. Andere Chemikalien im Fadenkreuz werden bereits zu gesunden Margen in Massenproduktion hergestellt und bergen nicht das technische Risiko eines neuartigen Gasfermentationsverfahrens. Obwohl sich die Vision von Intrexon auf dem Papier großartig anhört, gibt es jedoch einige Hindernisse, die Investoren, Management und Wall Street-Analysten zu übersehen scheinen.