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Zinkfinger-Nuklease-Spezifität

Zinkfinger-Nuklease-Spezifität



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Wenn ich sicherstellen möchte, dass ein ZFN nur an einer bestimmten Position im Genom schneidet, wie viele Untereinheiten benötige ich, um dies sicherzustellen?

Wenn das menschliche Genom ungefähr 3 Milliarden Basenpaare umfasst, brauchen wir eine Sequenz mit 16 Basenpaaren, weil 4^16 3 Milliarden überschreitet (wenn meine Gedanken richtig sind). Aber dann verstehe ich nicht ganz, wie die Untereinheiten des ZFN da reinkommen.


Das menschliche diploide Genom ist ~6,5 Milliarden bp groß, also müssen Sie die Länge einer Sequenz finden, die mit einer Wahrscheinlichkeit nur einmal auftritt (vorausgesetzt, die Sequenz ist völlig zufällig):

$4^n=6,5cdot10^9$

$ncdot log(4)=log(6.5)+9$

$n=frac{log(6.5)+9}{log(4)}$

$nca.16,30$

Laut diesem Artikel erkennt jeder Finger eines ZFN 3 bp, was bedeutet, dass Sie $frac{18}{3}=6$ Finger benötigen, um eine eindeutige Stelle wahrscheinlich zu erkennen. Interessanterweise heißt es in dem Artikel auch:

Die Notwendigkeit der Dimerisierung ist aus diesem Grund ein großer Vorteil: Da ein Monomer nicht aktiv ist, findet keine Spaltung an einzelnen Bindungsstellen statt. Das Spaltungsreagenz wird nur am Ziel assembliert, wenn die Finger eine ausreichende Spezifität aufweisen, und die kombinierte Anforderung an die Bindung von zwei Proteinen bringt die Gesamtspezifität in einen sehr nützlichen Bereich; z.B. geben zwei Dreifingerproteine ​​die Lage von 18 bp an, was im Prinzip ausreicht, um auch in einem komplexen Genom ein einzelnes Target herauszupicken.


Biokompatibilität, Oberflächentechnik und Verabreichung von Medikamenten, Genen und anderen Molekülen

4.32.1.2.2 Zinkfingernukleasen

Zinkfingernukleasen (ZFNs) waren das erste weit verbreitete programmierbare DNA-bindende Proteinsystem. 11 ZFNs bestehen aus einer Kette von Zinkfingerproteinen, die mit einer bakteriellen Nuklease fusioniert sind, um ein System zu erzeugen, das in der Lage ist, ortsspezifische doppelsträngige DNA-Brüche zu erzeugen, um Gen-Editierungen zu ermöglichen ( 1(A) ). Die Zinkfingerproteine ​​bieten ein ortsspezifisches Targeting, da sie jeweils eine DNA-Sequenz mit 3–4 Basenpaaren erkennen. 6,12 In ZFNs wird eine Kette von Zinkfingerproteinen verwendet, um einen längeren, spezifischeren Locus innerhalb des Genoms zu erkennen. Die üblicherweise in der ZFN-Technologie verwendete Nuklease, die an diese Kette von Zinkfingerproteinen fusioniert ist, ist FokI, die dimerisieren muss, um ein DSB einzuführen. 13 Daher wird ein Paar von ZFNs zusammen verwendet, um die DNA 14 zu zielen und zu schneiden ( 1(A) ). Wie oben beschrieben, aktiviert die Einführung eines DSB den nativen DNA-Schadensreaktionsweg, wodurch die Einführung spezifischer Gen-Editierungen durch HDR ermöglicht wird. 15,16 ZFNs wurden erfolgreich zur Gen-Editierung in menschlichen somatischen 17 und pluripotenten Stammzellen eingesetzt. 18 ZFNs haben jedoch einen inhärenten Nachteil. Der Zusammenbau von Tandem-Zinkfingerdomänen zu einer Kette mit hoher Affinität ist nämlich eine Herausforderung. Darüber hinaus haben sich Laborverfahren für jeden Labormitarbeiter, der kein ZFN-Spezialist ist, als zeitaufwändig erwiesen, was zu einem erheblichen Aufwand für eine effektive Bearbeitung führt. Ein Hauptvorteil des ZFN-Systems ist die Verwendung von dimerisiertem FokI, das die Spezifität des DNA-Targetings erhöhen und Off-Target-Effekte reduzieren kann.


Hintergrund

Herpes-simplex-Virus Typ II als Ursache von Genitalulzera beim Menschen

Herpes-simplex-Virus Typ I und II (HSV-1 bzw. 2) gehören zusammen mit dem Varicella-Zoster-Virus (Windpocken) zu den Herpesviridae taxonomische Familie von Viren [1]. Eine Infektion des Menschen mit diesen überwiegend neurotropen Viren kann aktiv oder latent sein [1, 2]. Eine aktive Infektion mit HSV-1 oder HSV-2 führt zu ulzerativen Läsionen der Mund- bzw. Genitalschleimhaut [3, 4] Die latente Infektion mit diesen Virusspezies verläuft weitgehend asymptomatisch. Eine latente HSV-2-Infektion tritt hauptsächlich in Neuronen der sakralen Wurzelganglien auf. Daher kann man sagen, dass das klinische Spektrum von HSV-2 eine primär aktive Infektion umfasst, gefolgt von einer Auflösung und Etablierung einer lebenslangen Latenzphase [4, 5]. Die primäre HSV-2-Infektion ist durch das Auftreten von Blasen oder Bläschen auf der Vulva oder dem Penis gekennzeichnet, die brechen und flache, schmerzhafte ulzerierende Läsionen hinterlassen [6, 7]. Diese Geschwüre heilen innerhalb von 2-3 Wochen spontan ab, obwohl die Heilung bei immungeschwächten Patienten sehr langsam sein kann [7]. Latent-HSV-2 ist durch wiederkehrende Episoden klinischer Erkrankung (4-5 pro Jahr) gekennzeichnet. Der subklinische Status, der zwischen Reaktivierungsepisoden intermittierend ist, kann mit infektiöser Virusausscheidung und Übertragung von HSV-2 in Genitalsekreten in Verbindung gebracht werden. Die Inzidenz symptomatischer HSV-2-Infektionen variiert geografisch, ist jedoch bei HIV-positiven Personen höher [8–10]. Die mit einer aktiven HSV-2-Infektion verbundenen Genitalläsionen sind zu einem besonderen Problem für die öffentliche Gesundheit geworden, da es Hinweise gibt, die mit einem erhöhten Risiko der sexuellen Aneignung oder Übertragung des humanen Immunschwächevirus Typ I (HIV-1) in Verbindung stehen [5–8 ]. Daher ist die Behandlung von HSV-2 und anderen genitalen ulzerativen Erkrankungen [9] eine akzeptable Maßnahme, wenn man erwägt, das Risiko einer sexuellen Übertragung und Ansteckung von HIV-1 zu reduzieren [10–12].

Herausforderungen bei bestehenden Optionen zur Behandlung oder Prävention des HSV-2-Erwerbs

Bestehende biomedizinische Interventionen zur HSV-2-Behandlung sind nur auf aktiv replizierende HSV-2-Partikel anwendbar [13]. Dies schränkt ihre klinische Relevanz ein, nur ulzerative Läsionen von HSV-2 zu behandeln [14, 15], anstatt die Infektion zu beseitigen. Insbesondere hemmen bestehende Chemotherapieoptionen zur Behandlung von HSV-2 nur das aktiv replizierende Virus, während das latente Virus nicht betroffen ist. Das latente HSV-2 ist jedoch die Quelle für zukünftige Episoden genitaler Ulzerationen nach Reaktivierung während oder nach einer durch eine Erkältung verursachten Immunsuppression, unter anderem nach einer HIV-Infektion oder einer Chemotherapie [16, 17]. Dieses Bild einer lebenslangen latenten Infektion, die reaktiviert werden kann, stellt das biomedizinische Management von HSV-2-Infektionen vor einzigartige Herausforderungen [18]. Es gab substanzielle Bemühungen, einen wirksamen HSV-2-Impfstoff auf der Grundlage bestehender biomedizinischer Erkenntnisse zu entwickeln, und diese dauern an [19, 20]. Insbesondere randomisierte klinische Studien mit früheren HSV-2-Impfstoffkandidaten, die rekombinante Ein- oder Zweikomponenten-Glykoproteine ​​(gB2 und gD2) umfassen, die in Adjuvanzien formuliert sind oder in lebenden attenuierten replikationsinkompetenten (disable-infectious single cycle-DISC, ICP8-Genmutation) exprimiert werden ) oder replikationskompetenten (ICP10-Genmutation) HSV-2-abgeleiteten viralen Vektoren, haben nur eine teilweise Wirksamkeit im Hinblick auf das Endziel des Schutzes gegen die sexuelle Übertragung oder den Erwerb von HSV-2 gezeigt [21–25].

-Virologie von HSV-2 und das Konzept des Pre-Integration Virus-Genom Slicing (PRINT-vGSX)

Wie die anderen generischen Mitglieder der Alphaherpesviridae Unterfamilie ist HSV-2 ein großes, umhülltes Virus mit einer äußeren Lipidhülle, die mit mindestens 10 viralen Glykoproteinen besetzt ist, einer intermediären Tegumentschicht, die mindestens 15 virale Proteine ​​umfasst, und einem ikosaedrischen Nukleokapsid, das das doppelsträngige DNA-Genom enthält [26]. Das vollständig sequenzierte Genom eines Stammes von HSV-2, HG52 (Dolan et al.[27]), zeigt, dass die genomische DNA von HSV-2 in zwei einzigartige Regionen doppelsträngiger DNA (lange 126 kb und kurze 26 kb kurz) organisiert ist, die als U . bezeichnet werdenL und duS. Diese werden durch invertierte Wiederholungssequenzen (TRL-IRL und IRS-TRS) eingeklammert, die leicht eine Isomerisierung und Rekombination der beiden Regionen ermöglichen [27, 28]. Das gesamte Genom hat einen G+C-Gehalt von 70,4 % und umfasst 84 offene Leserahmen, die ungefähr 74 Proteine ​​kodieren, die in drei Kategorien eingeteilt werden können: (i) unmittelbar-frühe Gene (dessen Transkription von einem viral kodierten aktivierenden Protein, VP16, abhängt und die die viralen α-Proteine ​​kodieren) (ii) frühe Gene (die von den α-Proteinen eingeschaltet werden und deren Produkte (β-Proteine) an der DNA-Replikation beteiligt sind) und (iii) späte Gene, deren Produkte (γ-Proteine) Virion-Strukturproteine ​​und Proteine ​​sind, die für den Zusammenbau und den Austritt von Viruspartikeln erforderlich sind. Die Mehrzahl der viralen Hüllglykoproteine ​​(gD) ist antigenisch mit denen des HSV-1 verwandt, während gG1 und gG2 typspezifisch sind [27, 29]. Diese Reihe zahlreicher Genprodukte, von denen viele für das Viruswachstum unentbehrlich sind in vitro, liegt der wirksamen Virulenz zugrunde, die von HSV-2 entwickelt wird, um die Abwehr des Wirts zu umgehen, einschließlich der Verhinderung der Apoptose in der infizierten Wirtszelle, der Blockade von Wegen der Interferon-Induktion und -Produktion und der Herunterregulierung der HSV-2-Antigen-Präsentation im Kontext von Typ I Major-Histokompatibilitätskomplex (MHC) [30].

Auf Basis des linearen Doppelstrangs (ds) DNA-Genomstruktur von HSV-2 [27] und das Funktionieren der primitiven Anti-Phagen-Abwehr, die Bakterien innewohnt, das Restriktionsmodifikationssystem (RM), die Möglichkeit, die genomische DNA von HSV-2 direkt anzugreifen und zu zerstören oder herauszuschneiden als alternative, neuartige biomedizinische Intervention gegen HSV-2 vorgeschlagen [31]. Konkret haben wir gezeigt, dass die Escherichia coli Restriktionsenzym (REase)-EcoRII, das das HSV-2-Genom bei mehr als 800 spaltet, ist ein idealer Vorläufer, um Genomabschnitte von infektiösen (aktiv replizierenden) HSV-2-Partikeln auszuschneiden oder latente genomische HSV-2-DNA irreversibel zu zerstören innerhalb infizierter Zellen. Es wurde festgestellt, dass Sequenzen des Ortsspezifitäts-Palindroms von EcoRII 5'-CCWGG-3' (W = A oder T) im Human-Wirt-Genom vorherrschen und daher eine Quelle für Wirt-Genom-Toxizität sind. Dieses Ergebnis beschränkte die HSV-2/EcoRII-basierten therapeutischen Modelle nur auf Mikrobizide [32, 33] und betonte die Notwendigkeit, künstliche REasen (oder Zinkfingernukleasen – ZFNs) zu entwickeln [34–36] mit einzigartiger Spezifität für Genomsequenzen von HSV -2 als sichere Vorstufen für die therapeutische Exploration in-vivo. Grosse et al.[37] identifizierten kürzlich solche HSV-1-spezifischen Homing-(Mega-)Endonukleasen und zeigten, dass ihre Expression in Nierenfibroblasten (COS-7) und BSR-Zellen der Afrikanischen Grünen Meerkatze die Infektion durch HSV-1 bei niedrigen und mittleren Infektionsmultiplizitäten hemmt ( MOIs), was zu einer signifikanten Reduktion der Viruslast führt. Darüber hinaus weisen die verbleibenden viralen Genome eine hohe Mutationsrate (bis zu 16 %) an der Meganuklease-Spaltungsstelle auf, was mit einem auf der Spaltung des viralen Genoms basierenden Wirkmechanismus vereinbar ist. Diese Arbeit hob Mega- (und Zinkfinger-)Nukleasen als eine alternative Klasse antiviraler Wirkstoffe mit dem Potenzial hervor, replikative und latente DNA-Virusformen anzugehen [37].

In diesem Beitrag werden die Identifizierung, Montage und Modellierung der in-vivo Das therapeutische Potenzial von Zinkfinger-Arrays (ZFAs), ZFNs und viralen Vektoren, die den ZFN-Genotyp transduzieren, mit einzigartiger Spezifität für Sequenzen des HSV-2-Genoms, werden erstmals vorgestellt.


Vergleich von Zinkfingernukleasen mit CRISPR-spezifischen Nukleasen für die Genom-Editierung des Wiskott-Aldrich-Syndrom-Locus

Primäre Immundefekte, einschließlich des Wiskott-Aldrich-Syndroms (WAS), sind ein Hauptziel für Strategien zur Genom-Editierung unter Verwendung spezifischer Nukleasen (SNs), da eine kleine Anzahl korrigierter hämatopoetischer Stammzellen Patienten heilen könnte. In dieser Arbeit haben wir verschiedene WAS-genspezifische CRISPR/Cas9-Systeme entworfen und ihre Effizienz und Spezifität mit homodimeren und heterodimeren WAS-spezifischen Zinkfinger-Nukleasen (ZFNs) verglichen, wobei K-562-Zellen als Zellmodell und Plasmid-Nukleofektion oder -Integration verwendet wurden -defiziente lentivirale Vektoren (IDLVs) für die Lieferung. Die verschiedenen CRISPR/Cas9- und ZFN-SNs zeigten eine ähnliche Effizienz, wenn Plasmid-Nukleofektion für die Lieferung verwendet wurde. Allerdings waren duale IDLVs, die ZFNs exprimieren, effizienter als duale IDLVs, die Cas9 und Guide-RNA exprimieren, oder All-in-One-IDLVs, die Cas9 und Guide-RNA im gleichen Vektor exprimieren. Die Spezifität von heterodimeren ZFNs und CRISPR/Cas9, gemessen durch Inkremente der γ-H2AX-Fokusbildung in WAS-editierten Zellen, war für beide ähnlich und beide übertrafen homodimere ZFNs unabhängig vom verwendeten Transportsystem. Interessanterweise zeigen wir, dass die Lieferung von SNs unter Verwendung von IDLVs effizienter und weniger genotoxisch ist als die Plasmid-Nukleofektion. Wir zeigen auch das ähnliche Verhalten von heterodimeren ZFNs und CRISPR/Cas9 für homologiegerichtete Gen-Knock-in-Strategien, wobei 88 bzw waren am Ziel. Zusammenfassend zeigen unsere Daten, dass CRISPR/Cas9 und heterodimere ZFNs gute Alternativen zur Weiterentwicklung von SN-basierten Gentherapiestrategien für WAS sind. Die IDLV-Lieferung von WAS-spezifischen heterodimeren ZFNs war jedoch die beste Option aller in dieser Studie verglichenen Systeme.

Schlüsselwörter: CRISPR/Cas9 K562 Wiskott-Aldrich-Syndrom Genome Editing integrative defiziente lentivirale Vektoren (IDLV) Zinkfingernukleasen (ZFN).


Abstrakt

Der Transfer von hochaviden T-Zell-Rezeptor(TCR)-Genen, die aus seltenen tumorspezifischen Lymphozyten isoliert wurden, in polyklonale T-Zellen ist eine attraktive Strategie der Krebsimmuntherapie. Der TCR-Gentransfer führt jedoch zu einer Konkurrenz um die Oberflächenexpression und einer unangemessenen Paarung zwischen den exogenen und endogenen TCR-Ketten, was zu einer suboptimalen Aktivität und möglicherweise schädlichen unvorhergesehenen Antigenspezifitäten der resultierenden TCRs führt. Wir haben Zink-Finger-Nukleasen (ZFNs) entwickelt, die die Zerstörung der endogenen β- und Î ±-Kettengene des TCR förderten. Lymphozyten, die mit ZFNs behandelt wurden, fehlte die Oberflächenexpression von CD3-TCR und sie expandierten durch die Zugabe von Interleukin-7 (IL-7) und IL-15. Nach lentiviraler Übertragung eines für das Wilms-Tumor 1 (WT1)-Antigen spezifischen TCR exprimierten diese TCR-editierten Zellen den neuen TCR in hohen Konzentrationen, ließen sich leicht nahezu rein expandieren und waren bei der Erkennung spezifischer Antigene im Vergleich zu Donor-matched, unedited . überlegen TCR-übertragene Zellen. Im Gegensatz zu unbearbeiteten TCR-übertragenen Zellen vermittelten die TCR-bearbeiteten Lymphozyten keine Off-Target-Reaktivität, während sie ihre Anti-Tumor-Aktivität in vivo beibehielten, was zeigt, dass die vollständige Bearbeitung der T-Zell-Spezifität tumorspezifische Lymphozyten mit verbesserten Biosicherheitsprofilen erzeugt.


Die Entdeckung von Zinkfingern und ihre Anwendungen in der Genregulation und Genommanipulation

Es wird über die Entdeckung des klassischen Cys . berichtet2Seine2 Zinkfinger, entstanden aus der Interpretation biochemischer Studien zur Wechselwirkung der Xenopus Protein-Transkriptionsfaktor IIIA mit 5S-RNA und von Strukturstudien zu seiner Struktur und seiner Wechselwirkung mit DNA. Der Finger ist eine in sich geschlossene Domäne, die durch ein Zinkion, das an ein Paar Cysteine ​​und ein Paar Histidine ligiert ist, und durch einen inneren hydrophoben Kern stabilisiert wird. Diese Entdeckung zeigte nicht nur eine neue Proteinfaltung, sondern auch ein neues Prinzip der DNA-Erkennung. Während andere DNA-bindende Proteine ​​im Allgemeinen die zweifache Symmetrie der Doppelhelix nutzen, können Zinkfinger linear hintereinander verknüpft werden, um Nukleinsäuresequenzen unterschiedlicher Länge zu erkennen. Dieser modulare Aufbau bietet eine Vielzahl kombinatorischer Möglichkeiten zur spezifischen Erkennung von DNA (bzw. RNA). Es ist daher nicht verwunderlich, dass der Zinkfinger in der Natur weit verbreitet ist, darunter 3 % der Gene des menschlichen Genoms.


Entwicklung von Zinkfingerdomänen zur Erkennung der DNA-Sequenzen der 5'-CNN-3'-Familie und deren Verwendung bei der Konstruktion künstlicher Transkriptionsfaktoren

Beim Design von Transkriptionsfaktoren zur gezielten Regulation endogener Gene wurden in den letzten Jahren erhebliche Fortschritte erzielt. Obwohl viele Strategien Selektionsmethoden beinhalten, die für jede neue Zielsequenz angewendet werden müssen, haben wir einen Ansatz entwickelt, der auf der Verknüpfung vordefinierter Zinkfingerdomänen basiert, die jeweils eine DNA-Sequenz mit drei Basenpaaren erkennen, um künstliche Transkriptionsfaktoren zu konstruieren, die an eine gewünschte Sequenz binden . Diese Domänen können zusammengestellt werden, um einzigartige 18-Basenpaar-DNA-Sequenzen mit hoher Spezifität zu erkennen. Hier berichten wir über die Entwicklung und Charakterisierung von Zinkfingerdomänen, die an 15 der 16 5'-CNN-3'-Subsites binden. Diese Domänen wurden durch eine Kombination aus Phagen-Display-Selektion, ortsgerichteter Mutagenese und de novo-Design erzeugt. Darüber hinaus wurden diese Domänen verwendet, um ein hochspezifisches Sechs-Finger-Protein zu generieren, das auf den ERBB-2-Promotor abzielt. Bei Fusion mit regulatorischen Domänen war dieses Protein in der Lage, die Expression des endogenen ERBB-2-Gens hoch- und herunterzuregulieren. Durch die Hinzufügung dieser Sammlung vordefinierter Zinkfingerdomänen können die meisten 5'-CNN-3'-, 5'-GNN-3'- und 5'-ANN-3'-enthaltenden Sequenzen jetzt schnell auf gerichtete Gene abgezielt werden Regulation und Nukleasespaltung.


MATERIALEN UND METHODEN

Proteinbindungs-Mikroarray-Experimente

Sequenzen der beiden PBM-„all-10-mer“-Designs sind unter http://hugheslab.ccbr.utoronto.ca/supplementary-data/C2H2_modularity/ angegeben. Details zum Design und zur Verwendung von PBMs wurden an anderer Stelle beschrieben ( 41, 47, 49, 50). Plasmide sind in der Ergänzungstabelle S1 aufgeführt. ZFAs wurden als SacI-BamHI-Fragmente in pTH5325, einen modifizierten T7-getriebenen GST-Expressionsvektor, kloniert (siehe Supplementary Document of the Supplementary Data). Kurz gesagt, wir verwendeten 150 ng Plasmid-DNA in einem 25 μl in vitro Transkriptions-/Translationsreaktion unter Verwendung eines PURExpress In Vitro Protein Synthesis Kit (New England BioLabs), ergänzt mit RNase-Inhibitor und 50 μM Zinkacetat. Nach einer 2-stündigen Inkubation bei 37 °C wurden 12,5 µl der Mischung zu 137,5 µl Proteinbindungslösung für eine endgültige Mischung aus PBS/2% Magermilch/0,2 mg pro ml BSA/50 µM Zinkacetat/0,1 . hinzugefügt % Tween-20. Diese Mischung wurde einem zuvor mit PBS/2% Magermilch blockierten Array hinzugefügt und einmal mit PBS/0,1% Tween-20 und einmal mit PBS/0,01% Triton-X 100 gewaschen. Nach einer 1-stündigen Inkubation bei Raumtemperatur Array wurde einmal mit PBS/0,5% Tween-20/50 &mgr;M Zinkacetat und einmal mit PBS/0,01% Triton-X 100/50 &mgr;M Zinkacetat gewaschen. Cy5-markierter Anti-GST-Antikörper wurde zugegeben, verdünnt in PBS/2% Magermilch/50 &mgr;M Zinkacetat. Nach einer 1-stündigen Inkubation bei Raumtemperatur wurde das Array dreimal mit PBS/0,05% Tween-20/50 µM Zinkacetat und einmal mit PBS/50 µM Zinkacetat gewaschen. Das Array wurde dann mit einem Agilent Microarray-Scanner mit einer Auflösung von 2 μM abgebildet.

Analyse von Microarray-Daten

Die Intensitäten der Bildpunkte wurden mit der ImaGene-Software (BioDiscovery) quantifiziert. Um die relative Präferenz für jedes 8-mer abzuschätzen, wurden zwei verschiedene Scores berechnet: die Z-Score wurde aus der durchschnittlichen Signalintensität über die 16 oder 32 Spots berechnet, die jedes 8-mer enthielten.E-score’ (zur Anreicherung) ist eine Variation der Fläche unter der ROC-Kurve ( 41) und wird hier verwendet, da sie sehr gut reproduzierbar ist und den Vergleich zwischen einzelnen Experimenten erleichtert. Jeder ZFA wurde auf zwei verschiedenen universellen Microarrays (bezeichnet als ME und HK) getestet. E-Score-Daten werden im Text diskutiert, jedoch beide Z- und E-Score-Daten werden in den ergänzenden Daten online unter http://hugheslab.ccbr.utoronto.ca/supplementary-data/C2H2_modularity/ bereitgestellt. Microarray-Daten wurden bei GEO hinterlegt (Zugangsnummer GSE25723).


TALENs und ZFNs

Die Welt verfügt heute über zwei wichtige Technologien zur gezielten Bearbeitung des Genoms: Zinkfinger-Nukleasen (ZFNs) und TAL-Effektor-Nukleasen (TALENs). Im Prinzip sind diese Technologien in der Lage, praktisch jede Stelle im Genom anzugreifen und die dort vorhandene DNA zu editieren. Diese haben bereits begonnen, Forschung und Medizin zu revolutionieren, und ihr Potenzial scheint in den kommenden Jahren enorm zu sein, also habe ich mich hingesetzt, um mich über ihre Funktionsweise zu informieren.

Gen-Targeting ist zwar relativ neu, aber nicht wie neu als ZFNs oder TALENs. In den späten 1980er Jahren fanden Cappechi, Evans und Smithies heraus, dass der zelluläre Prozess der homologen Rekombination gekapert werden könnte, um genomische DNA gegen eine neue interessierende Sequenz auszutauschen. Homologe Rekombination – bei der Enzyme zwei ähnliche DNA-Stücke gegeneinander austauschen – ist ein Mechanismus, der allen lebenden Organismen eigen ist. Bakterien nutzen es, um nützliche Gene miteinander auszutauschen, wir Tiere verwenden es, um unsere Chromosomenpaare während der Meiose kreuz und quer zu durchkreuzen, was wichtig ist, weil es der natürlichen Selektion ermöglicht, auf einzelne Gene und nicht auf ganze Chromosomen einzuwirken. Andernfalls könnte ein wirklich nützliches Gen niemals eine positive Selektion genießen, wenn es zufällig einem wirklich schlechten Gen direkt nachgeschaltet ist. Wie auch immer, Cappechi, Evans und Smithie haben herausgefunden, dass man einfach DNA erzeugen könnte, die homolog (dh ähnlich, nicht identisch) zu einem existierenden Gen in einem Organismus ist und diese DNA in den Kern einer Zelle bringen könnte – was Elektroporation erfordert, um die Permeabilisierung zu erreichen Zellmembran –, es bestand eine gewisse Chance, dass sie rekombiniert und in das Genom der Zelle integriert wird. Indem sie dies auf embryonale Stammzellen der Maus anwendeten und mutierte, nicht funktionelle Versionen von Genen in das Mausgenom rekombinierten, um funktionierende Gene zu ersetzen, erfanden sie die Knockout-Maus, eine Leistung, die ihnen 2007 den Nobelpreis einbrachte.

Diese Errungenschaft ist seitdem die Grundlage für so ziemlich alle umgekehrte Genetik (d.h. einen Genotyp erstellen, den resultierenden Phänotyp studieren). Aber nur die Daumen zu drücken und zu hoffen, dass die homologe DNA rekombiniert, ist ein ziemlich ineffizienter Prozess – nur ein sehr kleiner Teil der Zellen wird erfolgreich rekombiniert.

Der Prozess ist teilweise ineffizient, weil die homologe Rekombination erfordert, dass zuerst die DNA an einer relevanten Stelle einen Doppelstrangbruch durchmachen muss und dann die Reparaturmechanismen diesen Bruch reparieren müssen, indem die neue (und nicht die alte) DNA an das gebrochene Ende fusioniert wird . Wenn Sie sich also hinsetzen und über Möglichkeiten nachdenken, um diesen Prozess zu beschleunigen, könnten Sie auf die Idee kommen, zuerst die genomische DNA zu schneiden, um den Doppelstrangbruch zu erzeugen.

Die Biologie kennt einen solchen Mechanismus, um Doppelstrangbrüche zu erzeugen: Restriktionsenzyme. Einige Bakterienarten entwickelten diese Enzyme, um die DNA eindringender Bakteriophagen (Viren, die Bakterien infizieren) zu zerkleinern. Die Bakterien methylieren diese Sequenzen ihrer besitzen DNA, um Friendly Fire zu verhindern. Brillant. Seit Jahrzehnten haben wir Menschen diesen Mechanismus für alle Arten von Biologieprotokollen gekapert. Wenn Sie zurückdenken, erinnern Sie sich vielleicht daran, dass wir sie in den Tagen vor der Sequenzierung für DNA-Fingerabdrücke in Forensik und Vaterschaftstests verwendet haben. Restriktionsenzyme haben eine Einzelnukleotidauflösung in ihrer Bindungsspezifität, so dass ein SNP den Unterschied zwischen einer Restriktionsstelle und einer Nicht-Restriktionsstelle ausmachen kann. Wenn Sie also die DNA von zwei verschiedenen Personen demselben Restriktionsenzym aussetzen, werden sie an verschiedenen Stellen geschnitten, was zu unterschiedlich langen Fragmenten führt. Diese Längenunterschiede, die als Restriktionsfragmentlängenpolymorphismen oder RFLPs bezeichnet werden, wurden in der OJ-Studie besonders hervorgehoben.

Das Problem mit Restriktionsenzymen ist, dass ihre Erkennungssequenzen sehr kurz sind und daher jedes beliebige Restriktionsenzym an Hunderten oder Tausenden von Stellen im Genom schneidet. Zum Beispiel die Erkennungsstellen der Restriktionsenzyme EcoRI und SamI:

Jeweils nur sechs Basen. Was stattdessen benötigt wurde, war ein Restriktionsenzym, das eine viel längere Sequenz erkennen würde – lang genug, um für eine Position im gesamten Genom einzigartig zu sein.

Meganukleasen sind genau das. Trotz des Präfixes erkennen sie keine Sequenz von 1 Million Basenpaaren, sondern nur eine Sequenz von 12-40 Basenpaaren, aber in vielen Fällen reicht dies bereits aus, um eine und nur eine Erkennungsstelle im Genom eines gesamten Organismus zu haben . Wenn die genomische Site, die Sie ansprechen möchten, nur das passiert die von einer bekannten Meganuklease erkannte Sequenz tragen, dann sind Sie im Geschäft. Aber es gibt 4 18 /2 mögliche Sequenzen mit 18 Basenpaaren, auf die Sie vielleicht abzielen möchten, und Sie werden nicht nur auf 4 18 /2 verschiedene Meganukleasen stoßen, um die Arbeit zu erledigen. Die Leute haben versucht, zufällige Mutagenese-Screens zu verwenden, um neue Meganukleasen zu generieren, mit einigem Erfolg, aber wir sind noch lange nicht in der Lage, nur darauf zu zielen irgendein mögliche Reihenfolge.

Meganukleasen haben sich als nützlich erwiesen und Sie können sie heute bei Cellectis kaufen – sie sind keineswegs aus dem Bild. Aber sie haben die Wissenschaft nie revolutioniert, weil sie einfach nicht genug programmierbar waren. Sie konnten sie nicht von Grund auf neu entwerfen, um Ihre Gebote zu erfüllen.

Betreten Sie die Cys2Seine2 Zinkfingerprotein. Dies sind sequenzspezifische DNA-bindende Proteine, die als Transkriptionsfaktoren fungieren, d. h. die Genexpression regulieren, indem sie selektiv an Genpromotoren binden. Viele Arten haben sie, auch wir Menschen (das EGR1-Gen kodiert einen Zinkfinger-Transkriptionsfaktor). Aber während wir Tausende von Transkriptionsfaktoren haben, die nicht mehr „reprogrammierbar“ sind als eine Meganuklease, ist das Schöne am Zinkfinger, dass er modular ist. Jeder Zinkfinger hat zwei bis vier Domänen mit jeweils einer α-Helix, die in die große Furche einer DNA-Doppelhelix passt und selektiv an eine 3-Basenpaar-Sequenz bindet.

Die am häufigsten verwendeten Zinkfinger haben drei ‘Finger’ (DNA-bindende Domänen), was bedeutet, dass Sie eine 9-Basen-Spezifität haben. Die Zinkfingerproteine ​​werden dann paarweise verwendet, wodurch Sie eine 18-Basen-Spezifität erhalten. Dies reicht aus, um auf fast jede gewünschte Sequenz eindeutig abzuzielen.

Zinkfinger allein binden DNA. Wenn Sie also nur ein Protein entwerfen müssten, das selektiv einen Promotor bindet, um ein Gen zu aktivieren, sind Sie genau dort fertig. Will man damit aber gezielt DNA-Brüche erzeugen, braucht man dazu eine Schere. Natürlich suchen Sie sich nach einem anderen DNA-spaltenden Protein oder einer Proteindomäne um, die Sie mit den Zinkfingern fusionieren könnten. Alle Restriktionsenzyme haben die Fähigkeit, DNA zu spalten, aber Sie wissen, wie kompliziert die Proteinfaltung ist: Die meisten von ihnen haben die Fähigkeit zur DNA-Spaltung, die alle mit der DNA-Bindungsfähigkeit verbunden sind, und Sie können die beiden nicht sauber trennen. Aber das Restriktionsenzym FokI, das von Sugisaki & Kanazawa 1981 isoliert wurde, hat genau das, was Sie brauchen: eine DNA-spaltende Domäne, die keinerlei Sequenzspezifität besitzt und vollständig getrennt von der DNA-bindenden Domäne des Enzyms funktionieren kann.

Stellen Sie sich nun zwei Zinkfingerproteine ​​mit jeweils drei Fingern für eine Gesamtspezifität von 18 Basenpaaren vor, die ober- und unterhalb einer interessierenden Stelle gebunden sind und jeweils mit einer FokI-DNA-spaltenden Domäne dazwischen fusioniert sind. Das ist eine Zinkfingernuklease. Es ist sogar gelungen, die FokI-Spaltungsdomäne auf jedem Protein leicht unterschiedlich zu gestalten und DNA nur so zu spalten Heterodimere (Kombination der beiden unterschiedlichen FokI-Domänen) statt Homodimere, um Off-Target-Effekte zu reduzieren. Sie können auch länger gehen, um mehr Spezifität zu erzielen: CompoZr-kundenspezifische ZFNs, die von Sigma-Aldrich unter einer alleinigen kommerziellen Lizenz zum Verkauf von ZFNs verkauft werden, erkennen 24 – 36 Basen. (Übrigens, obwohl ZFNs patentiert sind, können Sie trotzdem legal Ihre eigenen rollen, und das Zinc Finger Consortium bietet Open-Source-Protokolle zum Synthetisieren von ZFNs sowie Software zu deren Entwicklung.)

Das Design von Zinkfingern, um auf eine bestimmte DNA-Sequenz abzuzielen, ist nicht ganz so perfekt oder elegant, wie Sie vielleicht hoffen: googeln Sie ‘Zinkfingercode’ und sehen Sie, ob Sie mehr Glück haben als ich. Ich hatte auf eine schöne Tabelle gehofft, die zeigt, welche Aminosäuresequenzen in der Alpha-Helix welchen DNA-Basentripletts entsprechen. Es scheint nicht ganz so einfach zu sein, weil die Finger miteinander interagieren und die Falteigenschaften des anderen verändern: “ Sowohl bei natürlichen als auch bei designten Mehrfinger-ZFPs… funktionieren einzelne Finger nicht immer als vollständig modulare Einheiten” [Hurt 2003]. Es gibt also immer noch ein wenig Versuch und Irrtum und Sie können nicht immer die genaue Sequenz auswählen, die Sie möchten, und Sie müssen sich möglicherweise mit einer anderen Site zufrieden geben, die ein wenig von Ihrer idealen Site entfernt ist.

Trotzdem haben sich Zinkfinger als ziemlich revolutionär erwiesen. Am bekanntesten ist, dass sie bei einem der bisher größten biologischen Fortschritte in unserem Leben eine Rolle gespielt haben: die Stammzell-Gentherapie für HIV. Mitte der 1990er Jahre hatte man die Vorstellung, dass HIV das CD4-Protein (das auf CD4+-T-Zellen gefunden wird) als Rezeptor benötigt, um Zellen zu infizieren. Samson 1996a charakterisierte das CCR5-Gen, das sich bald als a Korezeptor für HIV – muss das Virus zuerst an CD4 und dann an CCR5 binden, um in die T-Zellen einzudringen. Samson 1996b entdeckte ein CCR5-Allel, bei dem das Genprodukt durch eine 32bp-Frameshift-Deletion vollständig deaktiviert ist (jetzt CCR5Δ32-Allel genannt). Dieses Allel kommt bei Europäern zu etwa 10 % vor (in anderen Bevölkerungsgruppen nicht zu sehen), und Samson kam zu dem Schluss, dass es eine Resistenz gegen eine HIV-Infektion verleihen muss, da in 723 HIV-Fällen keine HIV-positiven Personen homozygot für dieses Allel waren und sogar Heterozygote um ca 35 %. Daher schien die Deletion von CCR5 aus dem Genom ein potenzieller therapeutischer Weg für HIV zu sein. Bis 2010 konnten mehrere Gruppen an Mäusen zeigen, dass ZFNs zur Störung von CCR5 und zur Erzeugung einer HIV-Resistenz eingesetzt werden können. Perez 2008 verwendete ZFNs, um CCR5 in menschlichen CD4+-T-Zellen zu zerstören, wodurch etwa 50% der CCR5-Allele zerstört wurden, und transplantierte diese Zellen dann in immundefiziente NOG-Mäuse und zeigte, dass die Mäuse mit den CCR5-zerstörten CD4+-Zellen weniger Virus produzierten und höher blieben CD4+-Zellzahlen (beide Indikatoren für die Schwere der HIV-Infektion) als Kontrollmäuse, die unmodifizierte CD4+-Zellen erhielten. Dieser Ansatz führte schnell zu einer laufenden klinischen Studie (Siehe auch diese selbstvermarktende, aber gut geschriebene Einführung in die klinische Studie von Sangamo, dem Unternehmen, das das Patent auf ZFNs hält) . Ein anderer Ansatz besteht darin, anstelle der Transplantation modifizierter CD4+-Zellen die Stammzellen, die die CD4+-Zellen bilden, zu modifizieren und so eine dauerhafte Versorgung mit HIV-resistenten Zellen zu schaffen. Holt 2010 tat genau dies mit hämatopoetischen (blutbildenden) Stammzellen aus menschlichem Nabelschnurblut, die mit ZFNs transfiziert wurden, die darauf abzielen, CCR5 zu zerstören, und in Mäuse transplantiert wurden. HIV tötete die meisten der unzerstörten Zellen schnell ab und hinterließ eine Population von homozygoten CCR5-Knockout-Zellen, die nicht infiziert werden konnten. Holts Ansatz – unter Verwendung von Stammzellen– ähnelt dem Fall einer Person, die (wir denken) vollständig von HIV geheilt wurde. Allers 2011 berichtet über einen HIV-positiven Leukämiepatienten, der eine Knochenmarktransplantation von einem passenden Spender erhielt, der ein CCR5Δ32-Homozygot war. Der Patient scheint nun nicht mehr mit HIV infiziert zu sein. Bisher hat noch niemand eine solche Transplantation mit patienteneigenen ZFN-modifizierten Zellen durchgeführt, aber das könnte der nächste sein. (Diese Art von Verfahren ist jedoch auf Patienten beschränkt, die neben HIV bereits eine lebensbedrohliche Leukämie haben, da Knochenmarktransplantationen unglaublich riskant sind).

Zinkfingernukleasen sind zu diesem Zeitpunkt alle erwachsen und haben es bereits in eine klinische Studie geschafft. Im Moment dreht sich jedoch alles um eine neue, vergleichsweise ungetestete, aber sehr vielversprechende Alternative: Transkriptionsaktivator-ähnliche Effektornukleasen, kurz TALENs.

Wie ZFNs und die meisten anderen coolen Dinge in der Biologie haben die Menschen TALENs nicht von Grund auf neu erfunden – sondern wir entführten biologische Werkzeuge von einem hochspezialisierten Organismus, der sich entwickelt hatte, um das zu tun, was wir tun wollten. TALENs, nutzen DNA-bindende Proteine ​​aus dem Xanthomonas Gattung von Bakterien. Xanthomonas are plant pathogens that produce proteins to specifically bind to and up- or down-regulate promoter sequences in host genes important to the disease process – much like a transcription activator would. Hence the “transcription activator-like” part of the name. The central region of the TAL protein is made up of 17 to 18 repeats of the same 34 amino acid unit, with amino acids 12 and 13 of each unit determining what single DNA nucleotide it binds to. And unlike ZFNs, these units are pretty much completely modular and spell out an almost-unambiguous code for the targeted DNA sequence. Here’s the beautiful elegant table you’ve been waiting for:

Amino acids 12 & 13 DNA letter targeted
NI EIN
HD C
NN G or A
NK g
NG T

So with, say, 17 repeats = 17*34 = 578 amino acids plus the non-repeating C- and N-terminal sequences of a TAL, you can uniquely target a 17 base pair DNA sequence. Use two TALs and you can recognize 34 bases put FokI DNA-cleaving domains in between them, and you’ve got a TALEN.

The process for synthesizing TALENs – creating your custom amino acid sequence to bind the DNA sequence of interest, adding FokI, and so on – is not exactly trivial. For a 20-page protocol on how to make your own, see Sanjana 2012, and for some open source resources to help you design it, see Cornell University’s TALE-NT tools. Or you can buy a custom-designed one from Cellectis, which holds the exclusive commercial license on TALENs, for $5000.

TALENs are quite new at this point but have already been used in some cool applications. Ding 2013 reports on using them to make isogenic models of human disease – pairs of cell lines that are (theoretically) identical except for the single site of a disease-causing genetic mutation. (This is what we at Prion Alliance have proposed to do for FFI using ZFNs in our Rare Disease Challenge proposal). In practice, the cell lines didn’t turn out quite identical: the TALENs exhibited minimal off-target effects, but simply growing cells in culture leads to the gradual accumulation of mutations here and there (just as aging leads to gradual accumulation of somatic mutations in cells in your body).

Durai 2005, writing about ZFNs, says that making a double-stranded DNA break at an appropriate location can increase the efficiency of homologous recombination by 50,000-fold. But even with highly site-specific ZFNs or TALENs there is still no one ‘at the wheel’ making sure the ZFNs/TALENs and the new homologous DNA all end up at the right place at the right time and that DNA repair mechanisms stitch the chromosome back together in the way you want. So after you’ve used your ZFNs/TALENs you have to do sequencing to see what fraction of the cells got successful integration of the edits you were trying to make. In practice it will be some small-ish fraction of cells (say, anywhere from 1.6% to 34% in a recent report by Ding 2013) and so you’ll select those for your further experiments and cull the rest.

That’s one reason why these technologies are still a long ways from allowing us to perform gene therapy in every cell of an adult human. But in the immediate term, these will be amazing tools for research, letting us create new models of human diseases. In the slightly longer term, there is also the possibility that they’ll play a role in making it possible to transplant modified versions of your own cells back into your body, like they did in HIV. While that’s harder to do with brain than blood, Stem Cells Inc has already brought human neural stem cell transplants to the clinical development stage, so don’t rule it out.

update 2013-01-22: I just learned that the folks behind the Ding 2013 paper are sharing their plasmids through addgene.org as a public resource to help other researchers build their own TALENs. Fantastisch! Also another quick update: if you watched the Nature Biotechnology video on Youtube at the top of this post, you should be aware that this graphic at 1:24 is not really accurate:

The above graphic depicts the template for homology-directed repair (HDR) as being of the same length as the piece of DNA that was cut out of the original genome. In fact, HDR depends upon homology between the new piece of DNA and the existing, uncut parts of the genome, so the introduced piece of DNA on top that you are trying to knock into the genome would need to extend darüber hinaus the points of the cut. So it should look something more like this:

Although, while qualitatively more correct, even this graphic does not depict properly the Länge of homology required for HDR. For ZFNs, apparently the new template DNA can be just

100b longer than the cut site on each side. That’s a big improvement over conventional knock-in without ZFNs/TALENs, which requires several kb of homology on each side of the desired mutation.

update 2013-01-22 #2: The question arose today as to whether TALENs, like ZFNs, could be designed to only function as heterodimers so as to reduce off-target effects. The answer is yes: Cade 2012 uses ‘obligate heterodimer’ TALENs in zebrafish and compares the results to homodimeric TALENs. Predictably, the ‘obligate heterodimer’ TALENs have fewer off-target effects.

update 2013-01-22 #3: We also had a discussion about costs for TALENs. As mentioned above, Cellectis sells custom-designed TALENs for $5000 a pair. Buying the requisite kit from addgene will run you just $300, plus several days of labor (assuming you know what you’re doing!) And although U.S. patent application EP2510096A2 looks to preclude anyone but Cellectis from selling TALENs commercially, research institutions do produce them internally as a service to research groups within the institution. I’m told that the ‘all-in’ price for getting TALEN-modified cell lines runs about $14,000. That includes design and assembly of TALENs, screening for cells that take up the TALEN plasmids, then screening for successfully modified cells and unmodified wild-type cells.

update 2013-06-07: Sigh – outdated no sooner than it was posted! Jetzt the hot new genome-editing technology is CRISPR, see e.g. Cong 2013. Also a colleague pointed out that the screenshot from that YouTube video above is inaccurate in another way – most of the time you don’t need to make zwei double-stranded breaks, just one, in order to get homology-directed repair to kick in.

About Eric Vallabh Minikel

Eric Vallabh Minikel is on a lifelong quest to prevent prion disease. He is a scientist based at the Broad Institute of MIT and Harvard.


In vitro selection of zinc fingers with altered DNA-binding specificity

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