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Warum finde ich eine eigentümliche B-Zell-Population, wenn pbmcs 3 Tage lang mit CD40L kultiviert werden?

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Während ich einen intrazellulären Cytokin-Assay an B-Zellen durchführe, finde ich eine eigentümliche Population. Ich verwende 2*10^6 Zellen, um jeden funktionellen Marker zu untersuchen. Die pbmcs werden 72 Stunden lang kultiviert, wobei die CD40L-Dosis 0 Stunde nach dem Plattieren und BFA in der 48. Stunde verabreicht wird. Bei der Analyse erhalte ich zwei CD19+-Populationen aus den Lymphozyten. Kann mich jemand aufklären, was wirklich passiert?


Warum finde ich eine eigentümliche B-Zell-Population, wenn pbmcs 3 Tage lang mit CD40L kultiviert werden? - Biologie

B-Zell-Antworten bei chronischem HBV richten sich überwiegend gegen HBcAg, nicht gegen HBsAg.

HBcAg-spezifische Gedächtnis-B-Zellen assoziieren mit den klinischen Phasen von HBV.

HBcAg-spezifische B-Zell-Antworten werden während der antiviralen Behandlung reduziert.

Hintergrund und Ziele

Über Häufigkeit, Phänotyp und Funktion von HBV-spezifischen B-Zellen während einer chronischen Infektion ist wenig bekannt. Hier untersuchen wir HBcAg und HBsAg-spezifische B-Zellen in verschiedenen klinischen Phasen einer chronischen HBV-Infektion.

Methoden

Wir schlossen 118 therapienaive und 34 mit Nukleos(t)id-Analoga behandelte Patienten mit chronischem HBV und 23 gesunde HBsAg-geimpfte Kontrollen ein. Globale und HBV-spezifische B-Lymphozyten wurden mittels FACS unter Verwendung von fluoreszenzmarkiertem HBsAg und HBcAg als Köder untersucht. Funktionelle HBV-spezifische B-Zell-Antworten wurden in B-Zell-ELISPOT-Assays quantifiziert. Anti-HBs- und Anti-HBc-Antikörper wurden im Serum und im ELISPOT-Überstand durch ELISA gemessen.

Ergebnisse

Höhere HBcAg-gerichtete B-Zell-Antworten wurden in klinischen HBV-Phasen mit erhöhten vs. niedrige Alanin-Aminotransferase (ALT)-Spiegel im Serum, unabhängig vom HBeAg-Status. Im Gegensatz dazu waren HBsAg-gerichtete Reaktionen geringer und schwankten nicht signifikant. Bei einzelnen Patienten zielen durchschnittlich 17,8-mal mehr zirkulierende B-Zellen auf HBcAg ab als HBsAg-Köder. Diese HBcAg-spezifischen B-Zellen weisen ein klassisches Gedächtnis-B-Zellprofil auf und haben etwas höhere CD69-Expressionsniveaus im Vergleich zu globalen Gedächtnis-B-Zellen. Virale Suppression und ALT-Normalisierung nach der Behandlung führten zu einer numerischen und funktionellen Reduktion der HBcAg-spezifischen B-Zell-Antworten, begleitet von einer fortschreitenden Abnahme der Serum-Anti-HBc-Antikörper.

Abschluss

HBcAg-spezifische Gedächtnis-B-Zellen weisen einen klassischen Gedächtnis-B-Zell-Phänotyp auf, variieren in Anzahl und Funktion während der natürlichen Geschichte von HBV und werden während einer antiviralen Behandlung signifikant reduziert.

Zusammenfassung legen

In den letzten Jahren haben Studien, die die Rolle von B-Zellen während einer chronischen Hepatitis-B-Virusinfektion untersuchen, wieder an Interesse gewonnen. Wir zeigen, dass zirkulierende B-Zellen häufiger auf das Hepatitis-B-Kernantigen als auf das Hepatitis-Oberflächenantigen abzielen. Darüber hinaus assoziieren diese Hepatitis-B-Kern-spezifischen B-Zellen mit dem natürlichen Verlauf des chronischen HBV, und ihre Reaktionen nehmen während einer wirksamen antiviralen Behandlung ab.


Einführung

Es wird angenommen, dass die Proliferationskapazität normaler differenzierter menschlicher Zellen begrenzt ist in vivo und in vitro. Die fortschreitende Verkürzung von Telomeren – repetitiven DNA-Sequenzen an den Enden der Chromosomen – mit jeder Zellteilung führt letztendlich zu einer replikativen Seneszenz, die durch einen dauerhaften Wachstumsstillstand gekennzeichnet ist [1], [2]. Der Telomerverkürzung wird durch die Telomerase entgegengewirkt, die an den Enden der Chromosomen Telomer-Repeats anfügt und in Keimbahnzellen exprimiert wird, aber auch in bestimmten somatischen Zellen wie aktivierten Lymphozyten induziert werden kann [3]–[6]. Die zelluläre Immortalisierung erfordert einen Mechanismus zur Aufrechterhaltung der Telomere und beinhaltet normalerweise eine Hochregulierung der Telomeraseaktivität [1].

Die Voraussetzungen für die Immortalisierung menschlicher Zellen in vitro sind zelltypspezifisch. Klone aus humanen embryonalen Stammzellen zeigen konstitutiv eine starke Telomerase-Aktivität und sind immortalisiert in vitro ohne Genmanipulation [7]. Für humane Fibroblasten und T-Lymphozyten war eine Transduktion mit Telomerase notwendig und ausreichend, um Telomere zu stabilisieren und in vitro eine Immortalisierung zu erreichen [8]–[10]. Die Aktivierung von T-Zellen ist mit der Induktion der endogenen Telomerase-Aktivität verbunden [11], jedoch auf Niveaus, die nicht ausreichen, um ihre Immortalisierung zu erreichen. Bei Epithelzellen war die ektopische Expression der Telomerase nicht ausreichend für deren Immortalisierung, zusätzlich war eine Inaktivierung des Rb/p16-Signalwegs erforderlich [12]. Das Spontane in vitro Die Immortalisierung menschlicher Körperzellen wurde bisher nur in Experimenten mit einzelnen menschlichen Spendern oder in Zellen von Patienten mit erblichen genetischen Erkrankungen beobachtet, die für Krebs prädisponieren [13], [14].

Aktivierte humane B-Lymphozyten zeigen eine starke Telomerase-Aktivität [3]–[6], die nicht nur mit der Erhaltung, sondern auch mit der Verlängerung der Telomere nach Aktivierung von B-Zellen in Keimzentren einhergeht [4]. Die Möglichkeit einer sehr langfristigen Proliferation oder Immortalisierung von normalen menschlichen B-Zellen in vitro wurde bisher nicht untersucht, mit Ausnahme von B-Zellen, die durch das humane onkogene Epstein-Barr-Virus (EBV) wachstumstransformiert wurden. Die EBV-Infektion normaler humaner B-Zellen führt im Allgemeinen zur Etablierung autonom proliferierender lymphoblastoider Zelllinien [15]. Dieser Prozess, der oft mehrdeutig als „EBV-Immortalisierung“ bezeichnet wird, produziert Zelllinien, die meist sterblich sind und eine geringe Telomeraseaktivität aufweisen [16], [17].

Alternativ können humane B-Lymphozyten aktiviert und zur Proliferation angeregt werden in vitro durch Auslösen ihres Oberflächenrezeptors CD40 in Gegenwart von Interleukin-4 [18], einer Kombination von Signalen, die die B-Zell-Aktivierung durch T-Helferzellen nachahmen. CD40-stimulierte B-Zellkulturen wurden verwendet, um die Differenzierung von B-Zellen zu Gedächtnis-B-Zellen oder Plasmazellen zu modellieren in vitro [19]. Ihr Potenzial, als antigenpräsentierende Zellen zu fungieren, um in vitro antigenspezifische T-Zellen für die autologe Immuntherapie zu generieren, wurde im Detail untersucht [20] [21]. Allerdings wurden in diesen Studien CD40/IL4-Rezeptor-gesteuerte B-Zellkulturen nicht länger als vier bis zehn Wochen gehalten [18] [20] [22]–[25]. Nach dieser Zeit starben die B-Zell-Kulturen anscheinend spontan aus [18] oder arreierten und differenzierten sich zu Plasmozyten [23]. Der Auslöser dieses Zelltods oder dieser Differenzierung und der Grund für die von verschiedenen Forschern berichteten Unterschiede in der Differenzierungskinetik und maximalen Kulturdauer von CD40-stimulierten B-Zellen wurden nicht identifiziert. Darüber hinaus wurde in Studien, die eine relativ langfristige Kultur von CD40-stimulierten B-Zellen (bis zu zehn Wochen) beschrieben, beobachtet, dass das vom Spender stammende Epstein-Barr-Virus (EBV) die Kulturen im Laufe der Zeit durchdringt [18] [20] , so dass die Frage offen bleibt, ob die Etablierung von strikt virusfreien CD40-stimulierten B-Zellkulturen mit normalen menschlichen erwachsenen Spendern möglich ist, die in der Regel positiv für EBV sind.

Hier beschreiben wir, dass CD40-stimulierte B-Zell-Kulturen sich bei Modifikation über einen erheblich längeren Zeitraum vermehren als zuvor berichtet wurde in vitro Stimulationsbedingungen angewendet werden. Wir legen Beweise dafür vor, dass solche sehr langfristigen B-Zellen von einer Mehrheit gesunder erwachsener Spender etabliert werden können, einen konstanten Phänotyp aufweisen, der für aktivierte B-Zellen repräsentativ ist, frei von EBV sind, abhängig von regelmäßig wiederholter CD40-Ligand/IL-4-Stimulation bleiben, und scheinen daher in vitro bedingt immortalisiert zu sein. Diese Ergebnisse legen nahe, dass ein Immortalisierungsprogramm, das einem differenzierten menschlichen Zelltyp, der B-Zelle, eigen ist, nur durch exogene Stimulation erreicht werden kann.


B-Lymphozyten verleihen Immuntoleranz über die Zelloberfläche GARP-TGF-β Komplex

3 Medizinische Fakultät, Medizinische Universität von South Carolina, Charleston, South Carolina, USA.

4 Institut für Immunologie, University of Pittsburgh, Pittsburgh, Pennsylvania, USA.

5 Erstes angegliedertes Krankenhaus, Medizinische Fakultät der Zhengzhou University, Zhengzhou, China.

Adressieren Sie die Korrespondenz an: Zihai Li oder Bei Liu, 86 Jonathan Lucas Street, Hollings Cancer Center, HO612B (Z. Li) oder HO612H (B. Liu), Charleston, South Carolina 29425, USA. Telefon: 843.792.1034 E-Mail: [email protected] (Z. Li). Telefon: 843.792.8994 E-Mail: [email protected] (B. Liu).

Artikel von Wallace, C. finden in: JCI | PubMed | Google Scholar

1 Institut für Mikrobiologie und Immunologie,

2 Klinik für Pathologie und Laboratoriumsmedizin und

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Artikel von Ansa-Addo, E. finden in: JCI | PubMed | Google Scholar

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Artikel von Metelli, A. finden in: JCI | PubMed | Google Scholar

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Artikel von Gilkeson, G. finden in: JCI | PubMed | Google Scholar

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Artikel von Shlomchik, M. finden in: JCI | PubMed | Google Scholar

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Artikel von Liu, B. finden in: JCI | PubMed | Google Scholar | />

1 Institut für Mikrobiologie und Immunologie,

2 Klinik für Pathologie und Laboratoriumsmedizin und

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Rolle von GARP-TGF-β auf B-Zellen bei der Immuntoleranz

Das Transmembranprotein GARP dient als Rezeptor für latentes TGF-β, was zur Aktivierung dieses Zytokins führt. GARP wird auf der Oberfläche von Tregs, Tumoren und Blutplättchen exprimiert und wurde mit der Krebsimmuninvasion in Verbindung gebracht. In dieser Episode enthüllen Zihai Li und Kollegen, dass der GARP-TGF-&beta-Komplex auf aktivierten, aber nicht ruhenden menschlichen und murinen B-Zellen vorhanden ist. Anhand mehrerer genetischer Mausmodelle stellten die Autoren fest, dass dieser Komplex für die Aufrechterhaltung der Immuntoleranz und die Vorbeugung von Autoimmunerkrankungen unerlässlich ist. Diese Ergebnisse unterstützen die weitere Erforschung von B-Zell-GARP als therapeutisches Ziel und mögliches diagnostisches Werkzeug.

GARP, ein an die Zelloberfläche andockender Rezeptor zur Bindung und Aktivierung von latentem TGF-β, wird von Blutplättchen und aktivierten Tregs stark exprimiert. Während GARP an der Immuninvasion bei Krebs beteiligt ist, sind die Rollen der GARP-TGF-β-Achse bei systemischen Autoimmunerkrankungen unbekannt. Obwohl B-Zellen zu Studienbeginn kein GARP exprimieren, fanden wir, dass der GARP-TGF-β-Komplex auf aktivierten menschlichen und Maus-B-Zellen durch Liganden für mehrere TLRs, einschließlich TLR4, TLR7 und TLR9, induziert wird. Die GARP-Überexpression auf B-Zellen hemmte deren Proliferation, induzierte einen IgA-Klassenwechsel und dämpfte die T-Zell-unabhängige Antikörperproduktion. Im Gegensatz dazu ist die B-Zell-spezifische Deletion des GARP-kodierenden Gens Lrrc32 bei Mäusen führte spontan zur Entwicklung systemischer Autoimmunerkrankungen sowie zur Verschlechterung der durch Pristan induzierten lupusähnlichen Erkrankung. Die kanonische TGF-β-Signalgebung reguliert GARP in Peyer-Patch-B-Zellen leichter hoch als in Milz-B-Zellen. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass B-Zellen für die Induktion der oralen Toleranz von T-Zell-abhängigen Antigenen über GARP erforderlich sind. Unsere Studien zeigen nach unserem Kenntnisstand zum ersten Mal, dass GARP-TGF-β auf der Zelloberfläche ein wichtiger Kontrollpunkt für die Regulierung der peripheren Toleranz von B-Zellen ist, was einen Mechanismus der Pathogenese von Autoimmunerkrankungen hervorhebt.

Glykoprotein A-Wiederholungen vorherrschend (GARP), kodiert durch das Gen Lrrc32, ist ein Transmembranprotein vom Typ 1, das als Andockrezeptor an der Zelloberfläche für den latenten transformierenden Wachstumsfaktor-β (LTGF-β) dient (1, 2). LTGF-β kommt auf der Oberfläche von Tregs und Thrombozyten im Überfluss vor, indem es an die extrazelluläre Region von GARP bindet (2 – 7). Mehrere Studien an Tregs haben gezeigt, dass GARP die TGF-β-Biogenese und die LTGF-β-Aktivierung fördert (8 – 10). Darüber hinaus wurde die GARP-Expression in Zellen mit erhöhter TGF-β-Aktivität beobachtet: hepatische Sternzellen (11), mesenchymale Stromazellen (12) und mehrere aggressive Krebsarten (13 – 15).

TGF-β ist ein Master-Zytokin zur Aufrechterhaltung der immunologischen Toleranz: Frühe Studien zeigten, dass TGF-β1-/–-Mäuse eine tödliche Multiorgan-Entzündungserkrankung mit einem hohen Anteil an Autoantikörpern, einschließlich antinuklearer Antikörper (ANA) entwickeln (16, 17). Die Biologie von TGF-β wurde umfassend charakterisiert, und das Molekül existiert in verschiedenen biochemischen Formen: aktives und frei lösliches TGF-β LTGF-β, gebildet von TGF-β, assoziiert mit Latenz-assoziiertem Peptid (LAP) LTGF-β im Komplex kovalent mit großen TGF-β-bindendes Protein (LTBP) und die Membranform von LTGF-β (mLTGF-β) in Verbindung mit GARP (18 – 20). Nur LAP-freier löslicher TGF-β, der sowohl durch integrin-abhängige als auch -unabhängige Mechanismen aktiviert wird, ist biologisch aktiv (21, 22).

Obwohl TGF-β sowohl über kanonische als auch nicht-kanonische Signalwege funktioniert, benötigen B-Zellen den kanonischen Weg für die TGF-β-induzierte Apoptose (23, 24). Die TGF-β-Signalgebung beginnt an der Zelloberfläche über Typ-I- und Typ-II-TGF-β-Rezeptoren, was zu einer stromabwärts gelegenen Smad2-Phosphorylierung führt (25).Während B-Zellen sowohl parakrinen als auch autokrinen TGF-β-Signalweg nutzen, legen frühere Studien nahe, dass die TGF-β-Regulierung der Apoptose in B-Zellen ein autokriner Mechanismus ist (24, 26). Es ist jedoch nicht klar, welche zellintrinsischen Mechanismen B-Zellen verwenden, um TGF-β-induzierte Apoptose selbst zu regulieren. Zusätzliche Rollen der TGF-β-Signalgebung in B-Zellen umfassen (a) Induktion der Klassenwechsel-Rekombination (CSR) von Ig zu IgA während der Differenzierung von reifen B-Zellen zu IgA-produzierenden Plasmazellen und (b) B-Zell-Regulierung durch zellautonome Produktion von TGF-β1 ( 27 – 29 ). Mit einem Cre-loxP haben Cazac und Roes gezeigt, dass Tgfbr2 –/– konventionelle B-Zellen hatten eine verkürzte Lebensdauer, während es zu einer Ausdehnung von . kam Tgfbr2 –/– peritoneale B-1-Zellen, B-Zell-Hyperplasie in Peyer-Plaques (PPs) und erhöhtes Serum-Ig. Bemerkenswerterweise hatten diese Mäuse einen schweren IgA-Mangel (30). Diese Arbeit beleuchtet die kritischen Funktionen von TGF-β in der B-Zellbiologie.

Sowohl zentrale als auch periphere Toleranzkontrollpunkte sind notwendig, um eine B-Zell-getriebene Autoimmunität zu verhindern ( 31 – 33 ). Jüngste Arbeiten zu GARP im Zusammenhang mit TGF-β haben versucht, die Rolle von GARP bei der Förderung einer tolerogenen Umgebung zu untersuchen (6, 34 – 36). Jedoch hat sich keine Studie mit der physiologischen Rolle von GARP bei der Toleranz in vivo befasst. Insbesondere die Rolle von GARP im Zusammenhang mit B-Zell-getriebenen Autoimmunerkrankungen ist unbekannt. In dieser Studie fanden wir, dass B-Zellen GARP auf der Zelloberfläche als Reaktion auf mehrere TLR-Liganden exprimieren. Wir untersuchten den Mechanismus der GARP-Induktion sowie die immunologische Relevanz von B-Zell-intrinsischer GARP in der Immuntoleranz mit Hilfe von Gain- und Loss-of-Function-Studien. Wir entdeckten zum ersten Mal unseres Wissens, dass die B-Zell-GARP-LTGF-β-Achse als wichtiger Immun-Checkpoint für die B-Zell-Toleranz und Prävention von Lupus-ähnlichen Autoimmunerkrankungen bei Mäusen dient.

Die TLR-Aktivierung sowohl von Maus- als auch von Human-B-Zellen induziert die Zelloberflächen-GARP- und LTGF-β-Expression. TLRs sind wichtige angeborene Immunrezeptoren, die pathogenassoziierte molekulare Muster erkennen und die Aktivierung von Immunantworten regulieren. Die Aktivierung von TLRs auf B-Zellen induziert direkt die B-Zell-Proliferation und verbessert die Antigenpräsentation, die Zytokinsekretion, die Plasmazelldifferenzierung, die CSR und die Gedächtnis-B-Zelldifferenzierung (37, 38). Frühere Forschungen haben umfassend einen signifikanten Zusammenhang zwischen erhöhter TLR-Aktivität und Autoimmunerkrankungen nachgewiesen ( 39 – 43 ).

Wir stellten die Hypothese auf, dass die TLR-Stimulation negative Regulationswege wie GARP-LTGF-β aktiviert, um eine B-Zell-Hyperaktivierung zu verhindern. Dazu wurden CD19 + B-Zellen aus WT-Mausmilzen isoliert und für 24–120 Stunden mit anti-μ-Antikörper (15 μg/ml) zur B-Zell-Rezeptor (BCR)-Stimulation oder verschiedenen TLR-Liganden kultiviert: LPS (TLR4-Ligand) , R848 (TLR7/8-Ligand) und CpG (TLR9-Ligand). Wir fanden, dass mehrere TLR-Liganden die Zelloberflächenexpression von GARP und LTGF-β stark induzierten, während die BCR-Stimulation nur eine mäßige GARP-Expression induzierte ( 1A ). Die Kinetik der GARP-Oberflächenexpression unterschied sich in Abhängigkeit von den verwendeten TLR-Liganden (Abbildung 1B). Die Hochregulierung von GARP wurde auch durch Immunoblot bestätigt ( 1C ). Interessanterweise fanden wir, dass die Ligation des MyD88-unabhängigen TLR3 keine Oberflächen-GARP-Expression induzierte, aber eine Kombination von IL-1β und Poly I:C im Vergleich zu GARP-KO B-Zellen als negative Kontrolle (Abbildung 1D). Die phänotypische Analyse von LPS-behandelten CD19 + B-Zellen der Milz zeigte, dass GARP + -Zellen größer (Anstieg von FSC und SSC) und stärker aktiviert waren als GARP – -Zellen, mit signifikant höheren Konzentrationen an CD86, CD80 und CD44. Die Konzentrationen von CD23 und PD-L1 waren ebenfalls signifikant erhöht, während keine Änderung als Reaktion auf LPS für die Expression von IgM, CD62L, MHC-Klasse II, CD1d und PD-1 beobachtet wurde ( 1E ).

Mehrere TLR-Liganden induzieren die GARP-Expression sowohl auf menschlichen als auch auf Maus-B-Zellen. Milz-B-Zellen wurden aus WT-Mausmilzen unter Verwendung von CD19 + -Magnetkügelchen isoliert. (EIN) Zellen wurden mit Maus-Anti-μ (15 μg/ml), LPS, R848 oder CpG 120 Stunden lang stimuliert. Durchflusszytometrie wurde in 24-Stunden-Intervallen verwendet, um die GARP + LAP + -Expression auf lebenden B-Zellen zu messen. Die Zahlen repräsentieren den Prozentsatz der Zellen im GARP + LAP + Quadranten über die gesamte CD19 + B-Zellpopulation. Flussdiagramme sind repräsentativ für 3 unabhängige Experimente. Ein repräsentatives Grundlinien-Flussdiagramm wird ebenfalls gezeigt. (B) Quantifizierung der GARP- und LAP-Expression (n = 4 biologische Replikate). MFI, mittlere Fluoreszenzintensität von GARP. Die statistische Analyse wurde durch 2-Wege-ANOVA durchgeführt ***P < 0,001. (C) Immunblot von GARP im Ganzzell-Lysat von unbehandelten (UT) WT B-Zellen oder nach Stimulation mit den angegebenen Bedingungen für 72 Stunden. Vertreter von 3 Immunoblots. (D) Primäre WT- und GARP-KO-Milz-B-Zellen wurden 72 Stunden lang mit LPS, Poly I:C oder IL-1β plus Poly I:C kultiviert. Die Zellen wurden auf GARP und LAP gefärbt und durch Durchflusszytometrie analysiert. Repräsentativ für 3 unabhängige Experimente. (E) Phänotypische Analyse von LPS-behandelten (48 Stunden) GARP – und GARP + B-Zellen mittels Durchflusszytometrie. Histogrammdiagramme sind repräsentativ für n = 3 biologische Wiederholungen und 2 unabhängige Experimente. Schwarze Linien bezeichnen GARP – Zellen, rote Linien bezeichnen GARP + Zellen, schattierte Bereiche bezeichnen den Isotyp. Die Zahlen repräsentieren die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI). (F) Humane B-Zellen wurden aus normalen Subjekten unter Verwendung von Human-Anti-CD19 + -Magnetkügelchen isoliert. Die Zellen wurden frisch analysiert oder 72 Stunden lang mit humanem Anti-&mgr;, R848 oder CpG kultiviert. GARP + LAP + -Spiegel wurden durch Durchflusszytometrie analysiert. Repräsentativ für 3 unabhängige Experimente. (g) Quantifizierung der GARP + LAP + Expression in 3 biologischen Replikaten von gesunden Spendern. Jeder Datenpunkt repräsentiert einen einzelnen Spender. Die statistische Analyse wurde von 2-tailed . durchgeführt T Prüfung (E) und 1-Weg-ANOVA mit Tukeys Mehrfachvergleichen (g) *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. Fehlerbalken repräsentieren SD.

Ähnlich wie murinen B-Zellen regulieren humane CD19 + B-Zellen GARP als Reaktion auf sowohl R848 (TLR7/8-Ligand) als auch CpG (TLR9-Ligand) hoch. Im Gegensatz zu Maus-B-Zellen führte die BCR-Stimulation jedoch auch zu einer Hochregulierung von Oberflächen-GARP und LAP auf menschlichen B-Zellen, wie kürzlich beschrieben wurde (44), wenn auch auf niedrigerem Niveau als die TLR-Signalgebung (Abbildung 1, F und G). Sowohl Maus- als auch Human-B-Zellen haben GARP als Reaktion auf TLR-Stimuli hochreguliert, aber es ist nicht bekannt, wie die TLR-induzierte GARP-Expression die B-Zell-Funktionen reguliert. Da GARP für die Oberflächenexpression und Aktivierung von LTGF-β notwendig ist (4, 5), legen unsere Ergebnisse nahe, dass die B-Zell-GARP-Expression als Reaktion auf die TLR-Aktivierung ein wichtiger negativer Kontrollpunkt für die B-Zell-Aktivierung sein kann (41).

Die GARP-Überexpression auf B-Lymphozyten reduziert die Proliferation, erhöht die IgA-CSR und schwächt die T-Zell-unabhängige Antikörperproduktion ab. Um die biologische Bedeutung der B-Zell-GARP-Expression zu verstehen, haben wir ein induzierbares Mausmodell erzeugt, um die GARP-Expression pharmakologisch zu kontrollieren (45). Wir klopften ein Tet-on trans-wirkendes Element zur Promotorregion des endogenen GARP-Gens, Lrrc32. Kreuzung von Lrrc32 TetOn Mäuse mit Rosa26 rtTA Mäuse erlaubten eine induzierbare GARP-Überexpression (OE) unter Verwendung von Doxycyclin (Abbildung 2A). Wenn die primäre Funktion von GARP in B-Zellen darin besteht, die TGF-β-Aktivierung und -Verfügbarkeit zu regulieren, dann wird angenommen, dass transgene OE von GARP IgA-CSR, B-Zell-Proliferation und Antikörper-Reaktionsfähigkeit verändert (27, 29).

Die GARP-Überexpression dämpft die B-Zell-Proliferation und verändert die Antikörperproduktion. rtTA GARP OE-Mäusen wurde Doxycyclin verabreicht, um die GARP-Expression breit zu induzieren. (EIN) Diagramm des Versuchsschemas. (B) Analyse von GARP und LAP auf WT- und GARP-OE-Milz-CD19-Bead-gereinigten B-Zellen unmittelbar ex vivo (UT) und nach 96-stündiger Behandlung mit anti-μ-Antikörper, LPS oder einer Kombination aus anti-μ-Antikörper, CD40L und LPS. Die Zahlen repräsentieren den Prozentsatz von B220 + GARP + -Zellen gegenüber der Gated CD19 + B-Zellpopulation. Flussdiagramme sind repräsentativ für n = 4 biologische Replikate. (C) WT- und OE-Milz-CD19 + -gereinigte B-Zellen wurden mit CFSE markiert und 3 Tage mit LPS kultiviert. Die CFSE-Verdünnung wurde durch Durchflusszytometrie in 24-Stunden-Intervallen gemessen. CD19 + gereinigte CFSE-markierte B-Zellen wurden auch mit WT-Nicht-B-Zell-Milzzellen für 72 Stunden kultiviert, und die CFSE-Verdünnung wurde durch Durchflusszytometrie bestimmt. Histogramme sind repräsentativ für 2 unabhängige Experimente. (D) Die Lebendzellzahl von 96-Stunden-stimulierten Zellen wurde durch Trypanblau-Ausschluss analysiert (n = 4). (E) Die Gesamt-IgA-Spiegel in den 96-Stunden-Überständen wurden durch ELISA gemessen (n = 4). (F) WT- und GARP-OE-Mäusen wurde Doxycyclin im Trinkwasser für 1 Woche vor der Immunisierung mit TNP-ficoll verabreicht, und dies wurde während des gesamten Experiments fortgesetzt. In den Seren der angegebenen Mäuse wurden TNP-spezifische IgM-Spiegel gemessen (n = 6 WT und n = 7 biologische Replikate von OE). Statistiken wurden durch 2-Wege-ANOVA durchgeführt *P < 0,05. (g) Milz- und Peyer-Pflaster CD19 + Bead-gereinigte B-Zellen wurden aus Doxycyclin-behandelten WT- und GARP-OE-Mäusen isoliert und sofort gefärbt und mittels Durchflusszytometrie auf intrazelluläre pSmad2/3-Spiegel untersucht (n = 3 biologische Replikate). Repräsentativ für 3 unabhängige Experimente. Histogramme zeigen pSmad2/3-Färbung grau schattierte Bereiche repräsentieren die Isotypkontrolle, schwarze Linien repräsentieren WT und grüne Linien repräsentieren OE. Alle statistischen Analysen wurden von 2-tailed . durchgeführt T testen, wenn nicht anders angegeben *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. Fehlerbalken repräsentieren SD.

CD19 Microbead-gereinigte Milz-B-Zellen von WT- oder GARP-OE-Mäusen wurden mit Anti-μ-Antikörper LPS oder einer Kombination aus Anti-μ-Antikörper, CD40L und LPS in Gegenwart von Doxycyclin stimuliert. Eine höhere GARP-Expression wurde auf GARP OE B220 + Milz-B-Zellen für mindestens 96 Stunden aufrechterhalten ( 2B ). In Übereinstimmung mit der Rolle von GARP bei der Aktivierung von TGF-β proliferierten GARP-OE-Zellen nach Stimulationen weniger als WT-Zellen, basierend auf der CFSE-Verdünnung und der Zellzahl (Abbildung 2, C und D). Der IgA-Spiegel war in GARP OE B-Zellkulturen unter allen Bedingungen signifikant erhöht, einschließlich der Behandlung mit Anti-μ-Antikörper allein (Abbildung 2E). Um die funktionelle Bedeutung von B-Zell-GARP in vivo weiter zu untersuchen, immunisierten wir WT- und GARP-OE-Mäuse mit einem T-Zell-unabhängigen Antigen, 2,4,6-Trinitrophenyl-AECM-ficoll (TNP-ficoll). In Übereinstimmung mit der bekannten TGF-β-induzierten Dämpfung der B-Zell-Reaktionsfähigkeit ( 46 ) fanden wir, dass GARP OE-Mäuse nach der Immunisierung eine Verringerung des TNP-spezifischen IgM-Spiegels aufwiesen (Abbildung 2F). Darüber hinaus haben wir den Phosphorylierungsstatus von Smad2 und Smad3 in der Milz und PP B-Zellen ex vivo bewertet und festgestellt, dass GARP OE B-Zellen einen signifikanten Anstieg der pSmad2/3-Spiegel aufwiesen ( 2G ). Zusammenfassend schlussfolgern wir, dass die GARP-Expression auf B-Zellen die Biologie der erhöhten TGF-β-Signalgebung getreu wiedergibt.

B-Zell-GARP schützt die periphere Toleranz und verhindert Autoimmunität. Unsere bisherigen Ergebnisse haben eine faszinierende Möglichkeit aufgezeigt, dass die B-Zell-GARP-LTGF-β-Achse als Kontrollpunkt dient, um TLR-vermittelte Autoimmunerkrankungen zu verhindern. Wir adressierten diese Hypothese genetisch anhand von Funktionsverluststudien in B-Zell-spezifischen GARP-KO-Mausmodellen. Bei Mäusen beides Cd19 und Lrrc32 befinden sich auf Chromosom 7, Region F ( 47 ), was die Verwendung von CD19-Cre als Treiber von Lrrc32 Löschen schwierig. Um dies zu überwinden, haben wir ein gemischtes Knochenmark-Chimäre-Modell (BM-Chimäre) generiert (Abbildung 3A). Wir haben zuerst entwickelt Rosa26 cre Lrrc32 f/f Mäuse und induzierte GARP-Deletion durch Behandlung der Mäuse mit Tamoxifen. Rosa26 WT Lrrc32 f/f Als Kontrolle dienten Mäuse. Letal bestrahlte WT CD45.1 C57BL6/J-Mäuse wurden im Verhältnis 1:1 mit gemischten Knochenmarkszellen von B-Zell-defizienten μMT-Mäusen und Tamoxifen-behandelten rekonstituiert Rosa26 cre Lrrc32 f/f oder Rosa26 WT Lrrc32 f/f Mäuse. In diesem Modell waren alle B-Zellen entweder GARP WT oder KO und mindestens 50% aller verbleibenden Immunzellen waren WT. Stabiles B-Zell-GARP KO wurde 3 Monate nach der Knochenmarkrekonstitution in 72-stündigen LPS-behandelten peripheren B-Zellen bestätigt (Abbildung 3B).

Mäuse mit GARP-defizienten B-Zellen entwickeln spontan eine Lupus-ähnliche Erkrankung. (EIN) Schema der Erzeugung von B-Zell-spezifischen Lrrc32-KO-Mäuse unter Verwendung einer gemischten Knochenmark-Chimäre (BM-Chimäre)-Strategie. (B) Bestätigung der wirksamen GARP KO in B-Zellen 3 Monate nach Knochenmarkrekonstitution. Mäusen wurde Blut entnommen und PBMCs wurden 72 Stunden lang mit LPS kultiviert, um die GARP-Expression zu induzieren. Die GARP- und LAP-Expression wurde durch Durchflusszytometrie analysiert. Stellvertretend für n = 5 biologische Replikate. (C) IgM-spezifische ANAs (1:80 Verdünnung) wurden 6 Monate nach Knochenmarkrekonstitution analysiert (n = 5 WT und n = 6 KO). (D) IgG-spezifische ANAs in den Seren wurden in den angegebenen Verdünnungen 6 Monate nach der Knochenmarkrekonstitution mit Hep-2-Objektträgern quantifiziert. Repräsentative Bilder werden angezeigt (n = 5 WT und n = 6 KO). Maßstabsbalken: 50 μm. (E und F) Fünf-μm-Nierenschnitte wurden mit Anti-IgM-FITC (E) und Anti-IgG-FITC (F) zum Nachweis von Ig-Ablagerungen in den Glomeruli. Quantifizierung und repräsentative Bilder werden angezeigt (n = 5 WT und n = 6 KO). Maßstabsbalken: 50 μm. (g) Gesamt-Ig in den Seren von Mäusen 3 Monate nach der Knochenmarkrekonstitution wurde durch ELISA gemessen (n = 15 WT und n = 16 KO). (h) IgM-, IgG1- und IgG2b-Spiegel in den Seren von Mäusen 3 Monate nach der Knochenmarkrekonstitution wurden durch ELISA gemessen. (ich) Gesamt-IgA aus den Seren von BM-Chimärenmäusen wurde durch ELISA gemessen. (J) Darmbakterien-spezifisches IgA wurde in den Seren von Mäusen 6 Monate nach Knochenmarkrekonstitution gemessen (n = 5 WT und n = 6 KO). Die statistische Analyse wurde durch 2-Wege-ANOVA durchgeführt *P < 0,05. (K) Durchflusszytometrie (n = 5). Alle Statistiken durchgeführt von 2-tailed T testen, sofern nicht anders angegeben *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. Fehlerbalken repräsentieren SD.

Die gemischten BM-chimären Mäuse wurden 6 Monate nach der Knochenmarkrekonstitution untersucht, und auffallend fanden wir Hinweise auf spontane Autoimmunität bei BM-chimären GARP-KO-Mäusen, einschließlich erhöhter ANA (Abbildung 3, C und D), IgM- und IgG-Ablagerung in den Glomeruli der Niere (Abbildung 3, E und F) und Hypergammaglobulinämie (Abbildung 3, G und H). Wir haben auch die bakterienspezifischen IgA-Spiegel im Serum als Index der Darmpermeabilität aufgrund des Verlusts der Darmtoleranz gemessen (48 – 50). Während es eine systemische Abnahme des Gesamt-IgA gab (Abbildung 3I), beobachteten wir, dass B-Zell-spezifische GARP-KO-Mäuse einen signifikanten Anstieg des IgA-Spiegels gegen Darmbakterien aufwiesen (Abbildung 3J).

Die Analyse der sekundären Immunkompartimente zeigte keinen Unterschied im CD19 + -Zellprozentsatz in der Milz, jedoch wiesen mesenteriale Lymphknoten (mLNs) der KO-Mäuse einen signifikanten Anstieg der CD19 + -Zellen auf ( 3K ). Im mlN und im Dünndarm wurde eine Zunahme hoch proliferativer B-Zellen beobachtet, die durch intrazelluläres Ki67 identifiziert wurde (Supplemental Figure 1C Supplemental Material online available with this article https://doi.org/10.1172/jci.insight.99863DS1). Die Beobachtung, dass der B-Zell-Prozentsatz und Ki67 + B-Zellen im Schleimhautkompartiment der GARP-KO-Mäuse erhöht waren, lässt auf eine In-vivo-B-Zell-Expansion schließen, was stark darauf hindeutet, dass B-Zell-intrinsisches GARP ein wichtiger negativer Kontrollpunkt für die B-Zell-Proliferation ist. Darüber hinaus beobachteten wir bei BM-Chimären-GARP-KO-Mäusen einen Anstieg der myeloischen Milzzellen (Ergänzende Abbildung 1A) sowie Tregs in der Milz, mlN, PP und Dünndarm-Lamina propria (Ergänzende Abbildung 1B), was möglicherweise einen kompensatorischen Mechanismus widerspiegelt um die Autoimmunität als Reaktion auf eine B-Zell-Hyperaktivierung zu kontrollieren (51, 52). Trotz der Veränderungen in Immunzellen gab es keinen Unterschied im systemischen Spiegel von aktivem oder Gesamt-TGF-β1 (Ergänzende Abbildung 1D). Wir kamen zu dem Schluss, dass die Löschung von Lrrc32 aus B-Zellen bei Mäusen führt trotz des kompensatorischen Anstiegs von Tregs zu einer spontanen Lupus-ähnlichen Erkrankung.

BM-Chimäre GARP-KO-Mäuse haben eine erhöhte Anfälligkeit für chemisch induzierten experimentellen Lupus. Mehrere spontane und genetische Mausmodelle des systemischen Lupus erythematodes (SLE) werden häufig verwendet, um die Pathogenese systemischer Autoimmunerkrankungen zu untersuchen (53). Wir untersuchten zunächst, ob GARP auf Immunzellen im Lupus-anfälligen NZM2410-Mausmodell anomal exprimiert wird. Ähnlich wie in Studien am Menschen haben frühere Experimente an zu Lupus neigenden Mäusen reduzierte TGF-β-Spiegel gezeigt, was das System für eine Immundysregulation und Autoantikörperproduktion prädisponiert (54, 55). Wir fanden, dass GARP auf CD19 + B-Zellen im Milzkompartiment von 24 Wochen alten NZM2410-Mäusen mit Lupus signifikant erhöht war, aber nicht bei jungen gesunden Mäusen (Ergänzende Abbildung 2A). Weitere Untersuchungen ergaben, dass die B-Zellpopulation der Randzone GARP am stärksten exprimierte, während Übergangs- (CD21 – CD23 – ) B-Zellen keine GARP- und LAP-Expression aufwiesen (Ergänzende Abbildung 2B).

Als nächstes forderten wir die gemischten BM-Chimären WT- und GARP-KO-Mäuse mit Pristan heraus, um experimentellen Lupus zu induzieren. Das Modell des Pristan-induzierten Lupus (PIL) rekapituliert den menschlichen SLE, da seine Pathogenese durch TLR-Hyperaktivierung und eine verstärkte Typ-I-IFN-Signatur vermittelt wird ( 56 ). WT- oder B-Zell-selektiven GARP-KO BM-Chimärenmäusen wurde eine Einzeldosis Pristan i.p. 3 Monate nach Knochenmarkrekonstitution. Wir beobachteten, dass GARP-KO-Mäuse IgG-ANAs entwickelten, die bereits 2 Wochen nach der Pristan-Injektion nach 3 Monaten erhöht blieben (Abbildung 4A). Andere Kennzeichen der Autoimmunität, wie Proteinurie (Abbildung 4B), IgG (Abbildung 4C) und IgM-Nierenablagerung (Abbildung 4D), waren bei KO-Mäusen im Vergleich zu WT-Mäusen deutlicher sichtbar. Chimäre BM-Mäuse auf einem C57BL6/J-Hintergrund entwickeln als Reaktion auf eine Pristan-Injektion kein Anti-dsDNA-Ig oder Anti-Chromatin-IgG (57). Ähnlich wie bei den Beobachtungen bei SLE-Patienten (58, 59) war bei GARP-KO-Mäusen mit erhöhter Schwere der Erkrankung aktiver TGF-&bgr;1, nicht Gesamt-TGF-&bgr;1 signifikant reduziert ( 4E ). Interessanterweise beobachteten wir eine erhöhte B-Zell-GARP-Expression in WT-Mäusen mit PIL, verglichen mit einer minimalen GARP-Expression zu Studienbeginn vor der Behandlung mit Pristan (Abbildung 4F). Wir fanden auch, dass BM-Chimäre GARP-KO-Mäuse im Vergleich zu WT-Mäusen eine erhöhte Lungenblutung und Immunzellinfiltration aufwiesen (Abbildung 4G), in Übereinstimmung mit der Vorstellung, dass C57BL6/J-Mäuse im PIL-Modell anfällig für pulmonale Alveolarblutungen sind (57). .

B-Zell-spezifisch Lrrc32-KO-Mäuse haben eine erhöhte Anfälligkeit für chemisch induzierten experimentellen Lupus. WT- und B-Zell-spezifische GARP-KO-Knochenmark-chimäre Mäuse wurden mit 500 &mgr;l Pristan i.p. 3 Monate nach Knochenmarkrekonstitution. Drei Monate nach der Pristan-Injektion wurden die Mäuse getötet und auf das Vorhandensein einer lupusähnlichen Signatur analysiert (n = 6 WT und n = 6 KO). (EIN) IgG-ANAs im Serum wurden 2 Wochen und 3 Monate nach Pristan-Injektion nachgewiesen. Serum wurde 1:80 für die 2-wöchige Analyse und 1:300 für die 3-Monats-Analyse verdünnt. (B) Die Proteinkonzentration im Urin wurde durch Bradford-Analyse vom Endpunkt (3 Monate nach Pristan) gemessen, wobei Urin 1:50 verdünnt wurde (n = 4 WT und n = 5 KO), da nicht von allen Mäusen Urin gewonnen wurde. (C und D) IgG (C) und IgM (D) wurde die Deposition in den Nieren quantifiziert. Repräsentative Bilder werden angezeigt (n = 4 WT und n = 5–6 KO). Maßstabsbalken: 50 μm. (E) Aktive und Gesamt-TGF-β1-Spiegel wurden in den Seren der Mäuse unter Verwendung von ELISA gemessen. (F) Die GARP- und LAP-Expression auf der Oberfläche peripherer B-Zellen in WT- und GARP-KO-Mäusen wurde zu Studienbeginn und 3 Monate nach der Behandlung mit Pristan quantifiziert und mittels Durchflusszytometrie analysiert. (g) Die Lungen von WT- und GARP-KO BM-Chimärenmäusen wurden mit 4% Paraformaldehyd perfundiert und 3 Monate nach Pristan-Injektion reseziert. Die Lungen wurden geschnitten und mit H&E gefärbt. Schwarze Pfeile weisen auf Infiltrat-Cluster von Immunzellen hin, die durch den Pathologie-Score quantifiziert werden. Jedes Bild ist repräsentativ für 1 Maus. Maßstabsbalken: 200 μm. Die statistische Analyse wurde von 2-tailed . durchgeführt T Prüfung *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. Fehlerbalken repräsentieren SD.

In dem Bemühen, die integrale Natur von B-Zell-spezifischer GARP bei der Dämpfung der frühen Autoimmuninduktion zu bestätigen, kreuzten wir hCD20-ER cre transgene Mäuse ( 60 ) mit Lrrc32 f/f Mäuse zu generieren hCD20-ER cre Lrrc32 f/f Mäuse. Mäuse wurden mit Tamoxifen behandelt, um GARP in B-Zellen zu deletieren, gefolgt von einer Injektion mit Pristine, um Lupus zu induzieren (Ergänzende Abbildung 3, A und B). Wir haben das gefunden hCD20-ER cre Lrrc32 f/f B-Zell-spezifische GARP-KO-Mäuse hatten im Vergleich zu WT-Mäusen bereits 2 Wochen nach der Pristan-Injektion einen signifikanten Anstieg der ANA (Ergänzende Abbildung 3, C und D). Zusammenfassend zeigten wir, dass die B-Zell-spezifische Deletion von GARP bei Mäusen sowohl spontanen als auch chemisch induzierten Lupus fördert und dass die GARP-Expression auf B-Zellen in Lupus-anfälligen Mäusen induziert wird.

Wenn GARP ein peripherer Kontrollpunkt zur Vorbeugung von Autoimmunerkrankungen ist, postulierten wir, dass GARP OE PIL bei Mäusen begrenzen würde. Tatsächlich fanden wir, dass die systemische OE von GARP die IgG ANA 1 Monat und 4 Monate nach der Pristan-Injektion reduzierte (ergänzende Abbildung 4A). Es gab auch eine mäßige Verringerung der glomerulären IgG-Ablagerung bei GARP-OE-Mäusen im Vergleich zu WT-Mäusen (ergänzende Abbildung 4B). Während GARP OE in diesem Modell nicht auf das B-Zell-Kompartiment beschränkt war, waren die B-Zellen bei der 4-Monats-Endpunktanalyse am stärksten verändert. In der Milz war der Prozentsatz der B-Zellen des Keimzentrums (GL7 + CD19 + ) ebenso wie der Prozentsatz der Ki67 + B-Zellen signifikant reduziert (ergänzende Abbildung 4C). Der Prozentsatz an Gr1 + CD11b + granulozytären Zellen war auch bei GARP OE-Mäusen signifikant verringert (ergänzende Abbildung 4D), im Gegensatz zu der Zunahme an granulozytären Zellen, die bei B-Zell-spezifischen GARP-KO BM-chimären Mäusen beobachtet wurde (ergänzende Abbildung 1A). In den PPs und mlNs (ergänzende Abbildung 4E) gab es Veränderungen in den CD4 + und CD8 + T-Zellkompartimenten. Aktives TGF-&bgr;1 war sowohl bei GARP WT- als auch bei OE-Mäusen nach Pristan-Behandlung signifikant reduziert, obwohl GARP OE-Mäuse einen signifikanten Anstieg des gesamten TGF-&bgr;1-Prä-PIL aufwiesen (ergänzende Abbildung 4F). Auffallenderweise hatten GARP OE-Mäuse einen Anstieg an löslichem GARP im Serum nach Pristan-Behandlung (Ergänzende Abbildung 4G), was mit der Förderung der Toleranz in Verbindung gebracht wurde (13, 34). Somit werden die Rollen von GARP-LTGF-β1 bei der Immuntoleranz und der systemischen Autoimmunität sowohl durch Funktionsverlust- als auch Funktionsgewinnstudien veranschaulicht.

PP-B-Zellen regulieren die periphere Toleranz über eine erhöhte Reaktionsfähigkeit auf die GARP-LTGF-β-Achse. B-Zellen (61, 62) sowie PPs (63) sind für die Schleimhauttoleranz sowohl gegenüber Selbst- als auch gegenüber oralen Antigenen erforderlich. Wir beobachteten, dass GARP OE B-Zellen aus dem PP einen erhöhten pSmad2/3 (Abbildung 2G) aufwiesen und B-Zell-spezifische GARP-KO-Mäuse einen signifikanten Anstieg der gesamten B-Zellen sowie Ki67 + B-Zellen in den mLNs, aber nicht in aufwiesen die Milz (Abbildung 3K und ergänzende Abbildung 1C). Diese Daten legten eine faszinierende Möglichkeit nahe, dass die GARP-LTGF-β-Achse eine strategisch wichtige Rolle für die Schleimhauttoleranz spielt. In Übereinstimmung mit dieser Hypothese fanden wir, dass WT-PP-B-Zellen erhöhte Spiegel von . exprimierten Lrrc32 Transkript an der Basislinie, verglichen mit Milz-WT B-Zellen (Fig. 5A). Im Einklang mit dem Anstieg der Lrrc32 Expressionsniveau reagierten PP-B-Zellen sowohl auf die BCR-Ligation als auch auf die TLR-Stimulation, indem sie GARP im Vergleich zu Milz-B-Zellen auf ein erhöhtes Niveau hochregulierten (Fig. 5B). 48 Stunden nach der Stimulation hatten Anti-μ-Antikörper und LPS-behandelte GARP-KO PP B-Zellen eine erhöhte Proliferation im Vergleich zu WT-Zellen (Abbildung 5C), was mit dem Befund übereinstimmt, dass GARP OE B-Zellen eine reduzierte Proliferation aufweisen. Der Befund, dass die IgA-Sekretion von 96-Stunden-LPS-behandelten PP B-Zellen in GARP-KO-Zellen reduziert war (Fig. 5D), stimmt auch mit einer reduzierten autokrinen TGF-β-Signalgebung überein.

Peyer-Patch-B-Zellen haben eine erhöhte Reaktionsfähigkeit auf die GARP-TGF-β-Achse. (EIN) qRT-PCR-Analyse von Lrrc32 mRNA-Eingang n = 3 biologische Replikate von CD19 + B-Zellen aus altersangepassten 4 Monate alten WT- und GARP-KO-Milzen und Peyer-Plaques. Relativer Ausdruck von Lrrc32 auf β-Aktin normalisierte Transkripte. Repräsentativ für 2 unabhängige Experimente. (B) WT Peyer-Pflaster und Milz-CD19 + -Zellen wurden für 24–96 Stunden in Gegenwart von Anti-μ oder LPS kultiviert. Der Prozentsatz von GARP + LAP + -Zellen gegenüber den gesamten CD19 + -Zellen zu jedem Zeitpunkt wird quantifiziert (n = 3 biologische Replikate und repräsentativ für 3 unabhängige Experimente). (C) Die Zellzahlen wurden nach 48 Stunden unter Verwendung von Trypanblau-Ausschluss gemessen (n = 3 biologische Replikate und repräsentativ für 2 unabhängige Experimente). (D) IgA-Spiegel aus 96-Stunden-Zellkultur von Peyer-Patch-B-Zell-Überständen wurde durch ELISA quantifiziert (n = 5 WT und n = 6 KO biologische Replikate kombiniert aus 2 unabhängigen Experimenten). (E) WT CD19 + -Zellen wurden aus Milz- und Peyer-Patch-Kompartimenten isoliert und auf die angegebenen Oberflächenmarker gefärbt (n = 4 Milz und n = 3 PP). Jeder Punkt in der Grafik repräsentiert ein einzelnes biologisches Replikat. MFI, mittlere Fluoreszenzintensität. (F) CD19 + B-Zellen aus Milz und Peyer-Pflastern wurden 96 Stunden lang mit anti-μ-Antikörper oder LPS behandelt. Die Smad2/3-Phosphorylierung wurde durch Durchflusszytometrie gemessen. Grafische Daten repräsentieren pSmad2/3 MFI von n = 3 biologische Replikate. (g) Repräsentatives Histogramm der pSmad2/3-Unterschiede zwischen WT- und KO-Peyer-Patch-B-Zellen (n = 3 biologische Replikate, die für 2 unabhängige Experimente repräsentativ sind). (h) CD19 + B-Zellen aus Peyer-Pflastern wurden serumverhungert und 1 Stunde lang mit TGF-β („β“) mit oder ohne TGF-βRI-Inhibitor („i“) behandelt. Die Smad2/3-Phosphorylierung wurde durch Durchflusszytometrie gemessen. Die Zahlen geben den MFI von pSmad2/3 an. Die Daten sind repräsentativ für 3 unabhängige Experimente. Die statistische Analyse wurde von 2-tailed . durchgeführt T Prüfung *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. Fehlerbalken repräsentieren SD.

Schleimhautgewebe sind stark mit aktivem TGF-β und assoziierten Cofaktoren (z. B. Retinsäure, BAFF und APRIL) angereichert, was erklärt, warum die IgA-CSR in den darmassoziierten lymphatischen Geweben im Vergleich zu anderen sekundären lymphatischen Organen ausgeprägter ist ( 64 ). Wichtig ist, dass Darm-B-Zellen TGF-β in einer autokrinen Weise produzieren (65, 66). Die phänotypische Analyse ergab Basislinienunterschiede zwischen WT-Milz- und PP-B-Zellen, einschließlich einer erhöhten CD1d-, MHC-Klasse-I-, MHC-Klasse-II-, CD40- und CD86-Expression in PP-B-Zellen (Abbildung 5E), was darauf hindeutet, dass die B-Zellen im PP-Kompartiment mehr sind bereit für Antworten auf Antigene als Milz-B-Zellen. Um die Veränderungen der Proliferation und der IgA-CSR in PP-B-Zellen mit der GARP-TGF-β-Achse in Verbindung zu bringen, bewerteten wir die pSmad2/3-Spiegel in WT- versus GARP-KO-B-Zellen, die 96 Stunden lang mit anti-μ-Antikörper oder LPS behandelt wurden, was zu hohe endogene GARP-Expression auf den WT-Zellen. Die Ex-vivo-Analyse von WT- und KO-Milz- und PP-B-Zellen zeigte, dass GARP-defiziente PP-B-Zellen eine signifikante Verringerung der pSmad2/3-Signalgebung zeigten (Abbildung 5, F und G), während Milz-B-Zellen diesen GARP-getriebenen Unterschied nicht aufwiesen . PP WT- und GARP-KO B-Zellen reagierten gleichermaßen auf exogenes TGF-β (Fig. 5H), was anzeigt, dass die TGF-β-Bioverfügbarkeit, nicht die TGF-β-Signalmaschinerie, durch die GARP-Expression beeinflusst wird.

Die tiefgreifende Wirkung der Zelloberfläche von GARP-TGF-β auf die PP-B-Zellbiologie wurde weiter in vivo in BM-Chimären-GARP-KO-Mäusen gezeigt. Die Deletion von GARP aus B-Zellen führte zu einer signifikant erhöhten Anzahl von PPs bei Mäusen ( 6A ). Eine höhere Anzahl von PPs korrelierte auch mit einer erhöhten PP-Zellularität ( 6B ) und einer erhöhten CD19 + B-Zell-Proliferation, gemessen durch Ki67 + -Färbung 6 Monate nach der Knochenmarkrekonstitution ( 6C ). Umgekehrt reduzierte GARP OE die Gesamtzahl der PPs (ergänzende Abbildung 5A), den Prozentsatz der B-Zellen (ergänzende Abbildung 5B) und das B-Zell-Ki67 + -Expressionsniveau (ergänzende Abbildung 5C). Als weiterer Beweis für den Verlust der B-Zell-Homöostase wurde beobachtet, dass die BM-Chimäre GARP-KO-Mäuse eine erhöhte Dünndarmlänge ( 6D ) sowie deutlich größere PPs ( 6E ) aufwiesen. Die fäkalen IgA-Spiegel (Abbildung 6F) und die Anzahl der IgA-produzierenden Zellen in den PPs (Abbildung 6G) waren bei GARP-KO-Mäusen im Vergleich zu WT-Mäusen merklich reduziert. Die erhöhte Reaktionsfähigkeit von PP-B-Zellen auf TGF-&bgr; wird durch einen signifikanten Anstieg der TGF-&bgr;RII-Expression im Vergleich zu Milz-B-Zellen erklärt (ergänzende Abbildung 5D). Während es keinen Unterschied im TGF-βRII-mRNA-Spiegel zwischen WT- und OE B-Zellen gibt, weisen GARP OE B-Zellen einen signifikanten Anstieg von p21 auf, das ein nachgeschaltetes Ziel im TGF-β-Signalweg ist (ergänzende Abbildung 5D).

B-Zell-spezifisch Lrrc32 –/– Mäuse haben Peyer-Patch-B-Zell-Hyperplasie und reduziertes Schleimhaut-IgA. Die Peyer-Pflaster wurden in 6 Monate alten BM-Chimärenmäusen analysiert. (EIN) Unterschiede in der Gesamtzahl der Peyer-Pflaster zwischen gleichaltrigen 6 Monate alten weiblichen WT- und KO-BMC-Mäusen (n = 5 WT und n = 6 KO biologische Replikate, die für 2 unabhängige Experimente repräsentativ sind). (B) Unterschiede in der Zellularität von Peyer-Patches zwischen WT- und KO-BMC-Mäusen (n = 5 WT und n = 6 KO biologische Replikate, die für 2 unabhängige Experimente repräsentativ sind). TNC, gesamte kernhaltige Zellen. (C) Durchflusszytometrie-Quantifizierung der Ki67-Expression in CD19 + -Zellen aus Peyer-Plaques von WT- und KO-Mäusen 6 Monate nach Knochenmarkrekonstitution (n = 3 Wiederholungen). Repräsentativ für 3 unabhängige Experimente. (D) Quantifizierung der gesamten Dünndarmlänge (Duodenum bis Ileum) bei WT- und KO-Mäusen 6 Monate nach Knochenmarkrekonstitution (n = 5 WT und n = 6 KO biologische Replikate). Repräsentativ für 2 unabhängige Experimente. (E) Repräsentative Bilder der Größenunterschiede zwischen Peyer-Plaques von GARP WT- und KO-Mäusen 6 Monate nach Knochenmarkrekonstitution (n = 5). Maßstabsleiste: 0,5 mm. (F) Fäkale IgA-Spiegel von WT- und GARP-KO BM-Chimärenmäusen 6 Monate nach der Knochenmarkrekonstitution wurden durch ELISA gemessen (n = 5 WT und n = 7 KO biologische Replikate). (g) IgA IHC auf frisch gefrorenen Peyer-Pflaster-Schnitten von WT- und KO-BM-Chimärenmäusen. Repräsentative Bilder von n = 3 biologische Replikate. Maßstabsbalken: 20 μm. Die statistische Analyse wurde von 2-tailed . durchgeführt T Prüfung *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. Fehlerbalken repräsentieren SD.

B-Zell-intrinsisches GARP ist für die orale Verträglichkeit unverzichtbar. Als nächstes befassten wir uns aus mehreren Gründen mit der Rolle von B-Zell-intrinsischem GARP bei der oralen Toleranz: erstens scheinen PP-B-Zellen empfindlicher auf die Regulation durch GARP zu reagieren, zweitens sind PPs für die orale Toleranz erforderlich ( 67 ) und drittens GARP-TGF -β-Achse auf B-Zellen ist für die Aufrechterhaltung der systemischen Toleranz erforderlich. Zu diesem Zweck verwendeten wir ein orales Toleranzmodell von Hühnerovalbumin (OVA) ( 7A ) ( 68 , 69 ), um zu bestimmen, ob die orale Toleranz durch GARP + B-Zellen bewirkt wird. Während BM-Chimären-WT-Mäuse vor der Immunisierung gegen hochdosierte orale OVA toleriert wurden, zeigten BM-Chimären-GARP-KO-Mäuse keine signifikante Abnahme der zunehmenden systemischen OVA-spezifischen Antikörperantwort, gemessen durch Anti-OVA-Antikörper (Abbildung 7B), und OVA-spezifische Antikörper bildende Zellen (AFCs) (Fig. 7C). In Übereinstimmung mit der Tatsache, dass OVA ein T-Zell-abhängiges Antigen ist, fanden wir, dass B-Zell-spezifische GARP-KO-Mäuse eine stark erhöhte Antigen-spezifische T-Zell-Reaktion zeigen. Wichtig ist, dass eine vorherige orale Verabreichung von Antigen die erhöhten T-Zell-Antworten in den KO-Mäusen nicht tolerierte ( 7D ). Die pathologische Analyse des proximalen Dünndarms zeigte ferner Hinweise auf einen Toleranzverlust bei den BM-Chimären GARP-KO-Mäusen ( 7E ). Wir schließen daraus, dass B-Zell-intrinsisches GARP eine wichtige Rolle bei der oralen Toleranz spielt.

B-Zell-intrinsisches GARP ist für die orale Verträglichkeit unverzichtbar. (EIN) Schematische Darstellung des oralen Toleranzmodells. Mäusen wurden 25 mg OVA über eine Sonde (toleriert) oder PBS (nicht toleriert) als Kontrolle verabreicht, wonach alle Mäuse 100 &mgr;g OVA emulgiert in 100 &mgr;l CFA s.c. Die Endpunktanalyse erfolgte am 21. Tag, als die Mäuse getötet wurden. (B) OVA-spezifisches IgG und IgM wurden in Mäuseseren durch ELISA nachgewiesen (n = 4–5 biologische Replikate). (C) Mononukleare Milzzellen wurden aus Mäusen durch mechanische Trennung gewonnen und dann 20 Stunden in OVA-beschichteten ELISPOT-Platten kultiviert, gefolgt von einem Nachweis mit Anti-Maus-IgG1 und -IgM. Quantitative Daten und repräsentative Well-Bilder werden gezeigt. (D) CD4 + T-Zellen wurden durch magnetische Bead-positive Selektion aus der Milz von WT- und KO-tolerisierten und nicht tolerierten Mäusen isoliert. CD4 + T-Zellen wurden im Verhältnis 1:1 mit bestrahlten WT-naiven Splenozyten in Gegenwart von OVA 4 Tage lang kultiviert. Keine Behandlung (NT) zeigt CD4 + -Zellen an, die ohne OVA kultiviert wurden. Die Überstände wurden gesammelt und die IL-6- und IFN-γ-Spiegel wurden durch ELISA gemessen. (E) Proximales (Duodenum) Dünndarmgewebe wurde fixiert und geschnitten, gefolgt von H&E-Färbung. Repräsentative Bilder zeigen Zwölffingerdarmzotten. Es wird eine grafische Analyse des Pathologie-Scores gezeigt, der von einem für die Behandlung blinden Pathologen analysiert wurde. Die statistische Analyse wurde von 2-tailed . durchgeführt T Prüfung (B und C) und 1-Weg-ANOVA mit Tukeys Mehrfachvergleichen (D und E) *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. Fehlerbalken repräsentieren SD.

TGF-β ist ein pleiotropes Zytokin mit entscheidenden Rollen bei der Entwicklung von Immunzellen, Homöostase und Toleranz (20). Allerdings bleiben viele Fragen offen, insbesondere im Zusammenhang mit der Regulierung über GARP. Unsere Studie befasst sich mit Zelloberflächen-TGF-β bei der peripheren Immuntoleranz, die aufgrund des fehlenden Verständnisses der molekularen Basis seiner Zelloberflächenexpression so lange dem Feld entgangen war. Kürzlich wurde die Expression eines Zelloberflächen-Andockrezeptors für TGF-β, GARP, auf Tregs (3, 4, 10), Blutplättchen (4, 7) und Krebszellen (13) beschrieben. Während wir die Rolle von GARP in der Immunität untersuchten, entdeckten wir, dass GARP auf peripheren B-Zellen bei systemischen Autoimmunerkrankungen signifikant hochreguliert wird und die GARP-Expression die Grundlage für die TGF-β-Präsenz auf der Zelloberfläche ist. Wichtig ist, dass wir festgestellt haben, dass mehrere MyD88-abhängige TLR-Liganden ( 70 ), einschließlich Liganden für TLR4, TLR7 und TLR9, die Oberflächen-GARP-Expression auf normalen B-Zellen antreiben, was eine faszinierende Möglichkeit aufwirft, dass die GARP-TGF-β-Achse auf aktivierten B-Zellen ist ein Kontrollpunkt für die Aufrechterhaltung der peripheren Toleranz von B-Zellen. Wir befassten uns kritisch mit dieser Hypothese unter Verwendung mehrerer genetischer Modelle, einschließlich GARP-bedingter KO- und OE-Systeme. Wir haben schlüssig gezeigt, dass (a) der Verlust von GARP aus B-Zellen spontane und chemisch induzierte lupusähnliche Erkrankungen bei Mäusen fördert (b) die Zunahme von GARP die T-Zell-unabhängige Antikörperproduktion und die B-Zell-Proliferation dämpft und gleichzeitig die IgA-CSR fördert (c) PP-B-Zellen sind insbesondere von der GARP-TGF-β-Achse abhängig, um die Proliferation, die IgA-Produktion und somit die Toleranz zu regulieren, und (d) GARP auf B-Zellen spielt eine unverzichtbare Rolle bei der oralen Toleranz von T-Zell-abhängigen Antigenen.

Mechanistisch gibt es mehrere mögliche Gründe, warum die B-Zell-intrinsische GARP-TGF-β-Achse für die periphere B-Zell-Toleranz wichtig ist. Erstens stellt die durch TLR-Liganden induzierte GARP-Expression sicher, dass die B-Zell-Aktivierung nicht über den autokrinen antiproliferativen Effekt von TGF-β außer Kontrolle gerät. Zweitens fördert GARP die IgA-CSR durch die Erhöhung der TGF-β-Aktivität, was durch eine kürzlich durchgeführte In-vitro-Studie (44) nahegelegt wurde und nun durch unsere Studie zur Schleimhaut-IgA-Produktion in vivo im Kontext von Autoimmunerkrankungen schlüssig gezeigt wird. Die Schleimhaut-IgA-Produktion spielt eine wichtige Rolle bei der Schleimhautabwehr gegen Krankheitserreger oder kommensale Bakterien, die zufällig die Darmepithelbarrieren überwinden ( 71 – 73 ). Drittens könnte die GARP-Expression auch die Fähigkeit von TLR-aktivierten B-Zellen hemmen, proinflammatorische Zytokine über einen TGF-β-abhängigen Mechanismus zu produzieren, ein Bereich, der in unserem Labor aktiv untersucht wird.

Eines der auffälligsten Ergebnisse unserer Arbeit ist, dass PP-B-Zellen für die Homöostase stärker von der GARP-TGF-β-Achse abhängig sind als Milz-B-Zellen. Ohne GARP erfahren PP-B-Zellen eine verstärkte Proliferation und Aktivierung, aber die Fähigkeit dieser B-Zellen, sich in IgA-produzierende Zellen zu differenzieren, ist beeinträchtigt. Diese Daten legen nahe, dass PPs kritische Organe für die B-Zell-Toleranz der Schleimhaut sind. PP-Lymphorgane befinden sich in einer prekären Lage, da sie über das Darmmikrobiom ständig unterschiedlichen Konzentrationen von TLR-Agonisten ausgesetzt sind (74). Es ist daher teleologisch sinnvoll, PP-B-Zellen mit robusteren peripheren Toleranzmechanismen wie der GARP-TGF-β-Achse auszustatten. Eine kürzlich durchgeführte umfassende Studie der klonalen Verteilung von B-Zellen beim Menschen ergab zwei breite klonale Netzwerke: eines umfasst Blut, Knochenmark, Milz und Lunge, und das andere beschränkt sich auf Gewebe im Magen-Darm-Trakt (75).Die Gruppe beobachtete, dass die Klone des GI-Trakts eine höhere Häufigkeit von somatischer Hypermutation aufweisen, was auf eine biologische Relevanz für die erhöhte Bedeutung von GARP im PP-Immunkompartiment hindeutet, um körpereigene und orale Antigene zu tolerieren. Weitere Belege für dieses Argument finden sich in einer GWAS-Studie aus dem Jahr 2016: C11orf30-LRRC32 Locus ist mit mehreren „immunbezogenen Phänotypen“ wie entzündlichen Darmerkrankungen und Allergien verbunden ( 76 – 78 ).

Es gibt eine erhöhte Expression von GARP auf B-Zellen in Mausmodellen von Lupus. Basierend auf der tolerogenen Rolle von B-Zell-GARP, die in unserer Studie entdeckt wurde, glauben wir, dass die GARP-Hochregulation im Autoimmun-Setting einen kompensatorischen Mechanismus darstellt, um B-Zellen zu normaler Homöostase zurückzuführen. Dies stimmt perfekt mit der Tatsache überein, dass die TLR-Signalgebung bei Lupus vorherrscht (79, 80), aber auch die GARP-Expression induziert. Diese Argumentation legt zwei wichtige zukünftige Untersuchungslinien nahe: Erstens, gibt es SLE-Patienten, die nicht in der Lage sind, GARP hochzuregulieren und dadurch schlimmere klinische Erkrankungen zu entwickeln? Zweitens, kann biologisch aktives lösliches GARP therapeutisch für Autoimmunerkrankungen eingesetzt werden? In Mauskrebsmodellen hat sich die Blockierung von GARP über Antikörper als vorteilhaft erwiesen (13, 36). Aufgrund der multifaktoriellen Funktionen von TGF-β ist es eine Herausforderung, TGF-β direkt in der Klinik anzuvisieren (81). Eine GARP-basierte therapeutische Strategie kann eine praktikablere Methode zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen in der Klinik sein, jedoch ist Vorsicht geboten, da ein Gleichgewicht zwischen Krebsimmunüberwachung und Immuntoleranz gefunden werden muss.

Trotz einer Reihe faszinierender Ergebnisse in der Studie bleiben viele Fragen im Zusammenhang mit B-Zell-GARP und Toleranz offen. NF-κB ist das gemeinsame Downstream-Molekül mehrerer MyD88-abhängiger TLR-Signalkaskaden (70). Es ist möglich, dass die TLR-Signalgebung die GARP-Expression über NF-κB induziert, wie durch das Vorhandensein einer mutmaßlichen NF-κB-Bindungsstelle in der Promotorregion von Lrrc32 ( 82 ). Es sind jedoch weitere Studien erforderlich, um zu klären, wie GARP durch TLR-Pfade reguliert wird. Es ist bekannt, dass GARP an TGF-β1, TGF-β2 und TGF-β3 bindet (45). Es gibt Hinweise darauf, dass ruhende B-Zellen höhere Mengen an TGF-β3 exprimieren als aktivierte B-Zellen und in der Lage sind, Treg-Populationen in einem TGF-β3-abhängigen Mechanismus zu vergrößern (83). GARP wird jedoch nicht von ruhenden B-Zellen exprimiert, was zu der Annahme führt, dass GARP in erster Linie die Bioverfügbarkeit von TGF-β1- und TGF-β2-Isoformen reguliert und nicht TGF-β3, um seine regulatorischen Rollen in B-Zellen auszuüben. Darüber hinaus konzentrierte sich diese Arbeit auf die periphere Toleranz, nicht auf die zentrale B-Zell-Toleranz, hauptsächlich weil GARP nicht auf unreifen B-Zellen im Knochenmark gefunden wurde. Angesichts der zentralen Rolle von TGF-β bei der negativen Selektion von B-Zellen im Knochenmark ( 84 ) kann die Rolle von GARP in diesem Prozess jedoch nicht vollständig ausgeschlossen werden. Schließlich konzentrierte sich diese Studie auf die B-Zell-intrinsische Rolle von GARP bei der Regulierung der Toleranz, jedoch können B-Zellen auch die Toleranz durch Interaktion mit T-Zellen regulieren. Zum Beispiel sind LPS-geprimte B-Zellen weniger potente Stimulatoren von CD8 + T-Zellen als Anti-Ig/Anti-CD40-stimulierte B-Zellen, was auch einen TGF-β1-abhängigen Mechanismus veranschaulicht ( 85 ).

Dies ist die erste Studie unseres Wissens, die zeigt, dass die GARP-TGF-β-Achse der Zelloberfläche die systemische Toleranz auf eine B-Zell-intrinsische Weise über autokrinen TGF-β-Signalweg moduliert. Wir kamen zu unserer Schlussfolgerung durch mehrere genetische Strategien. Wir gehen davon aus, dass diese Studie ein Ausgangspunkt für weitere Untersuchungen zur Rolle von GARP in der Pathogenese menschlicher Autoimmunerkrankungen sowie der Möglichkeit sein wird, GARP als neuartige diagnostische und therapeutische Strategie für Autoimmunerkrankungen einzusetzen.

Mäuse. Wir entwickelten ein induzierbares GARP-OE-Mausmodell unter Verwendung des „Flexible Accelerated STOP TetO-Knockin-Systems“ (Ingenious Targeting Laboratory) ( 86 ). Die Entwicklung des GARP-FAST-Mausmodells wurde zuvor beschrieben (45). GARP OE wurde mit Doxycyclin (50 µg/ml MilliporeSigma) in 1% Saccharose-Trinkwasser induziert. Lrrc32 flox/flox Mäuse wurden von Riken ( 9 ) erhalten und gekreuzt mit Rosa26-ER cre-Mäuse (The Jackson Laboratory), um Tamoxifen-induzierte Ganzkörper-GARP-KO-Mäuse zu erzeugen. hCD20-ER cre Lrrc32 f/f Mäuse wurden durch Kreuzung erzeugt hCD20-ER cre Mäuse, die zuvor beschrieben wurden ( 60 ), mit Lrrc32 f/f Mäuse. Die Induktion von GARP KO wurde bei beiden Modellen mit i.p. Injektion von Tamoxifen (MilliporeSigma), gelöst in Erdnussöl. Mäuse erhielten 7 Tage lang täglich eine Dosis von 5 µg/g Körpergewicht. C57BL6/J- und µMT-Mäuse wurden von The Jackson Laboratory gekauft. NZM2410-Mäuse waren ein Geschenk von Gary Gilkeson (Medical University of South Carolina [MUSC]). B-Zell-spezifische Knochenmarkchimäre-Mäuse wurden durch tödliche Bestrahlung (2 Dosen von 550 Gy im Abstand von 6 Stunden) weiblicher CD45.1 C57BL6/J-Mäuse erzeugt. 24 Stunden nach der tödlichen Bestrahlung wurden die Mäuse i.v. mit 2 × 10 6 Knochenmarkzellen aus μMT injiziert und mit Tamoxifen behandelt Rosa26 cre Lrrc32 f/f oder Rosa26 WT Lrrc32 f/f Mäuse im Verhältnis 1:1 gemischt. Alle Mäuse, außer dem Stamm NZM2410, wiesen einen reinen C57BL6/J-Hintergrund auf und wurden für die Experimente altersangepasst. Sofern nicht anders angegeben, waren die Mäuse für die Experimente zwischen 6 Wochen und 6 Monaten alt. Für alle Lupus- und Toleranzexperimente wurden weibliche Mäuse verwendet, da bei männlichen Mäusen nur eine geringe Autoimmunitätsrate beobachtet wurde.

Menschliche Proben. Deidentifizierte Vollblutproben von gesunden Kontrollen wurden vom multidisziplinären klinischen Forschungszentrum MUSC in heparinbeschichteten Röhrchen erhalten. Lymphozyten aus peripherem Blut wurden unter Verwendung eines Ficoll-Paque PLUS-Gradienten (GE Healthcare) isoliert.

Zellkultur. Um gereinigte Maus-B-Zellen zu erhalten, wurden Milz und PPs aseptisch isoliert und durch einen 40-μM-Filter zerdrückt, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten, und mit ACK-Puffer (MilliporeSigma) behandelt, um RBC zu lysieren. Maus-B-Zellen wurden aus Splenozyten oder PP-Lymphozyten unter Verwendung von Maus-CD19 + -Magnetperlen nach dem Protokoll des Herstellers (Miltenyi Biotec) isoliert. Humane CD19 + Magnetkügelchen (Miltenyi Biotec) wurden verwendet, um B-Zellen aus humanen PBMCs zu isolieren. In allen Experimenten wurden die Zellen in RPMI (Corning) kultiviert, das mit 10 % FBS (Atlas Biologicals), 1 % Penicillin/Streptomycin (ThermoFisher) und 0,1 % 2-Mercaptoethanol (MilliporeSigma) ergänzt war. Maus-B-Zellen wurden mit Anti-μ (5 μg/ml, sofern nicht anders angegeben Jackson ImmunoResearch), LPS (10 μg/ml .) behandelt E. coli 055:B5, MilliporeSigma), R848 (2,5 µg/ml InvivoGen) oder CpG (1 µM, BW-006 InvivoGen). In Experimenten mit exogener TGF-β-Behandlung und TGF-βRI-Hemmung wurden Zellen vor der Zugabe von 2 ng/ml TGFβ1 (PeproTech) 1 Stunde lang mit TGF-βRI-Inhibitor, gelöst in DMSO (SB 431542 Hydrat, MilliporeSigma), behandelt.

Lupusinduktion und Autoimmunanalyse. Weiblichen BM-Chimären oder Doxycyclin-behandelten GARP OE-Mäusen wurde eine einzelne i.p. Injektion von Pristan (500 μl/20 g Maus MilliporeSigma). GARP OE und WT Wurfgeschwister wurden während des gesamten Versuchs mit Doxycyclin (50 µg/ml) im Trinkwasser gefüttert.

ANA. ANAs wurden unter Verwendung von NOVA Lite Hep-2-Objektträgern (Inova Diagnostics) und FITC-konjugierten Anti-Maus-IgG- oder Anti-Maus-IgM-Antikörpern (ThermoFisher) nachgewiesen. Serum wurde in den angegebenen Verhältnissen in PBS verdünnt. Die Fluoreszenzintensität wurde verblindet analysiert und auf einer Skala von 0–4 auf einem Zeiss-Mikroskop aufgezeichnet, wie zuvor beschrieben (87).

Immunablagerung. Die Immunablagerung in den Nieren wurde unter Verwendung von frisch gefrorenen Nierenschnitten, eingebettet in Cryomatrix-Lösung (ThermoFisher), analysiert. Die Objektträger wurden in eiskaltem Aceton fixiert und dann über Nacht unter Verwendung des M.O.M. Bausatz (Vector Labs). Die Objektträger wurden entweder mit IgM-FITC- oder IgG-FITC-Antikörpern (ThermoFisher) für 30 Minuten bei Raumtemperatur gefärbt und dann mit einem Eindeckmedium gegen Verblassen (Southern Biotech) eingedeckt. Die Fluoreszenzintensität von 25 nicht überlappenden Glomeruli wurde gemittelt, um den Nierenablagerungs-Score wie zuvor beschrieben zu erhalten (88).

Urin Protein. Urin wurde von den Mäusen am 3-Monats-Endpunkt gesammelt. Die Proteinkonzentration wurde mit einem Bradford-Assay (Bio-Rad) unter Verwendung von 1:50 in PBS verdünntem Urin und einer BSA-Standardkurve gemessen.

Histologie. Mäuselungen wurden vor der Resektion mit 10 % Formalin perfundiert und in 4 % Formalin fixiert. Fixierte Lungen wurden in Paraffin eingebettet, geschnitten und nach einem Standard-H&E-Färbeprotokoll gefärbt.

Durchflusszytometrie. Milzen, mlNs und PPs wurden in eine Einzelzellsuspension dissoziiert, und Milzzellen wurden mit RBC-Lysepuffer (MilliporeSigma) von Erythrozyten abgereichert. Nach dem Blockieren des Fc-Rezeptors wurden die Zellen in FACS-Puffer auf Oberflächenmarker gefärbt. Antikörper gegen Maus-CD4 (Klon RM4-5), FoxP3 (FJK-16), CD11b (M1/70), GARP (YGIC86), LAP (TW7-16B4), IgD (11 - 26), IgM (eb121-15F9) , CD23 (B3B4), CD86 (GL1), MHC-I (SF-1.1.1), MHC-II (M5/114.15.2), CD44 (IM7), CD62L (MEL-14), PD-L1 (B7 -H1), CD1d (L363), Helios (22F6) und CD5 (53–7.3) wurden von ThermoFisher bezogen. Anti-Maus CD8a (53-6,7), Gr1 (RB6-8C5), CD21 (7G6), CD80 (16-10A1), PD-1 (J43), Ki67 (SolA15) und pSmad (O72-670) wurden gekauft von BD Biosciences. Anti-Maus-B220 (RA3-6B2), CD19 (6D5) und GL7 wurden von BioLegend bezogen. Alle intrazellulären Färbungen wurden unter Verwendung des kommerziellen FoxP3/Transcription Factor Staining Buffer Set (Affymetrix) durchgeführt. Die Analyse von pSmad2/3 wurde unter Verwendung von BD Phosflow-Puffersets gemäß dem Protokoll des Herstellers (BD) durchgeführt. Die Proben wurden auf einem BD LSR-Zytometer analysiert und von FlowJo Software (Tree Star) analysiert. Die Lebensfähigkeit der analysierten Zellen wurde durch Gating auf Singuletts und lebende Zellen sichergestellt, wie durch das Fehlen von 7-AAD oder Fixable Viability Dye (Affymetrix) angezeigt.

TNP-Ficoll-Immunisierung. Doxycyclin-behandelten WT- und GARP-OE-Mäusen wurde zu Beginn über die Gesichtsvene Blut entnommen, um Serum zu sammeln, und mit TNP-AECM-Ficoll (50 μg/ml in PBS Biosearch Technologies) immunisiert, das in die Peritonealhöhle injiziert wurde. Den Mäusen wurde 5 Wochen lang wöchentlich Blut entnommen. TNP-ficoll-spezifische IgM-Antikörperspiegel wurden durch ELISA nachgewiesen. ELISA-Platten (Corning) wurden über Nacht bei 4°C mit TNP-Ficoll (50 μg/ml in PBS) beschichtet, gefolgt von einer Blockierung mit 1% BSA für 3 Stunden. Verdünntes Serum wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur unter Schütteln inkubiert. TNP-spezifische IgM-Antikörper wurden mit Anti-Maus-IgM-HRP (Southern Biotech) nachgewiesen.

Modell der oralen Toleranz. Fünf Monate alte rekonstituierte weibliche Knochenmarkchimäre WT- und GARP-KO-Mäuse wurden entweder mit 25 mg OVA-Peptid (MilliporeSigma) oder PBS als Kontrolle über eine orale Sonde gefüttert. Sieben Tage später erhielten sowohl OVA- als auch PBS-behandelte Mäuse 100 &mgr;g OVA-Peptid (BioVendor), emulgiert in 100 &mgr;l komplettem Freundschem Adjuvans (InvivoGen) s.c. Mäuse wurden 14 Tage nach s.c. Immunisierung. Serum wurde für den OVA-spezifischen IgM- und IgG-ELISA sowie Splenozyten für den ELISPOT- und OVA-induzierten CD4 + T-Zell-Zytokin-Produktionsassay gesammelt.

ELISPOT. Milzen von tolerierten (OVA-Schlundsonde und OVA-CFA s.c.-Immunisierung) und nicht tolerierten (PBS-Schlundsonde und OVA-CFA s.c.-Immunisierung) WT- und GARP-KO BM-Chimärenmäusen wurden in eine Einzelzellsuspension zerdrückt. Die Zellen wurden mit 1 × 10 6 Zellen/Vertiefung in Immobilon-P (Millipore)-Platten mit hoher Proteinbindung ausplattiert, die mit 30% Ethanol aktiviert und über Nacht mit 100 &mgr;g/ml OVA vorbeschichtet wurden. Splenozyten von jeder Maus wurden dreifach kultiviert und 20 Stunden bei 37ºC inkubiert. Die Platten wurden dreimal mit PBS gewaschen, gefolgt von dreimaligem Waschen mit PBS mit 0,5% Tween-20, dann wurden entweder Anti-Maus-IgG1-HRP- oder Anti-Maus-IgM-HRP-Nachweis-Antikörper für 2 Stunden zugegeben. Nach weiteren Waschungen wurde AECM-Substrat (MilliporeSigma) zugegeben und die Reaktion nach der Farbentwicklung mit destilliertem Wasser gestoppt. Bilder und Quantifizierung wurden mit dem AID EliSpot Reader System ELR04 (Autoimmun Diagnostika GmbH) durchgeführt.

OVA-induzierter CD4 + T-Zell-Zytokin-Produktionsassay. CD4 + -T-Zellen wurden aus RBC-abgereicherten Splenozyten unter Verwendung von Anti-Maus-CD4 + -MACS-Kügelchen (Miltenyi Biotech) isoliert. Gereinigte CD4 + T-Zellen von tolerierten und nicht tolerierten WT- und GARP-KO-Mäusen wurden im Verhältnis 1:1 mit WT-bestrahlten unbehandelten Splenozyten kultiviert, die eine Quelle antigenpräsentierender Zellen darstellten. 100 &mgr;g/ml OVA-Peptid wurden in jede Vertiefung gegeben und die Zellen wurden 96 Stunden bei 37 °C inkubiert. Die Überstände wurden gesammelt und durch ELISA auf IL-6 und IFN-γ analysiert.

ELISA. Zur Messung von aktivem und Gesamt-TGF-β1 sowohl in Zellkulturüberständen als auch im Serum wurden ELISA-Platten (Corning) über Nacht bei 4 °C mit Anti-Maus/humanem TGF-β1-Einfangantikörper (BioLegend) beschichtet, gefolgt von einer Blockierung mit 1% BSA 1 Stunde bei Raumtemperatur. Proben wurden 10 Minuten mit HCl behandelt und mit Tris/NaOH neutralisiert, um Gesamt-TGF-β zu erhalten. Sowohl aktives als auch Gesamt-TGF-β1 wurden unter Verwendung von Anti-Maus-Biotin-TGF-β-Antikörper (BioLegend), Streptavidin-HRP (BioLegend) und TMB-Substratreagenzien (BD) nachgewiesen. Um lösliches GARP in Maus- und Humanserum nachzuweisen, wurde ein Human/Maus-GARP-ELISA-Kit gemäß dem Protokoll des Herstellers (BioLegend) verwendet. Immunglobulinspiegel wurden sowohl im Serum als auch im Zellkulturüberstand unter Verwendung eines Maus-Antikörper-Isotyp-Kits (Southern Biotech) nachgewiesen. Nach der Beschichtung der Platten über Nacht wurden die Platten mit 1% BSA für 3 Stunden blockiert, gefolgt von dem oben beschriebenen Standard-ELISA-Verfahren. Um den IgA-Spiegel in Fäkalien zu bestimmen, wurden Fäkalienpellets gesammelt und gewogen. Pro mg Kot wurden 10 µl 1% BSA in PBS mit Protease-Inhibitor-Cocktail (MilliporeSigma) zugegeben und homogenisiert. Nach der Zentrifugation wurde der fäkale Überstand in einer Verdünnung von 1:1000 zu der blockierten ELISA-Platte hinzugefügt. Zum Nachweis von bakterienspezifischem IgA in den Seren wurde ein Fäkalüberstand von µMT-Mäusen nach der oben beschriebenen Methode hergestellt und die Proteinkonzentration mittels Bradford-Assay (Bio-Rad) gemessen. Jede Vertiefung der ELISA-Platte wurde mit 0,5 µg/ml µMT fäkalem Überstand beschichtet. IL-6- und IFN-γ-ELISAs wurden gemäß Herstellerprotokoll (BD) durchgeführt.

qRT-PCR und Immunoblot. RNA wurde aus gereinigten Milz- und PP-B-Zellen unter Verwendung von Trizol-Reagenz gemäß dem Protokoll des Herstellers (Life Technologies) isoliert. cDNA wurde nach den Anweisungen des Herstellers mit dem iScript cDNA-Synthese-Kit (Bio-Rad) hergestellt. Die Primersequenzen waren wie folgt: Maus-GARP vorwärts 5′-CGCTTCGTCACCTGGATTTA-3′, Maus-GARP rückwärts 5′-ATTGTGGGCCAGGTTAAGG-3′, Maus-β-Aktin vorwärts 5′-AGCTGAGAGGGAAATCGTGC-3′ und Maus-β-Aktin rückwärts 5′- TCCAGGAGGAAGAGGATGC-3′. qRT-PCR wurde auf einem StepOne Plus-Gerät (Applied BioSystems) durchgeführt. Für die Immunoblot-Analyse wurde Zelllysat unter Verwendung von RIPA-Puffer, ergänzt mit einem Protease-Inhibitor-Cocktail (MilliporeSigma), hergestellt. 75 ug Lysat wurden auf einer 10% SDS-PAGE laufen gelassen. Nach dem Transfer auf eine PVDF-Membran (Millipore) wurde GARP mit einem Anti-Maus-GARP-Antikörper (R&D Systems) sondiert und auf β-Aktin (MilliporeSigma) normalisiert.

Immunhistochemie. Dünndarmschnitte mit PPs wurden in Cryomatrix-Gefriermedium eingebettet und schockgefroren. Fünf-μm-Schnitte wurden geschnitten und mit eiskaltem Aceton fixiert, gefolgt von Blockieren und Inkubieren mit IgA-HRP (Southern Biotech). Die Farbe wurde unter Verwendung des DAB Peroxidase Developing Kit (Vector Laboratories) nachgewiesen. Die Bilder wurden auf einem Olympus-Mikroskop aufgenommen.

Statistiken. Die Datenanalyse wurde unter Verwendung der GraphPad Prism-Software (GraphPad Software Inc.) durchgeführt. Die Analysen wurden mit ungepaarten 2-tailed . durchgeführt T Test oder Mann-Whitney für nichtparametrische Daten oder ANOVA, wie angegeben. Für Analysen mit Mehrfachvergleichen wurde eine Einweg-ANOVA mit Tukey-Vergleich verwendet. P Werte von weniger als 0,05 wurden als signifikant angesehen.

Zulassung zum Studium. Gesunde Kontrollpersonen gaben ihr Einverständnis zur Entnahme von peripheren Blutproben durch das multidisziplinäre klinische Forschungszentrum für rheumatische Erkrankungen am MUSC. Das MUSC IRB genehmigte die Protokolle für diese Studien (Pro00021985 und Pro27985), und das Projekt wurde gemäß der Deklaration von Helsinki durchgeführt. Alle Tierverfahren in dieser Studie wurden nach einem vom MUSC Institutional Animal Care and Use Committee genehmigten Protokoll durchgeführt. Die Tiere wurden unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen gehalten.

ZL hat das Projekt betreut. CHW, BL und ZL haben die Experimente entworfen. CHW und BXW führten die Experimente durch. SS führte den größten Teil der histologischen Analyse durch. GG erleichterte die Beschaffung klinischer Proben. MJS stellte Mäuse zur Verfügung. Alle Autoren, einschließlich MS, EAAA und AM, trugen zur Datenanalyse bei und halfen bei der Manuskripterstellung.

Dieses Projekt wurde durch mehrere Zuschüsse von der NIH unterstützt: UL1TR001450 und TL1TR001451 (an CHW) R01AI077283 (an ZL) R01CA213290 (an ZL) R01CA188419 und P01CA186866 (an ZL) R01CA193939 (an BL) und U01AI125859 (an BL). Es wurde auch teilweise von der Cell Evaluation & Therapy Shared Resource, dem Hollings Cancer Center, MUSC (P30CA138313) und der Abteilung für Rheumatologie und Immunologie des Multidisziplinären Klinischen Forschungszentrums (NIH/National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases) unterstützt ) und P60AR062755 (an GG). Wir danken Wei Jiang (MUSC) für den Einsatz des AID ELISPOT-Readers in ihrem Labor. Die Autoren danken den ehemaligen und gegenwärtigen Mitgliedern des Li-Labors für anregende Diskussionen während der gesamten Studie.

Interessenkonflikt: Die Autoren haben erklärt, dass kein Interessenkonflikt besteht.


Diskussion

Die Prävention von Pneumokokken-Erkrankungen bei splenektomierten/asplenischen Kindern und Erwachsenen hat medizinische Priorität. Eine gründliche Untersuchung zur Optimierung des Einsatzes des Polysaccharids und/oder des konjugierten Impfstoffs bei Asplenie-Patienten steht noch aus. Tatsächlich umfassen die Leitlinien häufig Aspleniepatienten in einer breiteren Kategorie von immungeschwächten und immunsupprimierten Personen mit einem höheren Risiko für Pneumokokkeninfektionen 17, 19 . Das am häufigsten verwendete immunologische Korrelat zur Bewertung der Immunogenität von Impfstoffen ist der Spiegel an zirkulierendem IgG, das für ein bestimmtes Antigen spezifisch ist. Die Weltgesundheitsorganisation hat einen mutmaßlichen Schwellenwert von ≥ 0,35 µg/ml IgG gegen PnPS als Korrelat des Schutzes nach Konjugat-Impfung empfohlen 24 . Die ersten Empfehlungen der CDC zur Impfung bei Asplenikern aus dem Jahr 1997 beruhen auf der Beobachtung, dass die Antikörperspiegel, die bei dieser Patientengruppe durch die PnPS-Impfung induziert werden, mit denen gesunder Personen vergleichbar sind 25 . Andere Studien haben diese Ergebnisse unterstützt 26, 27 . Einige Autoren haben jedoch gezeigt, dass die Reaktion auf die PnPS-Impfung bei Asplenie-Individuen reduziert sein oder fehlen kann 28-30 , und dass Antikörpertiter schneller abfallen können als bei gesunden Individuen 31, 32 . Somit wurde die Empfehlung zur Wiederholungsimpfung 5 Jahre nach der ersten Dosis formuliert 16 . Pneumokokken-Konjugatimpfstoffe sind bei Asplenie-Individuen immunogen 33, 34, und neuere Richtlinien 16, 19, 35 schließen PCV13 in das Impfprotokoll für diese Gruppe von Hochrisikopatienten ein. Die Impfung mit dem PnPS-Impfstoff wird weiterhin empfohlen, hauptsächlich wegen seines größeren antigenen Repertoires, das im Vergleich zu PCV13 mehr Serotypen umfasst.

Antikörper stellen nur eines der Produkte der Immunisierungsreaktion dar. Tatsächlich erzeugt die Keimzentrumsreaktion als Reaktion auf eine natürliche Infektion oder Impfung zwei ausgeklügelte Werkzeuge, die unterschiedliche, aber komplementäre Schutzfunktionen haben: langlebige Plasmazellen und Gedächtnis-B-Zellen 36 . Die ersten, die in spezialisierten Knochenmarknischen ausgestattet sind, überleben praktisch ewig, sie sind nicht in der Lage, Antigen 37 zu erkennen, sondern produzieren kontinuierlich hochaffine Antikörper, die durch frühere immunologische Erfahrungen ausgewählt wurden. Gedächtnis-B-Zellen, die sich vorzugsweise in der Milz befinden, tragen Antigen-selektierte Antikörper als Oberflächenantigenrezeptoren und sind daher in der Lage, schnelle Rückrufreaktionen auszulösen.

So wird beim Eindringen eines bereits aufgetretenen Erregers in den Organismus der Schutz durch „gebrauchsfertige“ Serum-Immunglobuline gewährleistet, die von langlebigen Plasmazellen produziert werden. Währenddessen binden Gedächtnis-B-Zellen das Antigen, reagieren und erhöhen in wenigen Tagen, indem sie das Plasmazellkompartiment implementieren, den Spiegel spezifischer Antikörper. Es ist theoretisch schwer zu sagen, ob nur einer dieser beiden Schutzzweige ausreicht, um Krankheiten zu vermeiden 38 . Wir zeigen, dass splenektomierte Patienten die gleiche Menge an zirkulierenden Pneumokokken-spezifischen Antikörpern aufweisen wie gesunde Personen gleichen Alters. Aufgrund dieses Befundes sollte keine zusätzliche Impfung erforderlich sein.

Unsere Studie zeigt, dass der Unterschied zwischen Personen mit oder ohne Milz in der Häufigkeit von Gedächtnis-B-Zellen liegt. Wie bereits bekannt, sind die gesamten Gedächtnis-B-Zellen nach Splenektomie reduziert. Wir zeigen nun, dass das Fehlen dieser Zellpopulation sowohl die erhöhte Anfälligkeit für Pneumokokken-Infektionen als auch die verminderte Reaktion auf Polysaccharid-Impfstoffe bei Asplenie-Individuen erklärt: Tatsächlich S. pneumoniae-spezifische Gedächtnis-B-Zellen sind vermindert und bleiben bei Patienten, die mit reinen Polysaccharid-Antigenen geimpft wurden, niedrig. Wie durch eine aktuelle Studie bestätigt 39 , erzeugen T-unabhängige Antigene keine geschalteten Gedächtnis-B-Zellen und Polysaccharid-Impfstoffe können sogar einen bereits bestehenden Pool von spezifischen geschalteten Gedächtnis-B-Zellen erschöpfen 40 . Im Gegensatz dazu wurde gezeigt, dass eine PnPS-Impfung bei der Maus langlebige Plasmazellen induzieren kann 41 . Somit stammen die Antikörper im Serum von Asplenie-Patienten wahrscheinlich von langlebigen Plasmazellen, die entweder durch frühere natürliche Infektionen oder durch Impfungen erzeugt wurden.

Die Frage, ob Gedächtnis-B-Zellen eine Rolle bei der Abwehr von Pneumokokken-Erkrankungen spielen können, kann anhand des Falles des gemeinsamen variablen Immundefekts beantwortet werden. Diese primäre Immunschwäche ist gekennzeichnet durch einen reduzierten Serumspiegel aller Immunglobulin-Isotypen und ein fehlendes Ansprechen auf die Impfung. Bei den meisten Patienten sind Atemwegsinfektionen die Hauptsymptome und können zu bleibenden Lungenschäden führen. Vor einigen Jahren wurde ein Zusammenhang zwischen dem Vorhandensein von IgM-Gedächtnis-B-Zellen und einer verminderten Inzidenz von Bronchiektasen bei einer Gruppe von Patienten gezeigt, die einen Standard-Immunglobulinersatz erhielten 42, 43 . Daher wurde vorgeschlagen, dass IgM-Gedächtnis-B-Zellen am Schutz vor wiederkehrenden Lungeninfektionen und nachfolgenden Lungenschäden beteiligt sein könnten. Dennoch muss darauf hingewiesen werden, dass ein maßgeschneiderter Immunglobulinersatz und eine richtige Lebensführung auch alle gängigen Patienten mit variabler Immunschwäche vor Atemwegsinfektionen und Lungenschäden schützen können 44 .

Hier zeigen wir, dass IgM-Gedächtnis-B-Zellen, die in der Lage sind, Anti-Pneumokokken-Antikörper zu produzieren, nach Splenektomie um das Zehnfache niedriger sind als normal.

Wir zeigen, dass bei Gesunden der Anteil der zirkulierenden PnPS-spezifischen IgM-Gedächtnis-B-Zellen an der Gesamtzahl der IgM-Gedächtnis-B-Zellen hoch ist (4%).

Diese hohe Frequenz könnte das Ergebnis einer Koevolution unseres Immunsystems mit einem ubiquitären Krankheitserreger sein, der den Menschen ab den ersten Lebenstagen infiziert. Tatsächlich sind Pneumokokken menschliche Kommensalen, die den Nasopharynx von 8–30% der gesunden Erwachsenen und 20–50% der gesunden Kinder unter 4 Jahren besiedeln 45 . Daher haben viele Erwachsene ohne Impfung bereits Anti-PnPS-IgM- und -IgG-Antikörper 46 . Darüber hinaus sind IgM-Gedächtnis-B-Zellen funktionell äquivalent zu Maus-B-1-B-Zellen, die natürliche Antikörper produzieren, die durch Eigenantigene oder veränderte Eigenantigene in völliger Abwesenheit jeglicher antigener Stimulation ausgelöst werden. Diese bereits vorhandenen natürlichen IgM-Antikörper neutralisieren und hemmen die Replikation von Pathogenen direkt, indem sie mehrere Antigene, einschließlich bakterieller Polysaccharide, binden 47 .

Bei einer Influenzavirusinfektion nimmt die Verbreitung von Pneumokokken zu und da die lokale Immunantwort gegen das Virus zu Veränderungen der Schleimhautepithelschicht führt, können Bakterien leichter in die Atemwege eindringen und Infektionen verursachen 48 . Tatsächlich werden saisonale respiratorische Syncytial-Virus (RSV) oder Influenza-Epidemien oft mit einer Lungenentzündung in Verbindung gebracht, die durch S. Lungenentzündunge49 . Im speziellen Fall von Asplenie-Patienten, bei denen bereits ein OPSI-Risiko besteht, kann eine jährliche Impfung gegen Influenza (die eine T-abhängige Immunantwort erzeugt) als zusätzliches Instrument zum Schutz vor bakteriellen invasiven Erkrankungen eingesetzt werden. Eine kürzlich durchgeführte Studie hat gezeigt, dass die Influenza-Impfung die Mortalität bei splenektomierten Patienten um 54 % reduziert 50 .

Ein großer Teil der nach der Impfung erzeugten geschalteten Gedächtnis-B-Zellen befindet sich in der Milz und geht bei ihrer Entfernung verloren 51 . Dies erklärt, warum Anti-Tetanus-IgG-Gedächtnis-B-Zellen im peripheren Blut von Erwachsenen mit Asplenie signifikant reduziert waren. Bei Kindern mit Asplenie war dieser Unterschied nicht signifikant, wahrscheinlich weil der Impfstoff auch nach Splenektomie zu mehreren Zeitpunkten zwischen 2 Monaten und 11 Lebensjahren verabreicht wird. So konnten tetanusspezifische geschaltete Gedächtnis-B-Zellen „de novo“ in den Keimzentren der Lymphknoten, die die Injektionsstelle entleeren, produziert werden. Im Gegensatz dazu werden die meisten Erwachsenen nach einer Splenektomie nicht gegen Tetanus geimpft.

Trotz der bestehenden Empfehlung, alle zehn Jahre eine Auffrischimpfung gegen Tetanus zu verabreichen, ist die Einhaltung dieser Empfehlung schlecht. Unsere vorliegende Studie unterstreicht die Bedeutung dieser Empfehlung sowie die Notwendigkeit einer erneuten Impfung gegen andere Antigene, um den Pool der geschalteten Gedächtnis-B-Zellen nach Splenektomie aufzufüllen.

Da wir unsere Asplenie-Patienten ohne Patienten mit Immunschwäche, Autoimmunität, hämatologischen Tumoren oder unter immunsuppressiver Therapie ausgewählt haben, spiegeln alle unsere Beobachtungen die „reinen“ Effekte der Milzentfernung wider. Daher können wir die Hypothese aufstellen, dass glykokonjugierte Impfstoffe die plausibelste Wahl für die Erzeugung spezifischer B-Gedächtniszellen nach Splenektomie sein könnten.

Unsere Studie hat einige Einschränkungen: In unserer Studienstichprobe waren die Kinder mit Asplenie älter als die Kontrollen. Dies könnte unser Ergebnis in Richtung einer Unterschätzung des Unterschieds verzerrt haben, da erwartet wird, dass die Gedächtnis-B-Zellen mit dem Alter zunehmen. Darüber hinaus erlaubt uns das Beobachtungsdesign nicht, definitive Schlussfolgerungen über die Wirksamkeit von PCV zur Erzeugung einer angemessenen Immunantwort bei Patienten mit Asplenie zu ziehen.

Zusammenfassend bestätigt und erweitert unsere Studie die Ergebnisse, die zuvor von anderen berichtet wurden, und beleuchtet die entscheidende Rolle der Milz bei der immunologischen Reaktion auf Infektionen, die durch eingekapselte Bakterien verursacht werden. Eine geeignete prospektive klinische Studie ist erforderlich, um die Wirksamkeit der T-abhängigen Impfung bei splenektomierten Personen besser zu bewerten.


3 T-ZELLEN UND NEBENWIRKUNGEN AUF PENICILLINE

αβT-Zellen können in zwei Hauptuntergruppen, CD4 + und CD8 + T-Zellen, unterteilt werden und werden durch ihre hochspezifischen T-Zell-Rezeptoren (TCRs) aktiviert. Eine T-Zell-vermittelte Immunität kann durch die Erkennung von fremden oder nicht-eigenen Peptiden (zB viral) hervorgerufen werden, die von den humanen Leukozyten-Antigen-(HLA)-Molekülen einer antigenpräsentierenden Zelle (APC) präsentiert werden.

Es wird angenommen, dass die Aktivierung von T-Zellen durch Penicilline in DHRs aufgrund der Fähigkeit von Penicillinen erfolgt, Proteine ​​kovalent zu modifizieren, um Neoantigene zu bilden, die dem Immunsystem zuvor nicht begegnet sind. Dies kann zu neuen selbstabgeleiteten Peptiden führen, entweder direkt durch die kovalente Modifikation eines Rests innerhalb eines präsentierten Peptids oder durch Veränderung der Expression oder Prozessierung des Quellproteins.

3.1 Nachweis von Penicillin-spezifischen T-Zellen

T-Zellen durchlaufen bei der Aktivierung einen Prozess, der als klonale Expansion bekannt ist, und setzen Zytokine für die nachgeschaltete Immunaktivierung frei. Die Proliferation von Lymphozyten als Reaktion auf Penicillin wurde bereits in den 1960er Jahren beobachtet. 21, 22 Es wurde berichtet, dass die Lymphozytentransformation in mitotisch aktive Zellen spontan in in vitro Kulturen von Patienten während der akuten Reaktionsphase, jedoch nicht bei gesunden Kontrollpersonen oder nicht allergischen oder genesenen Patienten. Eine Transformation wurde auch bei Stimulation mit Penicillin bei Proben von allergischen Patienten mit einer höheren Rate beobachtet als bei gesunden Probanden. 22 Moderne Lymphozytentransformationstests (LTTs) weisen die Proliferation im Allgemeinen durch Messung der 3 H-Thymidinaufnahme von sich teilenden Zellen oder Verdünnung von Carboxyfluoresceindiacetatsuccinimidylester (CFSE)-Färbung durch Durchflusszytometrie nach. 23, 24 Wie bei anderen Arzneimitteln variieren Sensitivität und Spezifität des LTT für die Diagnose von Penicillin-DHRs zwischen den Studien und können durch das klinische Stadium und die Art des DHR beeinflusst werden. 25, 26 Beispielsweise zeigte die LTT für DHR zu BP und AX in 3 Studien Sensitivitäts- und Spezifitätsbereiche von 62,5%-75% bzw. 85%-100%. 27-29

In jüngerer Zeit hat sich IFNγ ELISpot als einer der wichtigsten diagnostischen Tests etabliert, um eine arzneimittelspezifische T-Zell-Beteiligung bei Verdacht auf DHRs nachzuweisen. 18, 30 Rozieres et al. verglichen die Fähigkeit von LTT und IFNγ ELISpot, zirkulierende AX-spezifische Lymphozyten in peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) von AX-DTH-Patienten (n = 22) zu identifizieren. Sie zeigten, dass der IFNγ ELISpot-Assay eine höhere Sensitivität aufwies und AX-spezifische Lymphozyten bei 91 % der AX-DTH-Patienten detektierte, im Vergleich zu 68 % über LTT. 29 Alternativ wurden Granzyme B ELISpot-Assays verwendet, um das Vorhandensein zytotoxischer Zellen zu untersuchen. 31, 32 Bemerkenswert ist, dass Mayorga et al. als Teil der ENDA/EAACI Drug Allergy Interest Group empfehlen, eine Kombination aus LTT- und ELISpot-Assays für eine belastbare Bewertung durchzuführen. 23

Während der ELISpot-Assay hochempfindlich für den Nachweis von arzneimittelreaktiven T-Zellen ist, waren Durchflusszytometrie-Techniken bei der Charakterisierung von T-Zell-Phänotypen in beiden Fällen von entscheidender Bedeutung in vitro expandierte T-Zellen und direkt Ex-vivo. 33 Darüber hinaus hat die Gewinnung von Biopsien zur direkten immunhistochemischen Untersuchung Informationen über die Immunzellpopulationen geliefert, die das Entzündungsgebiet infiltrieren. 34, 35 Kombinationen von in vitro und in vivo Techniken werden jetzt routinemäßig verwendet, um die T-Zellen zu erkennen, zu isolieren und zu charakterisieren, die an verschiedenen klinischen Phänotypen von Penicillin-induzierten DHRs beteiligt sind (Tabelle 2). 36 Durch die Charakterisierung von Zelltypen, Migrationsverhalten und Zytokinsignatur haben die Forscher potenzielle Rollen für verschiedene Zytokine (z. B. CXC-Chemokin-Ligand [CXCL] 10 und IL-4) und Rezeptoren (z. B. CC-Chemokin-Rezeptor [CCR] 4 und CCR9) herausgestellt. in der Pathologie von Penicillin-induzierten DHRs 37–39 (Tabelle 3). In der Tat, im weiteren Sinne des DHR in vitro Untersuchungen haben nicht nur Zytokin-Signaturen und -Rollen für T-regulatorische Zellen und dendritische Zellen in der Krankheitspathologie aufgedeckt, 40-43, sondern führten zu Empfehlungen ihrer Manipulation für verbesserte diagnostische Ergebnisse. 23

Mechanismus der Penicillin-spezifischen T-Zell-Aktivierung

  • Abkürzungen: ELISA, Enzyme-Linked Immunosorbent Assay ELISpot, Enzyme-Linked Immunabsorbent Spot IFNγ, Interferon-γ LTT, Lymphozytentransformationstest PBMC, peripherer mononuklearer Blutzell-TCR, T-Zell-Rezeptor.
Medikament(e) DHR Fälle Beginnzeit Immunoassays T-Zell-Subtypen Immunprofil Referenz
Ampere SJS 1 25 Tage LTT mit MTT IFNγ 156
Ampere, BP Schweres Erythema multiforme, Fieber, Unwohlsein, Blasenbildung 2 verzögert 5-7 Tage Immunhistochemie, FC-Analyse der läsionalen Epidermis, LTT, Proliferationsassay, ELISA CD8 + > CD4 + IL-2, IFNγ (CD8 + T-Zell-Klone, n = 7). IL-4 (CD4 + T-Zell-Klon, n = 1), HLA-DR 34
Verstärker, Piperacillin MPE 2 1 Tag Immunhistochemie CD4 + > CD8 + HLA-DR 35
Amp, AX, AC, BP SJS 2 2-3 Tage LTT CD4 + 109
Ampere, BP, Penicillin V BP-Überempfindlichkeit 4 LTT, Proliferationsassay, FC CD4 + > CD8 + 106
Amp, AX, BP, Fluss Exanthem, Fieber, Ödem, Urtikaria 7 LTT, ELISA, FC CD4+ (62%-90%), CD8+ (10%-38%) 154
AXT MPE, Lyell-Syndrom 23 verzögert (positiver Hautpatchtest) 6-48 Stunden LTT, IFNγ ELISpot IFNγ 29
MPE 11 Kontrollen (negativer Hauttest)
Anaphylaxie 15 sofort <30 min
AC MPE 1 3 Tage Scratch-Patch, Immunhistochemie, LTT, ELISA, FC CD4 + /CD45RO + (2/3), CD8 + /CD45RO + (1/3) HLA-DR, CD45, Perforin, IL-5, TNFα 50
AXT, AC MPE, Angioödem 3 9-54 Uhr Arzneimittelprovokation, Immunhistochemie, LTT, FC CD8 + (dominant während der Reaktion), CD4 + HLA-DR, CLA, Granzym B, CXCL9, CCL27, CXCR3, CCR10 59
AXT MPE 4 7-8 Tage LTT 153
10 gesunde Kontrollen
5 tolerante Kontrollen
AXT, AC AGEP, 2 4-36 Stunden Immunhistochemie, LTT, ELISA, ELISpot CD4+ (60%-70%), CD8+ (30%-40%) HLA-DR, CD25, IL-4, IL-5, IFNγ, RANTES (CCL5), GM-CSF, IL-8, CXCR1 39
Nicht-AGEP (Arzneimittel nicht angegeben) 4 Bedienelemente
AC MPE, Lungenentzündung, Hautinfektion, Arthritis 3 3-10 Tage Immunhistochemie, LTT IL-5, Eotaxin, RANTES (CCL5), MCP-3 57
9 Bedienelemente
AXT 4 MPE, 1 Erythema exsudativum multiforme 5 LTT, 17-plex Bead-basierter Immunoassay (Bio-Rad) Baseline-Sekretion: CCL2, CCL4, IL-6 (P < .05) PBMC-Stimulation: IL-5, IL-13, IFNγ, TNFα und GM-CSF 55
5 Bedienelemente
AXT, AC MPE 13 Quantitative Echtzeit-PCR, Immunhistochemie CD4 + , CD8 + TNF, IFNγ, CCR6, CCL20 und CCL27 Haut: CXCR2, CXCL9 und CXCL10 Blut: CXCR3 Peripheres Blut: CCR10 Haut: CCL20, CXCL9, CXCL10, CCL27 Beide: TNFα, IFNγ, Perforin, Granzyme B, CXCR3, CCR 38
MPE induziert durch Nonpenicilline 14
26 medikamententolerante Kontrollen
AX, BP DILI 1 4 Wochen LTT 76
AX, BP Morbilliformes Exanthem 12 <2 Woche LTT, Proliferationsassay 27
6 Bedienelemente
AX, AC, Cloxacillin, Penicillin V Exanthem 4 >6 h FC CLA (Median = 20,4 vs 9,4) (P < .001). HLA-DR 63
10 gesunde Kontrollen
8 tolerante Kontrollen
AC DILI 7 2-39 Tage LTT, IFNγ ELISpot, FC CD4 + > CD8 + > CD4 + /CD8 + IFNγ, Perforin, Granzym B, FasL, IL-17, IL-22, CCR4, CCR9, CXCR3 79
BP Urtikaria, Angioödem, MPE, Durchfall, Fieber, Atemnot, generalisierter Pruritus 10 LTT, ELISA, FC CD4 + (16 Klone) > CD8 + (3 Klone) BP: IL-4, IL5 > IFNγ BP-HSA: IFNγ > IL-4, IL-5 beide: IL-2, IFNγ, TNFα 54
BP Sofortige Schwellung des Gesichts, erythematöser Hautausschlag 2 Sofort LTT 92
8 Bedienelemente
BP Gesund 10 IFNγ ELISpot CD4 + /CD45RA + IFNγ 108
BP Anaphylaxie, Exanthem, Angioödem, Urtikaria, Dyspnoe, generalisierter Pruritus, Medikamentenfieber 5 sofort LTT, IFNγ ELISpot CD4 + /CD45RA + IFNγ 93
Urtikaria, Medikamentenfieber, Exanthem 2 verzögert
33 Bedienelemente
BP, AX Urtikaria, Angioödem, Anaphylaxie 31 sofort <60 min LTT 28
Urtikaria, MPE 19 verzögert 9-48 Stunden
28 Bedienelemente
BP, Amp MPE, asthmatische Sofortreaktion 4 LTT, Proliferationsassay ELISA, FC CD4 + (85%-95%)> CD8+ (5%-15%) L-Auswahl 53
10 Bedienelemente
BP, Amp BP-Überempfindlichkeit 2 LTT, Proliferationsassay, ELISA, FC CD4 + (2 Klone) IL-4 107
BP Exanthem, Urtikaria, Anaphylaxie 6 LTT 155
6 gesunde Kontrollen
BP 7 gesund IFNγ ELISpot, IFNγ/Granzyme-B Fluorospot Assay CD8 + IFNγ, Granzym B 112
Flussmittel, AX, BP, Piperacillin Flussmittel-DILI 6 (4/6 HLA-B*57:01+) 3-4 Wochen LTT, IFNγ ELISpot, FC, Chemotaxis-Assay Patient: CD8 + (35 Klone) > CD4 + (10 Klone) Arzneimittelnaiv: CD8 + IFNγ, FasL, Perforin, Granzym B, CCR2, CCR4, CCR9, CXCR3 37
6 tolerante Kontrollen
3 HLA- B*57:01 + medikamentennaiv
Fluss 9 Gesund, Flussmittel-naiv, HLA-B*57:01+ LTT, IFNγ ELISpot, FC CD8 + > CD4 + IFNγ, CD107a 89
8 gesunde, flussmittelnaive, HLA-B*57:01-Kontrollen
Piperacillin PIP-überempfindlich 4 LTT, IFNγ ELISpot, FC, Chemotaxis-Assay Blut: 84,25 % CD4 + , 15,75 % CD8 + Entzündete Haut: 85,5% CD4 + , 14,5% CD8 + IFNγ, IL-13, IL-22, Granzym B, CCR4, CCR5, CCR8, CCR10, CXCR3, CXCR6 62
4 Bedienelemente
Piperacillin MPE, Fieber, urtikarielle Eruptionen, grippeähnliche Symptome 28 2-11 Tage Immunhistochemie, LTT, IFNγ ELISpot CD4 + > CD8 + IFNγ, IL-13, Granzym B, IL-1β, IL-6, TNF, MIP-1α 56
9 tolerante Kontrollen
  • Abkürzungen: AC, Amoxicillin und Clavulansäure AGEP, akute generalisierte exanthematische Pustulose Amp, Ampicillin AX, Amoxicillin BP, Benzylpenicillin CCL, CC Chemokinligand CCR, CC Chemokinrezeptor CLA, kutanes Lymphozyten-assoziiertes Antigen CXCL, CXCR, Chemokinligand DILI, arzneimittelinduzierte Leberschädigung ELISA, Enzyme-Linked Immunosorbent Assay ELISpot, Enzyme-Linked Immunabsorbent Spot FasL, Fas Ligand FC, Durchflusszytometrie Flux, Flucloxacillin GM-CSF, Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor HSA, Humanserumalbumin IFNγ , Interferon-γ IL, Interleukin LTT, Lymphozytentransformationstest MCP, Monozyten-Chemoattraktant-Protein MIP, Makrophagen-Entzündungsproteine ​​MPE, makulopapulöses Exanthem MTT, 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid PBMC, periphere mononukleäre Blutzellen SJS, Stevens-Johnson-Syndrom TNF, Tumornekrosefaktor.

3.2 Penicillin-induzierte kutane unerwünschte Arzneimittelwirkungen

Kutane unerwünschte Arzneimittelwirkungen (cADRs) reichen von leichten, nicht lebensbedrohlichen Reaktionen, die sich als Hautausschlag präsentieren, bis hin zu potenziell tödlichen Erkrankungen wie AGEP, DRESS und Stevens-Johnson-Syndrom (SJS)/toxische epidermale Nekrolyse (TEN). 39, 44-48 Wie in Tabelle 3 zusammengefasst, umfassten die meisten T-Zell-Studien Patienten mit MPE, die sich klinisch als ausgedehnte, erhabene Hautläsionen zeigen, die 24-48 Stunden nach der Verabreichung des Arzneimittels auftreten. 49

BP-, AX-, Flux- und Piperacillin-reaktive T-Zelllinien und Klone, die von MPE-Patienten isoliert wurden, stammen überwiegend aus dem CD4 + T-Zell-Kompartiment (55%-100% der T-Zellklone, die mit verschiedenen Strategien identifiziert wurden [1-10 Patienten pro Studie] Tabelle 3). 30, 50-54 Eine weitere Phänotypisierung von CD4 + T-Zell-Klonen mittels Immunoassays einschließlich Durchflusszytometrie, ELISpot oder kommerziell erhältlichen Zytokin-Nachweiskits (z. B. Bio-Plex Pro™ 55 ) ergab ein heterogenes Immunprofil, das hauptsächlich aus Th2-Zytokinen (IL- 4, IL-5 und IL-13) 30, 51, 52, 54-57 und in geringerem Maße Th1-Zytokine (IFNγ, IL-2). 30, 54 Die Mischung aus Th1- und Th2-Zytokinprofilen und der Nachweis von Eotaxinen passt gut zu dem Verständnis, dass diese lebenswichtige Regulatoren der Reifung und Rekrutierung von Eosinophilen sind, im Einklang mit der MPE-Pathologie. 57, 58 Interessanterweise kommt es während einer akuten Phase-Reaktion zu einer hohen Prävalenz von aus dem Blut stammenden CD8 + T-Zellen (

55%-75% der gesamten T-Zellen) wurde bei Patienten mit PBMC nachgewiesen, bei denen AX- oder AX in Kombination mit Clavulansäure (AC)-induziertem Angioödem und generalisiertem Erythem auftraten. 59 Darüber hinaus setzten diese Zellen proinflammatorische Zytokine und zytotoxische Moleküle (dh IFNγ, Tumornekrosefaktor (TNF), Perforin, Granzym B) frei, von denen anderswo gezeigt wurde, dass sie direkt zur Apoptose von Keratinozyten und epidermalen Läsionen beitragen. 60

Die immunhistochemische Untersuchung der entzündeten Haut von Patienten mit Penicillin-induzierter MPE und akuter generalisierter exanthematöser Pustulose (AGEP) zeigte eine perivaskuläre Infiltration von hauptsächlich CD4 + -T-Zellen (60-70 % Gesamt-T-Zellen), bei denen keine Blasenbildung der Haut vorlag. 35, 39, 50, 59, 61 Ein besonderes Merkmal der AGEP ist jedoch die Freisetzung von IL-8, das eine Rolle bei der Neutrophilenrekrutierung an der Stelle der Läsion spielen könnte. 39 Es wurde auch gezeigt, dass infiltrierende CD4 + T-Zellen hochregulierte Spiegel von HLA-DR (später Aktivierungsmarker) in 80-100 % der gesamten CD4 + T-Zellpopulation exprimieren (Yawalkar et al.: 9 Kontrollen, 3 Penicillin-hypersensitiv Patienten Britschgi et al: 4 Kontrollen, 2 Penicillin-Überempfindlichkeitspatienten).39, 57 Darüber hinaus wird im gesamten Spektrum der Penicillin-cADRs eine verstärkte Expression von Haut-Homing-Markern wie dem kutanen Lymphozyten-assoziierten Antigen (CLA), CCR10 und dem C-X-C-Motiv-Chemokinrezeptor (CXCR) 3 auf infiltrierenden T-Zellen nachgewiesen. 59, 62, 63 Diese Rezeptoren sind grundlegend für die Rekrutierung von T-Zellen in die Dermis, wo die entsprechenden Liganden produziert werden, einschließlich CXCL9 für CXCR3 und C-C-Chemokinligand (CCL)27 für CCR10. 38, 59, 64

Im Gegensatz dazu sind infiltrierende T-Zellen bei bullösen Hautläsionen (dh Blasenbildung der Haut), die durch AX und BP verursacht werden, stammen überwiegend aus dem CD8 + T-Zell-Kompartiment (74-90 % der CD3 + T-Zellen). 34 Unterstützung von CD8 + T-Zell-Reaktionen bei bullösen Reaktionen (dh SJS und TEN) setzten T-Zell-Klone von denselben Patienten erhöhte Spiegel der proinflammatorischen Zytokine IL-2 und IFNγ frei, die die Freisetzung von Perforin, Granzym B und FasL fördern, die die Keratinozyten-Apoptose verursachen. 65, 66

Somit scheinen sich die phänotypischen Unterschiede trotz der Überlappung der Zytokine, die diesen verschiedenen Pathologien zugrunde liegen, auf die dominanten beteiligten T-Zell-Untergruppen auszurichten – CD4 + T-Zellen bei MPE und CD8 + T-Zellen bei SJS/TEN. Warum sich Tendenzen zu CD4+- oder CD8+-T-Zellen entwickeln, die zu diesen unterschiedlichen Pathologien führen, ist noch wenig verstanden. Weitere Untersuchungen zu ortsspezifischen und residenten Immunzellen und APCs (z. B. Langerhans gegenüber dermalen dendritischen Zellen) können die Abgrenzung unterstützen.

3.3 Arzneimittelinduzierte Leberschädigung

Penicilline können auch eine arzneimittelinduzierte Leberschädigung (DILI) verursachen, ein Überbegriff, der verwendet wird, um toxische Hepatitis oder mit Arzneimitteln verbundene Hepatotoxizität zu beschreiben. Das DILI-Muster kann biochemisch durch die Veränderung der Alanin-Aminotransferase- oder alkalischen Phosphatase-Spiegel im Patientenserum bestimmt werden. 67 Penicillin-DILI manifestiert sich typischerweise innerhalb von 1-3 Wochen nach Verabreichung des Arzneimittels und zeigt sich normalerweise als cholestatische oder gemischte cholestatische und hepatozelluläre Schädigung (75% der gesamten DILI-Patienten), wobei sowohl die Funktion der Hepatozyten als auch die Leberzellen beeinträchtigt sind. 68, 69 Die am häufigsten berichteten Penicilline, die DILI induzieren, sind AC (AC-DILI) 69-71 und Flux (Flux-DILI). 72-75

Der erste Bericht über die Beteiligung von T-Zellen an DILI wurde von Bauer und Bircher veröffentlicht, in dem arzneimittelspezifische T-Zellen gegen BP und AX aus PBMCs von DILI-Patienten nachgewiesen wurden. 76 Das Immunprofil von DILI-assoziierten T-Zellen wurde weiter durch die Naisbitt-Gruppe charakterisiert, nachdem Flux-spezifische CD4 + - und CD8 + -T-Zell-Klone (n = 4 bzw. n = 35) aus PBMCs von Flux-DILI-Patienten gewachsen waren. 37 Darüber hinaus wurde berichtet, dass DILI-assoziierte T-Zell-Klone hohe Spiegel der Leber-Homing-Rezeptoren CCR2 und CCR9 exprimieren. 77, 78 Es wurde auch gezeigt, dass die CCR9 + T-Zellen in Transwell-Migrationsassays zu CCL25 (CCR9-Ligand) wandern (2- bis 4-fache Migration gegen keine Ligandenkontrolle). 37, 77 Dieser Effekt wurde auch in einer Folgestudie derselben Gruppe mit Fokus auf AC-DILI-Patienten beobachtet. Hier zeigten auch AX-spezifische CD4 + und CD8 + T-Zellklone (n = 40 bzw. n = 65) eine Hochregulation von CCR9. 79 Schließlich zeigte die immunhistopathologische Untersuchung der Leberbiopsie eines Flux-DILI-Patienten eine Infiltration durch CD3 + CD8 + T-Zellen, entsprechend der vermuteten Beteiligung von CD8 + T-Zellen an der Flux-DILI-Pathologie. 80


Diskussion

Über die Biologie der murinen Übergangs-B-Zellen ist viel bekannt, doch unser Verständnis der menschlichen Übergangs-B-Zellen beginnt gerade erst, sich zu enträtseln. Hier identifizierten und charakterisierten wir 2 Populationen menschlicher Übergangs-B-Zellen: CD21 lo und CD21 hi. Unsere Daten zeigten, dass diese 2 Populationen unterschiedliche Phänotypen aufweisen, mit einer höheren Expression von CD23, CD44, IgD und BAFF-R durch die CD21 hi-Untergruppe (Abbildung 1). Bemerkenswerterweise korreliert die stärkere Expression von CD21, CD23 und IgD auf den Übergangsuntergruppen von CD21 hi gegenüber CD21 lo mit den Phänotypen von murinen Übergangs-B-Zellen, wobei die Expression dieser Moleküle ebenfalls entlang eines T1 → T2 → T3 Gradienten 7,8 . zunimmt

Die phänotypischen Daten, zusammen mit einer größeren Proliferation und Ig-Sekretion durch die CD21 hi-Übergangs-B-Zellen (Tabellen 2-3), legen nahe, dass CD21 lo und CD21 hi CD10 + B-Zellen unterschiedlichen Stadien der B-Zell-Entwicklung entsprechen, wobei die CD21 lo Teilmenge, die eine weniger reife Bevölkerung darstellt. Eine zwingendere Unterstützung für diese Schlussfolgerung kam von der Bewertung der Zusammensetzung des B-Zell-Kompartiments bei Patienten mit XLA oder solchen, die sich von einer HSCT erholten, sowie von Microarray-Analysen. Zuerst, obwohl BTK Mutationen verursachen eine schwere Blockade der B-Zell-Entwicklung 21 (Abbildung 4), die wenigen zirkulierenden B-Zellen, die bei XLA-Patienten nachweisbar waren, waren überwiegend CD21 lo-Übergangszellen, was darauf hindeutet, dass der Verlust von Btk die Reifung von CD21 lo-Übergangs-B-Zellen zu CD21 hi-Übergangszellen verhindert, und anschließend naive B-Zellen (Abbildung 4). Zweitens, und in Übereinstimmung mit den Beobachtungen bei XLA-Patienten, waren CD21-lo-Übergangs-B-Zellen die erste B-Zell-Untergruppe, die nach HSCT die Peripherie besiedelte. Im Laufe der Zeit nahm die Zahl dieser Zellen ab, und dies fiel mit dem Auftreten von CD21 hi-Übergangszellen zusammen, was darauf hindeutet, dass CD21 lo-Übergangs-B-Zellen die anfängliche Population von ausgewanderten BM-B-Zellen darstellen, die sich anschließend zu der CD21 hi-Übergangsuntergruppe entwickeln (Abbildung 5 .). ). Drittens hat das Gen-Profiling ergeben, dass LEF-1 wurde in CD21 lo-Übergangs-B-Zellen am höchsten exprimiert, wobei die Expression in CD21 hi-Übergangs-B-Zellen reduziert und in reifen naiven und Gedächtniszellen ausgelöscht wurde ( 2 ). Hystad et al. haben kürzlich berichtet, dass LEF-1 fehlte in menschlichen frühen B-Zellen (CD34 + CD10 + CD19 – ), induziert in Pro-B-Zellen (CD34 + CD10 + CD19 + ), weiter hochreguliert in Prä-B-Zellen (CD34 + CD10 + CD19 – ) und reduziert, aber immer noch exprimiert, in unreifen B-Zellen (CD34 – CD10 + CD19 + ). 37 Das sinkende Niveau von LEF-1 Expression zwischen humanen BM-Prä-B-Zellen und unreifen B-Zellen, 37 und CD21 lo- und CD21 hi-Untergruppen von Übergangs-B-Zellen und eine weitere Herunterregulierung zwischen den CD21 hi-Übergangs- und naiven B-Zellen deuten darauf hin, dass die B-Zell-Entwicklung wie folgt fortschreitet linear: unreif → CD21 lo übergangsweise → CD21 hi übergangsweise → naiv (Abbildung 6). Der Befund, dass CD21 lo Übergangszellen für autoreaktive Ab angereichert waren, stimmt auch mit der Vorstellung überein, dass CD21 lo Übergangs-B-Zellen die früheren BM-Emigranten sind und dass sie immer noch einer negativen Selektion unterzogen werden.

Vorgeschlagenes Modell der menschlichen B-Zell-Entwicklung. Wir schlagen vor, dass B-Zellen, die aus dem BM in die Peripherie wandern, CD21 lo Übergangs-/T1 B-Zellen sind, die sich anschließend in CD21 hi Übergangs-/T2 B-Zellen differenzieren. Dieser Reifungsschritt erfordert Btk, was auf eine Rolle für das BCR-Engagement hinweist, und wird von einem verbesserten Überleben und dem Potenzial zur Proliferation und Differenzierung in Ig-sezernierende Zellen begleitet. Es gibt auch eine Verringerung der Autoreaktivität, was darauf hindeutet, dass ein Kontrollpunkt für die Selbsttoleranz auf der Stufe zwischen diesen beiden Phasen der B-Zell-Übergangsentwicklung existiert. Phänotypisch erhöhen die CD21 hi-Übergangs-B-Zellen die Expression von CD21, CD23, CD44, Bcl-2, BAFF-R und IgD. Inzwischen Ausdruck von LEF-1, KIAA1199, DTX-1, und AKAP12 wird reduziert, wenn die Zellen in das reife B-Zell-Repertoire eintreten. CD21 hi-Transitional/T2 B-Zellen führen dann zu T3/prenaiven CD5 + B-Zellen, 38 die durch einen Verlust der Expression von CD10, eine hohe Expression von CD21, aber eine beeinträchtigte Extrusion von R123 gekennzeichnet sind. Die autoreaktive Spezifität dieser Population muss noch bestimmt werden.

Vorgeschlagenes Modell der menschlichen B-Zell-Entwicklung. Wir schlagen vor, dass B-Zellen, die aus dem BM in die Peripherie wandern, CD21 lo Übergangs-/T1 B-Zellen sind, die sich anschließend in CD21 hi Übergangs-/T2 B-Zellen differenzieren. Dieser Reifungsschritt erfordert Btk, was auf eine Rolle für das BCR-Engagement hinweist, und wird von einem verbesserten Überleben und dem Potenzial zur Proliferation und Differenzierung in Ig-sezernierende Zellen begleitet. Es gibt auch eine Verringerung der Autoreaktivität, was darauf hindeutet, dass ein Kontrollpunkt für die Selbsttoleranz auf der Stufe zwischen diesen beiden Phasen der B-Zell-Übergangsentwicklung existiert. Phänotypisch erhöhen die CD21 hi-Übergangs-B-Zellen die Expression von CD21, CD23, CD44, Bcl-2, BAFF-R und IgD. Inzwischen Ausdruck von LEF-1, KIAA1199, DTX-1, und AKAP12 wird reduziert, wenn die Zellen in das reife B-Zell-Repertoire eintreten. CD21 hi-Übergangs-/T2-B-Zellen führen dann zu T3/pränaiven CD5 + B-Zellen, 38 die durch einen Verlust der Expression von CD10, eine hohe Expression von CD21, aber eine beeinträchtigte Extrusion von R123 gekennzeichnet sind. Die autoreaktive Spezifität dieser Population muss noch bestimmt werden.

Die Ergebnisse unserer Studie liefern neue und signifikante Einblicke in die menschliche B-Zell-Entwicklung in der Peripherie und verdeutlichen unser Verständnis der Voraussetzungen für diesen Prozess. Zuerst identifizierten wir mehrere Gene (z. LEF1, KIA1199), die in CD21 lo-Übergangs-B-Zellen stark exprimiert und in nachfolgenden Stadien der B-Zell-Entwicklung herunterreguliert werden (Abbildung 2). Die genaue Rolle dieser Gene bei der Entwicklung von menschlichen B-Zellen ist unbekannt. LEF-1-defiziente Mäuse weisen jedoch eine Verringerung der Gesamtzahl der B-Zellen in der fetalen Leber und im perinatalen BM auf, 39 was die Bedeutung dieses Gens für die Kontrolle der B-Zell-Entwicklung unterstreicht. Im Gegensatz dazu war die Überexpression von KIAA1199 40 in Krebszellen mit erhöhtem Zelltod und/oder Wachstumssuppression verbunden. Basierend auf diesen Beobachtungen ist es möglich, dass der erhöhte Ausdruck von KIAA1199 in Übergangs-B-Zellen trägt im Vergleich zu naiven B-Zellen zu deren reduziertem Überleben und Vermehrung in vitro bei. Eine weitere Untersuchung dieser Gene in Immunzellen sollte mehr über ihre Rolle bei der Entwicklung von menschlichen B-Zellen aufdecken.

Unsere Feststellung, dass BTK Mutationen blockieren die B-Zell-Entwicklung im Übergangsstadium von CD21 lo stark (Abbildung 4) stellt eine frühere Erkenntnis in Frage, dass BTK erforderlich ist, um eine B-Zell-Toleranz beim Menschen herzustellen. 41 Ng et al., die das Vorherrschen von Übergangs- (dh CD10 + ) B-Zellen bei XLA-PB feststellten, 41 zeigten, dass diese Zellen eine höhere Häufigkeit von Autoreaktivität (∼ 55 % – 60 %) aufwiesen als CD10 + B-Zellen von normalen Spendern ( 37%). 41 Sie kamen zu dem Schluss, dass eine veränderte Signalübertragung durch den BCR aufgrund von Mutationen in BTK ermöglichte das Entweichen eines erhöhten Anteils an autoreaktiven B-Zellen, sodass eine intakte BTK-Funktion für die Aufrechterhaltung der B-Zell-Toleranz notwendig war. 41 Eine alternative Interpretation ist jedoch, dass die bei XLA B-Zellen beobachtete Zunahme der Autoreaktivität 41 einfach die Tatsache widerspiegelt, dass etwa 80 % der Übergangs-B-Zellen bei diesen Patienten zur Untergruppe von CD21 lo gehören (Abbildung 4), und eine größere Häufigkeit von diesen Zellen sind autoreaktive Abs im Vergleich mit der CD21 hi-Untergruppe (Fig. 2C), die den größten Teil der CD10 + -Population bei gesunden Spendern ausmacht (Fig. 1D). Somit ist es möglich, dass BTK keine Rolle bei der Herstellung von Toleranz spielt, sondern für die Reifung von CD21 lo-Übergangs-B-Zellen zu CD21 hi-Übergangs-B-Zellen notwendig ist.

Obwohl die CD21 lo und CD21 hi Übergangs-B-Zell-Untergruppen zahlreiche Unterschiede aufwiesen, teilten sie mehrere phänotypische und funktionelle Eigenschaften. Zum Beispiel waren diese 2 B-Zell-Untergruppen basierend auf der Replikationsgeschichte beide nicht-proliferative Zellen in vivo ( 1F ). Daher ist es unwahrscheinlich, dass die Entwicklung von CD21 lo-Übergangszellen zu CD21 hi-Übergangszellen eine Proliferation beinhaltet. Interessanterweise hatten naive B-Zellen in vivo mehrere Teilungen durchlaufen (Abbildung 1F), 30,31 was darauf hindeutet, dass die Differenzierung von Übergangs-B-Zellen zu naiven Zellen eine proliferative Phase beinhalten könnte. Bemerkenswerterweise hatte BAFF trotz nachweisbarer Expression von BAFF-R eine sehr geringe Wirkung auf das Überleben einer der Übergangs-B-Zell-Untergruppen (Fig. 1,3). Wir fanden auch, dass BAFF die Expression von CD21 oder CD23 auf menschlichen Übergangs-B-Zellen in vitro nicht moduliert (ergänzende Abbildung 3). Da BAFF entscheidend für das in vivo-Überleben 13,42 und die Hochregulierung der Expression von CD21 und CD23 43 auf Maus-B-Zellen ist, ist es möglich, dass die B-Zell-Entwicklung beim Menschen weniger von BAFF abhängig ist als bei Mäusen. Dies wird durch die kürzliche Beschreibung von 2 verwandten Personen mit Mutationen in gestützt TNFRSF13C (Kodierung BAFF-R), die im Gegensatz zu Baffr-defiziente Mäuse, 13,42 entwickelten immer noch naive und Gedächtnis-B-Zellen, wenn auch in geringerer Häufigkeit im Vergleich zu normalen gesunden Kontrollen. 44

Mehrere Studien haben menschliche Übergangs-B-Zellen nach Phänotyp und/oder Funktion in Untergruppen unterteilt. Anolik et al. definierten humane „T1“- und „T2“-Übergangszellen basierend auf Expressionsniveaus von CD24 und CD38, wobei T1 B-Zellen CD38 +++ CD24 +++ und T2 B-Zellen CD38 ++ CD24 ++ sind. 26 Diese Übergangsuntergruppen wurden im PB von Patienten nachgewiesen, die sich von einer B-Zell-Depletion-Therapie erholten. 26 Vor kurzem identifizierte diese Gruppe eine dritte Population von humanen Übergangs-B-Zellen (bezeichnet als T3), die einen Phänotyp von naiven B-Zellen aufweisen (dh CD10 − CD24 int CD38 int IgD + CD27), die aber aufgrund ihrer Ineffizienz von naiven Zellen getrennt werden können beim Extrudieren von R123. 45 In Übereinstimmung mit unseren Daten von HSCT-Patienten ging das Auftreten der T1-Untergruppe dem der T2- und T3-Populationen im Rahmen der B-Zell-Rekonstitution nach B-Zell-Depletion voraus. 26,45 Interessanterweise beschrieb eine andere Studie eine Population humaner pränaiver CD5 + B-Zellen, die sich von Übergangs- und naiven B-Zellen durch ihre intermediären Expressionsniveaus von CD9, CD10 und CD38 und den Efflux von R123 unterscheiden lassen. 38 Basierend auf dem Oberflächenphänotyp, ihrer Dominanz bei CB und ihrer Fähigkeit, in vitro zu naiven B-Zellen zu reifen, 38,45 ist es wahrscheinlich, dass T3-Zellen und CD5 + pränaive B-Zellen dieselbe Population von sich entwickelnden B-Zellen darstellen. Da sich unsere Studie auf die CD10-Expression stützte, um Übergangs-B-Zellen zu identifizieren, entspricht weder die CD21 lo- noch die CD21 hi-Untergruppe T3/CD5 + (CD10 –/lo ) pränaiven B-Zellen. Unsere Analyse zeigte, dass CD21 lo und CD21 hi Übergangs-B-Zellen in PB von normalen Spendern vergleichbare Mengen an CD24 und CD38 exprimieren, was die Möglichkeit erhöht, dass sie nicht CD38 +++ CD24 +++ T1 und CD38 ++ CD24 ++ . entsprechen T2-Übergangszellen bzw. Als wir jedoch CD24 und CD38 auf Übergangs-B-Zell-Untergruppen bei Patienten nach HSCT untersuchten, beobachteten wir, wie Anolik et al mit CD21 hi Übergangs-B-Zellen (ergänzende Abbildung 4). Trotz dieses anfänglichen Unterschieds näherte sich die Expression von CD24 und CD38 in den Übergangs-B-Zell-Untergruppen schließlich einander an (ergänzende Abbildung 4), was darauf hindeutet, dass die Expressionsniveaus von CD24 und CD38 in Übergangs-B-Zell-Untergruppen die Zeit seit ihrer Erzeugung und ihrem Export widerspiegeln aus dem BM, anstatt eine Abgrenzung zwischen Übergangsteilmengen. Auf dieser Grundlage ist es wahrscheinlich, dass die CD21 lo und CD21 hi Übergangs-B-Zell-Untergruppen die CD38 +++ CD24 +++ T1- und CD38 ++ CD24 ++ T2-Zellen sind. 26 Dies wird weiter durch die Befunde gestützt, dass die Expression von CD21 und CD23 auf T2/CD21 hi im Vergleich zu T1/CD21 lo Übergangs-B-Zellen erhöht war und dass keine der Populationen in In-vitro-Überlebens- oder Differenzierungsassays auf BAFF ansprach. 26,45

Durch die Kombination der Daten aus unserer aktuellen Studie und denen, die kürzlich veröffentlicht wurden, ist es möglich, eine Karte der humanen peripheren B-Zell-Entwicklung vorzuschlagen, bei der unreife B-Zellen den BM als CD21 lo-Übergangs-/T1-Zellen verlassen, die sich zu CD21 hi-Übergangs-/T2-Zellen in entwickeln eine BTK-abhängige Weise (Abbildung 6). Interessanterweise legt die Verringerung der Autoreaktivität zwischen den Übergangsstadien von CD21 lo und CD21 hi nahe, dass in diesem Schritt ein Kontrollpunkt für die Selbsttoleranz existiert. Dies ist analog zu den Kontrollpunkten zwischen frühen unreifen und unreifen B-Zellen sowie Übergangs- und naiven B-Zellen, bei denen autoreaktive B-Zellen aus dem Repertoire entfernt werden, 5 und steht im Einklang mit der erhöhten Häufigkeit von T1/CD21 lo Übergangs-B-Zellen bei einigen Patienten mit systemischer Lupus erythematodes. 24,46 CD21 hi-Übergangs-B-Zellen entwickeln sich dann zu T3/pränaiven B-Zellen, die einen abschließenden Reifungsprozess durchlaufen, um naive B-Zellen zu werden (Abbildung 6). Es wird wichtig sein, die Autoreaktivität und Proliferationsgeschichte der T3/pränaiven B-Zellpopulation zu untersuchen, um festzustellen, ob eine Replikation für die Entwicklung dieser Zellen in das naive Kompartiment erforderlich ist und ob eine Deletion autoreaktiver Zellen über das CD10 + -Stadium von B . hinaus auftritt -Zellentwicklung. Insgesamt wird dieser Rahmen eine verfeinerte molekulare Untersuchung der menschlichen B-Zell-Entwicklung in Fällen von immunologischen Dyskrasien ermöglichen, die durch ein gestörtes B-Zell-Verhalten gekennzeichnet sind, wie Immunschwäche, Autoimmunität und Malignität.

Präsentiert in mündlicher Form auf den Keystone Symposien, B-Zellen im Kontext, Taos, NM, 28. Februar 2009.


Die Studien mit menschlichen Teilnehmern wurden von Freiburg 239/1999 und 121/11 und Freiburg 66/13 überprüft und genehmigt. Die Patienten/Teilnehmer gaben ihr schriftliches Einverständnis zur Teilnahme an dieser Studie.

MR führte die Experimente durch, analysierte und interpretierte die Daten und schrieb das Manuskript. KP, VS und IH führten Experimente durch. RV trug zur Akquise und Probenentnahme von Patienten bei und überarbeitete das Manuskript kritisch. KW und BK konzipierten und koordinierten die Studie, interpretierten Daten und verfassten das Manuskript. Alle Autoren haben zu dem Artikel beigetragen und die eingereichte Version genehmigt.


ERGEBNISSE

RV infiziert bevorzugt humane IBC.

Um zu bestimmen, ob RV menschliches CBC und IBC differenziell infiziert, wurden gereinigte B-Zellen von erwachsenen Blutspendern oder unabhängig von Patienten, die sich einer bariatrischen Operation unterzogen, scheininfiziert oder mit iRRV, RRV oder Wa bei einer MOI von 5 infiziert. Die intrazelluläre Expression von NSP2 wurde untersucht durch Durchflusszytometrie zu verschiedenen Zeiten nach der Infektion. Vergleichbare Häufigkeiten von RV-infizierten Blutbildnern wurden nach Anti-NSP2-(MAb 191)- oder Anti-NSP4-(MAb B4-2)-Färbung beobachtet (n = 2 Daten nicht gezeigt) und anschließend wurde nur die NSP2-Färbung verwendet. Keine NSP2 +-Zellen wurden 2 hpi in zwei bzw. einem Experiment mit CBC und IBC nachgewiesen (Daten nicht gezeigt). Im Gegensatz dazu wurden signifikante Häufigkeiten von NSP2 +-Zellen in RRV- und Wa-infizierten, aber nicht schein- oder iRRV-infizierten Zellen mit 10 hpi nachgewiesen (Abb. ​ (Abb. 1A). 1A). IBC unterstützten die virale Replikation 4-mal häufiger als CBC (P < 0,0001, Mann-Whitney-Test). Signifikante Wa-Infektionen traten sowohl bei CBC als auch bei IBC in niedrigeren Konzentrationen auf als bei RRV. Obwohl kein statistischer Unterschied zwischen intestinalen und zirkulierenden NSP2 +-Zellen mit Wa infiziert wurde (P = 0,09, Mann-Whitney-Test) wurde eine Tendenz zu höheren Infektionsraten bei IBC festgestellt (Abb. ​ (Abb. 1A). 1A). Um diese Ergebnisse zu bestätigen, wurden CBC und IBC, die von demselben Freiwilligen erhalten wurden, mit RRV infiziert (Abb. ​ (Abb. 1B). 1B). Nach 10 h wurde die intrazelluläre Koexpression des Nichtstrukturproteins NSP2 und des viralen Strukturproteins VP6 untersucht. In Übereinstimmung mit unseren Ergebnissen exprimierten die meisten NSP2 +-Zellen auch VP6, und in IBC waren ungefähr 3-fach höhere Spiegel an doppelt positiven infizierten Zellen vorhanden als in CBC (Abb. ​ (Abb. 1B 1B).

RRV- und Wa-Infektion von CBC und IBC. Microbead-gereinigtes CBC (leere Kreise) und IBC (gefüllte Quadrate) von verschiedenen Patienten wurden scheinbehandelt oder mit Psoralen-inaktiviertem RRV (iRRV), RRV oder Wa RV (alle mit einer MOI von 5) behandelt. Nach 10 h wurden die Zellen auf Oberflächenmarker gefärbt und dann permeabilisiert, um intrazelluläre virale Proteine ​​nachzuweisen. (A) Zusammenfassung der Expression von NSP2 in B-Zellen. Linien repräsentieren den Median. Ein Sternchen zeigt statistisch signifikante Unterschiede zwischen dem Prozentsatz von CBC und IBC an, die mit RRV infiziert sind (P < 0,0001, Mann-Whitney-Test). (B) Koexpression von nichtstrukturellen (NSP2) und strukturellen (VP6) Proteinen in gepaarten CBC und IBC, die von demselben Patienten gereinigt wurden. (C) RRV infiziert produktiv menschliches CBC und IBC. Bead-gereinigte CBC und IBC wurden scheinbehandelt oder wurden 45 min mit iRRV oder RRV (MOI, 5) behandelt. Nach der Infektion wurden die Zellen dreimal gewaschen. Für den ersten Waschgang wurde eine 1/1.000-Verdünnung von neutralisierendem MAb (159 anti-VP7) verwendet. Überstände nach 2 und 24 h wurden gesammelt und die Virusreplikation wurde durch die Titration des infektiösen Virus in MA104-Zellen bestimmt. Als positive Kontrolle wurde ein Überstand von RV-infizierten MA104-Zellen verwendet. Die Ergebnisse der einzelnen Experimente sind dargestellt und horizontale Linien repräsentieren den Median. Ein Sternchen weist auf statistisch signifikante Unterschiede hin (P < 0,05, Wilcoxon-Test).

Als nächstes untersuchten wir, ob RV in infizierten B-Zellen einen vollständigen viralen Replikationszyklus durchläuft. Die relativen Mengen an infektiösem Virus (Abb. ​ (Abb. 1C) 1C) und VP6 (Daten nicht gezeigt) in infizierten CBC- und IBC-Überständen wurden durch Titration auf MA104-Zellen und ELISA bei 2 bzw. 24 hpi bewertet. Ein signifikanter Anstieg des infektiösen Virus und des löslichen VP6 war in den Überständen von CBC und IBC vorhanden, die mit lebendem RRV bei 24 hpi behandelt wurden (Abb. ​ (Abb. 1C 1C und Daten nicht gezeigt). und IBC mit RRV ist wesentlich weniger produktiv als die vergleichbare Infektion von MA104-Zellen (Abb. ​ (Abb. 1C). 1C). Diese Ergebnisse zeigen, dass RV bevorzugt menschliche IBC infiziert und dass diese Infektion produktiv ist.

RV infiziert überwiegend mBC-Untergruppen.

Die Verteilung der B-Zell-Untergruppen variiert je nach ihrer Lokalisation im Wirt und im Darm im Gegensatz zum Blut gibt es mehr Antigen-erfahrene als naïve B-Zellen (21, 22). Um die Anfälligkeit von B-Zell-Untergruppen für eine RV-Infektion zu bestimmen, wurden CBC isoliert und scheininfiziert oder mit RRV infiziert, und unmittelbar nach der Infektion wurden die Zellen mit Anti-CD19, Anti-CD27 und Anti-IgD gefärbt und nach FACS sortiert. Vier Untergruppen von B-Zellen wurden isoliert: CD27 − IgD + (naïve), CD27 + IgD − (Wechselspeicher), CD27 + IgD + (IgM-Speicher) (45) , und CD27 − IgD − (vor kurzem als CD27-mBC beschrieben [23, 71]). Alle Populationen waren nach dem Sortieren mehr als 94% rein (Abb. ​ (Abb.2A). 2A). Da die Sortierung nach der Infektion durchgeführt wurde, war die Virusexposition für alle Untergruppen vergleichbar. Bei 10 hpi wurden die Zellen gewaschen und erneut mit Anti-CD19-, Anti-CD27- und Anti-IgD-MAbs gefärbt und permeabilisiert, um intrazelluläres NSP2 nachzuweisen. Wie in Abb. ​ Abb.2A, 2A gezeigt, waren naïve B-Zellen relativ resistent gegen RV-Infektionen, und es wurden 3- bis 6-fach höhere Häufigkeiten infizierter Zellen in Switch, IgM und CD27-mBC . beobachtet Teilpopulationen (n = 3) (Abb. ​ (Abb.2A 2A ).

Um diese Beobachtungen zu bestätigen und zu erweitern, wurden gereinigte CBC und IBC infiziert, und 10 hpi wurden die Zellen mit Anti-CD19-, Anti-CD20-, Anti-CD27-, Anti-IgD-, Anti-CD38- und Anti-NSP2-MAbs gefärbt. Wie in Abb. ​ Abb.2B, 2B gezeigt, war die RV-Replikation stark auf IgD − CD27 + mBC beschränkt. Bemerkenswert ist, dass 20 bis 90% der intestinalen ASC (CD19 + CD20 niedrig CD38 hoch CD27 +) die RRV-Replikation unterstützten (Daten nicht gezeigt). Nach der RRV-Infektion waren 52 bis 86% und 54 bis 92% (Median von etwa 80%) der infizierten Zellen im Speicher (IgD−) von CBC bzw. IBC vorhanden (Abb. 2B und C .). ). Humanes Wa RV replizierte auch vorzugsweise in mBC-Untergruppen von CBC und IBC (Abb. ​ (Abb. 2C). 2C). Somit sind zirkulierende und intestinale mBC-Untergruppen die Hauptziele sowohl der heterologen als auch der homologen RV-Infektion, und im Darm findet auch bei CD38 mit hohem ASC eine erhebliche Infektion statt (Daten nicht gezeigt).

Eine RV-Infektion verringert die Lebensfähigkeit von CBC, jedoch nicht von IBC.

RV-Infektionen verlaufen in Zellkulturen häufig zytolytisch und können zum Absterben infizierter B-Zellen führen. Um zu bestimmen, ob RV Veränderungen der Lebensfähigkeit in infizierten CBC und IBC induziert, wurden Schein-, iRRV-, RRV- oder Wa-infizierte Zellen mit mehreren Lebensfähigkeitsmarkern 10 hpi gefärbt. Die Färbung von CBC mit Trypanblau zeigte eine signifikant höhere Häufigkeit toter Zellen bei RRV-infizierten als bei scheininfizierten Zellen, mit Medianen von 11,5 (Bereich 4,2 bis 29%) und 4,3% (Bereich 0 bis 14& #x00025) bzw. (P = 0.004, Mann-Whitney-Test n = 13) (Daten nicht angezeigt). Auf IBC wurde keine Trypanblau-Analyse durchgeführt, da die Kontamination der Präparate mit abgestorbenen Epithelzellen die Analyse verfälschte. Darüber hinaus war der Anteil fluoreszierender Amin-positiver (toter Zellen) B-Zellen signifikant höher (P = 0,001, Man-Whitney-Test n = 10) bei RRV-infiziertem CBC (Median, 8% Bereich, 3 bis 20%) als Schein (Median, 2% Bereich, 1 bis 5%)-, iRRV (Median 3% Bereich, 1 bis 5%)- oder Wa (Median, 4% Bereich, 1 bis 7%)-infizierte B-Zellen (Abb. ​ (Abb.3A). 3A). Es wurden jedoch keine Unterschiede in der Häufigkeit toter IBC zwischen Schein-, iRRV-, RRV- und Wa-infizierten Zellen gefunden (Abb. ​ (Abb. 3A). 3A). Etoposid (das bei den hier verwendeten hohen Dosen Nekrose hervorrufen kann [53]) induzierte vergleichbare Häufigkeiten toter Zellen sowohl im CBC als auch im IBC (Abb. ​ (Abb. 3A 3A ).

RV-induzierter Tod bei CBC und IBC. Bead-gereinigte CBC und IBC wurden scheininfiziert oder wurden mit iRRV, RRV oder WaRV (MOI, 5) oder mit 80 μM Etoposid als Positivkontrolle infiziert. Die Lebensfähigkeit der B-Zellen wurde nach 10 h durchflusszytometrisch bewertet. (A) Häufigkeit von Amin + CBC und IBC. Mediane und Bereiche von mindestens 12 Experimenten für CBC und IBC werden gezeigt. Für Wa RV sind sechs Experimente enthalten. Der doppelte Stern weist auf statistisch signifikante Unterschiede zwischen den Ergebnissen für schein- und RRV-infizierte B-Zellen hin (P = 0,005, Wilcoxon-Test). Ein Sternchen weist auf statistisch signifikante Unterschiede zwischen iRRV- und RRV-infizierten B-Zellen oder zwischen RRV- und Wa-infizierten Zellen hin (P = 0,01, Wilcoxon-Test). ns, nicht signifikante Unterschiede. (B) CBC waren scheininfiziert oder mit iRRV, RRV (MOI, 5) oder 80 μM Etoposid infiziert. Nach 10 h wurde die Expression von PI, Annexin V und NSP2 durch Durchflusszytometrie in B-Zellen bewertet. Für RRV-infizierte Zellen werden Gates auf NSP2 +- und NSP2 −-Zellen gezeigt. Ein repräsentatives Experiment von drei durchgeführten Experimenten wird vorgestellt.

Um den durch RRV in CBC erzeugten Todesmechanismus weiter zu untersuchen, wurden infizierte CBC mit Annexin V (einem Apoptosemarker) und Propidiumiodid (PI) (einem Nekrosemarker) gefärbt. Wie in Abb. ​ Abb.3B, 3B zu sehen ist, wurden mit diesen Markern Färbungsniveaus nachgewiesen, die mit den oben beschriebenen für das fluoreszierende Amin vergleichbar waren. Die Analyse infizierter Zellen (Abb. ​ (Abb.3B) 3B) zeigte eine überwiegende Häufigkeit von Annexin V- und PI-doppelt positiven Zellen, was darauf hindeutet, dass Nekrose wahrscheinlicher als Apoptose (15, 19) der primäre Mechanismus ist für RV-induzierten B-Zell-Tod. Diese Ergebnisse legen nahe, dass RRV Veränderungen der Lebensfähigkeit in einer signifikanten Fraktion von CBC induziert, während IBC, die leichter infiziert werden können, relativ resistent gegen RV-induzierten Tod früh (10 h) nach der Infektion sind. Es wurden keine Unterschiede zwischen Schein- und Wa-infizierten B-Zellen festgestellt, wahrscheinlich aufgrund der geringeren Häufigkeit von Zellen, die eine Virusinfektion unterstützen (Abb. ​ (Abb. 3A 3A).

RV induziert über einen indirekten Mechanismus die B-Zell-Aktivierung und Differenzierung zu ASC.

T-unabhängige massive B-Zell-Aktivierung wurde nach RV-Infektion berichtet in vivo und in vitro im Mausmodell (6, 10). Um zu bestimmen, ob RV die Aktivierung von humanem CBC und IBC . induziert in vitrowurden die Expressionsspiegel von CD69, CD40, CD86 und HLA-DR nach der Schein-, iRRV- oder RRV-Infektion von negativ gereinigtem CBC, IBC oder den entsprechenden PBMC- und IMC-Präparaten, aus denen B-Zellen gereinigt wurden, durchflusszytometrisch untersucht. Als positive Kontrollen für die B-Zell-Aktivierung wurden Zellstimulationen mit LPS, CpG 2006 oder in einigen Fällen Anti-BCR verwendet. LPS und CpG 2006 erhöhten signifikant den Prozentsatz an CD69 + B-Zellen, die in gereinigten CBC und PBMC vorhanden waren (Abb. ​ (Abb.4A, 4A, oben). Nach einer RV-Infektion wurde jedoch keine B-Zell-Aktivierung beobachtet in gereinigten zirkulierenden oder intestinalen B-Zellen (Abb. ​ (Abb. 4A, 4A, oben und unten, offene Balken). Auffallenderweise war die Häufigkeit aktivierter B-Zellen nach der RV-Infektion von PBMC signifikant höher als bei gereinigtem CBC abgeleitet von den PBMC (Abb. ​ (Abb. 4A, 4A, oben, gepunktete Balken). Die RV-Replikation war keine kritische Voraussetzung für die Aktivierung, da iRRV die CD69-Expression in PBMC sowie in lebenden RRV erhöhte (Abb. ​). x200B (Abb.4A, 4A, oben) Im Gegensatz dazu aktivierten RV und CpG 2006 IBC und IMC nicht, und nur eine geringe, aber signifikante Aktivierung (Abb. ​ (Abb.5A, 5A, unten) wurde nach die LPS-Behandlung von gereinigtem IBC und ganzem IMC (P < 0,03, Mann-Whitney-Test). Die Anti-BCR-Behandlung von gereinigtem CBC und IBC, die als positive Kontrollen verwendet wurden, führte zu einer erhöhten Expression von CD69 (Median für CBC, Bereich 26%, Median 15 bis 77% für IBC, Bereich 13% 3 bis 20&# x00025 n = 4 Daten nicht angezeigt). Ein nicht signifikanter, aber konsistenter Anstieg der CD86-Expression wurde bei mit RV infizierten CBC festgestellt, jedoch wurden keine Veränderungen beobachtet, wenn HLA-DR oder CD40 analysiert wurden (Daten nicht gezeigt). Zusammengenommen weisen diese Ergebnisse darauf hin, dass RV die Aktivierung von B-Zellen im Kreislauf induzierte, wenn sie als Bestandteil von PBMC vorhanden waren und nicht, wenn sie gereinigt wurden. Auf der anderen Seite wurden IBC nicht durch RV-Behandlung aktiviert (außer bei einer schwachen Aktivierung mit LPS), selbst wenn sie als Bestandteil von IMC exponiert wurden.

Da RV die B-Zell-Aktivierung in PBMC induzierte, wollten wir bestimmen, ob RV auch die BC-Differenzierung zu ASC induzieren könnte. Zu diesem Zweck wurden PBMC und CBC scheininfiziert oder mit iRRV oder RRV infiziert, und die Häufigkeit von Gesamt-IgA- und IgG-ASC wurde nach 5-tägiger Kultur mit dem zweifarbigen ELISPOT-Assay gemessen. In Übereinstimmung mit der CD69-Expressionsanalyse (Abb. ​ (Abb.4A), 4A) erhöhte die RRV-Infektion von PBMC die Häufigkeit von IgA/IgG-ASC in der Kultur signifikant (Abb. ​ (Abb.4B, 4B) , oben) Dieser Effekt war nicht von der RV-Replikation abhängig und wurde nicht durch die LPS-Kontamination des RRV-Präparats erklärt, da iRRV- und Polymyxin B-behandelter RRV-Überstand ähnliche Häufigkeiten von IgA/IgG-ASC in der Kultur induzierte (Abb. & #x200B (Abb. 4B, 4B, oben bzw. Daten nicht gezeigt) Im Gegensatz zur Wirkung des Virus auf PBMC führte die RV-Infektion von gereinigtem CBC nicht zu einer bemerkenswerten ASC-Differenzierung (Abb. ​ ( 4B , 4B , unten), was darauf hindeutet, dass Faktor(en) aus einer anderen Zelle(n), die in der PBMC-Population vorhanden sind, wahrscheinlich für die RV-vermittelte zirkulierende B-Zell-Aktivierung und Differenzierung zu ASC notwendig waren.

Als nächstes untersuchten wir, ob RV die Differenzierung von B-Zellen zu ASC modulieren könnte, die durch verschiedene polyklonale Stimulationen induziert wurde. CBC und PBMC wurden mit den Toll-like-Rezeptor (TLR)-Agonisten LPS und CpG 2006 sowie Anti-BCR behandelt und gleichzeitig mit RRV infiziert. Alle Stimuli wurden während des Zeitverlaufs des Experiments aufrechterhalten, wie in Materialien und Methoden beschrieben. Hohe Häufigkeiten von ASC wurden nach der LPS-Behandlung und noch mehr nach der CpG 2006-Behandlung von scheininfizierten PBMC oder CBC beobachtet (Abb. ​ (Abb.4C, 4C, offene Kreise). Eine signifikante Abnahme der Häufigkeit von ASC Generation wurde bei gleichzeitiger RV-Infektion in CpG-stimulierten PBMC und CBC und LPS-behandelten CBC beobachtet (Abb. ​ (Abb.4C, 4C, ausgefüllte Kreise). Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass RV die Differenzierung von polyklonalen stimulierte CBC zu ASC.

RV induziert die IL-6-Sekretion in menschlichem CBC, jedoch nicht in IBC.

Neuere Studien haben gezeigt, dass Zytokine, die von B-Zellen freigesetzt werden, eine wichtige Rolle bei der Modulation der Immunantwort spielen können (36, 47, 48, 73). Wir analysierten durch CBA das Muster der Zytokine (IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12p70 und TNF-α), die von CBC und IBC 72 h nach RV-Infektion produziert werden . Im Allgemeinen wurden in den Überständen von CBC höhere Spiegel von IL-6 und IL-8 gefunden als in denen von IBC (Abb. ​ (Abb.5). 5). RRV und iRRV verstärkten signifikant die Sekretion von IL-6 aus CBC, aber nicht aus IBC (P < 0,01 und P > 0,2 Wilcoxon-Test) (Abb. ​ (Abb.5, 5, oben und unten). Eine vergleichbare IL-6-Sekretion wurde nach der Infektion von CBC mit Cäsium-gereinigtem RRV erhalten, wobei die Möglichkeit ausgeschlossen wurde, dass dieses Zytokin wurde durch zelluläre Komponenten induziert, die in den Überständen vorhanden sind (n = 3) (Daten nicht angezeigt). IL-8 wurde in diesen Experimenten nicht durch RRV oder iRRV induziert. IL-10 und TNF-α wurden unregelmäßig in CBC induziert, jedoch nicht in IBC (Abb. ​ (Abb. 5).

Als nächstes untersuchten wir, ob RV die Sekretion von Zytokinen modulieren könnte, die durch polyklonal stimulierte B-Zellen induziert wird. Nach polyklonaler Stimulation mit anti-BCR (oder LPS- und CpG 2006-Daten nicht gezeigt) von scheininfizierten Zellen eine signifikante Erhöhung der Sekretion von IL-6 und IL-8 in CBC und IBC und TNF-α nur in CBC, wurde beobachtet (Abb. ​ (Abb.5). 5). Interessanterweise wurde eine signifikante Abnahme der IL-6- und IL-8-Sekretion bei mit RV infizierten Anti-BCR-behandelten CBC im Vergleich zu nicht infizierten Anti-BCR-behandelten Kontrollzellen beobachtet (P = 0,02 und P = 0,03 bzw. Wilcoxon-Test n = 13), und diese unterdrückende Reaktion war bei anti-BCR-behandelten infizierten IBC nicht vorhanden (Abb. ​ (Abb. 5). 5). Eine geringe Produktion von TNF-α (Median, 9 pg/ml Bereich, 1,8 bis 30 n = 12 Abb. ​ Abb.5) 5) und IL-10 (Median, 20 pg/ml Bereich, 5 bis 183 n = 10 Daten nicht gezeigt) wurde durch die Anti-BCR- bzw. CpG 2006-Stimulation von CBC provoziert. Bemerkenswert ist, dass auch nach einer RV-Infektion eine nachweisbare, aber nicht signifikante Abnahme von TNF-α in anti-BCR-stimulierten CBC erhalten wurde (Abb. ​ (Abb. 5, 5, oben). Im Gegensatz dazu IL-12p70 und IL-1β wurden in den Kulturen von CBC oder IBC mit keiner der Stimulationen nachgewiesen (Daten nicht gezeigt).Zusammenfassend sezernieren CBC und IBC Zytokine unterschiedlich nach einer RV-Infektion, wobei CBC stärker anspricht und RV die Sekretion von IL-6 und IL-8 aus anti-BCR-stimulierten CBC, aber nicht aus IBC (Abb. ​ (Abb. 5).

Die polyklonale Stimulation induziert einen signifikanten Anstieg der RRV-Infektion und des Zelltods bei CBC, jedoch nicht bei IBC.

Da RV die Frequenz von ASC und die Sekretion von IL-6 und IL-8 in polyklonal stimulierten B-Zellen modulieren kann (Abb. ​ (Abb.4 4 bzw B-Zell-Aktivierung bei viraler Replikation und Zelllebensfähigkeit CBC und IBC blieben unbehandelt oder wurden mit Anti-BCR, LPS oder CpG 2006 behandelt und dann mit iRRV, RRV oder Wa scheininfiziert oder infiziert. Anti-BCR, LPS , oder CpG 2006-Behandlung wurde während der Inkubation aufrechterhalten. In polyklonal stimulierten Zellen, die mit iRRV scheininfiziert oder infiziert waren, wurden keine NSP2 + B-Zellen nachgewiesen mit anti-BCR erhöhte sich der Prozentsatz der CBC, die die RRV-Replikation unterstützen, um das Dreifache. Die LPS-Behandlung hatte auch eine signifikante stimulierende Wirkung auf die RRV-Infektion (Abb. ​ (Abb.6B). 6B). Im Gegensatz dazu keine Zunahme in der Häufigkeit von NSP2-&rgr;-Zellen wurde in IBC nachgewiesen, die mit denselben Stimuli behandelt wurden (Abb. 6A und B). ase in der Wa-infizierten Zellzahl wurde in polyklonal stimulierten CBC beobachtet (n = 5) (Abb. ​ (Abb.6B). 6B ). Interessanterweise zeigte sich bei der gemeinsamen Analyse von Virusinfektion und Zelltod ein signifikant positiver Zusammenhang (n = 6, P = 0,02, Mann-Whitney-Test) zwischen dem Anstieg der RV-infizierten Zellzahl und dem CBC-Tod wurde in LPS-behandelten Zellen gefunden (Abb. ​ (Abb. 6C). 6C). Obwohl bei anti-BCR-stimulierten CBC keine signifikante Beziehung zwischen Zelltod und RV-Replikation beobachtet wurde, wurde eine ähnliche Tendenz festgestellt (Fig. 6A und C). Im Gegensatz zu CBC hatten RV-infizierte Anti-BCR- und LPS-stimulierte IBC keinen Anstieg der viralen Replikation und des RV-induzierten Zelltods (Abb. ​ (Abb. 6 6 ).

Die polyklonale Stimulation induziert eine Zunahme der RRV-Infektion und des Zelltods bei CBC, jedoch nicht bei IBC. (A) Gereinigtes CBC und IBC wurden vor der RRV-Infektion mit 10 µg/ml Anti-BCR-Antikörper behandelt (MOI, 5). Lebensfähigkeit und CD19- und NSP2-Expression wurden durch Durchflusszytometrie bei 10 hpi bestimmt. Ein Vertreter von 14 Experimenten ist gezeigt. (B) Die Verbesserung der viralen Replikation nach polyklonaler Stimulation wird als fache Zunahme dargestellt. Die Balken zeigen die Mediane und reichen von 8 bis 12 Experimenten für CBC und 6 bis 12 Experimenten für IBC. Für Wa RV werden fünf Experimente vorgestellt. * und **, statistisch signifikante Unterschiede zwischen RRV und Anti-BCR plus RRV (P = 0,0009) und zwischen RRV und LPS plus RRV oder Wa und Anti-BCR plus Wa (P = 0,03, Mann-Whitney-Test). (C) Gereinigte CBC und IBC wurden mit RRV oder RRV plus polyklonaler Stimulation infiziert und dann 10 h kultiviert.Die Zellen wurden gefärbt, um die Koexpression von Amin-Lebensfähigkeitsmarker und NSP2 zu bewerten. Balken stellen die mediane Häufigkeit von doppelt positiven (NSP2 + und Amin +) CBC (leere Balken) und IBC (gepunktete Balken) dar. P Werte (Mann-Whitney-Test) werden angezeigt (n = 6 bis 12 Versuche).

B-Zellen spielen keine Rolle bei der Stimulierung der RV-spezifischen Gedächtniszirkulation und der intestinalen CD4 + und CD8 + T-Zellen.

Um die Rolle von B-Zellen als Antigen-präsentierende Zellen zu charakterisieren, und in vitro Der T-Zell-Stimulationsassay wurde unter Verwendung von PBMCs und IMCs durchgeführt, die nicht abgereichert waren oder die von B-Zellen mit Mikrokügelchen abgereichert waren. Die Häufigkeiten von RV-spezifischen T-Zellen, die IFN-γ, IL-2, TNF-α oder IL-10 produzieren, wurden durch intrazellulären Zytokinnachweis bewertet. In Übereinstimmung mit unseren früheren Ergebnissen (39) wurde ein geringer, aber signifikanter Unterschied in der Häufigkeit von RV-spezifischen IFN-produzierenden CD4 + T-Zellen in mit RRV stimulierten PBMCs gefunden (Median 0,04 x00025 Bereich, 0,02 bis 0,11%) im Vergleich zu scheininfizierten Zellen (Median, 0,01% Bereich, 0,00 bis 0,02% P = 0.04, Wilcoxon-Test n = 5) (Abb. ​ (Abb.7). 7 ). Interessanterweise wurde auch ein wesentlicher Unterschied bei den intestinalen CD8-+-T-Zellen gefunden, die beide Schein (Median, 0,04% Bereich, 0,0 bis 0,08% P = 0,04, Wilcoxon-Test) oder RRV-stimuliert (Median, 0,58% Bereich, 0,04 bis 3,08%) (Abb. ​ (Abb.7)). Nach der Depletion von B-Zellen aus PBMCs oder IMCs wurden keine Unterschiede in der Häufigkeit von IFN-γ-produzierenden RV-spezifischen CD4- oder CD8-+-Zellen im Vergleich zu nicht-depletierten ganzen PBMCs oder IMCs gefunden, was darauf hindeutet: dass B-Zellen als Antigen-präsentierende Zellen in dieser Kurzform nicht signifikant beteiligt sind in vitro Gedächtnistest (Abb. ​ (Abb.7). 7). Es wurde jedoch eine bedeutende Abnahme der Häufigkeit von SEB-stimulierten intestinalen CD8 + T-Zellen, die IFN-γ produzieren, nach der B-Zell-Depletion beobachtet, was auf die Reduktion von HLA I-exprimierenden Zellen zurückzuführen sein könnte (HLA-Moleküle sind für eine adäquate Superantigenstimulation erforderlich). Bei den RV-spezifischen T-Zellen, die IL-10, TNF-α oder IL-2 produzieren, wurden keine wichtigen Unterschiede gefunden, die in PBMC oder IMC beobachtet wurden, die entweder nicht abgereichert oder von B-Zellen abgereichert blieben (Daten nicht gezeigt).

Zirkulierende und intestinale B-Zellen sind keine kritischen Antigen-präsentierenden Zellen für RV-spezifische T-Zellen. Ganze (offene Kreise) oder B-Zell-depletierte (gefüllte Kreise) PBMC oder IMC wurden scheinstimuliert oder mit RRV oder SEB stimuliert, wie in Materialien und Methoden beschrieben. Nach 10 h Kultur (Brefeldin A wurde für die letzten 5 h zugegeben) wurden die Zellen mit einem Lebensfähigkeitsmarker, MAb gegen CD3, CD4, CD8, CD69 und IFN-γ gefärbt. Die Häufigkeit von RV-spezifischen IFN-γ-produzierenden T-Zellen wurde mittels Durchflusszytometrie analysiert. Tote Zellen wurden von der Analyse durch Lebensfähigkeitsfärbung ausgeschlossen. Einzelne Experimente werden gezeigt. Linien repräsentieren die Mediane. Ein Sternchen weist auf signifikante Unterschiede zwischen Schein- und RV- oder SEB-stimulierten Zellen hin (P ≤ 0,04, Wilcoxon-Test).


Methoden

Patienten

Die Patienten wurden an das Dr. von Hauner Kinderkrankenhaus, Ludwig-Maximilians-Universität, München, Deutschland und die Abteilung für Pädiatrische Gastroenterologie, Bundesuniversität Minas Gerais, Belo Horizonte, Brasilien, überwiesen. Die Einverständniserklärung wurde gemäß den aktuellen ethischen und rechtlichen Richtlinien eingeholt. Das Studienprotokoll wurde vom Institutional Review Board des Universitätsklinikums Ludwig-Maximilians-Universität München (Projektnummer 381-11) genehmigt. Die Studie wurde in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki durchgeführt.

LCL-responsive T-Zelllinien

Für die Initiierung von T-Zelllinien (Passage 1) wurden 1 × 10 6 mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMC) von den Patienten P2.1 und P2.2 und von zwei EBV-seropositiven gesunden Spendern (HD1 und HD2) cokultiviert mit gammabestrahlten (80 Gy) autologen EBV + lymphoblastoiden Zelllinien (LCL) im Verhältnis 10:1 (PBMC:LCL) in einem Gesamtvolumen von 2 ml T-Zellmedium bestehend aus AIM-V Lymphozyten Medium ergänzt mit 10% gepooltem Humanserum, 2 mM  L-Glutamin, 10 mM HEPES und 1% Amphotericin B. Um die Expansion FCS-reaktiver T-Zellen zu verhindern, wurden Stimulator-LCL kontinuierlich in RPMI 1640 ergänztem Medium kultiviert mit 10% Humanserum, 2 mM L-Glutamin, 1% nichtessentielle Aminosäuren, 1 mM Natriumpyruvat, 2 mM  L-Glutamin und 50 mg ml 𢄡 Gentamicin wie beschrieben 35 . Nach 48 h wurden dem Kulturmedium 50 U ml𢄡 IL-2 (Novartis) zugesetzt. Die T-Zelllinien wurden alle zwei Wochen auf die gleiche Weise restimuliert und bei Bedarf aufgespalten. Nach zehn Passagen enthielten die Linien überwiegend (㺕%) CD3 + CD8 + Zellen und wenige (υ%) CD3 + CD4 + Zellen. Die Spezifität von T-Zellen wurde durch Inkubieren von 5 × 10 4 Zielzellen (autologe oder allogene HLA-fehlgepaarte LCL) mit 5 × 10 4 T-Zellen in einem Endvolumen von 200 μl T-Zell-Medium getestet. Nach 24 h Co-Kultur wurde ein ELISA (Rɭ Systems) zur Messung der überstehenden Zytokine durchgeführt.

Genetische Analyse

Genomische DNA der Probanden der Familie 1 F1, M1, P1.1, P1.2 und S1.1 ( 2a ) wurde unter Verwendung des Genom-weiten Human-SNP-Arrays 6.0 auf einer GEO-Plattform genotypisiert ","attrs":<"text":"GPL6801","term_id":"6801">> GPL6801 (Affymetrix) und wird verwendet, um Exombibliotheken mit dem SureSelect XT Human All Exon V4+UTRs-Kit (Agilent Technologies) vorzubereiten. Mit Barcodes versehene Bibliotheken wurden auf einer SOLiD 5500 XL Sequenzierungsplattform der nächsten Generation (Life Technologies) in der Sequenziereinrichtung des Dr. von Hauner Kinderkrankenhauses mit einer durchschnittlichen Abdeckungstiefe von 80 Reads sequenziert. Die bioinformatische Datenverarbeitung folgte einer hauseigenen Pipeline: Die Reads wurden mit der LifeScope Analysis Suite 2.5.1 (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) unter Verwendung von Standardparametern auf das menschliche Referenzgenom (Version hg19) ausgerichtet. Die Spurdaten für jede Probe wurden zusammengeführt und die PCR-Duplikate wurden unter Verwendung von SAMtools Version 1.18 (Ref. 36) entfernt. SAMtools wurde auch verwendet, um SNPs mit dem Befehl ‘mpileup –M 300 –I –g 𠄽 -C50 –S' aufzurufen. Kleine Insertionen und Deletionen (Indels) wurden unter Verwendung von DinDel Version 1.01 (Ref. 37 ) identifiziert, indem zuerst mutmaßliche Indels für jede Probe einzeln identifiziert und dann DinDel mit dem gepoolten Satz von Proben aus Familie A mit den zuvor identifizierten Indels erneut ausgeführt wurde als vorgeschlagene Varianten. Varianten wurden annotiert und ihre Manifestation auf mRNA- und Proteinebene gemäß der Ensembl-Datenbank (Version 68) identifiziert. Darüber hinaus wurden Informationen zu Variantenhäufigkeiten von HapMap (HM) 38 , 1000 Genome (TG) 39 , NHLBI Grand Opportunity Exome Sequencing Project (NH) und ExAC 40 gesammelt. Der WES-Ansatz für genomische DNA von Probanden der Familie 2 F2, M2, P2.1 und P2.2 wurden vor dem 20. veröffentlicht. Die c.489insG und c.871ʱG>T CARMIL2 Mutationen wurden durch Sanger-Sequenzierung bestätigt (siehe ergänzende Tabelle 5 für Primerinformationen). CARMIL2 cDNA wurde aus P2.1 T-Lymphoblasten-Gesamt-mRNA (RevertAid H Minus Reverse Trascriptase ThermoFisher Scientific) revers transkribiert und das Überspringen von Exon 11 wurde durch Sanger-Sequenzierung bestätigt (siehe ergänzende Tabelle 5 für Primerinformationen).

Zellkultur und Stimulation

PBMC wurden von gesunden Spendern und Patienten durch Ficoll-Hypaque (Pharmacia) Dichtegradientenzentrifugation isoliert. PBMC wurden in RPMI 1640 gehalten, ergänzt mit 2 mM Glutamin, 100 U ml 𢄡 Penicillin, 100 μg ml 𢄡 Streptomycin und 10% FCS (ThermoFisher) in 5% CO2 Inkubator bei 37 ଌ. Zelllinien wurden durch PCR mit dem VenorGeM Mycoplasma Detection Kit (MP0025, Sigma-Aldrich) negativ auf Mykoplasmen getestet. Es wurden Stimulationstitrationskurven erstellt (ergänzende Abb. 4b). Für T-Zell-Aktivierungs-, Proliferations- und Zytokinsekretionsexperimente wurden PBMC mit anti-CD3-gekoppelten Beads (Bio-anti-CD3, OKT3 von eBioscience gekoppelt mit anti-Biotin MACSiBeads von Miltenyi Biotec) im Verhältnis 10:1 mit und . stimuliert ohne 1 μg ml 𢄡 lösliches Anti-CD28 (CD28.2, eBioscience) oder mit 0,5 ng ml 𢄡 Phorbol 12-Myristat 13-Acetat (PMA) und 1 μM Ionomycin (Sigma-Aldrich). Für die T-Zell-Signalanalyse durch Immunblotting und (Phospho-) Durchflusszytometrie wurden T-Lymphoblasten aus PBMC mit 5 ng ml 𢄡 PMA, 1 μM Ionomycin und 100 U ml 𢄡 IL- induziert. 2 (Novartis) für zwei Tage und kultiviert für weitere 8� Tage in vollständigem RPMI 1640, ersetzt durch 100 U ml 𢄡 IL-2. Für T-Zell-Migrationsassays und die Analyse von Zytoskelettproteinen wurden PBMCs vier Tage lang mit 1 μg ml 𢄡 Phytohemagglutinin (Remel, Dartford) aktiviert. Die Zellen wurden dann in Medium gehalten, das 20 ng ml &x022121 rekombinantes IL-2 (Proleukin, Novartis) enthielt. Aktivierte humane T-Lymphoblasten wurden am 10. Tag nach der Stimulation verwendet.

Durchflusszytometrie

Treg Zellen wurden mit APC-H7-anti-CD3 (SK7, 1:50), APC-anti-CD4 (SK3, 1:100), PE-anti-CD25 (M-A251, 1:50) (alle BD Biosciences ) und FITC-anti-CD127 (eBioRDR5, 1:50, eBioscience). Die intrazelluläre Färbung mit PerCP-Cy5.5-anti-FOXP3 (PCH101, 1:25) wurde mit dem FOXP3-Färbekit (eBioscience) durchgeführt. Gedächtnis-T-Zellen wurden mit APC-H7-anti-CD3 (SK7, 1:50), PerCP-anti-CD4 (SK3, 1:10), PacB-anti-CD8 (RPA-T8, 1:100), APC-anti-CD28 (CD28.2, 1:200), PE-Cy7-anti-CD45R0 (HI100, 1:100), PE-anti-CCR7 (3D12, 1:5) (alle BD) und FITC-anti -CD27 (O323, 1:50, eBiowissenschaft). Proliferative Reaktion und AICD wurden durch Markierung von PBMC mit 2,5 μM Carboxyfluoresceindiacetatsuccinimidylester (CFSE, ThermoFisher), 7-Aminoactinomycin D (7-AAD, 2,5 μg ml𢄡, BD) gemessen. APC-H7-anti-CD3 (SK7, 1:50), PE-anti-CD25 (M-A251, 1:50), APC-anti-CD8 (SK1, 1:200) (alle BD) und PC5-anti -CD4 (13B8.2, 1:100, Beckman Coulter) 5 Tage nach der Stimulation. Die Degranulation von NK-Zellen und CTLs (zytotoxische T-Lymphozyten) wurde durch Oberflächenfärbung mit PerCP-anti-CD3 (SK7, 1:100), FITC-anti-CD8 (SK1, 1:100), APC-anti-CD56 (NCAM16 .) bestimmt .2, 1:100), PE-anti-CD107a (H4A3, 1:50) und PE-Cy7-anti-NKG2D (1D11, 1:20) (alle BD). Die Expressionsanalyse von Gesamt- und hochaffinem LFA1 wurde mit konformationsspezifischen monoklonalen Anti-LFA1-Antikörpern Klon 38 (AbD Serotec) und Klon 24 (freundliches Geschenk von N. Hogg) und Maus-IgG1 (MOPC-21) von Biozol (Eching) durchgeführt. als Isotypkontrolle bei 37 ଌ, 7% CO2, gefolgt von Ziegen-Anti-Maus-IgG-APC (BioLegend) auf Eis, alle in einer Konzentration von 10 μl ml 𢄡 verwendet. CXCR4 wurde mit PE-anti-CXCR4 (Klon 44717, 10 μl pro 10 6 Zellen, Rɭ Systems) nachgewiesen. Für die (Phospho-)Flow-Analyse wurden 2,5 × 10 6 T-Lymphoblasten mit titrierten Antikörperkonzentrationen (Ergänzende Abb. 6a) durch Quervernetzung von 1 μg ml 𢄡 anti-CD3 (UCHT1) und . stimuliert /oder 10 μg ml 𢄡 Anti-CD28 (CD28.2) mit 10 μg ml 𢄡 Ziegen-Anti-Maus-IgG alle von BD für die angegebene Zeit. Die Zellen wurden mit dem Fixierungs- und Permeabilisierungskit von Molecular Probes in 90% Methanol fixiert und permeabilisiert. Vor dem Anfärben von Oberflächenantigenen wurde ungebundenes Ziegen-Anti-Maus-IgG mit normalem Maus-IgG (Invitrogen) blockiert. Die permeabilisierten Zellen wurden mit den folgenden titrierten intrazellulären Antikörpern gefärbt: ERK1/2 phosphoryliert bei T202 und Y204 (�, 197G2, 1:200), ZAP70 phosphoryliert bei Y319 (�, 65E4, 1:400), PKC& #x003b8 phosphoryliert bei T538 (�, 1:200), Kaninchen AlexaFluor488-konjugierter Sekundärantikörper (�, 1:1000) alle gekauft von Cell Signaling und AlexaFluorA647-anti-NF㮫 p65 phosphoryliert bei S529 (K10- 895.12.50, 1:10) und AlexaFluorA647-anti-I㮫α (25/IkBa/MAD-3, 1:10), beide von BD gekauft. Gefärbte Zellen wurden unter Verwendung eines BD LSRII Fortessa- oder BD CANTOII-Durchflusszytometers analysiert. Gating-Strategien sind in der ergänzenden Abb. 11 gezeigt. Die Datenanalyse wurde mit der FlowJo-Software (TreeStar) durchgeführt.

Zytokinanalyse

Die Kulturüberstände wurden 48 h nach der Stimulation gesammelt, aus vier technischen Replikaten gepoolt und auf IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-12, IL-13, IL-17A, TNF-& x003b1, GM-CSF und IFN-γ unter Verwendung eines 10-Plex-Zytokin-Assay-Kits (L500000CA5) auf einem Bio-Plex 200-System (BioRad) gemäß den Anweisungen des Herstellers.

NK- und CD8-T-Zell-Degranulation und NKG2D-Expression

Die Degranulation von ruhenden und aktivierten NK-Zellen wurde durch Oberflächenfärbung von CD107a ohne (mittelkultivierte Zellen) und 3 h nach Stimulation mit K562-Zellen im Verhältnis 1:1 gemessen (Ref. 41). Als Zielzelllinie wurde die erythroleukämische Zelllinie K562 (ATCC, CCL-243) verwendet. NK-Zellen wurden in Medium mit 600 U ml 𢄡 IL-2 (Novartis) 48 h kultiviert, um die Degranulation aktivierter NK-Zellen zu beurteilen. Die Degranulation von CTL (zytotoxischen T-Lymphoblasten) wurde in T-Lymphoblasten 48 h nach Stimulation mit 1,25 μg ml 𢄡 Phytohemagglutinin-L (PHA-L, Sigma) und 200 U ml 𢄡 IL- untersucht. 2 (Novartis). Die CTL-Degranulation wurde anhand der Differenz der medianen Fluoreszenzintensität von CD107a von CTLs berechnet, die mit CD3/CD28-beschichteten Mikrokügelchen (ThermoFisher Scientific) im Verhältnis 1:10 für 3 h- und Medium-kultivierte Zellen stimuliert wurden.

Immunblotting und CD28-Co-Signalisierung

Für die CARMIL2-Expression, die CD28-Co-Signalgebung und die Zytoskelett-Analysen wurden die Zellen unstimuliert bzw. stimuliert, wie oben erwähnt. Proteinisolierung, SDS-PAGE und Immunblotting wurden wie an anderer Stelle veröffentlicht 42 durchgeführt. Folgende Primär- und Sekundärantikörper wurden verwendet: CARMIL2 (HPA041402, 1:400, Sigma-Aldrich und ab122717, 1:400, Abcam), Aktin (sc-8432, 1:500, Santa Cruz), detyrosiniertes α-Tubulin (Glu-Tubulin, AB3201, 1:500, Millipore), acetyliertes α-Tubulin (6-11-B-1, ab24610, 1:1.000, Abcam), α-Tubulin (DM1A, CP06,1: 2.000, Calbiochem), Vinculin (V9131, 1:10.000, Sigma-Aldrich), p38 (� 1:1.000, Cell Signalling) und Ziegen-Anti-Maus-HRP (1:4.000) und Ziegen-Anti-Kaninchen- HRP (1:5.000) beide von Jackson ImmunoResearch gekauft. Für die (Phospho)-Protein-Analyse wurde die Generierung und Stimulation von T-Lymphoblasten wie oben beschrieben durchgeführt und die folgenden Antikörper verwendet: ERK1/2 phosphoryliert an T202 und Y204 (�, 197G2, 1:1.000), ZAP70 phosphoryliert bei Y319 (�, 65E4, 1:1.000), PKCθ phosphoryliert bei T538 (�, 1:1.000), NF-㮫 phosphoryliert bei S536 (�, 1:1.000) und Kaninchen HRP -konjugierter sekundärer Antikörper (�, 1:3.000), alle von Cell Signalling gekauft. Unbeschnittene Immunoblots sind in den ergänzenden Abb. 8� dargestellt.

Quantifizierung von F-Aktin

Um die Menge an F-Aktin zu quantifizieren, wurden T-Lymphoblasten unbehandelt gelassen oder mit 100 nM Phorbol-Myristat-Acetat (PMA, Sigma-Aldrich) für 5 min oder mit 0,5 μM Latrunculin B (Calbiochem) inkubiert. für 10 min bei 37 ଌ gefolgt von einer Fixierung mit 4% Paraformaldehyd. Die fixierten Zellen wurden mit 0,01% Triton X-100 (Sigma-Aldrich) permeabilisiert, mit Phalloidin-Alexa594 (1:500, Invitrogen) gefärbt und die F-Aktin-Menge wurde durch Durchflusszytometrie-Analyse mit einem BD FACSCalibur und der FlowJo-Software quantifiziert ( Baumstern).

Migrationsassays

Die zweidimensionale Migration von T-Lymphoblasten auf ICAM1 wurde auf mit 0,15 μg rekombinantem humanem ICAM1/Fc (Rɭ Systems) pro Kanal beschichteten μ-Objektträgern (Ibidi) über Nacht um 4 ଌ analysiert. Objektträger wurden vor der Verwendung 1 h mit 1% BSA/PBS blockiert. Insgesamt 5 × 10 4 T-Lymphoblasten pro Kanal durften in einer dampfgesättigten Inkubationskammer bei 37 ଌ, 7% CO . wandern2, und Bilder wurden alle 8 s für 1 h mit einem Plan-Apochromat 40 × /1.3 NA Ölobjektiv mit einem Axiovert 200 Mikroskop (alle Zeiss Mikroskopie) aufgenommen. Die Migrationsgeschwindigkeit, akkumulierte und euklidische Distanz und Direktheit wurden mit der Software ImageJ (National Institute of Health) und dem Chemotaxis- und Migrationstool V2.0 von Ibidi quantifiziert. Zellen, die in 30 min 㲀 μm migrierten, wurden nicht berücksichtigt, da sie größtenteils stationär waren. Um die dreidimensionale Migration von T-Lymphoblasten zu analysieren, wurde eine Kollagenmatrix mit 1 mg ml 𢄡 Kollagen Typ I aus dem Rattenschwanz nach Herstellerangaben hergestellt (Ibidi). Aktivierte T-Lymphoblasten wurden in einer Konzentration von 1 × 10 5 Zellen innerhalb eines μ-Objektträgers in die Kollagenmatrix eingebettet. Die Analyse und Quantifizierung der Zellmigration wurde wie oben beschrieben durchgeführt, indem alle 8 s für 30 min Bilder mit einem EC Plan-Neofluar 20 × /0,50 NA aufgenommen wurden. Migrationsassays als Reaktion auf CXCL12 wurden mit 6,5 mm Transwells mit 5 μm Porengröße (Corning) durchgeführt. 5 × 10 5 T-Lymphoblasten wurden auf die Oberseite jedes Filters gegeben. Medium mit 2,5% Serum und 25  mM Hepes wurde unten platziert und bei Bedarf mit 100 ng ml 𢄡 CXCL12 (Rɭ Systems) ergänzt. Die Assays wurden 2 h bei 37 ଌ und 7% CO . durchgeführt2. Migrierte Lymphozyten wurden gesammelt und unter Verwendung von CountBright Absolute Counting Beads (Molecular Probes) und einem BD FACSCalibur quantifiziert.

Immunfluoreszenz-Bildgebung

Die Immunfluoreszenzfärbung der migrierten Zellen wurde auf 15 -mm-Glasdeckgläsern durchgeführt, die mit 0,7 μg rekombinantem humanem ICAM1/Fc (Rɭ Systems) beschichtet waren. Die Migration von 1 × 10 5 T-Lymphoblasten war für 1 h bei 37 ଌ, 7% CO . erlaubt2 in HBSS/25 mM HEPES. Adhärente Zellen wurden mit 3% Paraformaldehyd fixiert, mit 0,1% Triton X-100 permeabilisiert und die Deckgläser wurden mit einem Anti-LFA1-Antikörper (Klon 38, 10 μg ml 𢄡, AbD Serotec) inkubiert, gefolgt von Ziegen-Anti-Maus-Alexa 488 (Molecular Probes 1:150) oder Phalloidin-Alexa 546 (1:100, Invitrogen). Zur Lokalisierung von Tubulin wurden polarisierte T-Zellen in halbkonzentriertem PHEM-Puffer fixiert (30 mM PIPES, 12,5 mM HEPES, 5 mM EGTA, 1 mM MgCl2 pH 6,9) frisch ergänzt mit 0,25% Glutaraldehyd und 0,25% Triton X-100 für 5 min. Unumgesetztes Glutaraldehyd wurde 10 min mit 1 mg ml 𢄡 frisch gelöstem Natriumborhydrid gequencht und T-Zellen wurden Anti-Tubulin-Antikörper (YL12, ab6160, 1:200 Abcam) ausgesetzt, gefolgt von Ziege-Anti-Ratte -Cy3 (1:200, Jackson ImmunoResearch). Als Eindeckmedium wurde ProLong Gold Antifade Reagent (Life Technologies) verwendet. Fixierte Proben wurden bei Raumtemperatur mit einem an ApoTome befestigten Observer Z1 und einem Plan-Apochromat 100 × /1.4 NA Ölobjektiv (Zeiss Microscopy) abgebildet. Hellfeldbilder wurden unter Verwendung von Differenzialinterferenzkontrast (DIC) durchgeführt. Zur Bildaufnahme und Bildanalyse wurde eine AxioCam MRm Kamera und die AxioVision Software (Zeiss Microscopy) verwendet.

Immunhistochemie und vor Ort Hybridisierung

Für die Immunhistochemie wurden die folgenden Antikörper und Verdünnungen auf einem Ventana Benchmark XT Autostainer mit ultraView Universal DAB-Nachweiskits (Ventana Medical Systems) verwendet: Muskelspezifisches Aktin (DAKO HHF35 1:200), Calponin (DAKO CALP 1:300), Pan- Zytokeratin (Beckman Coulter KL-10 1:150), Desmin (DAKO D33 1:300), CD34 (Cell Marque QBEnd/10 1:800), CD117 (DAKO A4502 1:400), S100 (DAKO Z0311 1:3.000) , Ki67 (DAKO MIB-1 1:150), CD80 (Abcam EPR1157(2) 1:300), p53 (Leica Microsystems DO-7 1:25), C-MYC (Abcam Y69 1:100), LMP1 (Diagnostic BioSystems CS1/CS2/CS3/CS4 1:100), LMP2A (Acris Antikörper 15F9 1:100), EBNA2 (Merck Millipore R3 1:25) und der virale Transkriptionsfaktor ZEBRA (Santa Cruz Biotechnology BZ1 1:100). CD86 (BIOZOL Diagnostica 1B3 1:100) wurde manuell gefärbt. Chromogen vor Ort Hybridisierung für EBV-kodierte RNA (EBER) wurde unter Verwendung von Fluorescein-markierten Oligonukleotidsonden (INFORM EBER Probe, Ventana) durchgeführt. Fluoreszenz vor Ort Hybridisierung für C-MYC (Zyto Vision) wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt 43 .

Statistische Analyse

Die Daten wurden mit der Softwareumgebung R (Version 3.2.3) oder Prism 5 (GraphPad) für statistische Berechnungen und Grafiken analysiert. Die Gaußsche Normalverteilung von Datensätzen wurde unter Verwendung des Shapiro-Wilk-Normalitätstests getestet. Die Signifikanzen zwischen zwei Gruppen wurden mit den zweiseitigen ungleichen Varianzen von Welch berechnet T-Test oder zweiseitige ungepaarte Student's T-Prüfung. Zwei-Wege-ANOVA wurde für Vergleiche von mehr als zwei Gruppen verwendet. P Werte von π.05 wurden als signifikant angesehen.

Datenverfügbarkeit

CARMIL2-Variantendaten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, wurden bei ClinVar mit den primären Zugangscodes SCV000322745 und SCV000322755 hinterlegt. Weitere Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind auf Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.