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D1. Sequentielle Mechanismen aus mehreren Substraten - Biologie

D1. Sequentielle Mechanismen aus mehreren Substraten - Biologie



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In Wirklichkeit haben viele Enzyme mehr als ein Substrat (A, B) und mehr als ein Produkt (P, Q). Dies würde auch eine Reihe von linearen 1/v vs. 1/A doppelreziproken Plots (Lineweaver-Burk-Plots) ergeben. Das Muster der Lineweaver-Burk-Diagramme hängt davon ab, wie die Reaktanten und Produkte mit dem Enzym interagieren.

Sequenzieller Mechanismus

Bei diesem Mechanismus müssen beide Substrate an das Enzym binden, bevor Produkte hergestellt und freigesetzt werden. Die Substrate können zufällig (A zuerst, dann B oder umgekehrt) oder geordnet (A zuerst gefolgt von B) an das Enzym binden. Ein von W.W. Cleland wird unten für die sequentiell zufälligen und sequentiell geordneten Mechanismen gezeigt. Für beide Mechanismen ergeben Lineweaver-Burk-Plots bei variierendem A und verschiedenen festen Werten von B eine Reihe von sich schneidenden Linien. Ableitungskurven können gelöst werden, um geeignete kinetische Konstanten zu erhalten.


Der Verlust von reifem D1 führt zu einer kompromittierten CP43-Baugruppe in Arabidopsis thaliana

Photosystem II (PSII) ist ein hochkonservierter Integralmembran-Pigment-Protein-Komplex mit mehreren Untereinheiten. Die Proteine, Pigmente, Lipide und Ionen in PSII müssen präzise zusammengesetzt werden, um eine ordnungsgemäße PSII-Biogenese zu gewährleisten. D1 ist die Hauptuntereinheit des PSII-Kernreaktionszentrums (RC) und wird normalerweise als Vorläufer D1 synthetisiert. Die D1-Reifung durch die C-terminale Prozessierungsprotease CtpA ist für die PSII-Assemblierung essentiell. Der detaillierte Mechanismus, wie die D1-Reifung die PSII-Assemblierung beeinflusst, ist jedoch bisher nicht klar aufgeklärt. In dieser Studie, Arabidopsis thaliana CtpA Mutant (atctpa: SALK_056011), dem der ausgereifte D1-Prozess fehlt, wurde verwendet, um die Funktion dieses Prozesses bei der PSII-Assemblierung genauer zu untersuchen.

Ergebnisse

Ohne die C-terminale Prozessierung der Vorstufe D1 wurde die PSII-Assemblierung, einschließlich des PSII-Monomers, des Dimers, insbesondere der PSII-Superkomplexe (PSII-SCs), wie bereits berichtet, weitgehend beeinträchtigt. Western-Blotting nach der BN-2D-SDS-PAGE zeigte, dass, obwohl der Zusammenbau der PSII-Kernproteine ​​D2, CP43 und CP47 durch den Verlust des D1-Reifungsprozesses beeinflusst wurde, der Einbau von CP43 am stärksten beeinflusst wurde, was durch seine am stärksten reduzierte Zusammenbaueffizienz angezeigt wird in PSII-SCs. Darüber hinaus bestätigte das langsamere Wachstum von Hefezellen, die mit pD1 und CP43 co-transformiert wurden, im Vergleich zu denen, die mit reifem D1 und CP43 co-transformiert wurden, dass die Existenz eines C-terminalen Schwanzes von D1 die Interaktionseffizienz zwischen D1 und CP43 behinderte. Dies zeigt die physiologische Bedeutung des D1-Reifungsprozesses für den PSII-Aufbau und das gesunde Wachstum der Organismen.

Schlussfolgerungen

Der Knockout Arabidopsis atctpa Mutante ist ein gutes Material, um den unerwarteten Zusammenhang zwischen der D1-Reifung und der PSII-SCs-Assemblierung zu untersuchen. Der Verlust der D1-Reifung betrifft hauptsächlich den Einbau des PSII-Kernproteins CP43, eines inneren Antennenbindungsproteins, das bei der Assoziation von LHCII-Komplexen an PSII-Dimere während der Bildung von PSII-SCs eine Rolle spielt. Unsere Ergebnisse hier liefern detaillierte Unterstützung für die Rolle der D1-Reifung während der PSII-SCs-Assemblierung in höheren Pflanzen.


Schilddrüsenerkrankungen im Kindes- und Jugendalter

DELBERT A. FISHER MD , ANNETTE GRUETERS MD , in Pädiatrische Endokrinologie (Dritte Ausgabe) , 2008

Stoffwechsel von Schilddrüsenhormonen

Die Deiodierung ist der wichtigste Stoffwechselweg der Schilddrüsenhormone. 13 Der erste Schritt im T4-Metabolismus ist die Dejodierung zu T3 oder die Umkehrung von T3 (rT3) (Abbildung 7.1). Die fortschreitende Dejodierung der Jodthyronine wird über drei Monodejodinase-Enzyme vermittelt: MDI Typ I, MDI Typ II und MDI Typ III (Tabelle 7-2). Monodeiodierung des Beta- oder äußeren Rings (relativ zur Alanin-Seitenkette) produziert T3, das die drei- bis vierfache metabolische Potenz von T4 hat. Die Monodeiodierung des Alpha- oder Innenrings produziert rT3, das metabolisch weitgehend inaktiv ist. Unter normalen Umständen werden T3 und rT3 mit ungefähr ähnlichen Raten produziert.

In den meisten Geweben (insbesondere der Leber und mit Ausnahme des Gehirns und des braunen Fettgewebes) diffundieren T3 und rT3 (durch T4-Monodeiodierung erzeugt) schnell vom Gewebe in die interstitielle Flüssigkeit in das Plasma. Signifikante Mengen an T3 und geringe Mengen an rT3 werden von der Schilddrüse synthetisiert und freigesetzt. Somit spiegeln die zirkulierenden Spiegel von T3 und rT3 sowohl die Sekretion als auch die periphere Produktion wider. 70 bis 90 % des zirkulierenden T3 stammen aus der peripheren Umwandlung und 10 bis 25 % aus der Schilddrüse. Die entsprechenden Werte für rT3 sind 96 % bis 98 % und 2 % bis 4 %. Progressive Monodeiodierungsreaktionen im Gewebe bauen T3 und rT3 zu Diiod, Monoiod und nichtiodiertem Thyronin ab.

Die Alanin-Seitenkette des inneren Rings der Iodthyronine unterliegt auch Abbaureaktionen, einschließlich Transminierung, Desaminierung und Decarboxylierung. 14 Brenztraubensäure-Analoga und geringe Mengen von Milchsäure-Analoga wurden in Urin und Galle beobachtet. Diese haben eine minimale biologische Aktivität. Die in Gewebe, Galle und Urin gefundenen Essigsäureanaloga besitzen eine gewisse Aktivität, werden jedoch schnell abgebaut. Schilddrüsenhormone werden sowohl in freier als auch in konjugierter Form mit Urin und Stuhl ausgeschieden. Die Reaktionen beinhalten eine Glucuronid-Konjugation und eine Sulfokonjugation. Die Glucuronid-Konjugation erfolgt hauptsächlich in der Leber über die mikrosomale Glucuronyl-Transferase. Sulfokonjugation ist auch in der Leber von Bedeutung und kann ein obligatorischer Schritt für hepatische Monodeiodierungsreaktionen sein. 14 Die Iodthyroninsulfatierung verstärkt die Deiodierung des äußeren Rings in der Leber deutlich. Beim Fötus, bei dem die Deiodinase-Aktivität des äußeren Rings entwicklungsbedingt gering ist, sind die wichtigsten Metaboliten des Schilddrüsenhormons Sulfatkonjugate – die biologisch inaktiv sind. (Siehe Kapitel 6.)


Enzyme: Definition, Mechanismen und Klassifikation | Mikrobiologie

In diesem Artikel werden wir diskutieren über: 1. Definition von Enzymen 2. Mechanismus der Enzymwirkung 3. Enzymkinetik 4. Allosterische Enzyme 5. Klassifikation 6. Komponenten.

Definition von Enzymen:

Enzyme sind hochspezialisierte Proteine, die als Katalysator des biologischen Systems wirken. Louis Pasteur war der erste, der die Bedeutung von Enzymen bei der Untersuchung des Fermentationsprozesses erkannte und ihn als “Ferment” bezeichnete – ein integraler Bestandteil lebender Zellen.

Es war Edward Buchner, der 1897 das Enzym aus Hefezellen extrahierte, das für die Vergärung von Zucker zu Alkohol verantwortlich ist. 1926 isolierte und kristallisierte James B. Sumner Urease und postulierte auch, dass alle Enzyme Proteine ​​sind. Heute wissen wir, dass dies wahr ist, jedoch mit Ausnahme von Ribozymen, die eine katalytische RNA sind.

Enzyme sind die großen kugelförmigen Proteine ​​mit einem Molekulargewicht von 13.000 bis Millionen Dalton. Die katalytische Effizienz eines Enzyms hängt von seiner dreidimensionalen Konformation ab.

Darüber hinaus sind diese Biokatalysatoren hochspezifisch für die Reaktion sowie andere Bedingungen, z. Jedes Enzym hat seinen eigenen optimalen pH-Wert, seine eigene Temperatur usw. für maximale Leistung. Einige Enzyme benötigen für ihre biologische Aktivität eine zusätzliche Einheit, die als Cofaktoren bekannt ist.

Mechanismus der Enzymwirkung:

Das Enzym ist aktiv in der katalytischen Wirkung der biochemischen Reaktion. Sie wirken auf Substrat und bilden nach Wechselwirkungen mit dem Enzym einen Komplex, der als aktives Zentrum bezeichnet wird. Enzym und Substrat bilden am aktiven Zentrum einen Komplex.

Diese Bindungswirkung macht sowohl Enzym als auch Substrat stabil. Die Wechselwirkung zwischen Substrat und Enzym kann entweder ionische Bindungen und Wasserstoffbrücken oder Van-der-Waal-Kräfte sein. Die aktiven Zentren des Enzyms haben einige spezielle Gruppen wie NH2 COOH, -SH usw., die das Substrat durch obige Bindungen binden, um eine Übergangs-(Zwischen-)Verbindung zu bilden, die Enzym-Substrat-Komplex (ES) genannt wird.

Diese Reaktion ist exergonisch und setzt etwas Energie frei, die das Energieniveau des Substratmoleküls erhöht.

Daher wird die Aktivierung des Substratmoleküls und das Phänomen als Aktivierungsenergie oder Aktivierungsenergie bezeichnet, wie in Abb. 12.10 gezeigt:

Arten von Mechanismen von Enzymen:

Es gibt zwei Arten von Mechanismen, die beteiligt sind, um die Schloss- und Schlüsseltheorie der Substrat-Enzym-Komplexbildung (Schablonenmodell) und die Theorie der induzierten Anpassung zu erklären.

(i) Schloss- und Schlüsseltheorie:

Emil Fischer (1894) erklärte die spezifische Wirkung eines Enzyms mit einem einzigen Substrat mit einer Theorie des Lock-and-Key-Analogs (Abb. 12.11). Nach dieser Theorie ist die Reaktion von Unterzustand und Enzym analog zu Schloss und Schlüssel.

Enzym ist analog zum Schlüssel, bei dem die geometrische Konfiguration des Sockels festgelegt ist. In ähnlicher Weise hat das Substrat auch eine feste geometrische Konfiguration wie der Schlüssel. Ein bestimmtes Schloss kann mit einem bestimmten Schlüssel geöffnet oder geschlossen werden. Entsprechend dem jeweiligen Substrat kann am aktiven Zentrum des jeweiligen Enzyms ein Substrat-Enzym-Komplex gefunden werden.

Der Enzym-Substrat-Komplex bleibt eng anliegend und die aktiven Zentren der Enzyme sind komplementär zu den Substratmolekülen. Anschließend führen Enzym-Substrat-Komplexe aufgrund der Aktivität von Reaktionszentren zur Umwandlung des Substrats in die Produktbildung.

Da das Produkt eine geringere freie Energie hat, wird es freigesetzt. Enzyme werden fixiert, um ein weiteres Substratmolekül aufzunehmen, und somit setzt sich die Enzymaktivität fort. In dieser Analogie ist das Schloss das Substrat und der Schlüssel das Enzym. Nur der richtige Schlüssel (Substrat) passt in das Schlüsselloch (aktive Stelle) des Schlosses (Enzym).

Kleinere Schlüssel, größere Schlüssel oder falsch positionierte Zähne auf Schlüsseln (falsch geformte oder bemessene Substratmoleküle) passen nicht in das Schloss (Enzym).

Nur der richtig geformte Schlüssel öffnet ein bestimmtes Schloss, wie in Abb. 12.11 gezeigt:

(ii) Theorie der induzierten Anpassung:

1958 modifiziert Koshland das Fischer-Modell zur Bildung eines Enzym-Substrat-Komplexes, um die Enzymeigenschaft effizienter zu erklären. Nach dem Modell von Fischer ist die Natur des aktiven Zentrums des Enzyms starr, kann jedoch vorgeformt werden, um sich dem Substrat anzupassen.

Koshland erklärt, dass das Enzymmolekül seine ursprüngliche Form und Struktur nicht beibehält, aber der Kontakt des Substrats einige geometrische Veränderungen im aktiven Zentrum des Enzymmoleküls induziert. Das Enzymmolekül wird so hergestellt, dass es sich vollständig der Konfiguration und den aktiven Zentren des Substrats anpasst. Gleichzeitig können andere Aminosäurereste im Inneren des Moleküls vergraben werden.

Diese Theorie kann durch eine hypothetische Illustration erklärt werden, wie sie in Abb. 12.12 gezeigt ist. Sowohl die hydrophobe als auch die geladene Gruppe sind an der Substratbindung beteiligt. An der Katalyse sind eine Phosphoserin (-P) und eine SH-Gruppe des Cysteinrestes beteiligt.

Reste der anderen Aminosäure wie Lysin (Lys) und Methionin (Met) sind weder an der Bindung noch an der Katalyse beteiligt. In Abwesenheit von Substrat sind die substratbindende Gruppe und die katalytische Gruppe weit voneinander entfernt.

Der Kontakt des Substrats induziert jedoch eine Konformationsänderung im Enzymmolekül und richtet sowohl die Gruppen für die Substratbindung als auch die Katalyse aus. Gleichzeitig änderte sich auch die räumliche Ausrichtung der anderen Region. Dadurch kommen sich Lysin und Methionin viel näher.

Enzymkinetik:

Es gibt jetzt eine Reihe von Ansätzen, um den Mechanismus der Enzymwirkung zu untersuchen, einschließlich der Kenntnis der vollständigen 3D-Struktur, der ortsgerichteten Mutagenese und des Protein-Engineerings. genauer: ‘Die Enzymkinetik’.

Die Enzymkinetik folgt den Prinzipien der allgemeinen chemischen Reaktionskinetik, zeigt jedoch eine Besonderheit der Sättigung (Abb. 12.13). Bei niedrigerer Substratkonzentration ist die anfängliche Reaktionsgeschwindigkeit proportional zur Substratkonzentration (Reaktion 1. Ordnung). Eine weitere Erhöhung der Substratkonzentration hat keinen Einfluss auf die Reaktionsgeschwindigkeit und diese wurde konstant (Reaktion nullter Ordnung).

In der hypothetischen Ein-Substrat-Reaktions-Michaelis-Menten-Theorie verbinden sich Enzyme zuerst mit Substrat zu einem Enzym-Substrat-(ES)-Komplex.

Dieser ES-Komplex bricht dann im zweiten Schritt, um freies Enzym und Produkt freizusetzen als:

Gemäß den obigen Gleichungen entspricht die Anfangsgeschwindigkeit der vollständigen Reaktion dem Abbau des Enzymsubstratkomplexes. Somit,

Wobei Vo = Anfangsgeschwindigkeit,

(ES) = Konzentration des Enzymsubstratkomplexes

Jedoch kann keiner der beiden Parameter direkt bestimmt werden, und ein alternativer Ausdruck von Vo ist erforderlich. Dies kann durch Betrachtung der Geschwindigkeitsgleichung 2. Ordnung für die Bildung von ES aus E und S erfolgen.

d(ES)/dt = Ka(E) (S) = Ka[ET] – (ES)] (S) (4)

Wobei, Ka= Geschwindigkeitskonstante zweiter Ordnung

(ET) = Gesamtenzymkonzentration

(ES) = Konzentration des Enzymsubstratkomplexes

Da ein Reaktionsstart in Betracht gezogen wird, kann die Bildung von (ES) durch Reaktion (2) vernachlässigt werden, da zu Beginn die Reaktion in Vorwärtsrichtung verläuft, wenn (S) hoch und (P) null ist.

Die Geschwindigkeitsgleichung für den Abbau von ES kann als Summe von zwei Reaktionen ausgedrückt werden – die erste Reaktion liefert das Produkt und die zweite Reaktion liefert E + S. Dann gilt:

Im stationären Zustand jedoch, wenn die Bildungsrate von ES gleich seinem Abbau ist, dann gilt Gleichung 4 = 5

Oder Ka [ET]-[ES] (S) = Ka (ES) + Kb (ES)

Oder [S] [(ET)-(ES)]/(ES) = Ka + Kb/Ka = ​​Km (7)

(Ka+Kb/Ka), d. h. ausgedrückt als Km, ist als Michaehs-Menten-Konstante bekannt. Die Umordnung der Gleichung 7 ergibt,

Der Wert von (ES), ausgedrückt in Gleichung:

Wenn die Substratkonzentration hoch ist, liegen alle Enzyme im System als ES-Komplex vor.

Daher wird das Enzym gesättigt und erreicht die maximale Geschwindigkeit (V max), angegeben als:

Setzen wir diesen Wert in Gleichung 9 ein, erhalten wir

Dies ist die Michaelis-Menten-Gleichung, d. h. die Geschwindigkeitsgleichung für eine Ein-Substrat-Enzym-katalysierte Reaktion unter Berücksichtigung des Sonderfalls, wenn die anfängliche Reaktionsgeschwindigkeit genau die Hälfte von Vmax beträgt, dann nach Gleichung 10

Somit ist die Michaelis-Menten-Konstante gleich der Substratkonzentration, bei der die anfängliche Reaktionsgeschwindigkeit die Hälfte der maximalen Geschwindigkeit beträgt.

Km variiert je nach Substrat, pH-Wert und Temperatur und ist kein fester Wert.

Durch Ersetzen der Gleichung 10 erhalten wir

Oder, Wo = Km/Vmax (S) 4- 1 / Vmax (11)

Es ist die Lineweaver-Burk-Gleichung, die eine gerade Linie ergibt, wenn 1/Vo gegen 1/S aufgetragen wird (Abb. 12.14).

Einfluss von pH und Temperatur auf die enzymatische Wirkung:

En­zyme haben einen optimalen pH-Wert und eine optimale Temperatur (oder einen Bereich), bei dem sie maximal aktiv sind. Die Seitenketten in Aminosäuren spielen die zentrale Rolle. Die Seitenketten im aktiven Zentrum können als schwache Säure oder Base wirken und ihre Ausrichtung hängt vom Ionisationszustand ab. Daher ist der Ionisationszustand wichtig, um die Konformation des Enzymmoleküls und damit die Aktivität zu bestimmen.

Im Gegensatz dazu führen höhere Temperaturen zu einer Umlagerung von Bindungen. Dadurch wird die Konformation der aktiven Zentren verändert und die Aktivität beeinträchtigt. Enzyme mit mehr Cysteinresten sind wegen der Bildung von -S-S-Brücken zwischen den Peptidketten thermisch stabiler.

Allosterische Enzyme:

Allosterische (allos = other steros = site) sind regulatorische Enzyme, deren katalytische Aktivität von der nicht-kovalenten Bindung eines bestimmten Metaboliten an einer anderen Stelle als der aktiven Stelle abhängt. In vielen Multienzymsystemen hemmt das Endprodukt den Stoffwechselweg, indem es ein Enzym der Anfangsreaktion hemmt. Dieses Phänomen ist allgemein als Rückkopplungshemmung bekannt.

Die gehemmten Enzyme sind allosterische Enzyme, die das Endprodukt an allosterischen Stellen unterbringen. Die Wechselwirkung des Modulators (Endprodukt) mit dem allosterischen Zentrum verändert die dreidimensionale Struktur des katalytischen Zentrums und beeinflusst somit dessen Aktivität. Modulatoren können das allosterische Zielenzym hemmen oder induzieren, daher als negative bzw. positive Modulatoren bezeichnet.

Klassifizierung von Enzymen:

Im Allgemeinen endet der Name von Enzymen mit dem Suffix ase. Bis vor kurzem wurden Enzyme willkürlich nach dem Namen des Entdeckers benannt. Dies ist jedoch kein praktikabler Ansatz, da einige der Enzyme völlig irrelevante Namen haben. Daher wurde nun ein neues System vorgeschlagen, um diese Schwierigkeit zu bekämpfen und alle neu entdeckten Enzyme einzubeziehen.

Dieses System wurde 1973 vom Internationalen Komitee für die Nomenklatur der Enzyme empfohlen. Dieses System umfasst sechs Hauptklassen einschließlich anderer Unterklassen entsprechend der Art der katalysierten Reaktion (Tabelle 12.2).

Heutzutage werden Enzymen im Allgemeinen zwei Namen zugewiesen: der empfohlene Name und ein systematischer Name. Der empfohlene Name ist der allgemeine Name. Es ist klein und einfach zu bedienen.

Die systematische Bezeichnung erfolgt nach der Reaktion in den sechs Klassen der Enzyme:

Enzymkomponenten:

Im Allgemeinen bestehen Enzyme ausschließlich aus Proteinen. Viele Enzyme enthalten aber auch einen Nichtproteinanteil, der für die Aktivität des Enzyms notwendig ist. Der Proteinteil des Enzyms in diesen Enzymtypen wird als Apoenzym bezeichnet und der Nichtproteinteil wird als Cofaktor bezeichnet. Der Cofaktor kann ein Metallion oder ein organisches Molekül (Coenzym) sein. Das vollständige Enzym mit Cofaktor und Apoenzym wird Holoenzym genannt.

In dem Enzym mit Metallionen als Cofaktor befinden sich Ionen wie Mg +2 , Fe +2 , Fe +3 , K + usw. Diese können als primäre katalytische Zentren oder als Brückengruppe dienen, um Substrat und Enzym zusammen zu binden. Solche Enzyme mit Metallionen als Cofaktor werden manchmal Metalloenzyme genannt, z.B. Phosphotransferasen (die Mg +2 als Metall-Cofaktor aufweisen), Cytochrome und Katalase (die Fe +2 und Fe +3-Metallion aufweisen).

Das Coenzym, bei dem es sich um ein komplexes organisches Molekül handelt, kann eines der Vitamine sein (organische Spurenmoleküle, die für die Funktion aller Zellen von entscheidender Bedeutung sind und in der Nahrung benötigt werden). Wenn das Coenzym sehr fest an die Enzymmoleküle gebunden ist, wird es normalerweise als prothetische Gruppe bezeichnet. Einige der wichtigen Coenzyme sind Nicotinamid-Derivate, Flavin-Adenin-Dinukleotid (FAD)-Derivate.


DISKUSSION

In dieser Studie haben wir die ATPase-Aktivität und Kooperativität jeder AAA-Domäne von p97 charakterisiert.

ATP-Bindung an D1 ist Voraussetzung für die intrinsische ATPase-Aktivität von D2

Nukleotidbindungsdefiziente Mutanten in D1 (CDC-48.1 K257A) zeigten keine nachweisbare ATPase-Aktivität, aber andere Mutanten in D1, die eine ATP-Bindung ermöglichen, zeigten eine wesentliche ATPase-Aktivität ( 2 ). Da D2 von CDC-48.1 K257A wie das Wildtyp-Protein an ATP bindet (ergänzende Fig. S1), war die ATP-Hydrolyse in der Mutante beeinträchtigt, und daher erfordert die ATP-Hydrolyse durch D2 die ATP-Bindung an D1. Sowohl konsistente als auch inkonsistente Ergebnisse wurden unter Verwendung von Säuger-p97 berichtet (9, 15, 16, 18). Außerdem ist unser in vivo Die Analyse hat gezeigt, dass die entsprechende Hefe-Cdc48p-Mutante eine ATPase-Aktivität aufweisen muss, zumindest ausreichend, um zu überleben, obwohl die Mutation das Zellwachstum signifikant beeinflusst (19). Diese Diskrepanz ist nicht auf den Speziesunterschied zurückzuführen, da rekombinante Hefe Cdc48p mit der Mutation, die auf die gleiche Weise exprimiert und gereinigt wurde, ebenfalls eine recht geringe ATPase-Aktivität zeigte (Ergänzungstabelle S1). Vielmehr ist es möglich, dass einige p97-Adapterproteine in vivo (oder einige kontaminierte Effektoren in den gereinigten Proben) unterstützen die Nukleotidbindung an D1 oder beschleunigen die ATPase-Aktivität von D2, selbst wenn D1 in der nukleotidfreien Konformation vorliegt.

ATP-gebundene Konformation von D1 stört die D2-ATPase-Aktivität

Es wird gefunden, dass D1 von Wildtyp-Säuger-p97 ausschließlich an ADP in Kristallstrukturen bindet (25, 26). Mutationen im D1-Walker-B-Motiv, das wahrscheinlich in einem ATP-gebundenen Zustand zum Stillstand kommt, führten zu einer signifikanten Abnahme der positiven Kooperativität von D2 sowie der ATPase-Aktivität selbst ( 2 und Tabelle 1). Da Mutationen in den Sensor-1- und Arginin-Fingerresten von D1 mit γ-Phosphat des gebundenen ATP in der ATP-Bindungstasche interagieren ( Abb. 1 B), den ATPase-Mangel in der D1 Walker B-Mutante unterdrückt, ist es wahrscheinlich, dass diese Interaktionen in D1 das Signal für die Hemmung der ATPase-Aktivität von D2 sind. Briggs et al. (18) zeigten, dass sowohl D1- als auch D2-Ringe unabhängig voneinander in Bezug auf die Nukleotidbindung agieren können, und wir haben auch durch Messung der intrinsischen Tryptophan-Fluoreszenz festgestellt, dass D2 von CDC-48.1 E311Q an ATP als Wildtyp-Protein binden kann (ergänzende Abb. S1), was darauf hindeutet, dass D1 die Nukleotidbindung an D2 nicht beeinflusst. Zusammengenommen sollte D1 in der ADP-gebundenen Form für den normalen D2-ATP-Hydrolysezyklus vorliegen, da der ATP-gebundene Zustand von D1, der von den SRH-Resten wahrgenommen wird, die Kommunikation zwischen den Untereinheiten von D2 während des ATPase-Zyklus stören kann.

Positive Kooperativität ist entscheidend für die Funktion(en) von p97 in Vivo

Wir fanden, dass die Wachstumsrate von Hefezellen, die eine Cdc48p-Mutante exprimieren, variierte. Interessanterweise stand die Wachstumsrate eher im Zusammenhang mit dem Hill-Koeffizienten der p97-Mutante als mit der Größe der ATPase-Aktivität selbst ( 5 ), was darauf hindeutet, dass die positive Kooperativität von D2 entscheidend für die in vivo Funktion von p97. Warum ist die positive Kooperativität von D2 wichtig für die Funktion von p97? Bei der ATP-Hydrolyse erfährt D2 große Konformationsänderungen, insbesondere in einer Schleife, die der Pore des D2-Rings zugewandt ist (25). Da diese Schleife höchstwahrscheinlich mit Substratproteinen wechselwirkt (16), können die Konformationsänderungen von D2 zu Konformationsänderungen von Substratproteinen führen. Eine Möglichkeit besteht darin, dass der positiv kooperative ATPase-Zyklus diese Konformationsänderungen beschleunigen kann, wodurch die Arbeit in kurzer Zeit abgeschlossen wird, um ein Zurückgleiten des Substrats in den ursprünglichen Zustand zu verhindern.

Mögliche Mechanismen zur Regulierung der lebenswichtigen D2-ATPase-Aktivität

Neben der positiven Kooperativität wird der ATPase-Zyklus von D2 auch zwischen den Untereinheiten koordiniert, wie aus der Tatsache ersichtlich ist, dass eine kleine Menge von ATPγS gegenüber ATP die D2-ATPase-Aktivität stark inhibierte ( 6 ). Dieses Verhalten unterscheidet sich offenbar von dem von ClpX, von dem angenommen wird, dass es ATP in einem stochastischen Mechanismus hydrolysiert. Es wurde berichtet, dass die ATP-Bindung auf eine Untergruppe der D2-Untereinheiten beschränkt ist (18, 27). Eine andere Gruppe zeigte, dass bei der Bindung eines ATP-Analogons an D2 mindestens zwei verschiedene Konformationen beobachtet wurden (28). Diese Ergebnisse schließen stochastische und konzertierte Mechanismen von p97 aus. Es ist eher wahrscheinlich, dass der D2-Ring in einer geordneten Weise arbeitet, wie beispielsweise einem sequentiellen oder alternativen Mechanismus.

Wir fanden auch, dass die nichtkooperative Mutante immer noch die koordinierte ATPase-Aktivität zeigte ( 6 ), was darauf hindeutet, dass die Mechanismen, die die positive Kooperativität erzeugen, und die Koordination unterschiedlich sein sollten. Verschiedene Mechanismen könnten betrieben werden, wenn die sechs Protomeren in mindestens zwei Gruppen unterteilt würden. Wir schlagen eine Hypothese vor, dass D2 von drei nicht benachbarten Protomeren in einer Gruppe ATP koordiniert, aber ohne Kooperativität hydrolysiert ( Abb. 7 EIN). Dieser koordinierte ATPase-Zyklus durch alternative Protomeren in einem Hexamer ist möglich, weil F1 ATPase übernimmt einen ähnlichen Mechanismus (29). Eine positive Kooperativität könnte erreicht werden, indem die ATP-Hydrolyse eines benachbarten Protomers oder des entgegengesetzten in einem Hexamer, das sich in einer anderen koordinierten Gruppe befindet, verstärkt wird ( Abb. 7 B). Wie beeinflusst D1 diese Kommunikationen? Kristallstrukturen von Wildtyp-p97 in Gegenwart verschiedener Nukleotide zeigten, dass alle der sechs D1-Untereinheiten mit ADP (30) besetzt waren, was den koordinierten und kooperativen ATPase-Zyklus von D2 ermöglicht ( Abb. 7 E). Die nukleotidfreie Konformation von D1 hemmte den ATPase-Zyklus von D2, was darauf hindeutet, dass die Nukleotidbindung an D1 eine Voraussetzung für die ATPase-Aktivität von D2 ist ( 7 C). Wenn die Bindung von ATP, aber nicht von ADP, an D1 eines Protomers die ATP-Bindung an D1 des benachbarten Protomers hemmt, befindet sich in der D1 Walker B-Mutante nur D1 von drei alternativen Protomeren im nukleotidgebundenen Zustand, wodurch nur ein koordiniertes . aktiviert wird Gruppe von D2 ( Abb. 7 D). Die SRH-Mutationen können diese eingeschränkte Bindung von ATP freisetzen und die ATP-Bindung an alle sechs D1-Domänen ermöglichen, was zur Wiederherstellung der kooperativen ATPase-Zyklen führt. Heterogenität bei der ATP-Bindung an D1 kann der Grund dafür sein, dass keine Kristallstruktur mit ATP-gebundener Form von D1 aufgeklärt wurde. Weitere Strukturanalysen von p97 in verschiedenen Nukleotidzuständen und die direkte Beobachtung von Konformationsänderungen während der ATP-Hydrolyse werden die Informationen zur Aufklärung des Mechanismus liefern. Und da kürzlich gezeigt wurde, dass die Matrix-AAA-Protease in der mitochondrialen Innenmembran für ihre Funktion den koordinierten ATPase-Zyklus benötigt (31), wird die biologische Bedeutung der Koordination des p97-ATPase-Zyklus für die Funktionen auch in Zukunft interessant sein .


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Andrew MacMillan

Die Forschung in meinem Labor konzentriert sich auf die Chemie und Biologie von Nukleinsäuren mit einem Schwerpunkt auf biologisch wichtigen Reaktionen mit RNA. Große RNAs und komplexe Ribonukleoprotein-Maschinen wie das Spleißosom und das Ribosom spielen eine Schlüsselrolle bei konstitutiven und regulierten zellulären Prozessen und im Lebenszyklus viraler Krankheitserreger. Daher besteht ein Bedarf an detaillierten strukturellen und funktionellen Informationen über diese Moleküle. Eine Kombination aus biophysikalischen, chemischen, biochemischen und zellbiologischen Ansätzen bietet einen leistungsstarken Ansatz für die Analyse solcher Systeme. Modifizierte Nukleinsäuresubstrate, synthetisiert unter Verwendung sowohl chemischer als auch enzymatischer Verfahren, sind sehr nützliche Sonden der Struktur und Reaktionen von Nukleinsäuren und Nukleinsäure-Protein-Komplexen.

Besondere Interessengebiete sind:

  • Mechanismen des prä-mRNA-Spleißens Intron-Exzision aus einem prä-mRNA-Substrat beinhaltet zwei sequentielle Umesterungsreaktionen, die durch das Spleißosom katalysiert werden. Diese Reaktionen sind mechanistisch denen der selbstspleißenden Gruppe-II-Introns auffallend ähnlich, obwohl die evolutionäre Beziehung zwischen den beiden Systemen unklar ist. Es wird allgemein angenommen, dass der katalytische Kern des Spleißosoms eine RNA-Struktur ist, aber über die chemischen Mechanismen der Umesterungsreaktionen oder die Struktur des am aktiven Zentrum gebundenen Substrats ist wenig bekannt. Wir adressieren diese Fragen durch Struktur-/Funktionsstudien mit chemisch modifizierten Prä-mRNA-Spleißsubstraten und Spleißfaktoren. Wir verwenden auch hochauflösende Strukturanalysen - Röntgenkristallographie -, um die Strukturen von Protein- und Protein-RNA-Komplexen im Herzen des Spleißosoms zu charakterisieren.
  • Kleine RNA-vermittelte Genregulation Es wurde gezeigt, dass kleine RNAs die Genexpression in allen Organismen unterdrücken oder modifizieren. In höheren Eukaryoten gibt es mehrere Mechanismen, einschließlich der endogenen miRNA- und antiviralen siRNA-Wege. Wir erforschen das CRISPR-System, eine kleine RNA-abhängig erworbene Immunität bei Bakterien. Phagenresistenz wird durch das spezifische Targeting von fremder Nukleinsäure durch ein bakterielles Überwachungssystem verliehen. Wir verwenden biochemische und strukturelle Methoden, um den Mechanismus dieses Prozesses zu untersuchen.

Ausgewählte Publikationen:

Strukturelle Aufklärung einer PRP8-Kerndomäne aus dem Herzen des Spleißosoms.
Ritchie DB, Schellenberg MJ, Gesner EM, Raithatha SA, Stuart DT, MacMillan AM.
Natur Struktur. Mol.-Nr. Biol. (2008) 15:1199-1205.


Informationen zum Autor

Mitgliedschaften

Institut für Psychologie, University of Michigan, Ann Arbor, USA

Kent C. Berridge, J. Wayne Aldridge & Kimberly R. Houchard

Abteilung für Neurologie, University of Michigan, Ann Arbor, USA

Medizinische Fakultät der Wayne State University, Detroit, USA

Department of Neurobiology, Pharmacology and Physiology, University of Chicago, Chicago, USA

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Korrespondierender Autor


1.10. Pflanzen und Algenenzymsysteme

Pflanzliche Lebensmittel werden meist in roher Form verzehrt [68]. Dies erleichtert die Hauptbedenken bei Enzymen auf tierischer Basis, indem die Integrität der Enzyme selbst bewahrt wird. Darüber hinaus sind pflanzliche Verdauungsenzyme über einen weiten Bereich von pH-Werten wirksam. Dieser Bereich liegt normalerweise zwischen 3,0 und 9,0, was sehr gut auf das menschliche Magen-Darm-Umfeld abgestimmt ist [55–72]. Somit sind pflanzliche Enzyme kompatibel zur Unterstützung einer umfassenden Verdauungsgesundheit. Protease, Amylase, Lipase und Cellulose sind die wichtigen Enzyme und kommen in Pflanzen vor. Protease baut Protein ab, das in Fleisch, Fisch, Geflügel, Eiern, Käse und Nüssen enthalten sein kann. Amylase unterstützt Ihren Körper beim Abbau und der anschließenden Aufnahme von Kohlenhydraten und Stärke. Lipase unterstützt die Fettverdauung. Wenn Ihre Ernährung lipasereiche Lebensmittel enthält, verringert dies die Produktionsbelastung von Gallenblase, Leber und Bauchspeicheldrüse. Cellulase ist in vielen Obst- und Gemüsesorten enthalten und baut Nahrungsfasern ab, was ihren Nährwert für unseren Körper erhöht. Das Vorhandensein von Cellulase in pflanzlichen Quellen ist wichtig, da es im menschlichen Körper nicht natürlich vorhanden ist. Obst und Gemüse sind eine ideale Quelle für Enzyme. Sie sind enzymreich und können leicht verzehrt werden, ohne dass sie gekocht oder verarbeitet werden müssen, wodurch letztendlich die volle Funktionalität der Enzyme erhalten bleibt. Durch den Einsatz der Pflanzenbiotechnologie können verschiedene Enzyme sowohl aus Pflanzen als auch aus Algenressourcen hergestellt werden [56–72].

Bei der Algenphotosynthese werden verschiedene Proteine ​​und Enzyme produziert, die in der Wirtschaftsförderung und im Umweltmanagement eingesetzt werden können, beispielsweise in der Abwasserbehandlung, der Herstellung von Feinchemikalien und der Biodieselproduktion [56–72]. Aufgrund ihres Potenzials, Kohlendioxid mithilfe von Sonnenenergie einzufangen und zu fixieren, gelten photosynthetische Meeresalgen als potenzielle Modelle für die Produktion von Proteinen. Kürzlich wurde beobachtet, dass Algen-Chloroplasten für die Produktion rekombinanter Proteine ​​transformiert werden können [55]. Fünf verschiedene Klassen rekombinanter Enzyme Xylanase, α-Galactosidase, Phytase, Phosphatanhydrolase, und β-Mannanase, D. tertiolecta oder C. reinhardtii waren in den Plastiden von D. tertiolecta oder C. reinhardtii. Ähnliche Strategien sollten eine rekombinante Proteinproduktion in vielen Meeresalgenarten ermöglichen [55].