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3.12: Pflanzengeschichten - Biologie


3.12: Pflanzengeschichten

Ein potenter, von Cas9 abgeleiteter Genaktivator für Pflanzen- und Säugetierzellen

Die Überexpression komplementärer DNA stellt den am häufigsten verwendeten Gain-of-Function-Ansatz zur Abfrage von Genfunktionen und zur Manipulation biologischer Merkmale dar. Dieser Ansatz ist jedoch für die Multigenexpression aufgrund des erhöhten Klonierungsaufwands, der begrenzten Vektorkapazität, des Erfordernis mehrerer Promotoren und Terminatoren und der variablen Transgenexpressionsniveaus eine Herausforderung und ineffizient für die Multigenexpression. Synthetische Transkriptionsaktivatoren bieten eine vielversprechende alternative Strategie für die Genaktivierung, indem sie eine autonome Transkriptionsaktivierungsdomäne (TAD) an einen beabsichtigten Genpromotor am endogenen Genomlocus durch ein programmierbares DNA-Bindungsmodul anbinden. Unter den bekannten kundenspezifischen DNA-Bindungsmodulen sind die Nuklease-toten Streptococcus pyogenes Cas9 (dCas9)-Protein, das ein spezifisches DNA-Ziel durch Basenpaarung zwischen einer synthetischen Leit-RNA und DNA erkennt, übertrifft Zinkfingerproteine ​​und Transkriptionsaktivator-ähnliche Effektoren, die beide über Protein-DNA-Wechselwirkungen angreifen 1 . Vor kurzem wurden drei potente dCas9-basierte Transkriptionsaktivierungssysteme, nämlich VPR, SAM und SunTag, für Tierzellen 2,3,4,5,6 entwickelt. Für Pflanzenzellen fehlt jedoch noch eine effiziente dCas9-basierte Transkriptionsaktivierungsplattform 7,8,9. Hier haben wir ein neues potentes dCas9-TAD mit dem Namen dCas9-TV durch pflanzenzellbasierte Screens entwickelt. dCas9-TV verleiht sowohl in Pflanzen- als auch in Säugerzellen eine weitaus stärkere transkriptionelle Aktivierung einzelner oder mehrerer Zielgene als der routinemäßig verwendete dCas9-VP64-Aktivator.

Unter den synthetischen Genaktivatoren bieten dCas9-TADs im Vergleich zu Zinkfinger-Protein-TADs und Transkriptionsaktivator-ähnlichen Effektoren (TALE)-TADs potenziell beispiellose Einfachheit und Multiplexierbarkeit, da synthetische Leit-RNAs (sgRNAs) leicht modifiziert werden können, um neue Targeting-Spezifitäten zu erreichen. und dCas9, das von mehreren sgRNAs geleitet wird, kann gleichzeitig an mehrere verschiedene Zielorte binden 10 . Eine dCas9-Fusion mit VP64, einem häufig verwendeten TAD11, aktiviert jedoch nur schwach Zielgene unter Verwendung einer einzelnen sgRNA in Pflanzen- und Säugerzellen 7,8,9,12,13,14,15. Verwenden von Arabidopsis Protoplasten-basierten Promotor-Luciferase (LUC)-Assays bestätigten wir, dass dCas9-VP64 mit einer einzelnen sgRNA nur schwach (maximal 2,4-fach) oder ineffektiv Zielgene aktivierte (Ergänzende Ergebnisse und ergänzende Abb. 1 und 2). Wenn der Zielsequenz ein 5'-G fehlt, wurde interessanterweise gefunden, dass ein zusätzliches G, das an das 5'-Ende der sgRNA angehängt ist, die Aktivierung des Promotors verstärkt (Ergänzende Abb. 1), vermutlich durch Förderung der Transkriptionsinitiation der sgRNA durch das U6 Promoter. Daher fügen wir routinemäßig ein G an das 5'-Ende von sgRNAs an, wenn die Zielsequenzen mit einem Nicht-G-Nukleotid beginnen.


In den letzten zwei Jahrzehnten haben revolutionäre Verbesserungen in der DNA-Sequenzierungstechnologie diese schneller, genauer und viel billiger gemacht. Wir sind jetzt in der Lage, in nur einem Monat bis zu 10 Billionen DNA-Buchstaben zu sequenzieren. Ich nutze diese technologischen Fortschritte, um Genome für eine Vielzahl von Organismen zusammenzustellen und die genetischen Grundlagen neurologischer Erkrankungen, einschließlich Autismus und Schizophrenie, zu untersuchen, die Krebsprogression besser zu verstehen und die komplexen Strukturen der Genome höherer Pflanzen zu verstehen.


BEZIEHUNGEN ENTWICKELN

Die Beantragung einer Anschubfinanzierung erfordert die Förderung durch ein hochrangiges Fakultätsmitglied, das als Mentor für ihre jungen Kollegen fungiert. So begannen Yun Zhou und Jody Banks – Assistenz- bzw. ordentliche Professoren für Botanik und Pflanzenpathologie – zusammenzuarbeiten.

Banks, die ihre Amtszeit seit Jahrzehnten zählt, verfügt über das Wissen und die Erfahrung, um Zhou beim Aufbau seines Labors zu helfen, durch neue Prozesse zu navigieren und sofort durchzustarten.

"Ich war um den Block herum", sagte Banks. „Es war schön, Leuten wie Yun helfen zu können, loszulegen und Dinge herauszufinden. Ich kann ihnen viel Zeit sparen, damit sie nicht alles von Grund auf neu erfinden müssen.“

Aus der Mentorschaft ist auch eine Zusammenarbeit geworden. Zhou untersucht die transkriptionale Signalübertragung in der Pflanzenentwicklung und verwendet die Modellpflanze Arabidopsis thaliana In seiner Arbeit. Banks forscht ähnlich und verwendet Farne als Modellorganismen.


Umstrittenes Asphaltwerk erhält eine weitere Absage von den Kreisvorsitzenden

ASHEVILLE, North Carolina (WLOS) — Ein umstrittener Vorschlag für eine Asphaltanlage für East Flat Rock wurde am Donnerstag vom Henderson County Planning Board abgelehnt. Der Vorstand stimmte mit 5 zu 2, um dem Henderson County Board of Commissioners zu empfehlen, den Antrag abzulehnen, das Land bedingt von Kommerz- in Industriegebiet umzuwidmen, um den Bau der Anlage zu ermöglichen.

Dies ist das zweite Mal, dass Entwickler Jeff Shipman von Southeastern Asphalt versucht hat, die Anlage am Spartanburg Highway bauen zu lassen. Der Vorschlag wurde erstmals im Jahr 2020 vorgestellt, wurde jedoch nach vielen Bedenken der Community abgelehnt, insbesondere von einer großen Gruppe namens Friends of East Flat Rock. Die Gruppe kämpft dieses Mal genauso hart gegen den Vorschlag. Zu Beginn der Sitzung am Donnerstagabend erinnerten die Mitglieder des Planungsausschusses das Publikum daran, respektvoll zu bleiben und „Schreien und Geschrei“ zu vermeiden

Nachdem die vorherige Nachbarschaftskompatibilitätssitzung zu dem Vorschlag im März mehr als vier Stunden gedauert hatte, beschließen die Mitglieder des Planungsausschusses, den öffentlichen Beitrag zu begrenzen und jeder Seite etwa 30 Minuten Zeit zu geben, um ihren Standpunkt darzulegen. Ungefähr fünf Leute sprachen sich für die Pflanze aus. So viele Leute haben sich gegen das Werk ausgesprochen, dass viele aus Zeitgründen keine Gelegenheit hatten, sich zu äußern.

Eine der größten Sorgen der Anwohner war die Umwidmung. Viele argumentierten, dass die derzeitige Zoneneinteilung beibehalten werden sollte.

“Die meisten von uns haben beim Kauf von Häusern auf die Zoneneinteilung geachtet. Wir haben uns entschieden, unsere Ersparnisse auf der Grundlage der Zoneneinteilung in Immobilien zu investieren. Wenn diese Zoneneinteilung nicht eingehalten wird, was nützt es dann?”, fragte Shannon Nicholson, deren Kommentare mit Applaus beantwortet wurden.

Andere Bedenken reichten von Lärm über Umweltverschmutzung bis hin zu ökologischen und finanziellen Auswirkungen auf Nachbarn in der Nähe. Das Grundstück grenzt an viele Wohnimmobilien.

Ein Gutachter für Gewerbeimmobilien sprach sich für den Bauträger aus und sagte, der Vorschlag würde sich nicht negativ auf die Immobilienwerte in der Nähe auswirken, obwohl ein Vorstandsmitglied ihre Forschung in Frage stellte.

Viele Anwohner sagten, die Anlage würde einfach nicht in die Umgebung in der Nachbarschaft passen und eine solche Umzonung würde einen rutschigen Hang verursachen.

“Es gehört in Industrieparks, nicht in Hinterhöfe und passt nicht in den Gemeinschaftsplan. Die Büchse von Pandora wird für andere Unternehmen geöffnet sein, um in Gebiete einzudringen, die nicht für sie ausgewiesen sind, sagte ein anderer besorgter Bewohner.

Shipman betonte jedoch, dass die Pläne des Projekts den Planungsstandards des Landkreises entsprechen und einen angemessenen Abstand zu anderen Wohngebäuden und Schulen, Kirchen usw. einhalten. Er plant auch, einen Puffer um das Grundstück zu legen. Shipman sagte, dass das Werk einen wirtschaftlichen Vorteil für die Region darstellen würde, indem etwa 18 Arbeitsplätze geschaffen würden.

Einige der Leute, die das Projekt unterstützten, sagten, die Bedenken anderer Bewohner seien nicht begründet.

“Die Fakten stützen die Angst nicht. Die Wissenschaft unterstützt die Angst nicht. Dieses Asphaltwerk wird sich nicht negativ auf diese Gemeinde auswirken,&8221 sagte ein Anwohner, der das Projekt unterstützte.

Obwohl der Vorschlag einem harten Kampf gegenübersteht, scheint er trotz des Widerstands der Community noch zum Tragen kommen zu können. Die Abstimmung des Henderson County Planning Board am Donnerstagabend war im Wesentlichen eine Empfehlung. Der Vorschlag wird nun dem Henderson County Board of Commissioners vorgelegt, der das letzte Wort über das Projekt haben wird. Ein Termin dafür wurde nicht bekannt gegeben.

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Aktuelle Pflanzenbiologie

Um die Zusammenarbeit in der Community weiter zu fördern, sind alle akzeptierten Autoren von Forschungsartikeln verpflichtet, ihre Daten der Öffentlichkeit zugänglich zu machen. Dadurch werden Doppelprojekte vermieden und der Fortschritt der Wissenschaft beschleunigt. Die Zeitschrift wird einige dieser Datenbanken sowie die Computerinfrastruktur aktiv verknüpfen und mit ihnen kooperieren. Daten sollten immer im Rohdatenformat und vorzugsweise in öffentlich zugänglichen Ressourcen eingereicht werden, die beispielsweise von EBI-, EMBL- oder NCBI-Daten verwaltet werden. Welches Datenrepository verwendet wird, liegt im Ermessen der Autoren. Weitere Informationen zum Hinterlegen und Verknüpfen Ihrer Daten mit einem unterstützten Datenrepository finden Sie jedoch unter https://www.elsevier.com/databaselinking. Für Datentypen, für die keine solchen Repositorien existieren, sollten die Daten über die ergänzenden Informationen oder die eigene Website des Autors zur Verfügung gestellt werden. Wurden die Daten z.B. Pfade oder Modelle, dann sollten diese auch während des Begutachtungsprozesses zur Verfügung gestellt werden.

Weitere Informationen zur Einreichung finden Sie in unserem Leitfaden für Autoren.

Das Redaktions- und Verlagsteam der Zeitschrift hat sich der effizienten Handhabung von Manuskripten verschrieben. Die Zeitschrift verwendet ein doppelblindes Peer-Review, um Verzerrungen im Review-Prozess zu vermeiden. Die daraus resultierenden Publikationen werden Open Access sein.


Zweige der Botanik

Nach Biologie Unterkategorie

  • Pflanzenanatomie
  • Pflanzengenetik
  • Zytologie (das Studium von Zellen – in diesem Fall Pflanzenzellen)
  • Ökologie
  • Biochemie
  • Biophysik
  • Pflanzentaxonomie
  • Physiologie
  • Mikrobiologie
  • Molekularbiologie
  • Paläobotanik (das Studium von Pflanzenfossilien)

Nach Pflanzenart

Botaniker können sich auch auf das Studium einer bestimmten Art von Organismus spezialisieren, einschließlich:

  • Bryologie – das Studium von Mosseli>
  • Lichenologie – das Studium der Flechten, Organismen, die sowohl aus Pilzen als auch aus Algen bestehen. Beides sind keine Pflanzen, aber ihre Erforschung wurde traditionell in die Botanik aufgenommen.
      — das Studium der Pilze
  • Phykologie – das Studium der Algen
  • Pteridologie – das Studium der Farne

Angewandte Pflanzenwissenschaften

Diese Kategorien beziehen sich häufig auf die Verwendung von Pflanzen, beispielsweise in der Landwirtschaft. Sie beinhalten:

  • Agronomie – Pflanzen- und Bodenkunde
  • Ernährungswissenschaft
  • Forstwirtschaft —Erzeugung von Zierpflanzen und Kulturpflanzen
  • Management natürlicher Ressourcen
  • Planzenzucht
  • Pflanzenpathologie – das Studium von Pflanzenkrankheiten

Autophagie-Pfad

Der grundlegende Weg, dem die Autophagie folgt, beginnt mit einer isolierten Membran namens a Phagophor. Der Phagophor dehnt sich aus und umgibt die Ziele oder „Zellfracht“ und bindet sie in seine Doppelmembran ein. Der Phagophor verschmilzt dann mit einem Lysosom (bei Säugetieren, Vakuolen bei Pflanzen), das den Abbau der darin enthaltenen Komponenten durch lysosomale Proteasen fördert. Aminosäuren und andere Nebenprodukte dieses Schrittes gelangen in das Zytoplasma, wo sie später beim Aufbau neuer Moleküle helfen können.


Die Abbildung zeigt die Vesikel-Nukleation von Autophagosomen aus einer Isolationsmembran.

Technisch gesehen gibt es fünf Phasen, die in die Orchestrierung der Autophagie einfließen.

  • Phagophore Formen
  • Atg5-Atg12-Proteine ​​konjugieren und interagieren mit Atg16L im Phagophor
  • LC3-Protein wird modifiziert und in seine Membran eingefügt
  • Ziele werden ausgewählt und degradiert (aber auch zufällige Dinge können aufgenommen werden)
  • Autophagosom verschmilzt mit Lysosom und die eingeschlossenen Moleküle werden aufgebrochen

Die Bildung von Phagophoren beginnt mit der Herstellung einer isolierten Membran, ein wichtiger Schritt, da die Funktion der Vesikel von ihrer Fähigkeit abhängt, den Inhalt zu umhüllen. Dieser Prozess ist um eine Struktur namens PAS (eine präautosomale Struktur) herum organisiert. Bei der Makroautophagie von Säugetieren beginnt der Weg der Autophagie mit einem „Initiationsschritt“ mit PAS. Der Phagophor beginnt dann mit der „Nukleation“, was im Grunde das Kreisen von zytosolischen Proteinen und Organellen ist. Als nächstes reift der Phagophor unter Zugabe von LC3 in die Membran zu einem Autophagosom und beginnt mit der „Expansion“. Der nächste Schritt beinhaltet die Fusion eines Lysosoms, das Hydrolasen enthält. Dadurch wird der Inhalt, der sich im Inneren befand, in recycelbare Teile zerlegt – ein Prozess, der als „Nährstoffrecycling“ bezeichnet wird.

Eine weitere bemerkenswerte Tatsache über die Autophagie ist, dass sie früher nur als ein Pro-Tod-Mechanismus angesehen wurde. Dieses Missverständnis kam von Beweisen, die seine Beteiligung am nicht-apoptotischen Tod zeigten. Neuere Forschungen legen jedoch nahe, dass es eher Leben und Überleben fördert als den Zelltod. Autophagie tritt in allen Zellen auf, um basale, homöostatische Bedingungen aufrechtzuerhalten. Insbesondere führen Zellen dies durch, um den Organellenumsatz zu fördern, insbesondere wenn die Zellen Hunger leiden und Nährstoffe benötigen. Faktoren, die bei der Kontrolle der Autophagie eine Rolle spielen, sind Ernährung und Hormonspiegel sowie externe Hinweise wie Sauerstoffgehalt und Temperatur. Zum Beispiel wurde angenommen, dass Autophagie ausschließlich zur Neurodegeneration beiträgt, aber neuere Forschungen deuten darauf hin, dass sie ein schützender Weg zum Abbau von fehlerhaften oder toxischen Proteinen in Nervenzellen sein könnte.


Pflanzennematologie

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Professor Roland Perry arbeitet an der University of Hertfordshire, Großbritannien. Er schloss sein Studium mit einem BSc (Hons) in Zoologie an der Newcastle University, Großbritannien, ab, wo er auch in Zoologie über physiologische Aspekte des Überlebens der Austrocknung von Ditylenchus spp. promovierte. Nach einem Jahr Postdoc in Newcastle wechselte er an die Keele University, UK, wo er Parasitologie lehrte, nach 3 Jahren an Keele wurde er an die Rothamsted Experimental Station (jetzt Rothamsted Research) berufen. Seine Forschungsinteressen konzentrierten sich hauptsächlich auf pflanzenparasitäre Nematoden, insbesondere auf Nematodenschlüpfen, sensorische Wahrnehmung, Verhalten und Überlebensphysiologie, und mehrere seiner früheren Doktoranden und Postdoktoranden sind derzeit in der Nematologieforschung tätig. Er blieb bis 2014 in Rothamsted und wechselte dann zum Department of Biological and Environmental Sciences der University of Hertfordshire. Er war Mitherausgeber von The Physiology and Biochemistry of Free-living and Plant-parasitic Nematodes (1998), Root-Knot Nematodes (2009), Molecular and Physiological Basis of Nematode Survival (2011), dem ersten (2006) und dem zweiten (2013) Ausgaben des Lehrbuchs Plant Nematology and Cyst Nematodes (2018) (alle CAB International, UK). Er ist Autor oder Co-Autor von über 40 Buchkapiteln und begutachteten Rezensionen und über 120 begutachteten Forschungsarbeiten. Er ist gemeinsamer Chefredakteur der Nematologie und Chefredakteur des Russian Journal of Nematology. Er ist Mitherausgeber der Buchreihe Nematology Monographies and Perspectives. 2001 wurde er in Anerkennung seiner Forschungsleistungen zum Fellow der Society of Nematologists (USA) gewählt, 2008 wurde er zum Fellow der European Society of Nematologists für herausragende Beiträge zur Wissenschaft der Nematologie gewählt und 2011 zum Ehrenmitglied der der Russischen Gesellschaft für Nematologen. Er ist Gastprofessor an der Universität Gent, Belgien, wo er Vorlesungen über Nematodenbiologie mit den Schwerpunkten Physiologie und Verhalten hält.

– Maurice Moens Professor Maurice Moens ist Honorary Director of Research am Flanders Research Institute for Agriculture, Fisheries and Food (ILVO) in Merelbeke, Belgien, und Honorarprofessor an der Universität Gent, Belgien, wo er einen Vortrag über Agrarnematologie an der Fakultät für Biowissenschaften hielt . Er ist ehemaliger Direktor des Post Graduate International Nematology Course (MSc Nematology) und Koordinator des Erasmus Mundus – European Master of Science in Nematology, wo er fünf Vorlesungen über Pflanzennematologie hielt. Der MSc-Studiengang wird an der Fakultät für Naturwissenschaften der Universität Gent organisiert.
Er schloss sein Studium als Agraringenieur an der Universität Gent ab und promovierte an derselben Universität über die Verbreitung von pflanzenparasitären Nematoden und deren Management in hydroponischen Anbausystemen. Im Rahmen der belgischen Kooperation arbeitete er von 1972 bis 1985 als Forscher im Pflanzenschutz einschließlich Nematologie an zwei Forschungsstationen in Tunesien. Nach seiner Rückkehr nach Belgien wurde er zum leitenden Nematologen am Agrarforschungszentrum (jetzt ILVO) ernannt. Dort erweiterte er die Forschung in der Pflanzennematologie auf verschiedene Bereiche, die molekulare Charakterisierung, Biologie der Wirt-Parasiten-Beziehungen, biologische Bekämpfung, Resistenz und andere Formen der nicht-chemischen Bekämpfung umfassten. Im Jahr 2000 wurde er zum Leiter der Abteilung für Pflanzenschutz ernannt und 2006 zum Forschungsdirektor. 2012 ging er sowohl vom ILVO als auch von der Universität Gent in den Ruhestand, betreute aber weiterhin Doktoranden bis 2017. 2001 wurde er zum Fellow der Society of Nematologists . gewählt (USA) für herausragende Beiträge zur Nematologie im selben Jahr wurde er zum Fellow der European Society of Nematologists für herausragende Beiträge zur Wissenschaft der Nematologie gewählt. 2012 wurde er zum Ehrenmitglied der Chinesischen Gesellschaft für Pflanzennematologie gewählt und 2013 zum Ehrenmitglied der Russischen Gesellschaft für Nematologen. Er betreute 27 Doktoranden, die weltweit in der Nematologie tätig sind. Er ist ehemaliger Präsident der European Society of Nematologists (2010-2014). Er ist Mitherausgeber Wurzelknoten-Nematoden (2009) und die erste (2006) und zweite (2013) Ausgabe des Lehrbuchs, Pflanzennematologie. Er ist Autor oder Co-Autor von zehn Buchkapiteln und begutachteten Rezensionen und über 150 begutachteten Forschungsarbeiten. Er ist Mitglied der Redaktion der Russische Zeitschrift für Nematologie.


Nanotechnologie für die Pflanzengentechnik

Die COVID-19-Pandemie hat die Lebensmittelversorgungsketten erheblich gestört und den Bedarf an biotechnologischen Lösungen zur Erreichung der Ernährungssicherheit verstärkt. Feldfrüchte und Gemüse sind eine bedeutende Quelle für Nahrung, Materialien und Medizin. Somit besteht ein großer Anreiz, Nutzpflanzen gentechnisch zu verändern, die wünschenswerte Eigenschaften wie eine höhere Biomasseproduktion und Resistenz gegen Krankheitserreger aufweisen und gleichzeitig weniger Ressourcen, einschließlich Platz und Arbeit, benötigen. 1

Es besteht ein großer Anreiz, Nutzpflanzen gentechnisch zu verändern, die wünschenswerte Eigenschaften wie eine höhere Biomasseproduktion und Resistenz gegen Krankheitserreger aufweisen und gleichzeitig weniger Ressourcen, einschließlich Platz und Arbeitskräfte, benötigen.
[WLADIMIR BULGAR/WISSENSCHAFTSFOTOBIBLIOTHEK/Getty Images] Um gentechnisch veränderte Pflanzen zu erzeugen, müssen Oligonukleotide, die das interessierende Gen kodieren, effizient und mit minimalen biologischen Störungen in die intrazellulären Räume oder Zielorganellen wie Zellkerne und Chloroplasten von Pflanzenzellen transportiert werden. Der technologische Prozess in diesem Bereich war jedoch begrenzt.

Traditionelle Pflanzentransfektionsmethoden

Eines der am häufigsten verwendeten Werkzeuge für die Genübertragung in Pflanzen ist Agrobakterium, ein Gram-negatives Bakterium, das sowohl Pflanzenprotoplasten (Zellen ohne Zellwände) als auch Gewebe (wie Blätter) transfizieren kann. Dieses Verfahren ist jedoch für eine stabile, langfristige Integration von DNA-Fracht ungeeignet und erfordert jedes Mal, wenn die transiente Genexpression endet, eine wiederholte und langwierige Pflanzentransformation. Agrobakterium integrieren sich auch zufällig mit DNA, was die endogene Genexpression stören und die einheitliche Kontrolle über die Zielgenexpression einschränken kann. Vor allem, Agrobakterium Es wurde auch berichtet, dass es Pflanzengewebenekrose verursacht.

Die andere beliebte Technik ist die biolistische Partikelabgabe oder Genkanone. Dieses Verfahren verwendet hohe Energie, um mit Biomolekülen beschichtete Goldpartikel durch physikalische Zerstörung der Pflanzenzellwand und -membran direkt in Pflanzenzellen zu transportieren. 2 Partikel-beschossene Stellen können jedoch durch hohe Drücke schwer verletzt werden und können dann nicht mehr kultiviert werden. Außerdem ist der Durchsatz dieser Technik extrem gering.

Virale Vektoren, wie das Tabakmosaikvirus (hier gezeigt) das Kuherbsenmosaikvirus, sind für die Oligonukleotidabgabe nützlich. [PIXOLOGICSTUDIO/WISSENSCHAFTSFOTOBIBLIOTHEK/Getty Images] Virale Vektoren, wie die auf dem Tabakmosaikvirus basierende Geneware-Technologie und das Kuherbsenmosaikvirus, sind für die Oligonukleotidabgabe nützlich. 3 Dennoch haben virale Vektoren eine begrenzte Expressionskassettengröße und sind möglicherweise nicht in der Lage, große und komplexe Frachten zu liefern, die für die Pflanzenbiotechnologie wertvoller sind. 4 Darüber hinaus sind virale Vektoren nicht in der Lage, Proteine ​​direkt zu liefern, was sie mit populären Gen-Editing-Techniken wie CRISPR, die typischerweise das Cas-Protein verwenden, nicht kompatibel macht. 5 Schließlich unterliegt die Herstellung viraler Vektoren aufgrund ihres pathogenen Ursprungs und ihrer Fähigkeit, einen Teil ihrer genetischen Elemente in das Wirtsgenom der Pflanze zu integrieren, strengen Vorschriften.

Pflanzen-Magnetofektion

In den letzten Jahren wurde eine Reihe von nanotechnologischen Werkzeugen entwickelt, um die Grenzen traditioneller Techniken der Pflanzengentechnik zu überwinden. Eine solche aufkommende Technik ist die Verwendung magnetischer Eisenoxid-Nanopartikel, die mit DNA konjugiert sind. Dieses Verfahren wurde in großem Umfang für die Transfektion von Säugerzellen verwendet, aber es ist schwierig, es für die Pflanzentechnik anzupassen, da die Pflanzenzellwand vorhanden ist, die im Gegensatz zur Zellmembran keine Endozytose durchmacht. 6 Haixin Cui, Professor, und sein Team von der Chinesischen Akademie für Agrarwissenschaften zeigten zunächst, dass die Öffnungen von Baumwollpollen keine Zellwand haben und nutzten dann magnetische Nanopartikel als Träger, um Gene durch diese zellwandfreien Öffnungen zu transportieren. 7 Es wurden auch Magnetfelder angelegt, um gerichtete Kräfte bereitzustellen, um die Nanopartikel-Genträger in Pollen zu transportieren. Sie fanden heraus, dass ihre Magnetofektionsmethode >80% Lebensfähigkeit in Pollen lieferte und minimal störend war. Mithilfe von konfokaler Fluoreszenzbildgebung und energiedispersiver Spektroskopie bestätigte das Team auch, dass fluoreszenzmarkierte Nanopartikel-Genträger in Pollen eingebracht wurden. Schließlich zeigte das Team mithilfe von PCR, dass es in der Lage war, die BTΔα-CPTI Gen in das Genom einer transgenen Baumwollpflanze, um Insekten Resistenz zu verleihen, 8 mit stabiler Vererbung bei den Nachkommen. Das Team berichtete auch, dass ihre Magnetofektionsmethode bei anderen Pflanzenarten wie Kürbis und Lilie funktioniert.

Trotz der vielversprechenden Ergebnisse von Cui und seinem Team ist es möglicherweise noch zu früh, um zu dem Schluss zu kommen, dass Magnetofektion für die Genübertragung bei verschiedenen Pflanzenarten wirksam ist. In einem kürzlich erschienenen Artikel untersuchte ein Team um John Fowler, PhD, Professor an der Oregon State University, mehr als 50.000 Pollenkörner und berichtete, dass die Magnetofektion mit magnetischen Nanopartikeln nicht so gut funktioniert wie für einkeimblättrige Pflanzenarten wie Lilie, wie von Cui . behauptet und Kollegen. 9 Die Autoren argumentierten auch, dass die

Die von Cui und seinem Team berichtete 90 %ige Transfektionseffizienz bei Lilienpollen war wahrscheinlich auf eine fehlerhafte Verwendung des Biomarkers β-Glucuronidase zum Nachweis des Transfektionserfolgs zurückzuführen, da eine signifikante endogene β-Glucuronidase-Aktivität vorhanden ist.

„Pollen ist ein attraktives biologisches Ziel für die Transfektion, da Pollenkörner die männlichen Gameten tragen und so nach der Befruchtung in den Eizellen der Pflanze eine vollständige gentechnisch veränderte Pflanze erzeugen könnten. Jenny Mortimer vom Lawrence Berkeley National Laboratory und ich waren begeistert von der Arbeit von Zhao et al. weil es einen potentiell nützlichen und bequemen Weg darstellt, um transgene Pflanzen zu erzeugen. Wenn die Magnetofektionsmethode funktioniert, könnten wir die zeitaufwändige Gewebekultur auf Basis regenerierbarer Gewebe vermeiden. Die Regeneration ist machbar, aber sowohl für Sorghum als auch für Mais, einkeimblättrige Arten, die im Mittelpunkt unserer Forschungsprogramme stehen, technisch sehr anspruchsvoll“, sagt Fowler.

„Das Papier von Zhao et al. konzentrierten sich hauptsächlich auf zweikeimblättrige Arten wie Baumwolle und Kürbis, aber sie lieferten auch Daten, die darauf hindeuteten, dass ihre Methode bei Lilie, einer einkeimblättrigen Art, funktionieren könnte. In unserer Arbeit haben wir die Magnetofektion an Pollen von Mais, Sorghum und Lilie getestet und festgestellt, dass wir nie die vorübergehende Expression eines genetischen Reporters beobachtet haben, der eine erfolgreiche Transfektion anzeigen würde. Obwohl wir von den Ergebnissen enttäuscht waren, zeigt unsere Arbeit, dass die Magnetofektion wahrscheinlich keine einfache, universelle Pollentransfektionsmethode ist.“

Kohlenstoffnanoröhren-vermittelte Pflanzentransfektion

Neben der Verwendung magnetischer Nanopartikel werden auch Kohlenstoffnanoröhren als Nanowerkzeug für die Pflanzentransfektion immer beliebter. Markita Landry, PhD, Professorin, und ihr Team an der University of California, Berkeley, berichteten über die Verwendung von Kohlenstoff-Nanoröhrchen, die auf passiver Abgabe als Werkzeug zur Pflanzentransformation beruhen. Als Proof-of-Concept hat ihr Team DNA, die für grün fluoreszierendes Protein (GFP) kodiert, physikalisch adsorbiert und elektrostatisch auf einwandige Kohlenstoffnanoröhren gepfropft und gezeigt, dass ihre Technik DNA effektiv in die Blätter einer Vielzahl von Pflanzenarten einschleusen kann, darunter Weizen, Baumwolle und Rucola für transiente Genexpressionen. 10 Die Nanoröhren schützen auch die DNA vor dem Abbau durch endogene Nukleasen. Landry und ihr Team zeigten auch, dass ihre Kohlenstoff-Nanoröhrchen-Technologie zu keiner signifikanten Toxizität in reifen Blättern führte, indem sie eine quantitative PCR-Analyse von NbrbohB, ein bekanntes Stressgen in Tabakpflanzen, und relativ zum Housekeeping-Gen Dehnungsfaktor 1 (EF1).

Um die Nützlichkeit ihrer Methode weiter zu demonstrieren, testete das Team ihre Nanoröhren-Technologie auch an Protoplasten, die in der Biotechnologie ausgiebig für hochgradige pflanzengenetische Screens und die Synthese rekombinanter Proteine ​​verwendet werden. Aus Rucola-Blättern isolierte Protoplasten waren in der Lage, Kohlenstoff-Nanoröhrchen zu internalisieren und exprimierten das GFP-Plasmid stabil mit 80%.

siRNA ist ein nützliches Material für die transiente Pflanzengentechnik. Mit einwandigen Kohlenstoff-Nanoröhrchen zeigten Landry und ihr Team erfolgreich die Transfektion von siRNA, um die Expression von GFP in den Blättern von Tabakpflanzen bis zu einer Woche lang zu hemmen und zum Schweigen zu bringen. 11 Die Kohlenstoff-Nanoröhrchen schützten auch die siRNA vor dem Abbau und waren für die Verwendung in Pflanzen biokompatibel.

„Der Einsatz von Nanopartikeln für die Pflanzengentechnik hat zur Folge, dass DNA und RNA ohne Krankheitserreger wie z Agrobakterium oder ohne den Einsatz biolistischer Kraft, die das Pflanzengewebe zerstört. Ein weiterer Vorteil besteht darin, dass der Nanopartikeltransport von siRNA eine grüne Alternative zum Einsatz chemischer Pestizide oder dem Transport von mRNA für die DNA-freie genetische Manipulation von Pflanzen sein kann. Insgesamt könnten Nanopartikel den Durchsatz, die Präzision und die Leichtigkeit der Pflanzengentechnik erhöhen“, sagt Landry.

Ungelöste Probleme

Die Nanotechnologie hat die genetische Reprogrammierung von Säugerzellen erheblich verbessert und ist auch ein vielversprechendes Werkzeug für die Pflanzentechnik. Um dieses Feld voranzubringen, müssen jedoch einige wichtige Fragen geklärt werden.

Erstens haben Pflanzenzellen im Gegensatz zu Säugerzellen starre Zellwände, die Partikel mit einer Größe von mehr als etwa 5–20 nm ausschließen, 12 und es gibt nicht genügend begutachtete Beweise dafür, dass Nanopartikel in der Lage sind, durch die mehrschichtige Zellwand und dann durch die Zelle zu diffundieren Membran leicht. Eine systematische Charakterisierung, wie die Eigenschaften von Nanopartikeln ihre Interaktionen mit Pflanzenzellen und -geweben beeinflussen, ist für das mechanistische Verständnis von entscheidender Bedeutung. 13 Das Team um Michael Strano, PhD, Professor am Massachusetts Institute of Technology, fand beispielsweise heraus, dass der Transport einwandiger Kohlenstoffnanoröhren durch die Pollenzellmembran hauptsächlich durch ihr Oberflächen-Zeta-Potential gesteuert wird. 14 Komplexe biologische Unterschiede zwischen Pflanzenarten und die Arten des biologischen Materials von Pflanzen (Protoplasten, Blätter, Pollen und regenerierbare Gewebe wie Wurzelhaare) machen auch eine systematische Charakterisierung der Pflanzen-Nanopartikel-Wechselwirkungen erforderlich, um die Transfektionsergebnisse zu verbessern.

Zweitens korreliert die Größe der DNA-Fracht, die in Pflanzenzellen transportiert werden kann, direkt mit der Oberfläche der Nanopartikel. Bisher hatten sich nur kleine (<20 nm) kugelförmige Nanopartikel und einwandige zylindrische Kohlenstoffnanoröhren (0,8–1,2 nm Durchmesser und 500–1000 nm Länge) als nützlich erwiesen, Pflanzenzellen durch passive Diffusion und/oder unter Verwendung von mechanische Hilfsmittel wie eine Genkanone. Leider bedeutet dies, dass nur geringe Genfrachten (

4 kbp) mit null bis begrenztem physiologischem, wirtschaftlichem und landwirtschaftlichem Wert geliefert werden. 10 Um ein nützliches Werkzeug für die Pflanzenbiotechnologie im industriellen Maßstab zu sein, ist es nützlich, die Komplexität der Fracht, die mit Nanopartikeln geliefert werden kann, zu verbessern.

Drittens wurde gezeigt, dass Nanopartikel wie Kohlenstoffnanoröhrchen die Wurzelverlängerung wichtiger Kulturpflanzen wie Tomate und Salat nachteilig hemmen können, aber es gibt immer noch eine unzureichende Zytotoxizitätscharakterisierung in der Literatur, wenn über neue Pflanzentransfektionsmethoden berichtet wird. 15 Es ist mehr Arbeit erforderlich, um sicherzustellen, dass Pflanzen nach der Nanopartikel-Transfektion weiterhin gesund wachsen, damit die technisch hergestellten Pflanzen als Ressourcen verwendet werden können.

Schließlich bieten die meisten nanotechnologischen Techniken zur Pflanzentransfektion eine transiente Genexpression. Während dies für biologische Studien nützlich ist, ist es möglicherweise nicht so wirksam für die Pflanzenzüchtung, bei der langfristige Genexpressionen erforderlich sind, um stabile Phänotypen bereitzustellen.

Die Pflanzengentechnik wird aufgrund der wachsenden Bevölkerung und der steigenden Nachfrage nach Nahrungsmitteln, Medizin und Materialien immer wichtiger. Eine stärkere Zusammenarbeit zwischen Nanotechnologen und Pflanzenbiologen wird dazu beitragen, das bestehende Toolkit zur Pflanzentransformation mithilfe von Nanotechnologie zu erweitern, um positive gesellschaftliche Auswirkungen zu erzielen.