Information

Kann eine Proteinkinase sowohl einen Threonin- als auch einen Tyrosinrest phosphorylieren?

Kann eine Proteinkinase sowohl einen Threonin- als auch einen Tyrosinrest phosphorylieren?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Ich weiß, dass einige Kinasen aufgrund ihrer strukturellen Ähnlichkeiten sowohl Serin- als auch Threoninreste phosphorylieren können, aber kann eine solche Kinase auch einen Tyrosinrest phosphorylieren?

Wenn nicht, warum dann?


Nur wenige Proteinkinasen können alle drei Aminosäuren phosphorylieren - diese werden als dual-spezifische Kinasen (EC 2.7.12.1) klassifiziert. Beispiele sind APK1 aus Arabidopsis oder MEK-Kinasen in Säugetieren.

Wie bei anderen Enzymen bestimmen die Reste an der Substratbindungsstelle, welche Substrate dort aufgenommen werden können. Strukturen oder Ser-Thr- und Tyr-Kinasen stehen zur Besichtigung zur Verfügung, falls Sie diese erforschen möchten.


Kreuzphosphorylierung bakterieller Serin/Threonin- und Tyrosin-Proteinkinasen an wichtigen regulatorischen Resten


Lei Shi 1 , Nathalie Pigeonneau 2 , Vaishnavi Ravikumar 3 , Paula Dobrini 4 , Boris Macek 3 , Damjan Franjevic 4 , Marie-Francoise Noirot-Gros 2 und Ivan Mijakovic 1 *
  • 1 SysBio, Department of Chemical and Biological Engineering, Chalmers University of Technology, Göteborg, Schweden
  • 2 UMR1319 Micalis, Institut National de Recherche Agronomique, Jouy-en-Josas, Frankreich
  • 3 Proteomzentrum T࿋ingen, Interfakultäres Institut für Zellbiologie, Universität T࿋ingen, T࿋ingen, Deutschland
  • 4 Abteilung für Biologie, Fakultät für Naturwissenschaften, Universität Zagreb, Zagreb, Kroatien

Bakterien besitzen Protein-Serin/Threonin- und Tyrosin-Kinasen, die in ihrer Fähigkeit, mehrere Substrate zu phosphorylieren, eukaryalen Kinasen ähneln. Wir stellten die Hypothese auf, dass sich die Analogie noch weiter ausdehnen könnte und bakterielle Kinasen auch eine gegenseitige Phosphorylierung und Aktivierung erfahren könnten, was derzeit als ein Kennzeichen eukaryaler Kinasenetzwerke gilt. Um diese Hypothese zu testen, untersuchten wir die Kapazität aller Mitglieder von vier verschiedenen Klassen von Serin/Threonin- und Tyrosinkinasen, die im Modellorganismus firmicute vorkommen Bacillus subtilis sich gegenseitig phosphorylieren in vitro und miteinander interagieren in vivo. Die Interactomics-Daten deuteten auf ein hohes Maß an Konnektivität zwischen allen Kinasentypen hin, während Phosphorylierungsassays ebenso weit verbreitete Kreuzphosphorylierungsereignisse zeigten. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass die Kinasen des Hanks-Typs PrkC, PrkD und YabT die höchste Fähigkeit aufweisen, andere zu phosphorylieren B. subtilis Kinasen, während die BY-Kinase PtkA und die Zweikomponenten-ähnlichen Kinasen RsbW und SpoIIAB die höchste Neigung zeigen, durch andere Kinasen phosphoryliert zu werden. Die Analyse phosphorylierter Reste an mehreren ausgewählten Empfängerkinasen legt nahe, dass die meisten Kreuzphosphorylierungsereignisse wichtige regulatorische Reste betreffen. Daher ist es sehr wahrscheinlich, dass Kreuzphosphorylierungsereignisse die Fähigkeit von Empfängerkinasen beeinflussen, Substrate stromabwärts in der Signaltransduktionskaskade zu phosphorylieren. Wir schließen daher, dass bakterielle Serin/Threonin- und Tyrosinkinasen wahrscheinlich ein Netzwerk-ähnliches Verhalten aufweisen, das zuvor nur in eukaryalen Zellen beschrieben wurde.


Ras-Protein und MAPK-Pfad | Zellsignalisierung |Biologie

Nachdem Sie diesen Artikel gelesen haben, erfahren Sie mehr über das Ras-Protein und die MAPK-Wege, die verschiedene zelluläre Aktivitäten regulieren.

Die Genfamilie ras kodiert kleine GTPasen, die an der zellulären Signalübertragung beteiligt sind. Ras, die Superfamilie von Proteinen, reguliert verschiedene Zellverhalten wie Zellwachstum, Differenzierung und Überleben. Da Ras Signale von außerhalb der Zelle an den Zellkern übermittelt, können Mutationen in ras-Genen es dauerhaft aktivieren und eine unangemessene Übertragung innerhalb der Zelle verursachen, selbst wenn keine extrazellulären Signale vorhanden sind. Da diese Signale zu Zellwachstum und -teilung führen, kann eine nicht regulierte Ras-Signalübertragung letztendlich zu Onkogenese und Krebs führen.

Ras-Proteine ​​fungieren als binäre molekulare Schalter, die intrazelluläre Signalnetzwerke steuern. Ras-regulierte Signalwege steuern Prozesse wie Aktin-Zytoskelett-Integrität, Proliferation, Differenzierung, Zelladhäsion, Apoptose und Zellmigration. Ras und Ras-verwandte Proteine ​​werden bei Krebserkrankungen häufig dereguliert, was zu einer verstärkten Invasion und Metastasierung sowie zu einer verminderten Apoptose führt. Aktiviertes Ras aktiviert die Proteinkinaseaktivität der RAF-Kinase. RAF-Kinase phosphoryliert und aktiviert MEK. MEK phosphoryliert und aktiviert eine Mitogen-aktivierte Proteinkinase (MAPK).

Mitogen-aktivierte Protein (MAP)-Kinasen sind Serin/Threonin-spezifische Proteinkinasen, die auf extrazelluläre Reize (Mitogene, osmotischer Stress, Hitzeschock und entzündungsfördernde Zytokine) reagieren und verschiedene zelluläre Aktivitäten regulieren, wie Genexpression, Mitose, Differenzierung, Proliferation und Zellüberleben/Apoptose. MAPK-Wege werden innerhalb der Proteinkinase-Kaskaden aktiviert, die als “MAPK-Kaskade” bezeichnet werden. Jedes besteht aus drei Enzymen, MAP-Kinase, MAP-Kinase-Kinase (MKK, MEKK oder MAP2K) und MAP-Kinase-Kinase (MKKK oder MAP3K), die nacheinander aktiviert werden. Ein durch extrazelluläre Stimuli aktivierter MAP3K, der einen MAP2K an seinen Serin- und Threoninresten phosphoryliert und dieser MAP2K eine MAP-Kinase durch Phosphorylierung an seinen Serin- und Tyrosinresten aktiviert.

Die Phosphorylierung von Tyrosin geht der Phosphorylierung von Threonin voraus, obwohl die Phosphorylierung eines der beiden Reste in Abwesenheit des anderen erfolgen kann. Da sowohl Tyrosin- als auch Threonin-Phosphorylierungen erforderlich sind, um die MAP-Kinasen zu aktivieren, werden Phosphatasen, die Phosphat von beiden Stellen entfernen, diese inaktivieren. Diese MAP-Kinase-Signalkaskade wurde evolutionär gut konserviert, von Hefe bis zu Säugetieren. Kaskaden übermitteln Informationen an Effektoren, koordinieren eingehende Informationen von anderen Signalwegen, verstärken Signale und ermöglichen eine Vielzahl von Reaktionsmustern.

Eine Herunterregulierung der MAP-Kinase-Wege kann durch Dephosphorylierung durch Serin/Threonin-Phosphatasen, Tyrosin-Phosphatasen oder Dual-Spezifität-Phosphatasen und durch Rückkopplungs-Hemmmechanismen erfolgen, die die Phosphorylierung stromaufwärts gelegener Kinasen beinhalten. Medikamente, die MAP-Kinase-Kaskaden selektiv herunterregulieren, könnten sich als wertvolle Therapeutika bei der Kontrolle bösartiger Erkrankungen erweisen.


Zugangsoptionen

Erhalten Sie vollen Zugriff auf Zeitschriften für 1 Jahr

Alle Preise sind Nettopreise.
Die Mehrwertsteuer wird später an der Kasse hinzugefügt.
Die Steuerberechnung wird während des Bezahlvorgangs abgeschlossen.

Erhalten Sie zeitlich begrenzten oder vollständigen Artikelzugriff auf ReadCube.

Alle Preise sind Nettopreise.


Ergebnisse

Die ektopische Expression von sowohl E-Cadherin als auch PKD1 reguliert die β-Catenin/TCF-Aktivität herunter. Frühere Studien zeigten, dass eine Überexpression von E-Cadherin die β-Catenin-vermittelte Wnt-Signalgebung reduziert, wie durch den Topflash-Assay bestimmt wurde ( 26–28). Die Suppression erfordert die β-Catenin-Bindungsfähigkeit von E-Cadherin, ist jedoch unabhängig von der Adhäsionsfunktion von E-Cadherin.

Da E-Cadherin mit β-Catenin einen Proteinkomplex bildet, haben wir getestet, ob PKD1 die β-Catenin-Transkriptionsaktivität beeinflusst. Die Expression von β-Catenin konnte die TCF-Transkriptionsaktivität im Topflash-Assay in NIH 3T3-Zellen erhöhen (Abb. 1 .).EIN ). Die ektopische Expression von E-Cadherin oder PKD1 hemmt individuell die β-Catenin/TCF-Transkriptionsaktivität. Die Expression einer kinase-toten PKD1 (PKD1-KD) hat weniger hemmende Wirkungen als die Wildtyp-PKD1. Umgekehrt erhöht die Expression von shRNAs gegen PKD1 (siPKD1) oder E-Cadherin (siEcad) die β-Catenin/TCF-Transkriptionsaktivität. Ähnliche Ergebnisse wurden von der Dickdarmkrebs-SW480-Zelllinie, die für adenomatöse Polyposis coli negativ ist und hohe Mengen an β-Catenin aufweist, und der Prostatakrebs-C4-2-Zelllinie (Daten nicht gezeigt) erhalten. Die Daten legen stark nahe, dass sowohl PKD1 als auch E-Cadherin die β-Catenin/TCF-Signalgebung negativ regulieren.

PKD1 assoziiert mit β-Catenin und reguliert negativ die β-Catenin/TCF-Transkriptionsaktivität. EIN, sowohl PKD1 als auch E-Cadherin regulieren die β-Catenin/TCF-Transkriptionsaktivität negativ (Topflash-Assay). 50 Nanogramm Toplash-Plasmid, 2,5 ng Renilla-Luciferase und 50 ng Wildtyp-β-Catenin wurden mit 100 ng PKD1-, kinase-toter PKD1- oder E-Cadherin-Konstrukten oder mit 25 ng shRNA-Konstrukten gegen entweder . cotransfiziert E-Cadherin (siEcad) oder PKD1 (siPKD1) in NIH 3T3-Zellen. Die Glühwürmchen-Luciferase-Aktivitäten wurden 48 h nach der Transfektion mit Promega-Dual-Reporter-Assay-Reagenzien gemessen und die Glühwürmchen-Luciferase-Aktivität wurde durch die Renilla-Luciferase-Aktivität normalisiert. Die Überexpression von PKD1 oder E-Cadherin hemmt die β-Catenin-Transkriptionsaktivität. Im Gegensatz dazu erhöht der Knockdown von entweder PKD1 oder E-Cadherin durch siRNA die β-Catenin-Transkriptionsaktivität. Knockdown von PKD1 lindert die hemmende Wirkung, die durch die Überexpression von β-Catenin verursacht wird und umgekehrt. Riegel, SD basierend auf dreifachen Stichproben. Die Wirksamkeit dieser shRNA-Konstrukte wurde in Lit. gezeigt. 20. B zu D, Kolokalisation und in vivo Assoziation von PKD1 und β-Catenin. B, PKD1 und β-Catenin kolokalisieren hauptsächlich auf der Plasmamembran in LNCaP-Zellen, die E-Cadherin-positiv sind. C, PKD1 und β-Catenin kolokalisieren in normalem Prostatagewebe. D, PKD1 und β-Catenin kolokalisieren hauptsächlich im Zytosol in Blasenkrebs-JCA-Zellen, die E-Cadherin-negativ sind.

Die ähnlichen Phänotypen von PKD1 und E-Cadherin auf die β-Catenin/TCF-Funktion veranlassten uns, ihre epistatische Beziehung zu untersuchen. Wir fragten, ob Knockdown von PKD1 die E-Cadherin-Repression auf die Toplash-Aktivität überwinden könnte oder umgekehrt. Die siPKD1 wurde mit dem E-Cadherin-Expressionsvektor oder siEcad mit dem PKD1-Expressionsvektor in Maus-3T3-Zellen cotransfiziert. Knockdown von PKD1 kann die durch die Überexpression von E-Cadherin verursachte Hemmung überwinden und umgekehrt ( Abb. 1EIN), was darauf hindeutet, dass PKD1 und E-Cadherin die β-Catenin/TCF-Aktivität über denselben Weg regulieren.

PKD1 kolokalisiert und assoziiert mit β-Catenin in Prostatakrebszellen und menschlichem Gewebe. Wir untersuchten die subzelluläre Lokalisation von PKD1 und β-Catenin in LNCaP Prostatakrebszellen ( Abb. 1B). Während PKD1 in der Plasmamembran und im Zytosol lokalisiert ist, lokalisiert β-Catenin hauptsächlich in der Plasmamembran. Das zusammengeführte Bild zeigt, dass die beiden Proteine ​​nur an Zelladhärenten Verbindungen kolokalisieren. Interessanterweise ist PKD1 nicht auf Zelloberflächen vorhanden, die nicht mit anderen Zellen in Kontakt stehen, während β-Catenin auf der gesamten Zelloberfläche vorhanden ist ( Abb. 1B, weiße Pfeile). Ähnliche Ergebnisse wurden von C4-2-Zellen erhalten (Daten nicht gezeigt). Darüber hinaus sind PKD1 und β-Catenin in allen fünf untersuchten Paraffinproben aus normalem menschlichem Prostatagewebe auf der Zellmembran kolokalisiert (Abb. 1 .).C). Da E-Cadherin den E-Cadherin/β-Catenin-Komplex auf der Plasmamembran verankert und PKD1 mit β-Catenin kolokalisiert, ist es interessant zu wissen, ob E-Cadherin die PKD1-Membranlokalisation vermittelt. Verwendung der E-Cadherin-negativen JCA-Blasenkrebszelllinie ( Abb. 1D) und SW480-Zellen (Daten nicht gezeigt) zeigen wir, dass PKD1 mit β-Catenin im Cytosol, aber nicht an der Plasmamembran kolokalisiert, was darauf hindeutet, dass die Kolokalisation in Abwesenheit von E-Cadherin erfolgen kann.

PKD1 bindet an β-Catenin und phosphoryliert es. Da PKD1 und β-Catenin zusammen kolokalisieren, haben wir die Interaktion der beiden Proteine ​​durch Immunpräzipitationsexperimente untersucht. Figur 2EIN bestätigt, dass PKD1 und β-Catenin im gleichen Proteinkomplex vorhanden sind. Um zu beweisen, dass PKD1 und β-Catenin direkt interagieren können, wurde die Hefe-Zwei-Hybrid-Analyse verwendet. PKD1 hat zwei Cystein-reiche Domänen, C1a und C1b, eine PH-Domäne und eine katalytische Domäne. Figur 2B zeigt, dass β-Catenin direkt mit der katalytischen und der C1b-Domäne von PKD1 interagiert, was darauf hindeutet, dass PKD1 in Abwesenheit von E-Cadherin direkt mit β-Catenin interagieren kann. Da β-Catenin stark mit der PKD1-Kinasedomäne interagierte, führten wir eine in vitro Phosphorylierungsassay, der zeigt, dass aktive PKD1 β-Catenin phosphorylieren kann, während katalytisch inaktive PKD1 dies nicht kann ( Abb. 2C).

Direkte Interaktion und Phosphorylierung von β-Catenin durch PKD1. EIN, reziproke Coimmunpräzipitation von PKD1 und β-Catenin aus LNCaP-Zellen. Oberteil, Coimmunpräzipitation mit PKD1-Antikörper und Blotting mit β-Catenin-Antikörper. Spur 1, Immunpräzipitation mit Kontrollantikörper Spur 2, Nur ganze Zelllysate Bahn 3, Immunpräzipitation mit PKD1-Antikörper. Unterseite, Coimmunpräzipitation mit β-Catenin-Antikörper und Blotting mit PKD1-Antikörper. Spur 1, Immunpräzipitation mit Kontrollantikörper Spur 2, Immunpräzipitation mit β-Catenin-Antikörper. B, Hefe-Zwei-Hybrid-Test. Drei einzelne Kolonien wurden zum Testen verwendet. Nur die katalytische Domäne von PKD1 interagiert mit β-Catenin. C, in vitro Phosphorylierung. Gereinigtes Glutathion in voller Länge S-Transferase (GST)-markiertes β-Catenin-Protein aus E coli wurde entweder mit aktiver oder kinase-toter PKD1 in Gegenwart von [γ- 32 P]ATP inkubiert. β-Catenin wurde durch aktive PKD1 phosphoryliert. D, Kartierung von PKD1-Phosphorylierungsstellen auf β-Catenin in vitro. Wildtyp- und mutierte GST-markierte β-Catenine in voller Länge wurden in exprimiert und aus gereinigt E coli. Die gereinigten Proteine ​​wurden mit gereinigter aktiver PKD1 in Gegenwart von [ 32 P]ATP inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Proteine ​​durch SDS-PAGE aufgetrennt, mit Coomassie-Blau gefärbt und auf Filme exponiert. Siehe Materialien und Methoden für die Mutantennomenklatur.

Um die PKD1-Phosphorylierungsstelle zu kartieren, in vitro phosphoryliertes β-Catenin-Protein wurde trypsiniert und die resultierenden Peptidfragmente wurden durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie getrennt. Das 32 P enthaltende „heiße“ Peptid wurde isoliert und durch Edman-Abbau weiter analysiert. Die ersten fünf Aminosäurereste waren RAAMF, die mit der β-Catenin-Aminosäuresequenz 95 bis 99 übereinstimmten. Da dieses Peptid (Aminosäurereste 95–123) drei Threoninreste und einen Serinrest enthält, wurde ortsspezifische Mutagenese verwendet, um einzeln oder in Kombination von zwei oder drei dieser Reste. Aus dem bakteriellen Expressionssystem gereinigte Wildtyp- und mutierte β-Catenin-Proteine ​​wurden mit gereinigter aktiver PKD1-Kinase inkubiert. Wie in Abb. 2 gezeigtD, während Wildtyp-β-Catenin phosphoryliert ist, hebt die Mutation aller drei Threonin (Thr 102 , Thr 112 und Thr 120 )-Reste die Phosphorylierung auf, was darauf hindeutet, dass der Serinrest keine PKD1-Phosphorylierungsstelle ist. Wenn nur ein einzelner Threoninrest ersetzt wird, kann β-Catenin immer noch phosphoryliert werden, wenn Thr 112 und Thr 120 verändert wurden, β-Catenin wird nicht mehr phosphoryliert. Daher schlossen wir, dass Thr 112 und Thr 120 PKD1-Phosphorylierungsstellen sind. Diese beiden Reste befinden sich innerhalb der α-Catenin-Bindungsregion. Tatsächlich wurde Thr 112 auch als eine CKII-Phosphorylierungsstelle identifiziert, und eine Mutation von Thr 112 wurde in einer verringerten Affinität zu α-Catenin impliziert (9). Frühere Studien zeigten, dass die Mutation von Thr 120 die Bindungsfähigkeit von α-Catenin aufhob, obwohl keine spezifische Kinase für die Thr 120-Phosphorylierung identifiziert wurde (29).

Um die Phosphorylierung zu bestätigen in vivowurden zwei COOH-terminal verkürzte β-Catenine, Wildtyp und T112R/T120I-Gegenstück, das die ersten 150 Aminosäurereste von β-Catenin enthält, hergestellt. Diese Vektoren, die das NH2-terminale Region von β-Catenin wurden in 293T-Zellen mit entweder aktiver oder Kinase-toter PKD1 cotransfiziert. Zelllysate wurden durch Immunblotting analysiert. Figur 3EIN zeigt, dass das Wildtyp-β-Catenin phosphoryliert werden kann, wie durch eine elektrophoretische Mobilitätsverschiebung in Gegenwart von aktiver PKD1 angezeigt, jedoch nicht der T112R/T120I-Mutante, was darauf hindeutet, dass Thr 112 und Thr 120 phosphoryliert sind in vivo. Im Gegensatz dazu gibt es keine Mobilitätsverschiebung des Wildtyp-β-Catenin NH2-terminale Region bei Inkubation mit inaktiver PKD1 ( Abb. 3EIN). Um weiter zu bestätigen, dass die Bande mit niedrigerem Molekulargewicht phosphoryliertes β-Catenin ist, wurde das PKD1-enthaltende β-Catenin-Lysat mit λ-Phosphatase inkubiert ( 3EIN). In Gegenwart von Phosphatase verschwand die Bande mit niedrigerem Molekulargewicht. Wenn die Phosphatase jedoch mit Phosphatase-Inhibitoren vorinkubiert wurde, blieb die Bande mit niedrigerem Molekulargewicht zurück, was darauf hindeutet, dass die Bande mit niedrigem Molekulargewicht phosphoryliertes β-Catenin ist.

PKD1 phosphoryliert β-Catenin in vivo. A, oben, in vivo Phosphorylierung von verkürztem β-Catenin. Ein COOH-terminal verkürztes Konstrukt, das die ersten 150 Aminosäurereste von β-Catenin enthält (β-KatN) wurde mit PKD1 oder kinase-toter PKD1 (inaktiv) in NIH 3T3-Zellen cotransfiziert. Zelllysate wurden 2 Tage nach der Transfektion gesammelt und mit Anti-GFP-Antikörper immungeblottet. Das Wildtyp-β-Catenin hat eine extra schnell bewegliche Bande, wenn es mit aktiver PKD1 inkubiert wird, aber die Bande erscheint nicht in Gegenwart von inaktiver PKD1. Wenn Thr 112 und Thr 120 mutiert wurden, verschwand die schnell-mobile Bande sogar in Gegenwart von aktiver PKD1, was anzeigt, dass diese beiden Threonin-Stellen für die PKD1-Phosphorylierung notwendig sind. Der T112R/T120I bewegt sich langsamer als der Wildtyp, da er eine zusätzliche positive Ladung auf der T112R-Mutation trägt. Unterseite, Phosphatase-Behandlung. Zellen, die vorübergehend mit Wildtyp-β-catN und PKD1 transfiziert waren, wurden 1 h lang mit 10 nmol/l Bryostatin 1 behandelt. Die Zellen wurden in TBST-Puffer lysiert. Die Zelllysate wurden entweder mit λ-Phosphatase oder λ-Phosphatase plus Phosphatase-Inhibitor-Cocktail behandelt (PI von AG Scientific). Nach der Behandlung mit λ-Phosphatase verschwand die Bande mit niedrigem Molekulargewicht. B, Die Aktivierung von PKD1 erhöht die Phosphorylierung von β-Catenin. Oberteil, Zellen, die vorübergehend mit Wildtyp-β-catN und PKD1 transfiziert waren, wurden mit 10 nmol/l Bryostatin 1 behandelt. Die Behandlungsdauer wurde angegeben. Die phosphorylierte Bande nahm mit der Zeit zu. Unterseite, Die endogene β-Catenin-Phosphorylierung nimmt während der PKD1-Aktivierung zu. C4-2 weist eine sehr geringe PKD1-Aktivität auf ( 31). Bei Stimulierung durch Bryostatin 1 blieb das endogene β-Catenin in C4-2-Zellen im Wesentlichen unverändert. Im Gegensatz dazu wurde endogenes β-Catenin in C4-2-Zellen, die PKD1 stabil exprimieren, phosphoryliert, wie durch die Zunahme einer Bande mit niedrigem Molekulargewicht angezeigt. C, die nichtphosphorylierte Mutante hat eine ähnliche Proteinstabilität wie das Wildtyp-β-Catenin. Volllängen-Wildtyp und T112R/T120I-Mutante wurden 2 Tage lang in NIH 3T3-Zellen transfiziert. Die Zellen wurden entweder mit 2 µmol/l MG132, einem Proteosom-Inhibitor, oder 20 µmol/l Cycloheximid, einem Proteinsynthese-Inhibitor, für die vor der Entnahme angegebenen Zeiten behandelt. Immunblotting wurde mit Anti-β-Catenin durchgeführt. Als Beladungskontrolle diente das endogene β-Catenin. Es gab keinen nachweisbaren Unterschied zwischen Wildtyp und T112R/T120I-Mutante in der Proteinstabilität. D, nichtphosphoryliertes β-Catenin hat eine veränderte subzelluläre Lage. HA-markierte Wildtyp- und T112R/T120I-Mutanten wurden einzeln in C4-2/PKD1-Zellen transfiziert. Die Zellen wurden mit Anti-HA-Tag-Antikörper gefärbt. Das Muster von mutiertem β-Catenin unterschied sich von dem des Wildtyps, mit mehr Kernen.

Die zelluläre PKD1 kann aktiviert werden, wenn sie mit Bryostatin 1 behandelt wird (30). Die Aktivierung von PKD1 kann durch den Phosphoserin-Antikörper pS916 überwacht werden, der die Autophosphorylierung von Ser 916 auf PKD1 erkennt. Die mit PKD1 und verkürztem β-Catenin cotransfizierten Zellen wurden mit 10 nmol/l Bryostatin 1 für verschiedene Zeiträume bis zu 1 h behandelt. Zelllysate wurden durch Western-Blot analysiert. Wie in Abb. 3 zu sehenBakkumulierte aktive PKD1 im Laufe der Zeit zusammen mit der Akkumulation des phosphorylierten β-Catenin.

Um zu bestätigen, dass endogenes β-Catenin von PKD1 phosphoryliert wird, verwendeten wir C4-2-Zellen, von denen bekannt ist, dass sie eine viel geringere PKD1-Aktivität aufweisen als ihre elterlichen LNCaP-Zellen (19). Die Phosphorylierung von endogenem β-Catenin in C4-2-Zellen und in C4-2-Zellen, die PKD1 (C4-2/PKD1) stabil exprimieren, wurde verglichen. Wie in Abb. 3 zu sehenB, nach Aktivierung von PKD1 durch Bryostatin 1 wird das endogene β-Catenin nur in PKD1-transfizierten Zellen phosphoryliert.

Die Phosphorylierung durch PKD1 verändert die subzelluläre Lokalisation von β-Catenin. Da die NH2-terminale Region von β-Catenin an der Regulierung seiner Proteinstabilität beteiligt ist, wurden der Wildtyp und die T112R/T120I-Mutante auf ihre Stabilität untersucht. Vorübergehend transfizierte 3T3-Zellen wurden entweder mit MG132, einem Proteosom-Inhibitor, oder Cycloheximid, einem Proteinsynthese-Inhibitor, für 0, 1 und 4 Stunden behandelt. Die Proteinmengen wurden auf Immunoblots verglichen. Der Wildtyp und die Mutante zeigten in Gegenwart dieser Inhibitoren sehr ähnliche Muster, was darauf hindeutet, dass die nicht phosphorylierte Mutante eine ähnliche Proteinstabilität wie das Wildtyp-β-Catenin aufweist ( 3C).

Um die subzelluläre Verteilung von nicht-phosphoryliertem β-Catenin zu untersuchen, wurden exogenes HA-markiertes Wildtyp- und T112R/T120I mutiertes β-Catenin vorübergehend in C4-2/PKD1-Zellen transfiziert und mit anti-HA-Tag-Antikörpern gefärbt. β-Catenin vom Wildtyp verteilt sich hauptsächlich auf der Plasmamembran mit einem geringen Anteil im Zytosol und im Zellkern ( Abb. 3D). Obwohl ein Teil der T112R/T120I-Mutante auf der Plasmamembran lokalisiert ist, wurde eine zunehmende Menge von T112R/T120I im Zellkern gefunden ( Abb. 3D).

PKD1 moduliert die β-Catenin-Transkriptionsaktivität. Um den Einfluss von PKD1 auf die β-Catenin-Transkriptionsaktivität zu bewerten, untersuchten wir die Expression von β-Catenin-Zielgenen, einschließlich Cyclin D1 und c-Myc, die unter Kontrolle von β-Catenin/TCF stehen, und Tumormetastasensuppressor KAI1 Gen, das durch β-Catenin/κB P50 in metastasierenden Prostatakrebszellen gehemmt wird (8). Im Vergleich zu elterlichen C4-2-Zellen, KAI1 Der mRNA-Spiegel war in C4-2-Zellen, die PKD1 überexprimieren, viel höher (Abb. 4 .).EIN ), aber Ausdruck von Cyclin D1 und c-Myc war in parentalen C4-2-Zellen höher, was darauf hindeutet, dass PKD1 die β-Catenin-Transkriptionsaktivität verringert. Die Ergebnisse der Herunterregulierung von Cyclin D1 und c-Myc durch PKD1 stimmen mit unserer Beobachtung im Topflash-Reporter-Assay in Fig. 1 und unserer früheren Veröffentlichung (21) überein. Wir haben auch die Folgerung veröffentlicht, dass der Knockdown von PKD1 durch siRNA die Cyclin D1- und c-Myc-Proteinexpression erhöht, was darauf hindeutet, dass PKD1 die β-Catenin-Transkriptionsaktivität unterdrückt (21).

PKD1 moduliert die β-Catenin-Transkriptionsaktivität. EIN, Expression von β-Catenin-Zielgenen Cyclin D1, c-Myc, und KAI1in Gegenwart von PKD1. Gesamt-RNA aus parentalen C4-2-Zellen und C4-2/PKD1-Zellen wurde durch semiquantitative reverse Transkriptions-PCR amplifiziert. Die Expression von Cyclin D1 und c-Myc ist in C4-2-Zellen höher, während KAI1 in C4-2/PKD1-Zellen höher ist. B zu D, PKD1-Phosphorylierung erhöht die β-Catenin-Transkriptionsaktivität (Topflash-Assay). B, nichtphosphorylierte β-Catenin-Mutanten haben eine verringerte Transkriptionsaktivität. 50 Nanogramm Toplash-Plasmid, 2,5 ng Renilla-Luciferase und 25, 50 und 100 ng Wildtyp-β-Catenin wurden mit NIH 3T3-Zellen transfiziert. Der Luciferase-Assay wurde 2 Tage später durchgeführt. C, Eine β-Catenin-Mutante, die eine konstitutive Phosphorylierung nachahmt, weist eine erhöhte Transkriptionsaktivität auf. D, Vergleich der PKD1- und CKII-Phosphorylierung auf die β-Catenin-Transkriptionsaktivität. Topflash-Assays wurden mit Wildtyp-β-Catenin durchgeführt und zeigten Mutanten allein oder in Gegenwart von E-Cadherin voller Länge an. Die CKII-Phosphorylierung an Thr 102 /Thr 112 beeinflusst die β-Catenin-Transkriptionsaktivität nicht. E-Cadherin kann an alle β-Catenin-Isoformen binden, wie durch seine hemmende Wirkung auf den Topflash-Assay gezeigt wird. Die Daten wurden normalisiert und alle Experimente wurden dreifach durchgeführt. Riegel, SD.

Wildtyp- und T112R/T120I-mutiertes β-Catenin wurden auf ihre Transkriptionsaktivität durch Topflash-Assay getestet. Überraschenderweise verringern einzelne Mutationen von Thr 112 und Thr 120 die β-Catenin/TCF-TranskriptionsaktivitätenB). Die Ergebnisse stehen im Widerspruch zu unserer Beobachtung in 1 , dass PKD1 die β-Catenin/TCF-Aktivität funktionell unterdrückt. Um den Befund zu bestätigen, haben wir die Mutante T112E/T120E hergestellt, die eine konstitutive Phosphorylierung nachahmt und im Topflash-Assay getestet. T112E/T120E hat eine höhere β-Catenin/TCF-Transkriptionsaktivität als Wildtyp-β-Catenin ( Abb. 4C). Somit ist es möglich, dass die Phosphorylierung von PKD1 erforderlich ist, um die β-Catenin/TCF-Transkriptionsaktivität aufrechtzuerhalten, und dass PKD1 mehrere Rollen bei der Regulierung der subzellulären β-Catenin-Lokalisierung und der Transkriptionsfunktionen hat (siehe Diskussion).

Da sowohl PKD1- als auch CKII-Kinasen Thr 112 von β-Catenin phosphorylieren können, verglichen wir die CKII-Nichtphosphorylierungsmutante T102I/T112R mit der PKD1-Nichtphosphorylierungsmutante T112R/T120I bezüglich der β-Catenin/TCF-Transkriptionsaktivität. Die CKII-Mutante T102I/T112R hat keinen nachweisbaren Einfluss auf die β-Catenin/TCF-Aktivität ( Abb. 4D). Eine kombinierte CKII/PKD1-Mutante T102I/T112R/T120I stellt die β-Catenin/TCF-Transkriptionsaktivität im Vergleich zur PKD1-Nichtphosphorylierungs-Mutante T112R/T120I teilweise wieder her ( Abb. 4D), was darauf hindeutet, dass die CKII-Phosphorylierung an Thr 102 den PKD1-Phosphorylierungseffekt neutralisieren kann.

Die Zugabe von E-Cadherin kann die β-Catenin-Transkriptionsaktivität durch Sequestrieren von Cytoplasma-β-Catenin verringern (26). Die nichtphosphorylierten β-Catenin-Mutanten wurden auch auf ihre E-Cadherin-Bindungsfähigkeit in Topflash-Assays getestet. Alle getesteten β-Catenin-Isoformen, einschließlich PKD1- und CKII-Nichtphosphorylierungsmutanten, beeinflussen die β-Catenin-Reporteraktivität nicht, was darauf hindeutet, dass die Bindung mit E-Cadherin nicht beeinflusst wurde ( 4D).

Die PKD1-Phosphorylierung reguliert die β-Catenin-vermittelte Zellproliferation und -motilität. Eine Überexpression von E-Cadherin führt dosisabhängig zu Zellwachstumsstopp und Apoptose (26–28). Die Coexpression von β-Catenin mit E-Cadherin wirkt dem E-Cadherin-vermittelten Zellwachstumsstopp entgegen. Wir testeten die Fähigkeit von mutiertem β-Catenin, den durch E-Cadherin verursachten Zellwachstumsstopp zu überwinden. Die experimentellen Bedingungen wurden so gewählt, dass die Menge an Wildtyp-β-Catenin die E-Cadherin-vermittelte Hemmung des LNCaP-Zellwachstums marginal rettete ( Abb. 5EIN ). In Gegenwart von ektopischem E-Cadherin linderte die Zugabe von β-Catenin mit einem einzelnen substituierten Threoninrest (T112R oder T120I) die Hemmung des Zellwachstums nicht. Die T112R/T120I-β-Catenin-Mutante mit doppelter Nichtphosphorylierung hatte jedoch ein höheres Rescue-Potenzial als Wildtyp-β-Catenin, was darauf hindeutet, dass die PKD1-Phosphorylierung die β-Catenin-vermittelte Proliferationsfunktion hemmt.

Die Phosphorylierung reguliert die β-Catenin-vermittelte Zellproliferation und -motilität. EIN, nichtphosphoryliertes β-Catenin hat mehr Potenzial, um LNCaP-Zellen zu retten, die E-Cadherin überexprimieren. LNCaP-Zellen wurden mit 100 ng E-Cadherin- oder PKD1-Expressionsvektor voller Länge transfiziert. 50 Nanogramm β-Catenin-Konstrukte (Wildtyp oder Mutanten wie angegeben) oder 25 ng siPKD1 oder siE-Cadherin wurden einzeln mit E-Cadherin oder PKD1 cotransfiziert. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde 48 h nach der Transfektion durch das MTS-Verfahren (Promega) gemessen. Die experimentellen Bedingungen wurden so optimiert, dass das Wildtyp-β-Catenin-Konstrukt eine marginale Rettungskraft aufwies. Zellen mit T112R/T120I wuchsen in Gegenwart von E-Cadherin schneller als solche mit Wildtyp-β-Catenin. Knockdown PKD1 durch siRNA könnte das durch E-Cadherin-Überexpression gehemmte Zellwachstum wiederherstellen und umgekehrt. Riegel, SD basierend auf dreifachen Stichproben. P Wert wurde unter Verwendung einer Einweg-ANOVA bestimmt. B, nichtphosphoryliertes β-Catenin verstärkt die Zellmigration. Transient transfizierte 3T3-Zellen, die Wildtyp oder T112R/T120I exprimieren, wurden 2 Tage nach der Transfektion einem Wundheilungsassay unterzogen. Das Foto wurde 18 Stunden nach der Wundbildung aufgenommen. C, Matrigel-Assay der Zellinvasion. Wildtyp- und T112R/T120I-Mutanten-β-Catenin-Expressionsvektoren voller Länge wurden für 2 Tage in 3T3-Zellen transfiziert, bevor sie zu Matrigel enthaltenden Transwells hinzugefügt wurden. Die Zellen wurden 2 d auf Matrigel gezüchtet. Angelagerte Zellen wurden mit dem Diff Quick-Kit gefärbt (oben). Säulen, durchschnittliche Anzahl angelagerter Zellen pro Filter basierend auf dreifachen Proben Riegel, SD (Unterseite).

Ähnlich wie bei E-Cadherin kann auch die Überexpression von PKD1 die Zellproliferation hemmen ( Abb. 5EIN ref. 21). Die Cotransfektion von siPKD1 mit dem E-Cadherin-Expressionsvektor oder die Cotransfektion von siEcad mit dem PKD1-Expressionsvektor kann die durch die Überexpression von E-Cadherin oder PKD1 verursachte Wachstumshemmung lindern ( 5EIN). Die Daten unterstützen weiterhin die Hypothese, dass PKD1 und E-Cadherin die β-Catenin-Aktivität im gleichen Signalweg regulieren.

Wir untersuchten auch die Auswirkungen der PKD1-Phosphorylierung auf die Zellmotilität. Maus-3T3-Zellen, die entweder mit Wildtyp-β-Catenin oder mit T112R/T120I-Mutante transfiziert waren, wurden durch Wundheilungsassay getestet. Wie in Abb. 5 zu sehenB, hat die T112R/T120I-Mutante eine höhere Mobilität als der Wildtyp. Der Matrigel-Assay bestätigte auch, dass die T112R/T120I-Mutante im Vergleich zu Wildtyp-β-Catenin eine höhere invasive Fähigkeit aufwies (Abb. 5 .).C).


Vergleich der Konservierung innerhalb und zwischen der Ser/Thr- und Tyr-Proteinkinase-Familie: vorgeschlagenes Modell für die katalytische Domäne des epidermalen Wachstumsfaktorrezeptors

Die Proteinkinase-Familie kann aufgrund ihrer Fähigkeit, Ser/Thr- oder Tyr-Substrate zu phosphorylieren, in zwei Hauptgruppen unterteilt werden. Um die Grundlage dieses funktionellen Unterschieds zu verstehen, haben wir eine vergleichende Analyse der Sequenzkonservierung innerhalb und zwischen den Ser/Thr- und Tyr-Proteinkinasen durchgeführt. Es wurde ein multiples Sequenz-Alignment von 86 Proteinkinase-Sequenzen erzeugt. Für jede Position im Alignment haben wir die Erhaltung des Resttyps in Ser/Thr, in Tyr und in beiden Kinase-Unterfamilien berechnet. Um die strukturelle und/oder funktionelle Grundlage für die Konservierung zu verstehen, haben wir diese Konservierungseigenschaften auf das Rückgrat der kürzlich ermittelten Struktur der cAMP-abhängigen Ser/Thr-Kinase abgebildet. Die Ergebnisse zeigen, dass die Kinasestruktur basierend auf der Konservierung grob in drei Zonen unterteilt werden kann. Die innere Zone enthält in der gesamten Kinasefamilie hochkonservierte Reste und beschreibt den hydrophoben Kern des Enzyms zusammen mit Resten, die für die Substrat- und ATP-Bindung und Katalyse essentiell sind. Die äußere Zone enthält in allen Kinasen hochvariable Reste und stellt die lösungsmittelexponierte Oberfläche des Proteins dar. Die dritte Zone besteht aus Resten, die entweder in den Ser/Thr- oder Tyr-Kinasen oder in beiden konserviert sind, aber zwischen ihnen nicht konserviert sind. Diese sind zwischen dem hydrophoben Kern und der dem Lösungsmittel ausgesetzten Oberfläche eingebettet. Zusätzlich zur Analyse der Gesamtkonservierung in der Kinasefamilie haben wir uns auch mit der Konservierung ihrer Substrat- und ATP-Bindungsstellen befasst. Die ATP-Stelle ist in allen Kinasen hoch konserviert, während die Substratbindungsstelle variabler ist. Das aktive Zentrum enthält mehrere Positionen, die sich zwischen den Ser/Thr- und Tyr-Kinasen unterscheiden und für die Unterscheidung zwischen Hydroxyl-tragenden Seitenketten verantwortlich sein können. Mit diesen Informationen schlagen wir ein Modell für die Tyr-Substratbindung an die katalytische Domäne des epidermalen Wachstumsfaktorrezeptors (EGFR) vor.


Kann eine Proteinkinase sowohl einen Threonin- als auch einen Tyrosinrest phosphorylieren? - Biologie

Alle von MDPI veröffentlichten Artikel werden sofort weltweit unter einer Open-Access-Lizenz verfügbar gemacht. Für die Wiederverwendung des gesamten oder eines Teils des von MDPI veröffentlichten Artikels, einschließlich Abbildungen und Tabellen, ist keine besondere Genehmigung erforderlich. Bei Artikeln, die unter einer Open-Access-Creative Common CC BY-Lizenz veröffentlicht wurden, darf jeder Teil des Artikels ohne Genehmigung wiederverwendet werden, sofern der Originalartikel eindeutig zitiert wird.

Feature Papers stellen die fortschrittlichste Forschung mit erheblichem Potenzial für eine große Wirkung auf diesem Gebiet dar. Feature Papers werden auf individuelle Einladung oder Empfehlung der wissenschaftlichen Herausgeber eingereicht und vor der Veröffentlichung einem Peer Review unterzogen.

Das Feature Paper kann entweder ein origineller Forschungsartikel, eine umfangreiche neue Forschungsstudie sein, die oft mehrere Techniken oder Ansätze umfasst, oder ein umfassendes Übersichtspapier mit prägnanten und präzisen Updates zu den neuesten Fortschritten auf diesem Gebiet, das die aufregendsten Fortschritte in der Wissenschaft systematisch überprüft Literatur. Diese Art von Papier gibt einen Ausblick auf zukünftige Forschungsrichtungen oder mögliche Anwendungen.

Editor’s Choice-Artikel basieren auf Empfehlungen der wissenschaftlichen Herausgeber von MDPI-Zeitschriften aus der ganzen Welt. Die Herausgeber wählen eine kleine Anzahl von kürzlich in der Zeitschrift veröffentlichten Artikeln aus, die ihrer Meinung nach für Autoren besonders interessant oder in diesem Bereich wichtig sind. Ziel ist es, eine Momentaufnahme einiger der spannendsten Arbeiten zu geben, die in den verschiedenen Forschungsbereichen der Zeitschrift veröffentlicht wurden.


Einführung

Die posttranslationale Modifikation von Proteinen bietet vielfältige und vielfältige Möglichkeiten zur Steuerung der Proteinfunktion. Von den posttranslationalen Modifikationen, die Proteine ​​in Zellen erfahren können, ist die Phosphorylierung vielleicht eine der bisher am besten untersuchten. Proteinkinasen, die Enzyme, die die Phosphorylierung von hauptsächlich Serin-, Threonin- und Tyrosinresten auf Proteinsubstraten katalysieren [1,2], spielen eine grundlegende Rolle bei der Kontrolle der Vielzahl von Signalübertragungswegen und stellen daher wichtige Angriffspunkte für therapeutische Interventionen dar [3– 5]. Durch Phosphorylierung ihrer Proteinsubstrate sind Kinasen in der Lage, verschiedene Aspekte der Funktion dieses Substrats kritisch raumzeitlich zu regulieren, wie z ]. Somit spielen Proteinkinasen innerhalb biologischer Systeme eine wesentliche Rolle.

In humans, the kinase superfamily has been classified into two principle groups, comprising the eukaryotic protein kinases, of which there are 497, and the atypical protein kinases, of which there are 58 [6]. The eukaryotic protein kinases can be further segregated into several families based on sequence similarities within their kinase domains [7]. A dendrogram encapsulating all human protein kinases is commonly referred to as the kinome tree, where each specific branch represents a family of similar kinases [7]. The serine/threonine (Ser/Thr) protein kinase CK1 family forms its own distinct branch of the kinome tree [7] (Figure 1A), and constitutes one of the first Ser/Thr protein kinase families to be discovered [8]. The CK1 branch includes the CK1 isoforms, and the closely related vaccinia-related kinases (VRKs) and tau tubulin kinase 1 (TTBK1) members [7,9]. Historically, CK1 and an unrelated protein belonging to the CMGC family of protein kinases named casein kinase 2 (CK2), were named for their ability to phosphorylate the milk protein casein in vitro [10]. However, it should be noted that CK1 members are not the physiological casein kinases [10,11]. The bona fide casein kinase was recently identified as FAM20C, a Golgi-resident protein kinase that is capable of phosphorylating many secreted proteins, including casein [11–15]. Due to this misnomer, many studies use CK2 as a control in experiments seeking to prove that the phosphorylation of the substrate of interest is specific to CK1, whereas they are in fact unrelated enzymes.

Domain architecture of CK1 isoforms.

(EIN) Phylogenetic tree of the CK1 family of protein kinases (based on [7]). (B) Schematic detailing the domain architecture for the CK1 isoforms. Percentage sequence similarity of the kinase domains for each CK1 isoform, relative to the CK1α kinase domain, is shown.

(EIN) Phylogenetic tree of the CK1 family of protein kinases (based on [7]). (B) Schematic detailing the domain architecture for the CK1 isoforms. Percentage sequence similarity of the kinase domains for each CK1 isoform, relative to the CK1α kinase domain, is shown.

Seven mammalian CK1 isoforms and their associated splice variants have been reported (Figure 1A). These include the α, α-like, γ1, γ2, γ3, δ and ɛ CK1 isoforms, which have been grouped together based on their high degree of homology within their N-terminal kinase domains (Figure 1B). Outside of the kinase domain, there is little homology between CK1 members. Importantly, CK1 kinases are encoded by distinct genes, and are not splice variants, although splice variants do exist for some CK1 isoforms [16]. For example, there are three transcript variants for human CK1δ [17], and two transcript variants for human CK1α [18]. Interestingly, zebrafish present with four CK1α variants [19]. Within the CK1 family, the α, α-like, δ and ɛ isoforms share a higher degree of sequence similarity in their kinase domains when compared with those of the γ isoforms [16,20,21]. To date, most investigations have focussed on the CK1α, δ and ɛ isoforms, whilst the functions and regulation of the α-like and CK1γ isoforms have remained somewhat elusive, although mounting evidence supports roles for CK1γ in the regulation of immune signalling pathways [22,23]. As such, the major focus of this review will concern CK1α, δ and ɛ.

All CK1 isoforms have been reported to act as monomeric enzymes and are classically thought to exist in a constitutively active state [16,20,21]. However, studies demonstrating constitutive activity of CK1 isoforms have largely been performed in vitro with purified catalytic domains, and as such fail to capture any potential regulation from accessory proteins or other enzymes. It is now becoming clear that certain CK1 isoforms can become activated through direct association with cellular proteins [24]. A comprehensive comparison between the enzyme kinetics of each CK1 isoform, and any associated splice variants, is lacking, but the basal activities are likely different for each isoform, and most likely depend on the substrate used. CK1 family members catalyse the transfer of phosphate on to Ser/Thr residues of their protein substrates by utilising ATP exclusively as the source of the phosphate donor [25,26]. That said, the yeast orthologue of CK1δ, Hrr25, has been reported to phosphorylate tyrosine (Tyr) residues in addition to Ser/Thr [27], and the Xenopus laevis orthologue of CK1α was shown to phosphorylate Tyr residue in synthetic peptide substrates [28]. As ubiquitously expressed kinases, CK1 isoforms have been reported to be involved in numerous, seemingly unrelated signalling pathways, and many proteins have been reported to be phosphorylated by CK1 isoforms [16,20,21,29]. In terms of conservation, the CK1 family are conserved throughout evolution, and several CK1 orthologues have been identified in other vertebrates, as well as yeast, plants, and protozoa [19,30–35].

Early attempts aimed at elucidating the substrate specificity of CK1 identified the requirement for a priming phosphorylation event in the -3 position of the CK1 phosphorylation site. This consensus sequence of pS/pT-X-X-S*/T*, where X is any amino acid and S*/T* denotes CK1-phosphorylation residues, has long since been suggested as the optimal CK1 phosphorylation motif [25,36,37]. Given this requirement for a priming phosphorylation event, CK1 isoforms were thought to act downstream of other kinases, and as such, this restricted their contribution within signalling cascades to one of a hierarchical manner, with CK1 isoforms phosphorylating substrates only when the substrate had been pre-phosphorylated by another priming kinase. However, it has since come to light that a cluster of acidic residues N-terminal to the target Ser/Thr phosphorylation sites, with an acidic amino acid at the −3 position, can effectively substitute for the priming phosphorylation event [38–42]. Furthermore, a non-canonical S-L-S motif with a concurrent cluster of C-terminal acidic residues has also been shown to be phosphorylated by CK1 isoforms, albeit less efficiently than the canonical phospho-primed sequence [16,43]. Such phosphorylation of S-L-S motifs is best showcased in two of the most robustly established CK1 substrates — nuclear factor of activated T-cells (NFAT) and β-catenin [16,43]. Intriguingly, a novel CK1 phosphorylation motif, K/R-X-K/R-X-X-S/T, was reported to be phosphorylated in several sulfatides and cholesterol-3-sulfate binding proteins [44]. These observations imply that CK1 isoforms can phosphorylate Ser/Thr residues that are not defined by a specific sequence motif, suggesting that the phosphorylation of specific substrates in cells is likely to be regulated by other factors, such as determinants of their subcellular distribution and substrate recruitment.


Zusammenfassung des Autors

The activity of proteins can be finely and reversibly tuned by post-translational modifications. The attachment of phosphate groups to tyrosine residues is one of such modifications. While the existence of extracellular phosphoproteins has been known, the functional significance of extracellular phosphorylation is poorly understood. Here we describe a single extracellular tyrosine whose inducible phosphorylation may represent an archetype for a new class of mechanism mediating protein—protein interaction and regulating protein function. We show that the interaction between EphB2—which occurs upon receptor activation by its ligand ephrin-B—and the N-methyl-D-aspartate receptor (NMDAR) depends on extracellular phosphorylation of EphB2. This interaction regulates the localization of the NMDA receptor to synaptic sites in neurons. In vivo, EphB2 is phosphorylated in response to injury, and the subsequent up-regulation of the interaction between EphB2 and NMDA receptors enhances injury-induced pain behavior and mechanical hypersensitivity in mice. Importantly, our study defines a specific extracellular phosphorylation event as a mechanism driving protein interaction and suggests that extracellular phosphorylation of proteins is an underappreciated mechanism contributing to the development and function of the nervous system and synapse.

Zitat: Hanamura K, Washburn HR, Sheffler-Collins SI, Xia NL, Henderson N, Tillu DV, et al. (2017) Extracellular phosphorylation of a receptor tyrosine kinase controls synaptic localization of NMDA receptors and regulates pathological pain. PLoS Biol 15(7): e2002457. https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2002457

Wissenschaftlicher Redakteur: Allan Basbaum, University of California, San Francisco, United States of America

Empfangen: March 15, 2017 Akzeptiert: June 12, 2017 Veröffentlicht: July 18, 2017

Urheberrechte ©: © 2017 Hanamura et al. Dies ist ein Open-Access-Artikel, der unter den Bedingungen der Creative Commons Attribution License vertrieben wird und die uneingeschränkte Verwendung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium gestattet, sofern der ursprüngliche Autor und die Quelle angegeben werden.

Datenverfügbarkeit: Alle relevanten Daten sind in der Veröffentlichung und den Begleitinformationen enthalten. Mass spectrometry data, including raw files, are freely available upon request to Thomas Neubert ([email protected]). Raw confocal stacks are available upon request to Matthew Dalva ([email protected]).

Finanzierung: National Institute of Mental Health (grant number MH100093). National Institute of General Medicine (grant number GM102575). National Center for Research Resources (grant number RR027990). 100 Women in Hedge Fund Foundation. National Institute on Drug Abuse (grant number DA022727). National Eye Institute Vision Training Grant (grant number EY007035). National Institute of Neurological Disorders and Stroke (grant number NS050276). National Institute of Neurological Disorders and Stroke (grant number NS065926). The Vicki and Jack Farber Foundation. Die Geldgeber spielten keine Rolle beim Studiendesign, der Datenerhebung und -analyse, der Entscheidung zur Veröffentlichung oder der Erstellung des Manuskripts.

Konkurrierende Interessen: Die Autoren haben erklärt, dass keine konkurrierenden Interessen bestehen.

Abkürzungen: ACSF, artificial cerebrospinal fluid AU, arbitrary unit cFN3, C-terminal FN3 CIP, calf intestinal alkaline phosphatase Cys, cysteine-rich domain D-APV, D-2-amino-5-phosphonovalerate DIV, day in vitro EGFP, enhanced green fluorescent protein EPSC, excitatory postsynaptic current EYFP, enhanced yellow fluorescent protein FL, full length FN3, fibronectin type III IP, immunoprecipitation JM, juxtamembrane domain KD, kinase dead K–S, Kolmogorov–Smirnov LBD, ligand-binding domain LC-MS/MS, liquid chromatography tandem mass spectrometry LV, lentivirus mEPSC, miniature excitatory postsynaptic current MS/MS, tandem mass spectrometry nFN3, N-terminal FN3 NMDAR, N-methyl-D-aspartate receptor pA, picoampere PDZ, PSD-95/DLG1/ZO-1 domain PY99, α-phosphotyrosine RNAi, RNA interference Ro25, Ro 25–6981 RTK, receptor tyrosine kinase SAM, sterile α-motif shRNA, short hairpin RNA STED, stimulated emission depletion TK, tyrosine kinase domain TM, transmembrane domain TR, truncated VLK, vertebrate lonesome kinase WT, wild type


DISKUSSION

Roles of Protein Tyrosine Phosphatases in Yeast Meiosis and Sporulation

In S. cerevisiae, the involvement of Tyr phosphorylation in cellular signaling has been well established only in the regulation of MAP kinases. Much less is known about the tyrosine phosphorylation in regulation of other cellular responses in yeast. In this report, by analyzing the phenotypes of strains with phosphatase genes deleted, we have demonstrated that Ptp2 and Ptp3 are required for efficient meiosis and sporulation. Homozygous deletion of bothptp2Δ ptp3Δ causes no adverse growth defect but results in a significant reduction of sporulation efficiency. Inptp2Δ/ptp3Δ/− cells, the expression of sporulation-specific genes was significantly reduced, suggesting that Ptp2 and Ptp3 are required for the initiation of meiotic differentiation. The sporulation defect phentype can be affected by strain background. Double deletion of PTP2/PTP3in yeast strains dervied from SK background does not result in an apparent sporulation defect (our unpublished results). It is possible that in strains derived from SK background, which was selected for high sporulation effeciency, genetic variation has diminished the requirement of phosphatase in sporulation. The phosphatase activity of Ptp3 appears to be required for its function in sporulation, because a catalytically deficient Ptp3C814G mutant was unable to complement the sporulation defects of ptp2Δ/ptp3Δ in our strains. Because both Ptp2 and Ptp3 are Tyr-specific phosphatases, our results suggest an involvement of Tyr phosphorylation in regulation of meiosis and sporulation. One possible mechanism for PTPase action is that the phosphatases dephosphorylate a Tyr-phosphorylated regulator(s), thus allowing initiation of meiotic differentiation. Consistent with the notion that phosphatases are involved in the regulation of sporulation, Park et al. (1996) have recently reported that deletion of a dual-specificity phosphatase,YVH1, together with ptp2Δ resulted in a significant reduction in sporulation.

Regulation of Rim11 Tyr Phosphorylation

We have shown that there are at least three cellular proteins, p42, p43, and p52, that became Tyr phosphorylated inptp2Δ/ptp3Δ/− cells during sporulation. We presented data indicating that p42 is likely to be the MCK1 Genprodukt. Mck1 was previously shown to undergo autophosphorylation on tyrosine residues (Lim et al., 1993). Because deletion of MCK1 results in a pleiotropic phenotype, whereas cells with a homologous GSK3 gene,RIM11, deleted only displays a sporulation defect, we investigated whether p43 is encoded by RIM11. Löschung vonRIM11 abolished p43 Tyr phosphorylation. We observed that Rim11 is constitutively Tyr phosphorylated on the Tyr-199 residue, which is conserved among every member of the GSK3 family. Tyr phosphorylation of Rim11 was induced by shifting cells from glucose to acetate medium. However, Rim11 Tyr phosphorylation does not appear to be regulated by Ptp2 and Ptp3, because neither deletion nor overexpression of the PTPase genes had a significant effect on the Tyr phosphorylation of Rim11. Therefore, it is unlikely that Rim11 is the 43-kDa protein whose Tyr phosphorylation is up-regulated inptp2Δ/ptp3Δ/− cells during sporulation. Future studies are required to determine the identities of p43 and p52 and the role of tyrosine dephosphorylation of these proteins in sporulation.

In mammalian cells, GSK3 has been shown to be constitutively phosphorylated on Tyr (Hughes et al., 1993). However, it is unclear whether the Tyr phosphorylation is mediated by upstream kinases or by autophosphorylation. In our investigation on the regulation of Rim11 Tyr phosphorylation, we found that the in vivo Tyr phosphorylation of Rim11 is dependent on its own kinase activity, suggesting that autophosphorylation is responsible for the Tyr phosphorylation. It is formally possible that Rim11 Tyr phosphorylation was catalyzed by another kinase whose activity depends on Rim11 in vivo. Our data support a model that the tyrosine phosphorylation of Rim11 is autocatalytic. When kinase-deficient Rim11K68A is expressed in wild-type cells, its Tyr phosphorylation is mostly abolished, arguing against the dependence on another kinase. The autophosphorylation mechanism is further supported by the observation that purified recombinant GST-Rim11 undergoes tyrosine phosphorylation in vitro. Given the high degree of sequence homology between Rim11 and mammalian GSK3 (∼50∼60% homology), it is conceivable that the autophosphorylation mechanism may also be responsible for Tyr phosphorylation of mammalian GSK3 in vivo.

Function of Rim11 Tyr Phosphorylation

No kinase activity toward substrates was detected on Rim11Y199F mutant immunoprecipitated from yeast cells. Loss of kinase activity of Rim11Y199F could be due to either tyrosine phosphorylation-activating Rim11 kinase activity or the mutation causing an inappropriate global folding of Rim11. When Rim11Y199F mutant was purified as recombinant protein from E coli, the autophosphorylation activity was intact, although no kinase activity toward substrates was detected. Given the efficient GST-Rim11Y199F autophosphorylation activity, we believe that Rim11Y199F should have a correct global structure compared with wild type. Thus our data support the model that phosphorylation of Tyr-199 is required for specific activity of Rim11 toward substrate, possibly playing a role in substrate recognition and phosphorylation rather than kinase activity per se. One of Rim11 in vivo function is to phosphorylate two key meiotic regulators, Ime1 (Bowdish et al., 1994) and Ume6 (Malathi et al., 1997). Phosphorylation of Ime1 and Ume6 by Rim11 promotes the complex formation of Ime1 and Ume6, which induces the expression of sporulation specific genes (Rubin-Bejerano et al., 1996 Malathiet al., 1997). We propose that the function of tyrosine phosphorylation is to activate Rim11 kinase, thereby enhancing the ability of Rim11 to phosphorylate physiological substrates, including Ume6 and Ime1. Consistent with the in vivo requirement of Tyr-199 phosphorylation for Rim11 activity, Y199F mutation, which eliminated the phosphorylation site, completely abolished in vivo functions of Rim11.

In summary, this report demonstrates essential roles of tyrosine phosphorylation in yeast meiosis and sporulation by both protein Tyr phosphatases and kinase. Our results show for the first time that Tyr phosphorylation of Rim11 is required for its kinase activity toward substrates and plays an essential role in the regulation of meiosis and sporulation. The functional significance of tyrosine phosphorylation may also apply to members of mammalian GSK3 family that tyrosine phosphorylation enhances the ability of GSK3 to phosphorylate physiological substrates.


Schau das Video: Signaltransduktion Teil 1 -- Was ist Signaltransduktion? -- AMBOSS Auditor (Juli 2022).


Bemerkungen:

  1. Dack

    Tut mir leid, dass ich dich unterbringe, aber ich schlage vor, eine andere Art und Weise zu gehen.

  2. Shaktirisar

    Sich irren.

  3. India

    Ich gratuliere, was für eine hervorragende Botschaft.

  4. Holic

    Nein, nichts davon ist wahr. Ich spreche nicht über das Gespräch, ich spreche endlich darüber. Alle Argumente sind Gamno.

  5. Kagakazahn

    Danke für die Information. Das wusste ich nicht.

  6. Cynric

    Meiner Meinung nach liegst du falsch. Ich schlage vor, darüber zu diskutieren.

  7. Afif

    Es tut mir leid, aber ich glaube, du liegst falsch. Lassen Sie uns darüber diskutieren. Maile mir eine PM, wir reden.



Eine Nachricht schreiben