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16S rRNA- und 5S rRNA-Datensätze

16S rRNA- und 5S rRNA-Datensätze


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Ich benötige 16S rRNA und 5S rRNA (Gammaproteobacteria - E.coli) Sekundärstrukturdateien im ct-Format.

Ich habe versucht, in verschiedenen RNA-Datenbanken nach ihnen zu suchen, konnte aber keine finden. Kann mir jemand sagen, wo ich solche Datensätze finde?

Danke im Voraus.


RNA STRAND v2.0 - Die RNA-Sekundärstruktur- und statistische Analysedatenbank http://www.rnasoft.ca/strand/

16S rRNA: Sekundärstrukturdatei im ct-Format

http://www.rnasoft.ca/strand/show_file.php?format=CT&molecule_ID=CRW_00111&check_out_the=View+the+RNA+sequence+and+secondary+structure+for+molecule+CRW_00111

5S rRNA: Sekundärstrukturdatei im ct-Format

http://www.rnasoft.ca/strand/show_file.php?format=CT&molecule_ID=CRW_00573&check_out_the=View+the+RNA+sequence+and+secondary+structure+for+molecule+CRW_00573


Arten von RNA (Ribonukleinsäure): 4 Arten

Es ist die am häufigsten vorkommende RNA (70-80% der Gesamtmenge), die 3-4 Typen hat. Einige ihrer Typen (23S, 28S) sind die längsten aller RNAs. Wie der Name schon sagt, ist rRNA ein Bestandteil von Ribosomen.

Hier liegt es aufgewickelt zwischen und über den Proteinmolekülen. Abhängig von ihrem Sedimentationskoeffizienten gibt es vier Arten von RNAs von Eukaryoten – 28S, 18S, 5.8S und 5S.

Prokaryontische Ribosomen haben drei Arten von RNAs – 23S, 16S und 5S. 28S, 5.8S und 5S (23S und 5S in Prokaryoten) kommen in größeren Untereinheiten des Ribosoms vor, während 18S (16 S in Prokaryoten) in kleineren Untereinheiten des Ribosoms zu finden sind. rRNA wird in Form einer längeren Kette von 45S in Eukaryoten und 30S in Prokaryoten transkribiert.

Im eukaryotischen Transkript ist die Anordnung in Richtung 5′ → 3′ 18S — 5,8S — 28S. Vor der Entfernung der Spacer-RNA treten mehrere Methylierungen auf. Die Entfernung der Spacer-RNA zerlegt das Transkript in 2-3 Teile. 5S wird oft separat transkribiert.

(i) rRNAs binden Proteinmoleküle und führen zu Ribosomen,

(ii) Das У-Ende der 18S-rRNA (16S in Prokaryonten) weist Nukleotide auf, die zu denen der cap-Region der mRNA komplementär sind.

(iii) 5S-rRNA und der umgebende Proteinkomplex stellen eine Bindungsstelle für tRNA bereit.

rRNAs werden mit spezifischen Proteinen assoziiert, um Ribosomen-Untereinheiten zu bilden. Die 50S-Untereinheit des prokaryotischen Ribosoms enthält 23S-rRNA, 5S-rRNA und etwa 32 Proteinmoleküle. Die 30S-Untereinheit des prokaryotischen Ribosoms hat 16S-rRNA und etwa 21 Proteinmoleküle.

Die 60S-Untereinheit des eukaryotischen Ribosoms enthält 28S rRNA, 5S rRNA, 5.8S rRNA und etwa 50 Proteinmoleküle. Die 40S-Untereinheit des eukaryotischen Ribosoms besteht aus 18S-rRNA und etwa 33 Proteinmolekülen.

Typ # 2. Transfer-RNA (tRNA):

Es wird auch löslich oder sRNA genannt. Es gibt über 100 Arten von tRNAs. Transfer-RNA macht etwa 15 % der Gesamt-RNA aus. tRNA ist die kleinste RNA mit 70-85 Nukleotiden und einem Sedimentationskoeffizienten von 4S. Die Stickstoffbasen einiger seiner Nukleotide werden modifiziert, z. B. Pseudouridin (ψ), Dihydrouridin (DHU), Inosin (I).

Dies bewirkt ein Coiling der ansonsten einzelsträngigen tRNA in eine L-förmige Form (dreidimensional, Klug, 1974) oder in eine kleeähnliche Form (zweidimensional, Holley, 1965). Etwa die Hälfte der Nukleotide ist basengepaart, um gepaarte Stämme zu erzeugen. Fünf Regionen sind ungepaart oder einzelsträngig – AA-Bindungsstelle, T С-Schleife, DHU-Schleife, Extraarm und Anticodon-Schleife.

(i) Anticodon:

Es besteht aus drei Stickstoffbasen zur Erkennung und Anlagerung an das Codon der mRNA.

(ii) AA-verbindliche Site:

Es liegt am 3′ Ende gegenüber dem Anticodon und hat eine CCA-OH-Gruppe. Diese CCA-Gruppe wird nach der Transkription hinzugefügt (5′ Ende trägt G). Aminosäure- oder AA-Bindungsstelle und Anticodon sind die beiden Erkennungsstellen der tRNA.

(iii) T ψ C-Schleife:

Es enthält Pseudouridin. Die Schleife ist die Stelle für die Bindung an Ribosomen,

(iv) DHU-Schleife:

Die Schleife enthält Dihydrouridin. Es ist eine Bindungsstelle für das Enzym Aminoacylsynthetase,

(v) Zusatzarm:

Es ist ein Arm oder eine Schleife mit variabler Stelle, die zwischen T C-Schleife und Anticodon liegt. Die genaue Rolle des zusätzlichen Arms ist nicht bekannt.

(i) tRNA ist ein Adaptermolekül, das zur Übertragung von Aminosäuren auf Ribosomen zur Synthese von Polypeptiden gedacht ist. Es gibt verschiedene tRNAs für verschiedene Aminosäuren. Einige Aminosäuren können von 2-6 tRNAs aufgenommen werden. tRNAs tragen an bestimmten Stellen während der Polypeptidsynthese spezifische Aminosäuren wie pro Cidons der mRNA.

Codons werden von Anticodons von tRNAs erkannt. Bestimmte Aminosäuren werden von bestimmten aktivierenden oder Aminoacylsynthetase-Enzymen erkannt,

(ii) Sie halten Peptidylketten über den mRNAs.

Typ # 3. Messenger-RNA (mRNA):

Es handelt sich um eine lange RNA, die 2-5% des gesamten RNA-Gehalts ausmacht. Es bringt Anweisungen aus der DNA für die Bildung einer bestimmten Art von Polypepsie. Die Anweisungen sind in der Basensequenz ihrer Nukleotide enthalten. II wird genetischer Code genannt. Drei benachbarte Stickstoffbasen spezifizieren eine bestimmte Aminosäure.

Die Bildung von Polypep&Shytid erfolgt über dem Ribosom. mRNA wird an Ribosomen angeheftet. tRNAs werden induziert, um Aminosäuren in eine bestimmte Sequenz zu bringen, entsprechend der Sequenz von Codons, die über mRNA vorhanden sind. mRNA hat eine methylierte Region am 5′-Terminus.

Es fungiert als Kappe zur Befestigung mit Ribosomen. Auf Cap folgt ein Initiationscodon (AUG) entweder unmittelbar oder nach einer kleinen nicht-kodierenden Region. Dann gibt es eine kodierende Region, gefolgt von einem Terminationscodon (UAA, UAG oder UGA). Am 3’-Terminus befindet sich dann eine kleine nichtkodierende Region und ein Poly-A-Bereich (Abb. 9.24). Eine mRNA kann nur ein einzelnes Polypeptid oder mehrere davon spezifizieren.

Ersteres wird als monocistronisch bezeichnet, während letzteres als polycistronisch bezeichnet wird. Polycistronische mRNA kommt häufiger in Prokaryonten vor. Eukaryotische mRNA ist normalerweise monocistronisch.

Auch die Lebensdauer der mRNA ist variabel. In einigen niedrigeren Formen beträgt sie einige Minuten bis einige Stunden. Andererseits scheinen die mRNAs höherer Formen eine lange Lebensdauer zu haben. Bei jungen roten Blutkörperchen, die auch bei Kerndegeneration weiterhin Hämoglobin bilden, dauert es mehrere Tage.

(i) mRNA trägt kodierte Information für die Translation in die Polypeptidforma­tion.

(ii) Durch reverse Transkription kann es kompakte Gene bilden, die in der Gentechnik verwendet werden. Das Phänomen tritt auch in der Natur auf und hat bestimmte Gene in den Genomen hinzugefügt,


Eigenschaften der nukleären (18S, 5.8S, 28S und 5S) und mitochondrialen (12S und 16S) rRNA-Gene von Apis mellifera (Insecta: Hymenoptera): Struktur, Organisation und retrotransponierbare Elemente

Die Weiterverwendung dieses Artikels ist in Übereinstimmung mit der Creative Commons Deed, Namensnennung 2.5, gestattet, die keine kommerzielle Nutzung erlaubt.

Abstrakt

Als Begleitmanuskript zur Freisetzung des Honigbienen-Genoms berichten wir über die gesamte Sequenz der nuklearen (18S, 5.8S, 28S und 5S) und mitochondrialen (12S und 16S) ribosomalen RNA (rRNA)-kodierenden Gensequenzen (rDNA) und verwandte intern und extern transkribierte Spacer-Regionen von Apis mellifera (Insecta: Hymenoptera: Apocrita). Darüber hinaus sagen wir Sekundärstrukturen für die reifen rRNA-Moleküle basierend auf vergleichenden Sequenzanalysen mit anderen Arthropodentaxa und unter Bezugnahme auf kürzlich veröffentlichte Kristallstrukturen des Ribosoms vorher. Im Allgemeinen stimmen die Strukturen von Honigbienen-rRNAs mit zuvor vorhergesagten rRNA-Modellen von anderen Arthropoden in Kernregionen der rRNA überein, mit geringer zusätzlicher Expansion in nicht konservierten Regionen. Unsere multiplen Sequenz-Alignments werden in mehreren öffentlichen Datenbanken zur Verfügung gestellt und bieten eine vorläufige Etablierung eines globalen Strukturmodells aller rRNAs aus den Insekten. Darüber hinaus stellen wir konservierte Sequenzabschnitte zur Verfügung, die die rDNA-Cistrons flankieren, die die extern transkribierten Spacer-Regionen (ETS) und einen Teil der intergenen Spacer-Region (IGS) umfassen, einschließlich mehrerer repetitiver Motive. Schließlich berichten wir über das Auftreten von Retrotransposition in der nuklearen großen Untereinheit rDNA, da R2-Elemente an den üblichen Insertionspunkten vorhanden sind, die in anderen Arthropoden gefunden werden. Interessanterweise wurden funktionelle R1-Elemente, die normalerweise in den Genomen von Insekten vorhanden sind, in den rRNA-Genen der Honigbiene nicht nachgewiesen. Die Reverse-Transkriptase-Produkte der R2-Elemente werden aus ihren mutmaßlichen offenen Leserahmen abgeleitet und strukturell mit denen eines anderen Hymenoptera-Insekts, der Juwelwespe, abgeglichen Nasonia (Pteromalidae). Abschnitte von konservierten Aminosäuren, die zwischen geteilt werden Apis und Nasonia sind dargestellt und dienen als potentielle Stellen für das Primerdesign, da Ziel-Amplikons innerhalb dieser R2-Elemente als neue phylogenetische Marker für Hymenoptera dienen können. Angesichts des bevorstehenden Abschlusses der Sequenzierung der Nasonia Genoms, erwarten wir, dass unser Bericht letztendlich Licht in die Evolution des Hymenoptera-Genoms bei höheren Insekten bringt, insbesondere in Bezug auf die relative Erhaltung konservierter rDNA-Gene, verwandter variabler Spacer-Regionen und retrotransponierbarer Elemente.


VielfaltSeq

Motivation: Die Sequenzierung der nächsten Generation und insbesondere die Gensequenzierung von 16S ribosomaler RNA (16S rRNA) ist eine leistungsstarke Technik zur Identifizierung und Quantifizierung von im Menschen lebenden Mikroben, die zusammen als menschliche Mikrobiota bekannt sind. Sobald die Bakterienhäufigkeit durch 16S-rRNA-Gensequenzierung profiliert und in einem Zähldatensatz zusammengefasst wurde, bieten Diversitätsindizes wertvolle mathematische Werkzeuge, um die Zusammensetzung der menschlichen Mikrobiota zu untersuchen. Kurz gesagt kann Alpha-Diversität verwendet werden, um die taxonomische Komplexität einer einzelnen Stichprobe zu beschreiben, während Beta-Diversität verwendet werden kann, um Unterschiede zwischen Stichproben zu identifizieren.

Ergebnisse: Das DiversitySeq-Paket implementiert in einem einheitlichen Rahmen das gesamte Panel von Diversity-Indizes, das in (Finotello et al., 2016) untersucht wurde, und ermöglicht die Bewertung der Diversität anhand von Zähldatensätzen. DiversitySeq implementiert auch einen Simulator zur Generierung von synthetischen Zähldatensätzen aus der 16S rRNA-Gensequenzierung. Neben 16S-rRNA-Gensequenzierungsdaten kann dieses Paket mit anderen Datensätzen mit ähnlichen Eigenschaften verwendet werden, wie z.

Zitat

Wenn Sie die Software für Ihre Forschung verwenden, beziehen Sie sich bitte auf das Originalpapier von DiversitySeq mit dem folgenden Zitat.

Finotello F, Mastrorilli E, Di Camillo B. Messung der Diversität der menschlichen Mikrobiota mit gezieltem Next-Generation-Sequencing. Briefings in Bioinformatik. 19. Juli 2018 (4): 679-692.


Experimentelle Verfahren

Vorhersage der rRNA-Sekundärstruktur

Die zusammengestellten Honigbienen-rDNA-Sequenzen wurden in die Arthropoden-rRNA-Modelle (nl 18S, 5.8S, 28S, 5S rRNAs mt 12S und 16S rRNAs) integriert, die auf der Comparative RNA Website (CRW Site) (http://www.rna) vorhergesagt und zusammengestellt wurden .icmb.utexas.edu) und die jRNA-Website (http://hymenoptera.tamu.edu/rna). Helix-Nummerierung folgt der E coli System auf der CRW-Site verfügbar. Informationen zum Alignment von RNA-Sequenzen unter Verwendung von Sekundärstrukturmodellen, einschließlich Kovariationsanalyse, thermodynamischen Algorithmen und mehrdeutig ausgerichteten Regionen, sind auf beiden Websites verfügbar. Sekundärstrukturmodelldiagramme wurden mit dem Programm XRNA (entwickelt von B. Weiser und H. Noller, University of Santa Cruz, CA) erstellt. Basenpaarfrequenztabellen und Strukturdiagramme sind auf der CRW-Site verfügbar. Unterschiede zwischen unseren früheren Arthropoden-rRNA-Strukturen und den hier vorgestellten werden auf der jRNA-Website veranschaulicht.

IGS-Sequenzvergleich

Konservierte rDNA-Sequenzen, die das 3'-terminale Ende der 28S-rRNA und das 5'-terminale Ende der 18S-rRNA flankieren, wurden für Blast (Altschul et al., 1990) sucht in der Honey Bee Genome Database (http://racerx00.tamu.edu/bee_resources.html). Alle Optionen in Assembly 3 wurden untersucht, einschließlich nicht zugewiesener Gruppen (Bin 0) jedoch lagen fast ausnahmslos alle Blast-Ergebnisse innerhalb der Wiederholungslesevorgänge von Assembly 3. Es wurden die Standard-Blast-Einstellungen verwendet, außer dass wir nicht nach geringer Komplexität filtern. Die Ergebnisse wurden als Master-Slave mit Identitäten betrachtet und mit 500 Beschreibungen und Ausrichtungen angezeigt. Wir haben Master-Slave verwendet, um Lesevorgänge zu identifizieren, die in nachfolgenden Blast-Suchen verwendet werden, um die Sequenz zu erweitern. Es wurden nur Sequenzunterschiede berichtet, die vier oder mehr Male wiederholt wurden. Eindeutige und seltene SNP-Unterschiede wurden nicht berichtet. Sequenzen wurden dann manuell in SeAl v2.0a11 (Rambaut, 1996) ausgerichtet. Nur ein Alignment wurde für das 5′-Ende des IGS vorgenommen, während drei Alignments für das 3′-Ende der IGS- und ETS-Regionen vorgenommen wurden. Ausrichtungen sind auf der jRNA-Website verfügbar.

R1- und R2-Elementvorhersage-rDNA-Sequenzen, die die konservierten Insertionsstellen für R1- und R2-Elemente in Arthropoden überspannen, wurden unter Verwendung der oben diskutierten Blast-Strategie zusammengestellt. Ergebnisse, die Nicht-rDNA-Sequenzen enthielten, die entweder am 5'- oder 3'-Ende der rDNA-Insertionsstelle inseriert wurden, wurden zum manuellen Alignment nach SeA1 exportiert. Weitere Blast-Suchen wurden unter Verwendung konservierter Regionen von ausgerichteten Sequenzen durchgeführt, was es uns ermöglichte, sowohl vom 5′- als auch vom 3′-Ende über die R-Elemente zu „gehen“. Nach Fertigstellung der R2-Elemente translatierten wir die Konsensussequenz in sechs Frames, um den ORF des RT-Proteins zu bestimmen. Dies ermöglichte die Identifizierung von mutmaßlichen Start- und Stoppcodons. Nukleotid- und Aminosäuresequenzen des R2-Elements der Honigbiene wurden mit dem R2-B-Element der Juwelwespe abgeglichen. Nasonia sp. ( GenBank-Zugangsnr. AF090145). Das Alignment wurde manuell unter Bezugnahme auf die veröffentlichte Struktur von RT-Proteinen aus Arthropoden (Burke et al., 1999 ).


Abstrakt

Öffentlich verfügbare Sequenzdatenbanken des Gens der kleinen ribosomalen RNA-Untereinheit, auch als 16S-rRNA in Bakterien und Archaeen bekannt, wachsen schnell und die Zahl der Einträge übersteigt derzeit 4 Millionen. Ein einheitlicher Klassifikations- und Nomenklaturrahmen für alle Bakterien und Archaeen existiert jedoch noch nicht. In diesem Analysis-Artikel schlagen wir rationale taxonomische Grenzen für hohe Taxa von Bakterien und Archaeen auf der Grundlage von 16S rRNA-Gensequenzidentitäten vor und schlagen eine Begründung für die Umschreibung unkultivierter Taxa vor, die mit der Taxonomie kultivierter Bakterien und Archaeen kompatibel ist. Unsere Analysen zeigen, dass nur nahezu vollständige 16S-rRNA-Sequenzen genaue Messungen der taxonomischen Diversität liefern. Darüber hinaus deuten unsere Analysen darauf hin, dass die meisten der 16S-rRNA-Sequenzen der hohen Taxa bis zum Ende des laufenden Jahrzehnts in Umweltstudien entdeckt werden.


Methoden

Bakterienstämme und Wachstumsbedingungen

Infektiös, Tiefgang B. burgdorferi N40 wurde von Dr. L. Bockenstedt (Yale University, New Haven, CT) bereitgestellt. Nicht infektiöser Hochpass B. burgdorferi B31 wurde von Dr. J. Radolf (University of Connecticut Health Center, Farmington, CT) bereitgestellt. B. burgdorferi 297 (Klon BbAH130) wurde von Dr. M. Norgard (University of Texas Southwestern Medical Center, Dallas, TX) bereitgestellt. Dieser infektiöse Wildtypstamm war der Elternstamm für die ΔrelBbu B. burgdorferi [19]. B. burgdorferi Stämme wurden bei 34ଌ in BSK-H (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), ergänzt mit 6% Kaninchenserum (Sigma) (vollständiges BSK-H), wenn nicht anders angegeben, gehalten. Die Zellzahlen wurden wie zuvor beschrieben durch Dunkelfeldmikroskopie bestimmt [17].

DNA-Isolierung und PCR

DNA von B. burgdorferi wurde unter Verwendung des High Pure PCR Template Preparation Kit (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN) isoliert. Die PCR-Amplifikation wurde unter Verwendung von Taq DNA-Polymerase (Sibgene, Derwood, MD). Für die PCR verwendete Primer sind in Tabelle ​ Tabelle1 aufgeführt. 1. Die PCR wurde in einem Endvolumen von 10 μl unter Verwendung eines RapidCycler von Idaho Technology (Idaho Technology Inc., Salt Lake City, UT) durchgeführt. Das Amplifikationsprogramm bestand aus Denaturierung bei 94ଌ für 15 Sek. gefolgt von 37 Zyklen von 94ଌ für 10 Sek.-53ଌ für 10 Sek.-72ଌ für 50 Sek. (für tRNA Ala-tRNA Ile-Region) oder für 2 min (für tRNA Ile -23S rRNA-Region) und letzte Verlängerung bei 72ଌ für 30 Sekunden.

RNA-Isolierung und RT-PCR

RNA aus B. burgdorferi wurde mit TRIzol Reagenz (Invitrogen Life Technology, Carlsbad, CA.) gemäß den Empfehlungen des Herstellers isoliert und mit RQ1 RNase-freier DNase (Promega Corporation, Madison, WI) behandelt, um eine DNA-Kontamination zu beseitigen. Die für die RT-PCR verwendeten Primer sind in Tabelle ​ Tabelle1 1 aufgeführt und ihre Position ist in Abbildung ​ Abbildung1 dargestellt. 1. Die RT-PCR wurde mit dem Access RT-PCR-System (Promega) im RapidCycler unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: reverse Transkription bei 48ଌ für 45 min, Denaturierung bei 94ଌ für 2 min gefolgt von 35 Zyklen bei 94ଌ für 10 sec-52ଌ (5S rRNA, tRNA Ile, tRNA Ala, tRNA Ala - tRNA Ile, tRNA Ile - 23S rRNA, 23S rRNA - 5S rRNA und 5S rRNA - 23S rRNA intergene Regionen) oder 56ଌ (16S rRNA, 23S rRNA und 16S rRNA-tRNA Ala intergene Region) für 10 Sek.-68ଌ für 50 Sek. (alle rRNA- und tRNA-Gene und ihre intergenen Regionen außer tRNA Ile -23S rRNA und 23S rRNA-5S rRNA intergene Regionen) oder für 2 Min (tRNA Ile -23S rRNA und 23S rRNA-5S rRNA intergene Regionen) und abschließende Verlängerung bei 68ଌ für 5 min.

Isolierung und Messung von Gesamt-DNA und Gesamt-RNA

B. burgdorferi B31 wurde aus 3 × 10 4 Zellen/ml in BSK-H mit oder ohne 6 % Kaninchenserum bei 34ଌ oder in BSK-H mit 6 % Kaninchenserum bei 23ଌ gezüchtet. B. burgdorferi aus 50-70 ml Kulturen wurden durch Zentrifugation gesammelt, zweimal mit PBS, pH 7,5, gewaschen, in 900 µl PBS resuspendiert und mit 100 µl 50 % Trichloressigsäure bei 0°C gemischt. Nach mindestens 15 min bei 0°C wurden die Zellen auf Glasfaserfiltern ohne Bindemittel (Millipore, Irland, 25 mm Durchmesser, 2,7 μm Partikelpenetration) gesammelt und mit 20 ml 5% Trichloressigsäure gewaschen. Filter, die die eingeschlossenen Zellen enthielten, wurden gefaltet, auf den Boden eines Teströhrchens (13 × 100 mm) gelegt und mit 2 ml 5% Trichloressigsäure bedeckt. Die Röhrchen wurden verschlossen und für 20 Minuten in ein 90°-95ଌ Wasserbad gestellt. Nach dem Abkühlen wurden Glasfilter durch Zentrifugation sedimentiert und DNA- und RNA-Konzentrationen wurden kolorimetrisch an Aliquots der überstehenden Flüssigkeit durch Diphenylamin- (für DNA) oder Orcinol- (für RNA) Assays bestimmt [22,23]. Jedes Experiment wurde zweimal mit zwei technischen Replikaten wiederholt. Die Daten werden als Mittelwerte ± SE dargestellt.

Messung des Gesamtproteins

B. burgdorferi B31 wurden wie oben gezüchtet. B. burgdorferi Zellen aus 1,5 ml Kulturen wurden durch Zentrifugation gesammelt, zweimal mit PBS, pH 7,5 gewaschen, um alle anhaftenden Proteine ​​aus dem Kulturmedium zu entfernen, resuspendiert in 50 &mgr; 1 mM EDTA 0,1% Triton X-100 und inkubiert auf Eis für 10 Minuten. Das Gesamtprotein wurde nach der Bradford-Methode [47] (Bio-Rad Protein Assay, Bio-Rad Laboratories) mit einem Rinderserumalbumin-Standard gemessen. Jedes Experiment wurde zweimal mit zwei technischen Replikaten wiederholt. Die Daten werden als Mittelwerte ± SE dargestellt.

Nachweis von (p)ppGpp

(p)ppGpp wurde aus [ 32 P]-markiertem B. burgdorferi und chromatographiert auf Cellulose-PEI-DC-Platten (Selecto Scientific, Suwanee, GA) wie zuvor beschrieben [17]. Die Platten wurden luftgetrocknet, einem Leuchtstoffschirm (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) 12 bis 24 h ausgesetzt und unter Verwendung eines Storm 860 PhosphorImager (Molecular Dynamics) gescannt.

Reverse Transkription und Real-time PCR

Die cDNA-Synthese wurde mit 1 μg insgesamt durchgeführt B. burgdorferi RNA mit zufälligen Primern p(dN)6 (Roche) und aviäre Myeloblastose-Virus-Reverse-Transkriptase (Promega) gemäß den Empfehlungen des Herstellers. Zu quantifizieren Speck mRNA und 16S- und 23S-rRNA wurden die resultierenden cDNAs amplifiziert und auf einem LightCycler Real-time PCR Instrument (Roche) unter Verwendung von LightCycler Master SYBR Green I Mixture (Roche) analysiert. Die PCR wurde in Glaskapillaren in einem Endvolumen von 20 µl durchgeführt, wie zuvor beschrieben [18]. Das Amplifikationsprogramm bestand aus einer Denaturierung bei 95ଌ für 2 min, gefolgt von 35 Zyklen von 95ଌ für 1s-55ଌ (Speck und 23S rRNA) oder 57ଌ (16S rRNA) für 5 s-72ଌ für 10 s. Für jedes RNA-Isolat wurden mindestens zweimal PCR-Reaktionen durchgeführt. RNA, die aus mindestens zwei unabhängigen Kulturen isoliert wurde, wurde für Experimente mit Temperaturänderung verwendet. In Experimenten mit wurden für jedes RNA-Isolat viermal PCR-Reaktionen durchgeführt relBbumutant, und RNA wurde an den Tagen 2, 4 und 5 aus einer Kultur und an den Tagen 3 und 6 aus zwei unabhängigen Kulturen isoliert. #x200B Abbildung1) 1 ) waren ähnlich und wurden daher kombiniert. Genomische DNA aus 10 3 -10 6 Zellen der entsprechenden B. burgdorferi Stamm wurde als Standard verwendet, um die cDNA-Menge für die in jeder Echtzeit-PCR untersuchten Gene abzuschätzen. Die Proben wurden auf die cDNA-Menge von konstitutiv exprimierten Speck. Relative rRNA-Expressionsniveaus (Kopien rRNA/Kopien Speck) wurden für jede einzelne rRNA-Spezies (16S- oder 23S-rRNA) berechnet. Weil Speck Die mRNA-Expression ist konstitutiv [48,49] und Speck befindet sich auf dem Chromosom distal des Replikationsursprungs [50], was sicherstellt, dass nur eine Kopie von Speck/Borrelienzelle, Normalisierung mit Speck ist ausreichend. In RT-RT-PCR-Experimenten mit unterschiedlichen Temperaturen wurden diese Expressionsniveaus weiter auf die Expression während des Wachstums in BSK-H bei 23ଌ und 10 6 Zellen/ml normalisiert. In Experimenten mit ΔrelBbuwurden die Expressionsniveaus auf die Expression des Wildtyps am zweiten Tag normalisiert – dem ersten Tag, an dem RNA gesammelt wurde, getrennt für 16S- und 23S-rRNA. Die relative rRNA-Expression jeder rRNA-Spezies wird als mittlerer ± SE dargestellt.

Statistische Methoden

Unterschiede in den mittleren Niveaus der rRNA-Transkription, Zellzahlen und Mengen an Gesamt-DNA, RNA und Protein wurden unter Verwendung einer Einweg-Varianzanalyse mit einem Tukey-Kramer-Mehrfachvergleich nach dem Test statistisch analysiert. Unterschiede wurden als signifikant erachtet, wenn P < 0,05.


Ribosomale RNA

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Ribosomale RNA (rRNA), Molekül in Zellen, das Teil der Protein-synthetisierenden Organelle, bekannt als Ribosom, ist und das in das Zytoplasma exportiert wird, um dabei zu helfen, die Informationen in der Boten-RNA (mRNA) in Protein zu übersetzen. Die drei Haupttypen von RNA, die in Zellen vorkommen, sind rRNA, mRNA und Transfer-RNA (tRNA).

rRNA-Moleküle werden in einer spezialisierten Region des Zellkerns synthetisiert, die als Nukleolus bezeichnet wird und als dichter Bereich innerhalb des Zellkerns erscheint und die Gene enthält, die rRNA kodieren. Die kodierten rRNAs unterscheiden sich in der Größe und werden entweder als groß oder klein unterschieden. Jedes Ribosom enthält mindestens eine große rRNA und mindestens eine kleine rRNA. Im Nukleolus verbinden sich die großen und kleinen rRNAs mit ribosomalen Proteinen, um die großen und kleinen Untereinheiten des Ribosoms zu bilden (z. B. 50S bzw. 30S in Bakterien). (Diese Untereinheiten werden im Allgemeinen nach ihrer Sedimentationsrate, gemessen in Svedberg-Einheiten [S], in einem Zentrifugalfeld benannt.) Ribosomale Proteine ​​werden im Zytoplasma synthetisiert und zum Zellkern transportiert, um im Nukleolus untergeordnet zu werden. Die Untereinheiten werden dann zum endgültigen Zusammenbau in das Zytoplasma zurückgeführt.

Die rRNAs bilden ausgedehnte Sekundärstrukturen und spielen eine aktive Rolle bei der Erkennung konservierter Teile von mRNAs und tRNAs. In Eukaryoten (Organismen, die einen klar definierten Kern besitzen) können in einer einzelnen Zelle zwischen 50 und 5.000 Sätze von rRNA-Genen und bis zu 10 Millionen Ribosomen vorhanden sein. Im Gegensatz dazu haben Prokaryoten (Organismen, denen ein Zellkern fehlt) im Allgemeinen weniger Sätze von rRNA-Genen und Ribosomen pro Zelle. Zum Beispiel im Bakterium Escherichia coli, synthetisieren sieben Kopien der rRNA-Gene etwa 15.000 Ribosomen pro Zelle.

Es gibt radikale Unterschiede zwischen Prokaryoten in den Domänen Archaeen und Bakterien. Diese Unterschiede zeigen sich nicht nur in der Zusammensetzung von Lipiden, Zellwänden und der Nutzung verschiedener Stoffwechselwege, sondern spiegeln sich auch in rRNA-Sequenzen wider. Die rRNAs von Bakterien und Archaea unterscheiden sich ebenso voneinander wie von eukaryotischer rRNA. Diese Informationen sind wichtig für das Verständnis der evolutionären Ursprünge dieser Organismen, da sie darauf hindeuten, dass die Bakterien- und Archaeenlinien etwas vor der Entwicklung eukaryotischer Zellen von einem gemeinsamen Vorläufer abwichen.

In Bakterien hat sich das Gen, das sich als das aussagekräftigste für die Untersuchung der evolutionären Verwandtschaft erwiesen hat, 16S-rRNA, eine DNA-Sequenz, die für die RNA-Komponente der kleineren Untereinheit des bakteriellen Ribosoms kodiert. Die 16S-rRNA Gen ist in allen Bakterien vorhanden, und eine verwandte Form kommt in allen Zellen vor, einschließlich denen von Eukaryoten. Analyse der 16S-rRNA Sequenzen aus vielen Organismen haben gezeigt, dass einige Teile des Moleküls schnelle genetische Veränderungen erfahren, wodurch zwischen verschiedenen Arten innerhalb derselben Gattung unterschieden werden kann. Andere Positionen ändern sich sehr langsam, sodass viel breitere taxonomische Ebenen unterschieden werden können.

Andere evolutionäre Implikationen der rRNA ergeben sich aus ihrer Fähigkeit, die Peptidyltransferase-Reaktion während der Proteinsynthese zu katalysieren. Katalysatoren sind selbstfördernd – sie ermöglichen Reaktionen, ohne selbst verbraucht zu werden. Somit steht die rRNA im Verdacht, sowohl als Nukleinsäurespeicher als auch als Katalysator eine Schlüsselrolle in der frühen Evolution des Lebens auf der Erde gespielt zu haben.

Die Herausgeber der Encyclopaedia Britannica Dieser Artikel wurde zuletzt von Kara Rogers, Senior Editor, überarbeitet und aktualisiert.


BIOCHEMIE, BIOMEDIZIN & PHARMAZEUTIK

1) Der genetische Code ist eine dreifache Nukleotidsequenz in der mRNA, die die Aminosäuresequenz des Proteins bestimmt. Im Folgenden sind die Eigenschaften der Aminosäure AUSSER:
a) Spezifität
b) Universell
c) Redundant
d) Überlappung

2) Aminoacyl-t-RNA-Synthetase katalysiert die Anlagerung von Aminosäuren an die wachsende Polypeptidkette und erfordert vier energiereiche Phosphate. Sie sind
a) 4 ATP
b) 4 GTP
c) 2 ATP, 2 GTP
d) 1 ATP, 3 GTP

3) Das Ribosom hat drei Bindungsstellen (A, P, E) für tRNA-Moleküle. Welche der folgenden Aussagen zu diesen Websites ist NICHT richtig?
a) Die A-Stelle bindet an eine eingehende Aminoacyl-tRNA
b) Das Codon der P-Stelle ist von Peptidyl-tRNA (einer Aminosäure, die tRNA enthält) besetzt.
c) Die E-Stelle wird beim Austritt aus dem Ribosom von leerer t-RNA besetzt
D. Nichts des oben Genannten

4) Die Shine-Dalgarno-Sequenz befindet sich sechs bis zehn Basen stromaufwärts des Initiationscodons der mRNA. Es besteht aus
a) Purinreiche Nukleotidsequenz
b) Pyrimidinreiche Nukleotidsequenz
c) Uracil-haltige Nukleotidsequenz
D. Nichts des oben Genannten

5) Welches der folgenden ist das Initiationscodon?
a) UGA
b) AUG
c) ZBV
d) GAA

6) In Prokaryoten sind die Initiationsfaktoren (IF-1, IF-2 und IF-3) an der Initiation der Proteinsynthese beteiligt. Welcher der folgenden Faktoren erleichtert das Initiationscodon?
a) IF-1
b) IF-2
c) IF-3
d. Alles das oben Genannte

7) EF-Tu und EF-Ts binden an geeignete tRNA an das Codon in den leeren Stellen. Diese Faktoren spielen eine Rolle bei der. der Übersetzung.
a) Einleitung
b) Dehnung
c) Kündigung
d) Trimmen

8) Chloramphenicol ist eine Klasse von Antibiotika, die die Proteinsynthese hemmen, indem sie
a) Aminoacyltransferase
b) Peptidyltransferase
c) Initiierungsfaktor 1
d) Dehnungsfaktor

9) Puromycin, ein strukturelles Analogon der tRNA, ist eine Klasse von Antibiotika, die die Proteinsynthese hemmen durch
a) Hemmung der Aminoacyltransferase
b) Hemmung der Peptidyltransferase
c) vorzeitige Beendigung der Peptidkette
D. Nichts des oben Genannten

10) Tetracyclin ist eine Klasse von Antibiotika, die die Proteinsynthese durch Blockieren hemmen
a) Bindung von Initiationsfaktoren
b) Bindung von Elongationsfaktoren an tRNA
c) Bindung von Aminoacyl-tRNA an den mRNA-Ribosomen-Komplex
D. Nichts des oben Genannten

11) Welche der folgenden Aussagen zum genetischen Code trifft nicht zu?
a) Es ist entartet
b) Es ist eindeutig
c) Es ist fast universell
d) Es überlappt
12) Welcher der folgenden Bestandteile ist nicht Bestandteil der ribosomalen RNA, die in Prokaryonten vorhanden ist?
a) 23S-rRNA
b) 18S-rRNA
c) 16S-rRNA
d) 5S-rRNA


13) Welcher der folgenden Bestandteile ist nicht Bestandteil der ribosomalen RNA, die in Eukaryoten vorhanden ist?
a) 28S-rRNA
b) 18S-rRNA
c) 16S-rRNA
d) 5S-rRNA

14) Welche der folgenden Stellen ist die Anlagerungsstelle der Aminosäure im tRNA-Molekül?
a) 5'-Ende
b) 3'-Ende
c) Anti-Codon-Schleife
D. Nichts des oben Genannten

15) Lactose Operon ist ein Satz von Lactose metabolisierenden Genen, die ko-koordiniert exprimiert und reguliert werden. Folgendes ist nicht das Gen des Lactose-Operons:
a) LacX
b) LacZ
c) LacY
d) LacA

16) Welcher der folgenden ist nicht der positive Regulator von Lac Operon
a) Allolactose
b) Glukose
c) Laktose
d) cAMP

17) Welche der folgenden Aussagen ist die FALSE-Anweisung des Lactose-Operons?
a) Lac Operon wird aktiviert, wenn Glukose fehlt
b) Lac Operon wird aktiviert, wenn Laktose vorhanden ist
c) Lac Operon wird aktiviert, wenn Glukose fehlt und Laktose vorhanden ist
d) Lac Operon wird aktiviert, wenn Glukose vorhanden ist und Laktose fehlt

18) Welches der folgenden Gen kodiert für das Repressorprotein des lac-Operons
a) LacI
b) LacZ
c) LacY
d) LacA

19) LacZ kodiert für ein Protein
a) durchdringen
b) Beta-Galactosidase
c) Transacetylase
d) Repressorprotein

20) Adenylylcyclase ist ein Enzym, das in Abwesenheit von . aktiv ist
a) Allolactose
b) Glukose
c) Laktose
d) cAMP

21) Peptidyltransferase-Enzym ist in vorhanden
a) Messenger-RNA
b) Transfer-RNA
c) Ribosomale RNA
d) Kleine nukleare RNA



Fragen

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  1. Beschreiben Sie bakterielle Ribosomen. (ans)
  2. Nennen Sie die Funktion der Ribosomen. (ans)
  3. Übersetzung definieren. (ans)
  4. Geben Sie allgemein an, wie Antibiotika wie Neomycin, Tetracyclin, Doxycyclin, Erythromycin und Azithromycin das Bakterienwachstum beeinflussen. (ans)
  5. Die Tetracycline (Tetracyclin, Doxycyclin) sind Antibiotika, die an die 30S-Untereinheit bakterieller Ribosomen binden. Die Makrolide (Erythromycin, Azithromycin, Clarithromycin) sind Antibiotika, die an die 50S-Untereinheit bakterieller Ribosomen binden. Warum sind diese Antibiotika bei Pilz-, Protozoen- oder Virusinfektionen nicht wirksam? (ans)
  6. Mehrfachauswahl(ans)


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