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Wie signifikant ist der RNA-Abbau bei der Entfernung von cap/polyA's in Eukaryoten oder UTR's in Prokaryoten?

Wie signifikant ist der RNA-Abbau bei der Entfernung von cap/polyA's in Eukaryoten oder UTR's in Prokaryoten?


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Frage ist eher selbsterklärend, aber in zwei Teile unterteilt. Ich versuche, ein Repressionssystem zu verwenden, das die Spaltung von RNA an bestimmten Bereichen mit Ribozymen mit der Absicht einsetzt, sie abzubauen (oder einfach nur zu inaktivieren).

Dieses Szenario scheint bei Eukaryoten wahrscheinlicher zu sein, da sie 5'-UTRs und einen PolyA-Schwanz bei 3'-UTRs mit einer Kappe versehen haben, die der RNA-Stabilität verleihen. Wie schnell und wie stark wird eine nicht verkappte RNA abgebaut? Was ist mit dem Fehlen eines PolyA-Schwanzes?

Da Prokaryonten diese Strukturen fehlen, bin ich in meinem speziellen Fall auf die Verwendung von UTR-Regionen beschränkt. Gibt es einen ähnlichen Mechanismus, ob allgemein oder für spezifische Proteine, der es mir ermöglicht, eine UTR-Region für die RNA-Inaktivierung in Prokaryonten zu nutzen? Bitte denken Sie daran, dass das Hinzufügen synthetischer Sequenzen zu diesen UTR-Regionen sicherlich eine Möglichkeit ist.


Die Entfernung des 5'-Caps ist für den Abbau durch 5'→3'-Exonukleasen wie Xrn1/2 essentiell. Xrn1/2 ist konstitutiv und der Abbau von nicht verkappten RNAs würde ziemlich schnell erfolgen (keine Referenz für die genaue Lebensdauer). Die Deadenylierung geht im Allgemeinen dem 3'→5'-Abbau durch das Exosom voraus, aber ich bin mir nicht sicher, ob dies eine Voraussetzung ist. Schwanzlose mRNAs können jedoch durch Anbinden von Pab1p (Poly-A-Bindungsprotein) an die 3'UTR stabilisiert werden. Siehe dieses Papier.

Abbildung 4 des verlinkten Papiers.

Tethered Pab1p stabilisiert mRNAs, die keinen Schwanz erhalten. (Eine Strategie. Das selbstspaltende HDV-Ribozym wurde in die 3'-UTR von MFA2/MS2-RNA eingefügt, was in vivo eine mRNA ohne Poly(A)-Schwanz (A0) ergab. (B) Oligo(dT)-Cellulosechromatographie. RNAs wurden aus Zellen extrahiert, die das Ribozym enthaltende Konstrukt trugen, das in A dargestellt ist, oder das Kontrollplasmid, das in den vorherigen Figuren verwendet wurde. RNAs wurden durch Oligo(dT)-Cellulosechromatographie fraktioniert, dann durch Northern-Blotting analysiert. Die Ribozym-enthaltende RNA wird von der Säule nicht zurückgehalten, wohingegen die Kontroll-RNA zurückgehalten wird. (T) Gesamt-RNA vor der Fraktionierung; (+) von der Säule zurückgehalten; (−) wird von der Spalte nicht zurückgehalten. Die mRNA läuft in der Oligo(dT)-Retention (+)-Probe etwas schneller als in der Gesamt-(T)-RNA, da weniger RNA pro Spur geladen wird. (C) S1-Nuklease-Analyse. Das 3'-Ende von mRNA, die aus einem Stamm hergestellt wurde, der die Ribozym-enthaltende RNA trug, wurde durch S1-Nuklease-Kartierung bestimmt. Die Position der unverdauten Sonde (65 Nukleotide) und der geschützten Spezies (43 Nukleotide) sind gezeigt. Der prominente 3'-Terminus liegt an der erwarteten Position für die Ribozymspaltung. (D) Zerfall von Ribozym-gespaltener RNA durch ein transkriptionelles Pulse-Chase-Experiment und Northern Blotting. Die Umsatzrate von Ribozym-gespaltenen Reporter-mRNAs wurde in Stämmen mit (links) oder ohne (rechts) MS2/Pab1p bestimmt. Zeit (in min) nach transkriptionaler Repression sind direkt oben angegeben; Halbwertszeiten sind unten. (E) Quantifizierung der Ergebnisse. Die mRNA-Mengen wurden auf das Niveau der 18S-rRNA am unteren Ende jeder Spur in D normalisiert. (•) MS2/Pab1p; (○) Vektor allein.

Prokaryotische UTRs haben kein allgemeines Paradigma. Um eine kontrollierte Inaktivierung einer mRNA in einem prokaryotischen System zu erreichen, können Sie Riboswitches oder cis-repressive RNA (RBS-komplementäre RNAs) verwenden. Ein RNA-gesteuerter RNA-Abbau ist auch in Prokaryonten mit dem CRISPR-Cas-System möglich. Siehe dieses Papier. Für diese Aktivität werden die Proteine ​​Cmr-1,2,3,4 & 6 benötigt.


Bio Kapitel 14

In welche Richtung und auf welchem ​​Strang bewegt sich die RNA-Polymerase bei der Transkription des lokal abgewickelten DNA-Doppelstrangs in der Abbildung oben?

eine einzelne Nukleotiddeletion in einem Exon, das für ein aktives Zentrum eines Proteins kodiert

eine Duplizierung aller oder der meisten Introns

eine Frameshift-Mutation ein Codon vom 3'-Ende des Nicht-Templat-Strangs entfernt

Gene diktieren die Produktion bestimmter Enzyme, und betroffene Personen haben genetische Defekte, die dazu führen, dass ihnen bestimmte Enzyme fehlen.

Viele Stoffwechselenzyme verwenden DNA als Cofaktor, und betroffene Personen haben Mutationen, die ihre Enzyme daran hindern, effizient mit der DNA zu interagieren.

bestimmte Stoffwechselreaktionen werden von Ribozymen ausgeführt, und den betroffenen Personen fehlen wichtige Spleißfaktoren.

ein Enzym, das RNA als Teil des Transkriptionsprozesses synthetisiert

ein Enzym, das RNA als Substrat verwendet

ein Enzym, das die Assoziation zwischen den großen und kleinen ribosomalen Untereinheiten katalysiert

entweder eine Insertion oder eine Deletion einer Base

Die mRNA würde nicht aus dem Zellkern transportiert.

Das Molekül wird durch Restriktionsenzyme im Zellkern verdaut.

Das Molekül wird durch hydrolytische Enzyme abgebaut, da es am 5'-Ende und am 3'-Ende nicht mehr geschützt ist.

Viele Nukleotide werden benötigt, um für jede Aminosäure zu kodieren.

Am Anfang der mRNA befinden sich Terminations-Exons.

Der genetische Code ist redundant.

eine Substitution des ersten Nukleotids eines GGG-Codons

eine Deletion von zwei Nukleotiden

vorzeitiger Abbruch der Transkription

Aufnahme von I1 in die mRNA

Es könnte eine andere Aminosäure im Protein ersetzen, was seine Funktion verändern könnte.

Es könnte ein Serincodon gegen ein anderes Serincodon austauschen.

Es könnte ein Stopcodon gegen ein anderes Stopcodon austauschen.

Es ist eine Sequenz, die für die Bindung der RNA-Polymerase an die DNA kodiert.

Es fügt das modifizierte Guanin an das 3'-Ende der mRNA an.

Es zeigt die Stelle der Translationstermination an.

Die Sequenz entwickelt sich sehr schnell.

Jede Mutation in der Sequenz wird gegen selektiert.

Die Sequenz findet sich in vielen, aber nicht allen Promotoren.

Es erhöht die Transkriptionsrate.

Es kann die Produktion verschiedener Proteinprodukte aus einer einzigen mRNA ermöglichen.

Es ist ein Mechanismus, der die Transkriptionsrate erhöhen kann.

Sobald die Transkription begonnen hat, transkribiert die RNA-Polymerase, bis sie das Ende des Chromosoms erreicht.

RNA-Polymerase transkribiert durch die Terminatorsequenz, was bewirkt, dass sich die Polymerase von der DNA trennt und das Transkript freisetzt.

Die RNA-Polymerase transkribiert durch ein Intron, wodurch die Polymerase das Transkript loslässt.

einem Polypeptid, dem eine Aminosäure fehlt

Prokaryoten haben mindestens drei Arten von RNA-Polymerasen, während Eukaryoten nur eine haben.

Sowohl Eukaryonten als auch Prokaryonten erkennen ein Polyadenylierungssignal, um die Transkription zu beenden.

RNA-Polymerase sowohl in Prokaryoten als auch in Eukaryoten produziert die gleichen RNA-Moleküle.

Jedes Gen kodiert für ein Protein.

Die Art ist hoch entwickelt.

Die Entfernung des 5'-UTR hat keine Wirkung, da die Exons intakt bleiben.

Das erste Exon wird nicht gelesen, da I1 nun als UTR dient.

Die Entfernung der 5'-UTR entfernt auch die 5'-Kappe, so dass die mRNA durch hydrolytische Enzyme schnell abgebaut werden kann.

Genexpression ist der Prozess, bei dem Proteine ​​die Synthese von RNA steuern.

Genexpression ist der Prozess, durch den die DNA die Synthese von Proteinen steuert.

Genexpression ist der Prozess, bei dem Proteine ​​die DNA-Synthese steuern.

ein Triplett, das räumlich von anderen Tripletts getrennt ist

ein Triplett am gegenüberliegenden Ende der tRNA von der Anheftungsstelle der Aminosäure

ein Triplett im gleichen Leseraster wie ein vorgeschaltetes AUG

Die während der Transkription produzierte RNA wird dann in beiden Arten von Organismen modifiziert.

Bei Prokaryoten kann die Übersetzung beginnen, während die Transkription noch im Gange ist, bei Eukaryoten jedoch nicht.

Transkription und Translation können in beiden Organismen gleichzeitig erfolgen.

mRNA, tRNA und rRNA werden transkribiert.

Die Transkription kann beginnen, sobald die Translation die ersten paar Aminosäuren im Polypeptid aufgebaut hat.

Am 3'-Ende einer mRNA wird ein Poly-A-Schwanz und am 5'-Ende eine Kappe angefügt.


Ergebnisse

Fragmentierte 28S-rRNA-Moleküle mit homo- oder heteropolymeren Schwänzen sind sowohl im Zytoplasma als auch im Zellkern menschlicher Zellen vorhanden.

In früheren Arbeiten entdeckten wir verkürzte 28S- und 18S-rRNAs mit homo- oder heteropolymeren Schwänzen (18). Es war plausibel, dass diese rRNA-Fragmente Abbauzwischenprodukte des zuvor erwähnten Kernprozesses sind, aber eine zweite Option konnte nicht ignoriert werden: die vorübergehende, möglicherweise den Abbau unterstützende Adenylierung von RNA im Zytoplasma, die mit den stabilen Poly(A)-Schwänzen koexistiert, die charakterisieren diesen Mobilfunkstandort. Daher war unser erstes Ziel zu bestimmen, ob diese mit Schwanz versehenen, verkürzten Moleküle im Zellkern, im Zytoplasma oder in beiden vorhanden sind.

RNA und Protein wurden aus zytoplasmatischen und nukleären Fraktionen erhalten, die aus HeLa-Zellen hergestellt wurden. Eine klare fraktionsspezifische Verteilung von reifer rRNA und prä-rRNA (und tRNA) wurde bei der Ethidiumbromid-Färbung der gesamten, zytoplasmatischen und nukleären RNA beobachtet (Abb. S1). Um die Reinheit der Fraktionen zu beurteilen, wurden Northern Blots und Immunoblots hergestellt, und Abb. 1EIN zeigt, dass die RNA- und Proteinmarker ausschließlich in den entsprechenden Fraktionen nachgewiesen wurden. Als nächstes wurde die Anwesenheit von fragmentierter polyadenylierter 28S-rRNA durch Oligo(dT)-RT-PCR bewertet. Die Ergebnisse offenbarten 28S-rRNA-Fragmente mit homo- oder heteropolymeren Erweiterungen sowohl im Zellkern als auch im Zytoplasma (Abb. 1 .).B). Nach unserem Kenntnisstand ist dies der erste Nachweis von intern adenylierter RNA im Zytoplasma menschlicher Zellen.

28S-rRNA-Fragmente mit homo- oder heteropolymeren Poly(A)-Schwänzen im Zytoplasma und Kernen menschlicher Zellen. (EIN) Die Fraktionierungsreinheit wurde durch Immunoblots (IBs) und RNA-Blots unter Verwendung von fraktionsspezifischen Markern bestimmt: C, Zytoplasma: GAPDH. N, Kern: Histon H3 (H3), Fibrillarin und U2/U3/U5-snoRNAs. T, Gesamtzell-RNA/Proteine. (B) Oligo(dT)-RT-PCR-Isolierung von verkürzten, adenylierten 28S-rRNA-Molekülen aus Cyt- (oben) und Nuk- (unten) Fraktionen. 28S-rRNA ist schematisch mit Pfeilen dargestellt, die Primerpositionen anzeigen, und vertikalen Linien, die Schwanzstellen und Inhalt anzeigen (Tabelle S1). (C) cRT-PCR-Isolierung von verkürzten 28S-rRNA-Molekülen aus Cyt- (oben) und Nuk- (unten) Fraktionen. Fälle, in denen nicht bekannt ist, ob das „A“ kodiert oder posttranskriptional hinzugefügt wird, sind mit einem Stern gekennzeichnet (Tabelle S2).

Um die verkürzten Moleküle in beiden Fraktionen mittels unverzerrter Poly(A)-Erweiterungen zu bewerten, wurde zirkularisierte reverse Transkription (cRT) auf dieselbe Region der 28S-rRNA angewendet (Abb. 1 .).C). Verkürzte Moleküle wurden erfolgreich sowohl aus den zytoplasmatischen als auch aus den Kernfraktionen isoliert. Obwohl die meisten Fragmente schwanzlos waren, hatte eine kleine Zahl Verlängerungen von 1 bis 4 nt. Es gibt jedoch Fälle, in denen nicht klar ist, ob das Adenosin Teil der kodierten Sequenz ist oder posttranskriptionell hinzugefügt wurde. Diese Moleküle könnten die Oligo(A)-Addition widerspiegeln oder könnten sich entweder in einem Stadium vor der Schwanzsynthese oder während des 3'-5'-Abbaus befinden. Daher sind, wie in vielen früheren Studien zur transienten Adenylierung, verzerrte Methoden wie die Oligo(dT)-RT-PCR erforderlich, um lange interne Schwänze zu sehen und ihre nt-Zusammensetzung zu beurteilen, was oft zur Identität des Polyadenylierungsfaktors führen kann (7, 19 ).

Abgeschnittene, intronlose β-Actin-Transkripte mit homo- oder heteropolymeren Schwänzen.

Um zu überprüfen, ob neben rRNA auch mRNA diesen Prozess durchlaufen kann, wurde die Anwesenheit von verkürzten adenylierten β-Actin-mRNA-Molekülen mittels Oligo(dT)-RT-PCR analysiert. Genspezifische Primer wurden angewendet, von denen einige auf die mRNA-Sequenz unmittelbar stromaufwärts von Introns abzielten, was möglicherweise die Isolierung von sowohl gespleißten als auch ungespleißten adenylierten β-Aktin-Fragmenten ermöglichte. Wie in Abb. 2 gezeigtEINwurden verkürzte adenylierte β-Aktin-Fragmente isoliert und ähnlich wie bei rRNA wurden sowohl homo- als auch heteropolymere Schwänze beobachtet. Außerdem wurden solche Moleküle sowohl aus nuklearen als auch aus zytoplasmatischen Fraktionen erhalten (Tabelle S1). Unter den isolierten Sequenzen waren keine Introns vorhanden, was offenbart, dass es sich um (teilweise, wenn nicht vollständig) gespleißte Transkripte handelt. Diese Ergebnisse zeigen, dass mRNA wie rRNA eine vorübergehende Adenylierung durchlaufen kann.

(EIN) Gespleißte β-Actin-Fragmente mit homo- oder heteropolymeren Poly(A)-Schwänzen, isoliert aus menschlichen Zellen. Primäre β-Aktin-mRNA ist schematisch dargestellt (Introns in Schwarz, Exons in Grau). Die Längen jedes Exons/Introns sind gezeigt. Homo- und heteropolymere Schwänze sind oberhalb bzw. unterhalb des Gens dargestellt (Tabelle S1). (B) Oligo(dT)-RT-PCR-Isolierung von verkürzten, adenylierten VV-RNA-Molekülen [G8R (eine virale mRNA) und GFP (in das virale Genom integriert)] aus HeLa-Zellen 4 h nach der Transfektion (Tabelle S3).

Aus infizierten Zellen wurden verkürzte Vacciniavirus-RNAs isoliert, die homo- oder heteropolymere Schwänze trugen.

Zusätzlich zu den Fraktionierungsreinheitsassays (Abb. 1EIN). VV) gehört zur Familie der Pockenviren und enthält ein doppelsträngiges DNA-Genom, das mehr als 200 Proteine ​​kodiert. Pockenviren sind unter den meisten DNA-Viren insofern einzigartig, als sie während ihres gesamten Lebenszyklus nicht in den Zellkern eindringen (20). Um zu überprüfen, ob virale RNA einer transienten Adenylierung innerhalb des Zytoplasmas unterliegt, wurde RNA aus infizierten HeLa-Zellen gereinigt und auf das Vorhandensein von verkürzten, polyadenylierten Transkripten von Genen analysiert, die im viralen Genom kodiert sind. Abb. 2B zeigt die Ergebnisse der Analyse von G8R-mRNA, einem intermediären viralen Gen und GFP-mRNA, die aus einem in das virale Genom eingefügten GFP-Gen hergestellt wurde (21). Von diesen Genen stammende verkürzte Transkripte mit entweder homo- oder heteropolymeren Schwänzen wurden nachgewiesen. Diese Ergebnisse unterstützen zusätzlich, dass ein Mechanismus, der eine transiente RNA-Polyadenylierung beinhaltet, im Zytoplasma vorhanden ist und nicht nur für rRNA, sondern auch für mRNA gilt. Dementsprechend sollte im nächsten Schritt überprüft werden, ob es einen Zusammenhang zwischen dieser Art der RNA-Adenylierung und dem RNA-Zerfall gibt, wie in allen bisher untersuchten Systemen, in denen solche Moleküle gefunden wurden.

Sind die verkürzten, polyadenylierten Transkripte Abbauzwischenprodukte?

In allen Systemen, in denen verkürzte, adenylierte RNA-Moleküle nachgewiesen wurden, wurde später gezeigt, dass sie Zwischenprodukte eines Poly(A)-unterstützten RNA-Zerfallswegs sind. Wir fragten, ob die hier im Zytoplasma beobachteten Schwänze tatsächlich verräterische Anzeichen für einen solchen Prozess sind. Wenn dies der Fall ist, würde die Hemmung der exonukleolytischen Aktivität zu ihrer Akkumulation führen, wie in Bakterien, Pflanzenmitochondrien und den Kernen von Hefe- und menschlichen Zellen beobachtet (12 – 14, 22). Zu diesem Zweck verwendeten wir RNAi zum Knockdown (KD) von hXrn1 und den Exosom-Untereinheiten. Für letztere wurden PM/Scl-100, eine Exoribonuklease, die mit dem Exosom assoziiert ist, und hRrp41, ein Exosom-Kernprotein, gezielt. Immunblots offenbarten eine signifikante KD der Zielproteine ​​(Abb. 3EIN). Eine Reduktion der Exosomenaktivität wurde durch die Akkumulation von 5,8S rRNA-Vorläufern sowohl in den PM/Scl-100- als auch in den hRrp41-stummgeschalteten Zellen bestätigt (Abb. 3 .).B) (13, 23).

RNAi-vermitteltes Silencing von Exosom-Untereinheiten, hXrn1, hXrn2 und Lsm1. (EIN) Die Wirksamkeit der Stummschaltung wurde mittels Immunoblot mit spezifischen Antikörpern gemessen. (B) Der Verlust der Exosomenaktivität wurde durch die Akkumulation des 5.8S rRNA-Vorläufers, wie durch Northern-Blot nachgewiesen, bestätigt. (C) Die KD-Effizienz von RNAi-stummgeschalteten Proteinen, für die keine Antikörper verfügbar waren, wurde durch RT-PCR überwacht. Immunblots und RT-PCR wurden mit β-Actin normalisiert.

Abbauzwischenprodukte sind nicht reichlich vorhanden und werden schnell abgebaut, daher ist es vorteilhaft, hochexprimierte Transkripte auf solche verwandten Moleküle zu analysieren. Daher haben wir uns entschieden, uns auf die Region der 28S-rRNA zu konzentrieren, aus der adenylierte Fragmente durch Oligo(dT)-RT-PCR isoliert wurden, wie zuvor beschrieben. Um die fragmentierte, adenylierte 28S-rRNA-Akkumulation visuell zu bewerten, wurde ein radioaktiver Markierungsassay angewendet. Beladungsmengen wurden gemäß B2M-mRNA über RT-PCR normalisiert (Abb. 4EIN). Nach der Oligo(dT)-Reverse-Transkription wurden die gleichen Primer verwendet, mit denen die verkürzten Moleküle zuvor isoliert wurden, aber diesmal wurde eine zusätzliche PCR-Stufe aufgenommen, in der die Produkte über einen 5'-Ende [ 32 P] 28S rRNA-Primer markiert wurden . Die Fraktionierung auf denaturierendem Polyacrylamidgel ermöglichte eine empfindliche Beurteilung der Akkumulation der markierten Amplifikationsprodukte. Da die verkürzten Moleküle an verschiedenen Stellen entlang der 28S-rRNA polyadenyliert wurden (Abb. 1B) und die Verlängerungen unterschiedlich lang waren, führte die Akkumulation nicht zu einer einzelnen Bande, sondern zu einem verschmierten Signal. In den Spuren, die die RNAi-Stummschaltung von PM/Scl-100 und hXrn1 darstellen, wurde eine beträchtliche Akkumulation von verkürzten 28S-rRNA-Fragmenten beobachtet (Fig. 4 .).B). Obwohl von PM/Scl-100 (Rrp6 in Hefe) berichtet wurde, dass es im Zytoplasma existiert, wird es hauptsächlich im Kern menschlicher Zellen in Verbindung mit dem Kernexosom gefunden (24, 25). Daher ist das entsprechende Signal in dieser Spur höchstwahrscheinlich das Ergebnis der Akkumulation von kernlokalisierten Abbauzwischenprodukten. Im Gegensatz dazu war die Akkumulation von verkürzten 28S-rRNA-Fragmenten in den hRrp41-stummgeschalteten Zellen viel weniger drastisch.

Adenylierte 28S-rRNA-Abbauzwischenprodukte akkumulierten signifikant in Zellen nach RNAi-Silencing von Hauptexonukleasen. (EIN) Schematische Darstellung des PCR-Markierungsassays zum Nachweis der Akkumulation von adenylierten, verkürzten 28S-rRNA-Molekülen nach Exonuklease KD. Kurz gesagt, nach Oligo(dT)-RT von RNA aus verschiedenen KD-Zellen, PCR mit [ 32 P]-markiertem genspezifischen Primer (Sternchen wie zum Isolieren von Molekülen verwendet, wie in Abb. 1 gezeigt).B) und Adaptor-Oligo wurde durchgeführt. (B) RNA, die aus den Schein- und KD-HeLa-Zellen gereinigt wurde, wurde dieser Analyse unterzogen, um die Akkumulation von polyadenylierter, fragmentierter 28S-rRNA zu beurteilen. Links ist die Wanderung von DNA-Markern dargestellt (Nukleotidnummern). (C) Zytoplasmatische oder nukleäre RNA aus Zellen, in denen die angegebenen Proteine ​​durch RNAi zum Schweigen gebracht wurden, wurde einer Oligo(dT)-RT-PCR-Markierung unterzogen. Eine Kontrolle, bei der die reverse Transkriptase aus der Reaktion weggelassen wurde, ist in der ganz rechten Spur jeder Tafel gezeigt. (D) Um zu verifizieren, dass die PCR-Produkte von polyadenylierten Transkripten stammten, wurde eine Kontrolle durchgeführt, bei der die Poly(A)-Schwänze der zytoplasmatischen Fraktionen durch Inkubation mit Oligo(dT) und RNase H entfernt wurden, bevor Oligo(dT)-geprimte RT-PCR Beschriftung.Dies führte zu einer Reduktion der Amplifikationssignale auf Hintergrundniveaus, verglichen mit der hXrn1-Probe, die mit RNase H, aber ohne Oligo(dT) behandelt wurde [Spur markiert mit hXrn1 (–)].

hXrn1 spielt eine zentrale Rolle beim 5′-3′-RNA-Abbau im Zytoplasma. Entgegen der Intuitivität führte seine Stummschaltung zu einer signifikanten Akkumulation der polyadenylierten Moleküle. Eine zytoplasmatische Lokalisation dieser Transkripte wird durch die von hXrn1 impliziert, aber die offensichtliche Frage ist, warum die Hemmung einer 5’-3’-Exonuklease zur Akkumulation von Abbauzwischenprodukten mit 3’-Ende-Poly(A)-Schwänzen führt. Dieses Problem wird in der Diskussion.

Zusammengenommen legen die mit diesem Assay erhaltenen Informationen nahe, dass die isolierten polyadenylierten 28S-rRNA-Fragmente tatsächlich Abbauzwischenprodukte sind. Um die zelluläre Lokalisation definitiv zu bestimmen, wurden die hier beschriebenen Analysen nach Fraktionierung des Zellkerns und des Zytoplasmas wiederholt. Um weiter zu untersuchen, ob der Exosomkern an diesem Prozess beteiligt ist, wurden mehrere zusätzliche Untereinheiten und Exoribonukleasen herunterreguliert.

RNAi-Silencing von Exoribonukleasen bestätigte, dass Poly(A)-unterstützter RNA-Zerfall im Zytoplasma menschlicher Zellen existiert.

Um zu bestätigen, dass ein Abbau von vorübergehend adenylierter RNA im Zytoplasma von menschlichen Zellen stattfindet, wurde die Analyse nach der Herstellung von Kern- und Zytoplasmafraktionen wiederholt. Zwei zusätzliche Exosom-Kernkomponenten, hRrp40 und PM/Scl-75, und zwei Exoribonukleasen, hDis3 und hDis3L, wurden zerstört. hDis3 ist ein Homolog des Hefe-Dis3-Proteins, einer hydrolytischen 3′-5′-Exoribonuklease mit zusätzlicher Endonuklease-Aktivität, die mit dem Exosom sowohl im Zellkern als auch im Zytoplasma in Hefe assoziiert ist. Dieses Protein dient als einzige katalytische Untereinheit im zytoplasmatischen Hefeexosom (25, 26). Während dieser Arbeit wurde ein zusätzliches Dis3-Homolog in menschlichen Zellen, hDis3L, entdeckt, das im Gegensatz zu hDis3 stark mit dem Exosom-Kern assoziiert ist und im Zytoplasma lokalisiert ist. Daher ist es das wahrscheinlichere Dis3-Ortholog in menschlichen Zellen und seine Stummschaltung wurde eingeschlossen (27). Zwei zusätzliche Enzyme wurden zum Schweigen gebracht: hXrn2 und Lsm1. Erstere ist eine wichtige, nukleus-lokalisierte 5'-3'-Exonuklease, und daher könnte erwartet werden, dass ihre KD eine Akkumulation im Nukleus, aber nicht im Zytoplasma verursacht (4). Die Lsm-Proteine ​​spielen eine ähnliche Rolle wie die bakteriellen Hfq-Proteine, die über Schwanzaddition am bakteriellen mRNA-Zerfall beteiligt sind. Lsm1 ist mit hXrn1, Entkappungsenzymen (Dcp1/Dcp2) und dem mRNA-Zerfall im Zytoplasma assoziiert. Es wurde auch gezeigt, dass es direkt am Histon-mRNA-Oligo(U)-vermittelten Zerfall beteiligt ist. Daher wurde auch die Wirkung seiner RNAi-Stummschaltung bewertet (28). Die RT-PCR-Quantifizierung zeigte in Ermangelung geeigneter Antikörper eine signifikante Verringerung der mRNA-Spiegel der stummgeschalteten Proteine ​​(Abb. 3 .).C).

Im Zytoplasma von Zellen, bei denen die Exosomkomponenten hRrp40 oder PM/Scl-75 zum Schweigen gebracht wurden, wurde keine Akkumulation beobachtet, und in ihren Kernfraktionen konnte nur eine geringe Akkumulation beobachtet werden (Fig. 4 .).C). Im Gegensatz dazu führte die KD von entweder hDis3 oder hDis3L zu einer deutlichen zytoplasmatischen Akkumulation von verkürzten 28S-rRNA-Fragmenten, was darauf hindeutet, dass diese beiden Proteine ​​am Abbauprozess beteiligt sind. Wie erwartet, verursachten hXrn1- und PM/Scl-100-Silencing eine beträchtliche Akkumulation in der zytoplasmatischen bzw. nuklearen Fraktion, und die KD von hXrn2 führte zu einer Akkumulation nur in der nuklearen Fraktion. Die Stilllegung von Lsm1 führte zu keiner Akkumulation innerhalb einer der Fraktionen. Um sicherzustellen, dass die im Gel beobachteten markierten Produkte tatsächlich durch die Amplifikation polyadenylierter 28S-rRNA-Moleküle und nicht durch Artefakte der unspezifischen reversen Transkription erhalten wurden, wurde die aus dem Zytoplasma gereinigte RNA mit RNase H und Oligo(dT) inkubiert, bevor die Oligo(dT .) )-geprimte reverse Transkription (Abb. 4D). Auf diese Weise würden alle Poly(A)-Schwänze entfernt und während der anschließenden Oligo(dT)-geprimten RT würde keine cDNA produziert. Tatsächlich reduzierte diese Behandlung die beobachteten verstärkten Signale auf das Hintergrundniveau. Dies wird besonders deutlich, wenn man das Ergebnis für RNA vergleicht, die aus hXrn1-stummgeschalteten Zellen gereinigt wurde, die entweder mit RNase H allein oder mit RNase H zusammen mit Oligo(dT) inkubiert wurde (Abb. 4 .).D).

Zusammen bestätigen diese Ergebnisse, dass rRNA nicht nur im Zellkern von menschlichen Zellen, sondern auch im Zytoplasma vorübergehend adenyliert werden kann, und dies ist mit dem rRNA-Zerfall verbunden. Im Zytoplasma umfassen die beteiligten Exoribonukleasen hDis3L, hDis3 und hXrn1, da sich die adenylierten Abbauzwischenprodukte bei ihrer Herunterregulierung anreichern.

Exosom- oder hPNPase-Silencing verursacht keine Verringerung des Prozentsatzes heteroadenylierter Klone.

In diesem Stadium versuchten wir, das Enzym zu identifizieren, das für die Anlagerung der Schwänze, insbesondere der heteropolymeren Natur, verantwortlich ist. PNPase und das archaeale Exosom sind sowohl für das Heterotailing als auch für den Abbau von bakterieller, organellärer und archaealer RNA verantwortlich (7). Das strukturell ähnliche eukaryontische Exosom war ursprünglich ein Kandidat für die hier beobachtete Heteroaktivität, und wenn es für die Produktion der Heteroschwänze verantwortlich wäre, wäre eine Verschiebung zugunsten der Homo-Extensions bei seiner KD zu erwarten. Es wurde jedoch berichtet, dass das Exosom keine phosphorolytische Aktivität aufweist (25) und in Übereinstimmung damit fanden wir, dass der Prozentsatz der Homotails innerhalb der Gesamtmenge der isolierten und sequenzierten Klone bei der KD der Exosom-Untereinheiten, hRrp41, PM/ Scl-100 und PM/Scl-75 (Abb. 5).

Prozentsatz von Molekülen mit homopolymerem Schwanz, die aus HeLa-Zellen mit RNAi-Silencing von Exosomenkomponenten oder hPNPase, mit VV infizierten Zellen und Hefe isoliert wurden. Der Prozentsatz der Moleküle mit homopolymerem Schwanz an der Gesamtzahl der sequenzierten Moleküle, die aus HeLa-Zellen isoliert wurden, stieg bei RNAi-Silencing von: hRrp41, PM/Scl-75, PM/Scl-100 oder hPNPase (28S rRNA wurde analysiert) nicht an. In VV-infizierten Zellen wurde die virale G8R-RNA analysiert und in S. cerevisiae, 25S-rRNA, CYH2 und Actin1 (Tabellen S3, S4 und S5).

PNPase ist in menschlichen Zellen (hPNPase) vorhanden und phosphorolytisch aktiv (29). Obwohl im mitochondrialen Intermembranraum (IMS) (30) lokalisiert, haben wir die Möglichkeit in Betracht gezogen, dass hPNPase, ähnlich wie andere IMS-Proteine ​​wie Cytochrom C und Endonuklease G (31), aus diesem Kompartiment freigesetzt werden und in das Cytoplasma (und/ oder Kern), wo es Heteroschwänze polymerisieren könnte. Allerdings wurde auch in Zellen mit konstantem hPNPase-shRNA-Silencing kein Anstieg der Homotail-Rate beobachtet (32).


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Mol-Gen-Prüfung 4

Ein induzierbares Operon wird normalerweise nicht transkribiert. Es erfordert ein Induktormolekül, um die Transkription entweder durch Inaktivierung eines Repressorproteins in einem negativ induzierbaren Operon oder durch Stimulieren des Aktivatorproteins in einem positiv induzierbaren Operon zu stimulieren.

(a) Eine durch Acridinfarbstoff induzierte Mutation in der mRNA. Der Zustand ist in der beteiligten Zelle heterozygot.

2. Hemmung der Übersetzung

3. Transkriptionelles Stummschalten

2. In eukaryontischen Zellen spielt die Chromatinstruktur eine Rolle bei der Genregulation. Kondensiertes Chromatin hemmt die Transkription. Damit eine Expression stattfinden kann, muss das Chromatin verändert werden, um Veränderungen in der Struktur zu ermöglichen. Wichtig bei diesen Veränderungen sind die Acetylierung von Histonproteinen und die DNA-Methylierung.

3. Auf der Ebene der Transkriptionsinitiation ist der Prozess in eukaryontischen Zellen komplexer. Bei Eukaryoten erfordert die Initiation eine komplexe Maschine, die RNA-Polymerase, allgemeine Transkriptionsfaktoren und Transkriptionsaktivatoren umfasst. Bakterielle RNA-Polymerase wird durch die Wirkung regulatorischer Proteine ​​entweder blockiert oder stimuliert.

Promotoren, proximale Promotorelemente, Enhancer und Silencer in Eukaryoten.

A.
mäßig repetitive DNA
B.
stark repetitive DNA
C.
kurze eingestreute Elemente
D.
lange eingestreute Elemente
e.
DNA mit einzigartiger Sequenz

2. Direkte Reparatur. DNA-Schäden werden repariert, indem das beschädigte Nukleotid direkt wieder in seine ursprüngliche Struktur zurückverwandelt wird.

3. Basenexzisionsreparatur. Die beschädigte Base wird ausgeschnitten und dann wird das gesamte Nukleotid ersetzt.

4. Photoreaktive Reparatur – Umkehrung von Pyrimidin-Dimeren, die durch UV-Licht-Exposition gebildet wurden. Benötigt das Photoaktivierungsenzym

5. Reparatur nach der Replikation – tritt bei beschädigter DNA auf, die während der DNA-Replikation der anfänglichen Fehlpaarungsreparatur entgangen ist. Bei diesem Mechanismus rekombiniert das RecA-Protein den entsprechenden auf dem unbeschädigten Elternstrang gleicher Polarität

6. Doppelstrangbruchreparatur – verantwortlich für die Anheftung zweier gebrochener DNA-Stränge – verwendet die homologe Rekombinationsreparatur und die entsprechende Region auf dem Schwesterchromatid als Matrize


Die eukaryotische Prä-mRNA durchläuft eine umfangreiche Verarbeitung, bevor sie translatiert werden kann. Die zusätzlichen Schritte der eukaryotischen mRNA-Reifung erzeugen ein Molekül mit einer viel längeren Halbwertszeit als eine prokaryontische mRNA. Eukaryotische mRNAs halten mehrere Stunden, während die typischen E coli mRNA dauert nicht länger als fünf Sekunden.

Prä-mRNAs werden zunächst mit RNA-stabilisierenden Proteinen umhüllt, die die Prä-mRNA vor Abbau schützen, während sie verarbeitet und aus dem Zellkern exportiert wird. Die drei wichtigsten Schritte der Prä-mRNA-Prozessierung sind das Hinzufügen von stabilisierenden und signalgebenden Faktoren an den 5'- und 3'-Enden des Moleküls und das Entfernen von dazwischenliegenden Sequenzen, die die entsprechenden Aminosäuren nicht angeben. In seltenen Fällen kann das mRNA-Transkript nach der Transkription „bearbeitet“ werden.

5′ Kappen

Während die Prä-mRNA noch synthetisiert wird, a 7-Methylguanosin-Kappe wird durch eine Phosphatbindung an das 5'-Ende des wachsenden Transkripts angefügt. Diese Einheit (funktionelle Gruppe) schützt die entstehende mRNA vor Abbau. Darüber hinaus erkennen Faktoren, die an der Proteinsynthese beteiligt sind, die Kappe, um die Translation durch Ribosomen zu initiieren.

3′ Poly-A-Schwanz

Sobald die Elongation abgeschlossen ist, wird die Prä-mRNA durch eine Endonuklease zwischen einer AAUAAA-Konsensussequenz und einer GU-reichen Sequenz gespalten, wobei die AAUAAA-Sequenz auf der Prä-mRNA verbleibt. Ein Enzym namens Poly-A-Polymerase fügt dann eine Kette von ungefähr 200 A-Resten hinzu, die als bezeichnet wird Poly-A-Schwanz. Diese Modifikation schützt die prä-mRNA weiter vor Abbau und signalisiert den Export der zellulären Faktoren, die das Transkript benötigt, in das Zytoplasma.

Prä-mRNA-Spleißen

Eukaryotische Gene bestehen aus Exons, die proteinkodierenden Sequenzen entsprechen (Ex-on bedeutet, dass sie Exgedrückt) und intervening sequenzen genannt Introns (intron bezeichnet ihre intdienende Rolle), die an der Genregulation beteiligt sein können, aber während der Verarbeitung aus der prä-mRNA entfernt werden. Intronsequenzen in mRNA kodieren keine funktionellen Proteine.

Die Entdeckung von Introns kam in den 1970er Jahren für Forscher überraschend, die erwarteten, dass Prä-mRNAs Proteinsequenzen ohne weitere Verarbeitung spezifizieren würden, wie sie es bei Prokaryonten beobachtet hatten. Die Gene höherer Eukaryoten enthalten sehr oft ein oder mehrere Introns. Diese Regionen können regulatorischen Sequenzen entsprechen, jedoch ist die biologische Bedeutung von vielen Introns oder sehr langen Introns in einem Gen unklar. Es ist möglich, dass Introns die Genexpression verlangsamen, weil es länger dauert, prä-mRNAs mit vielen Introns zu transkribieren. Alternativ können Introns nicht-funktionelle Sequenzreste sein, die während der Evolution von der Fusion alter Gene übrig geblieben sind. Dies wird durch die Tatsache unterstützt, dass separate Exons oft separate Proteinuntereinheiten oder -domänen kodieren. Größtenteils können die Sequenzen von Introns mutiert werden, ohne dass das Proteinprodukt letztendlich beeinflusst wird.

Alle Introns einer Prä-mRNA müssen vor der Proteinsynthese vollständig und präzise entfernt werden. Wenn der Prozess auch nur um ein einziges Nukleotid fehlschlägt, würde sich der Leserahmen der wieder zusammengefügten Exons verschieben und das resultierende Protein wäre dysfunktional. Der Vorgang des Entfernens von Introns und des Wiederverbindens von Exons wird als . bezeichnet Spleißen (Abbildung 1). Introns werden entfernt und abgebaut, während sich die Prä-mRNA noch im Kern befindet. Das Spleißen erfolgt durch einen sequenzspezifischen Mechanismus, der sicherstellt, dass Introns entfernt und Exons wieder mit der Genauigkeit und Präzision eines einzelnen Nukleotids verbunden werden. Das Spleißen von Prä-mRNAs wird durch Komplexe von Proteinen und RNA-Molekülen durchgeführt, die als Spleißosomen bezeichnet werden.

Übungsfrage

Abbildung 1. Prä-mRNA-Spleißen beinhaltet die präzise Entfernung von Introns aus dem primären RNA-Transkript. Der Spleißprozess wird durch Proteinkomplexe, die als Spleißosomen bezeichnet werden, katalysiert, die aus Proteinen und RNA-Molekülen, den sogenannten snRNAs, bestehen. Spleißosomen erkennen Sequenzen am 5'- und 3'-Ende des Introns.

Fehler beim Spleißen werden mit Krebs und anderen menschlichen Krankheiten in Verbindung gebracht. Welche Mutationen können zu Spleißfehlern führen?

Beachten Sie, dass mehr als 70 einzelne Introns vorhanden sein können und jedes den Prozess des Spleißens – zusätzlich zum 5′-Capping und dem Hinzufügen eines Poly-A-Schwanzes – durchlaufen muss, um ein einzelnes, translatierbares mRNA-Molekül zu erzeugen.

RNA-Editierung in Trypanosomen

Figur 2. Trypanosoma brucei ist der Erreger der Schlafkrankheit beim Menschen. Die mRNAs dieses Pathogens müssen durch Zugabe von Nukleotiden modifiziert werden, bevor die Proteinsynthese erfolgen kann. (Kredit: Änderung der Arbeit von Torsten Ochsenreiter)

Die Trypanosomen sind eine Gruppe von Protozoen, zu denen der Erreger gehört Trypanosoma brucei, die beim Menschen Schlafkrankheit verursacht (Abbildung 2). Trypanosomen und praktisch alle anderen Eukaryoten haben Organellen, die Mitochondrien genannt werden, die die Zelle mit chemischer Energie versorgen. Mitochondrien sind Organellen, die ihre eigene DNA exprimieren und von denen angenommen wird, dass sie die Überreste einer symbiotischen Beziehung zwischen einem Eukaryonten und einem verschlungenen Prokaryonten sind. Die mitochondriale DNA von Trypanosomen stellt eine interessante Ausnahme von The Central Dogma dar: Ihre Prä-mRNAs haben nicht die richtigen Informationen, um ein funktionelles Protein zu spezifizieren. Dies liegt in der Regel daran, dass der mRNA mehrere U-Nukleotide fehlen. Um dies zu beheben, führt die Zelle einen zusätzlichen RNA-Verarbeitungsschritt namens RNA-Editierung durch.

Andere Gene im mitochondrialen Genom kodieren für 40 bis 80 Nukleotide lange Leit-RNAs. Eines oder mehrere dieser Moleküle wechselwirken durch komplementäre Basenpaarung mit einigen der Nukleotide im prä-mRNA-Transkript. Die Leit-RNA hat jedoch mehr A-Nukleotide als die Prä-mRNA U-Nukleotide zum Binden hat. In diesen Regionen schleift die Leit-RNA aus. Die 3'-Enden von Guide-RNAs haben einen langen Poly-U-Schwanz, und diese U-Basen werden in Regionen des Prä-mRNA-Transkripts eingefügt, an denen die Guide-RNAs eine Schleife bilden. Dieser Prozess wird vollständig durch RNA-Moleküle vermittelt. Das heißt, Leit-RNAs – und nicht Proteine ​​– dienen als Katalysatoren bei der RNA-Bearbeitung.

RNA-Editing ist nicht nur ein Phänomen von Trypanosomen. In den Mitochondrien einiger Pflanzen werden fast alle Prä-mRNAs editiert. RNA-Editierung wurde auch bei Säugetieren wie Ratten, Kaninchen und sogar Menschen identifiziert. Was könnte der evolutionäre Grund für diesen zusätzlichen Schritt in der Prä-mRNA-Verarbeitung sein? Eine Möglichkeit besteht darin, dass die Mitochondrien, die Überreste alter Prokaryonten sind, eine ebenso alte RNA-basierte Methode zur Regulierung der Genexpression haben. Um diese Hypothese zu untermauern, unterscheiden sich Änderungen an prä-mRNAs je nach zellulären Bedingungen. Obwohl spekulativ, könnte der Prozess der RNA-Editierung ein Überbleibsel aus einer Urzeit sein, als RNA-Moleküle anstelle von Proteinen für die Katalyse von Reaktionen verantwortlich waren.


Ergebnisse

Wir begannen mit der Generierung eines Transkripts, das für den miRNA-abhängigen Abbau empfindlich ist. Wir haben eine künstliche miRNA basierend auf dem mir6.1-Rückgrat (Chen et al., 2007) generiert, die auf eine Sequenz abzielt, die im Drosophila Genom, bestimmt durch E-RNAi (Horn & Boutros, 2010) und GESS (Yilmazel et al., 2014)-Programme und durch Nukleotid-BLAST-Suche der Leitsequenz gegen die Drosophila melanogaster Genom (FB2016_04-Release). Die künstliche miRNA wurde in ein 3′ UTR-Intron des mKate2 Gen, mit dem wir die Expression des miRNA-Konstrukts überwachen können.Um eine miRNA-gerichtete Spaltung anstelle eines endgerichteten Abbaus oder einer translationalen Hemmung zu begünstigen, wurden drei perfekt komplementäre Zielstellen für die miRNA (Ameres & Zamore, 2013) in die 3′-UTR der Firefly-Luciferase eingebaut (FLuc) Reportergen. Wie erwartet, Co-Expression der FLuc Reporter und das miRNA-Konstrukt führten zu einer starken Abnahme des FLuc-Proteinspiegels im Vergleich zur Expression des FLuc Reporterkonstrukt allein (von 100 % auf 5,3 ± 0,4 %, Fig. 1A).

Um festzustellen, ob wir miRNA-gerichtete Transkripte vor dem Abbau retten können, platzierten wir einen Poly(A)-Trakt mit 139 Basen unmittelbar 5′ zu den miRNA-Zielstellen und stromabwärts der kodierenden Sequenz von FLuc. Wir kamen zu dem Schluss, dass nach einer miRNA-gesteuerten endonukleolytischen Spaltung von Reportertranskripten der interne Poly(A)-Trakt, der sich jetzt am neu geschaffenen 3′-Ende des geschnittenen Transkripts befindet, mehr 5′-Sequenzen vor dem exonukleolytischen Abbau von 3′ nach 5′ schützen würde Übersetzung (Wilusz, Wormington & Peltz, 2001). Die Hinzufügung des inneren Poly(A)-Trakts in den FLuc Reporter verursachte eine mäßige Abnahme der FLuc-Expression im Vergleich zum FLuc Reporter ohne den Poly(A)-Trakt (von 100 % auf 89,9 ± 6,5 % Abb. 1A). Wenn jedoch die miRNA und FLuc Reporterkonstrukte koexprimiert wurden, fanden wir, dass die FLuc Reporter mit dem internen Poly(A)-Trakt (d. h. Poly(A)+) unterstützten ein viel höheres Niveau der FLuc-Expression als dies FLuc Reporter ohne internen Poly(A)-Trakt (d. h. Poly(A)–): 81,4 ± 4,0 % bzw. 5,3 ± 0,4 % (Abb. 1A).

Um zu testen, ob Reportertranskripte von der künstlichen miRNA gespalten wurden, führten wir eine RT-PCR-Analyse von Zellen durch, die die miRNA und den poly(A)+- oder poly(A)–-Reporter exprimieren. cDNA des ersten Strangs wurde von einer Position 3' zu den miRNA-Zielstellen revers transkribiert. Eine weitere 5′-Region innerhalb von FLuc Die kodierende Region wurde dann unter Verwendung von PCR amplifiziert ( 1B ). In einem solchen Experiment sollte die Menge des PCR-Produkts proportional zum Gehalt an ungeschnittenem . sein FLuc Abschrift. Wie in Abb. 1C dargestellt, führte die Zugabe der miRNA zu einer 65%igen Abnahme der Menge an FLuc RT-PCR-Produkt im Vergleich zu einer no-miRNA-Kontrolle, unabhängig davon, ob das Transkript einen internen Poly(A)-Trakt enthielt oder nicht. Das Vorhandensein der miRNA hatte auch keinen Einfluss auf die Gesamtspiegel polyadenylierter mRNAs in Drosophila S2-Zellen, gemessen durch RT-PCR eines nicht zielgerichteten Transkripts aus dem β-Glucuronidase (βGlu)-Gen (Fig. 1C). Zusammen stimmen diese Ergebnisse mit einem Modell überein, in dem der innere Poly(A)-Trakt Transkripte stabilisiert, die an einer weiter 3'-Position gespalten wurden. Mit diesem Modell im Hinterkopf machten wir uns daran, ein Transkript zu bauen, bei dem die Translation blockiert war, aber durch miRNA-abhängige Spaltung freigesetzt werden konnte.

Sekundärstruktur in der 5′-UTR einer mRNA kann die mRNA-Translation in vielen Zusammenhängen unterdrücken (Kozak, 2005, Lammich et al., 2011). Wir versuchten, eine Sekundärstruktur in der 5′-UTR aufzubauen, die durch Spaltung in der 3′-UTR entlastet oder an der Bildung gehindert werden konnte. Dazu haben wir uns natürlich vorkommenden Systemen zugewandt, in denen durch die Interaktion zweier unterschiedlicher RNA-Moleküle eine stabile RNA-Struktur erzeugt wird. CopT und CopA sind gut charakterisierte bakterielle RNA-Moleküle. Jeder bildet eine Haarnadelkurve, und sie teilen sich die Komplementarität über 90 Nukleotide. In Bakterien bindet CopA in trans an CopT, das sich in der Leader-Region von . befindet repA, eine Struktur bildend, die die Translation von verhindert repA mRNA (Blomberg et al., 1994 Blomberg, Nordstrom & Wagner, 1992). Die Paarung beginnt mit einer vorübergehenden Schleife-zu-Schleife-Wechselwirkung (Kissing-Komplex) und führt zu einer stabilen Struktur, einer Vier-Helix-Verbindung (Kolb et al., 2000a Kolb et al., 2000b). Diese Struktur blockiert den Zugang von Ribosomen zu ribosomalen Bindungsstellen in repA mRNA (Blomberg et al., 1994). Wir stellten die Hypothese auf, dass, wenn CopT und CopA in der 5'- bzw. 3'-UTR desselben Transkripts lokalisiert wären, die Bildung einer Sekundärstruktur, die aus ihrer Assoziation resultiert, die Translation der dazwischenliegenden kodierenden Sequenz verhindern würde.

Um diese Idee zu erforschen, haben wir CopT oder CopA allein oder in Kombination eingeführt in FLuc Transkripte. Einführung eines einzelnen CopT in die 5′ UTR von FLuc mRNA verursachte eine Reduktion der FLuc-Expression (von 100 % auf 65,3 ± 6,7 % Abb. 2A–2B: 2), während die Platzierung eines einzelnen CopA in die 3′-UTR des Transkripts keinen signifikanten Einfluss auf die FLuc-Expression hatte (107,7 ± 26,1 % Abb. 2A–2B: 3). Diese Ergebnisse werden erwartet, da eine starke Haarnadelstruktur, die stromaufwärts des Startcodons, jedoch nicht in der 3′-UTR, platziert ist, oft die Translationsinitiation behindert (Kozak, 2005). Wichtig ist jedoch, dass eine viel stärkere Reduktion der FLuc-Expression beobachtet wurde, wenn CopT und CopA in die 5′- und 3′-UTRs derselben eingefügt wurden FLuc Transkript (von 100 % auf 2,8 ± 0,7 % Abb. 2A–2B: 4). Dieses Stummschalten ist wahrscheinlich auf die Hemmung der Translation zurückzuführen, da die Transkriptspiegel ähnlich waren, wenn eine, beide oder keine Haarnadelstrukturen vorhanden waren ( 2C ).

Mit diesen Beobachtungen in der Hand fragten wir dann, ob eine miRNA die Hemmung der mRNA-Translation durch Unterbrechen oder Verhindern der Interaktionen zwischen CopA und CopT de-reprimieren oder verhindern könnte. Wir generierten ein Transkript, in dem drei zuvor getestete Zielstellen für die künstliche miRNA (Abb. 1) stromaufwärts von CopA im FLuc Transkript mit beiden Haarnadelstrukturen (Abb. 2A: 4). Zusätzlich wurde ein Poly(A)-Trakt zwischen das 3′-Ende der kodierenden Sequenz von . eingefügt FLuc und die miRNA-Zielstellen. Diese Anordnung stellt sicher, dass der Schnitt FLuc Transkript hat einen Poly(A)-Trakt, der am 3'-Ende exponiert ist. Dieses Konstrukt wird im Folgenden als miRNA-Reporter bezeichnet ( 3A ). Um die Wirksamkeit des miRNA-Reporters zu beurteilen, verglichen wir die FLuc-Expression aus diesem mit der Expression aus einem Kontrolltranskript, bei dem CopA in der 3′-UTR durch eine Zufallssequenz gleicher Länge (Reporter CopA− ) ersetzt wurde. Der Reporter CopA− liefert Messungen der FLuc-Expression in Abwesenheit der CopA-CopT-vermittelten Repression und dient somit als Referenz für die Reporterleistung mit und ohne miRNA.

Wir haben festgestellt, dass die Übersetzung von FLuc vom miRNA-Reporter wurde im Vergleich zum Reporter CopA– stark reprimiert (von 100 % auf 4,4 ± 0,5 %, Abb. 3B). Diese Repression wurde durch die Co-Expression der miRNA drastisch reduziert (von 4,4 ± 0,5 % auf 41,9 ± 4,2 %). Die Co-Expression der miRNA mit dem Reporter CopA− hatte den gegenteiligen Effekt: Die FLuc-Translation nahm leicht ab (von 100 % auf 84,0 ± 3,5 % Abb. 3B). Am wichtigsten ist, dass die RT-PCR-Analyse zeigt, dass die Anwesenheit der miRNA zwar eine signifikante Abnahme der Spiegel des ungespaltenen miRNA-Reportertranskripts im Vergleich zu einer Kontrolle ohne miRNA verursacht (von 100 % auf 43 %, Abb. 3C), die Translation von FLuc aus den miRNA-exprimierenden Zellen wurde gegenüber der no-miRNA-Kontrolle um das Zehnfache erhöht (Fig. 3B). Zusammengenommen argumentieren diese Beobachtungen, dass die miRNA-gesteuerte Spaltung des Reporter-Transkripts an bestimmten Zielstellen die Translationsrepression umkehrt oder verhindert, was zu einem miRNA-Spaltungsreporter mit positivem Translations-Readout führt.


RNA (Ribonukleinsäure): Struktur und Typen (mit Diagrammen)

Die Primärstruktur der RNA ist die gleiche wie die der DNA. Es ist auch eine Polynukleotidkette mit 5′-3′ Zuckerphosphat-Gliedern. Aber der Zucker ist Ribose und liegt im Allgemeinen als einzelsträngiges Molekül vor. Aus diesem Grund hat es nicht das Eins-zu-Eins-Verhältnis zwischen den komplementären Basen. Die Menge an Purinen entspricht nicht der von Pyrimidinen.

Eine der vier Hauptbasen in der RNA ist Uracil (U) anstelle von Thymin. Biophysikalische Eigenschaften von RNA zeigen viel weniger Sekundärstruktur. Wenn jedoch einer Basensequenz eine komplementäre Sequenz in derselben Kette folgt, kann sich das Polynukleotid in sich selbst zurückfalten, um eine antiparallele Duplexstruktur zu erzeugen, die als Haarnadel bekannt ist.

Es hat einen Stamm, den basengepaarten Doppelhelixbereich und eine Schleife mit ungepaarten Basen an einem Ende (Abb. 3.55). In diesen Regionen kann G auch mit U paaren, aber es ist nicht so stark wie das G-C-Paar.

Zellen enthalten drei Arten von RNA-Messenger-RNA (mRNA), ribosomaler RNA (rRNA) und Transfer-RNA (tRNA). Messenger-RNA dient als Matrize für die Proteinsynthese. Es ist eine sehr heterogene Klasse von Molekülen und sehr instabil. Es macht 2 – 5 Prozent der gesamten RNA der normalen Zelle aus. Es wurde zuerst von Hershey (1956) entdeckt. Der Name und das Konzept der Messenger-RNA wurde erstmals von F. Jacob und J. Monod (1961) angegeben.

Wenn geschmolzene DNA langsam mit einer bestimmten m-RNA abgekühlt wird, werden DNA-RNA-Hybridmoleküle gebildet, was darauf hindeutet, dass m-RNA aus dem Matrizenstrang des DNA-Duplex gebildet wird.

Es ist sehr heterogen in der Größe, da Gene oder Gengruppen unterschiedlich lang sind. Bei Prokaryoten beginnt die Translation des mRNA-Moleküls sehr oft vor dem Abschluss seiner Transkription, da mRNAs sowohl transkribiert als auch in die Richtung von 5′ nach 3′ translatiert werden und beide Prozesse nicht durch die Kernmembran getrennt sind.

(ich) Die Struktur von mRNAs :

Messenger-RNAs kodieren die Aminosäuresequenzen von Proteinen. Die Anzahl und Typen verschiedener mRNA-Spezies (Transcriptomics = mRNA-Profil) in einer bestimmten Zelle in einer bestimmten Lebensphase eines Individuums ist vergleichbar mit der Anzahl verschiedener Proteine ​​(Proteomics = Proteinprofil), die in dieser Phase in der Zelle vorhanden sind. Messenger-RNAs machen 1 bis 2 % der gesamten zellulären RNA aus.

Alle mRNAs teilen bestimmte Eigenschaften:

(a) Sie enthalten eine kontinuierliche Sequenz von Nukleotiden, die ein spezifisches Polypeptid kodieren

(b) Sie befinden sich im Zytoplasma und

(c) Sie sind entweder an Ribosomen angeheftet oder zu einer solchen Anheftung fähig, um translatiert zu werden.

(d) In Übereinstimmung mit dem für Polypeptide beobachteten Molekulargewichtsbereich variieren mRNAs in der Länge von einigen hundert Nukleotiden bis zu mehreren tausend Nukleotiden

(e) mRNAs sind im Allgemeinen labiler als rRNAs und tRNAs, obwohl die Umsatzrate für einige mRNAs ziemlich langsam ist.

Die meisten mRNAs enthalten ein signifikantes nichtkodierendes Segment, d. h. einen Teil, der nicht den Zusammenbau von Aminosäuren steuert. Beispielsweise bestehen etwa 25 Prozent jeder Globin-mRNA aus nicht-kodierenden, untranslatierten Regionen (UTRs). Nichtkodierende Teile befinden sich sowohl am 5′ als auch am 3′ Ende einer Messenger-RNA und enthalten Sequenzen, die wichtige regulatorische Funktionen haben.

Zusätzlich zu nichtkodierenden Nukleotiden weisen eukaryotische mRNAs spezielle Modifikationen an ihren 5′ und 3′ Termini auf, die auf prokaryotischen Botschaften nicht zu finden sind. Das 5′-Ende von eukaryotischen mRNAs hat eine methylierte Guanosin-“cap,”, während das 3′-Ende eine Kette von 50 bis 250 Adenosinresten aufweist, die einen Poly(A)-Schwanz bilden.

Die Sequenz zwischen Initiations- und Terminationscodon bildet den offenen Leserahmen (ORF). Es wird von 5′ und 3′ untranslatierten Regionen flankiert, die in ihrer Länge sehr variabel sind. Folglich korreliert die Länge der mRNA nicht immer mit der Länge der Aminosäuresequenz, die sie kodiert.

Die genaue Funktion der 5′ und 3′ UTRs ist für viele mRNAs noch wenig verstanden, aber oft enthalten diese Regionen RNA-Sequenzen, die Sekundärstrukturen bilden und mit Proteinen interagieren können, die Transport, Translation und Stabilität der mRNA regulieren.

Der 3′ Polyadenylat-Schwanz ist nicht in der DNA kodiert, sondern wird posttranskriptionell hinzugefügt, bevor die mRNA aus dem Zellkern in das Zytoplasma exportiert wird. Ein Enzymkomplex aus Endonuklease und Poly(A)-Polymerase erkennt eine Signalsequenz (5′ – AAUAAA – 3′) in der Nähe des 3′ Endes des Transkripts und spaltet die Prä-mRNA stromabwärts des Signals , und fügt 20 bis 250 Adenosinreste an das 3’-Ende hinzu.

Die Struktur von plastidären und mitochondrialen mRNAs unterscheidet sich von der der zytoplasmatischen mRNA. Die organellen mRNAs fälschen sowohl die 5′-Kappe als auch den Poly(A)-Schwanz. Aufgrund von Unterschieden in der posttranskriptionalen RNA-Prozessierung behalten mitochondriale mRNAs üblicherweise die 5′ Triphosphatgruppe, während die 5′ Enden der meisten Plastiden-mRNAs monophosphoryliert sind.

Ähnlich wie prokaryontische mRNAs können die 5′- und 3′-UTRs der meisten organellen mRNAs eine Stamm-Schleifen-Struktur bilden, die regulatorische und stabilisierende Funktionen hat. Diese RNA-Strukturen interagieren oft mit Proteinen und dienen als Signale, die die Verarbeitung, Translation und den Abbau der mRNA beeinflussen.

Eukaryontische Zellen enthalten zusätzliche Klassen kleiner, stabiler RNAs. Stabile uridinreiche RNAs sind Bestandteile kleiner nukleärer Ribonukleoproteine ​​(UsnRNPs) und bilden eine Hauptklasse der kleinen nukleären RNAs (snRNAs) von Eukaryoten. Diese RNAs sind ab U1 nummeriert. Einige snRNAs kommen in hoher Kopienzahl im Nukleoplasma vor und werden als Haupt-snRNAs bezeichnet.

Die meisten der kleineren snRNAs befinden sich im Nukleolus und werden daher als snoRNAs (kleine nukleoläre RNAs) bezeichnet. Die meisten snRNAs in snRNPs sind am Spleißen von dazwischenliegenden nicht-kodierenden Regionen von den Vorläufer-mRNAs im Zellkern beteiligt.

Andere snRNAs sind an der Verarbeitung des 3′ -Terminus der Histon-Prä-mRNA beteiligt, dem ein Poly(A)-Schwanz fehlt. Die meisten snoRNAs sind an der Verarbeitung von rRNA-Vorläufern beteiligt.

Bei Eukaryoten sind Transkription und Translation nicht simultan, da die Transkription ein Kernprozess und die Translation ein zytoplasmatischer Prozess ist. Die neu transkribierten mRNAs werden als primäre Gentranskripte bezeichnet, die aus dem Zellkern in das Zytoplasma transportiert werden.

Die funktionellen mRNAs von Eukaryoten werden aus den primären Gentranskripten durch verschiedene Verarbeitungsarten wie folgt abgeleitet:

(a) Spaltung von prä-mRNA oder großen mRNA-Vorläufern in kleine individuelle mRNA-Moleküle.

(b) Capping oder Addition von 7-Methyl-Guanosin-Gruppen an die 5′ Enden des Moleküls.

(c) Poly (A) Tailing oder die Addition einer 200 Nukleotid langen Sequenz von Adenylatnukleotid an das 3′ Ende des mRNA-Moleküls.

(d) Bildung von Komplexen mit spezifischen Proteinen.

Die Basensequenz vom 5′-Ende bis zum Initiationscodon wird als Leadersequenz bezeichnet und die dazwischen liegenden nicht-kodierenden Sequenzen werden Introns genannt. Die kodierenden Sequenzen, die in Protein übersetzt werden, werden Exons genannt. Die Verarbeitung des primären Transkripts beinhaltet die Entfernung der Intronsequenzen.

Die posttranskriptionalen Modifikationen einzelner Gentranskripte können einige oder alle der oben erwähnten 4 Verarbeitungsarten durchlaufen.

Die meisten der nicht-ribosomalen RNAs, die in den Kernen eukaryontischer Zellen synthetisiert werden, sind sehr groß und in ihrer Größe sehr variabel und werden als heterogene nukleäre RNA (hnRNA) oder prä-mRNA bezeichnet.

Die schnelle Verarbeitung dieser Riesenmoleküle im Zellkern kurz nach ihrer Transkription führt zur Bildung von mRNA-Molekülen, die aus dem Zellkern in das Zytoplasma transportiert werden. Während der Verarbeitung werden aus den Primärtranskripten die Introns herausgespleißt.

Es gibt drei verschiedene Arten von Spleißmechanismen:

(a) Spleißen des tRNA-Vorläufers durch Endonuklease und Ligase-Enzym.

(b) Das automatische Spleißen von Tetrahymena-RNA-Vorläufern ist ein einzigartiger Reaktionsmechanismus, der durch das RNA-Molekül selbst katalysiert wird (Selbstspleißung). Diese katalysierenden RNA-Moleküle werden Ribozyme genannt. An einem solchen Spleißmechanismus ist kein Proteinenzym beteiligt.

Es wurde auch gezeigt, dass diese autokatalytische Aktivität in rRNA-Vorläufern mehrerer niederer Eukaryoten und in einer großen Anzahl von mRNA-, tRNA- und mRNA-Vorläufern in Mitochondrien und Chloroplasten vieler verschiedener Spezies auftritt.

(c) Die Introns von Prä-mRNA-Transkripten werden in zweistufigen Reaktionen herausgespleißt, die durch Ribonukleoproteinkomplexe, die Spliciosomen genannt werden, katalysiert werden.

Die Introns von nuklearen prä-mRNAs aus Pflanzen variieren, neigen dazu, AU-reich zu sein und haben konservierte Sequenzen an ihren Spleißstellen. In zweikeimblättrigen Pflanzen enthalten diese Introns 70 % AU, während dasselbe in einkeimblättrigen 60 % beträgt. Die Nukleotidsequenzen, die jede Exon-Intron-Verbindung umgeben, sind hochkonserviert.

In fast allen nukleären mRNA-Introns von Pflanzen bestehen die Grenzsequenzen an der Spleißstelle 5′ (Donorstelle) und der Spleißstelle 3’ (Akzeptorstelle) aus 5′ GU und AG 3′. Diese Eigenschaft wird als GU-AG-Regel bezeichnet. Ein zusätzliches Strukturelement, die Verzweigungsstelle, befindet sich normalerweise 20 bis 40 Nukleotide stromaufwärts von der 3’Spleißstelle.

Während der Intronexzision bindet das 5’Ende des Introns an einen Adeninrest an der Verzweigungsstelle und bildet ein Lariat. Das Spleißen von Prä-mRNA-Introns erfolgt innerhalb eines großen Ribonukleoproteinkomplexes (Spleißosom), der die snRNAs U1, U2, den U4/U6-Komplex und 115 enthält, die mit kleinen ribonuklearen Proteinen (snRNPs) und Nicht-snRNP-Proteinfaktoren assoziiert bleiben ( Abb. 3.58).

In der folgenden Tabelle sind vier Haupttypen von Introns aufgeführt:

Der Selbstspleißmechanismus variiert je nach Introngruppe. Das Spleißen von Gruppe-1-Introns wird initiiert, wenn ein Guanosinmolekül oder ein 5′ phosphoryliertes Derivat an eine Intronsequenz bindet. Die 3’OH-Gruppe des gebundenen Guanosins greift die Phosphatgruppe an der 5’Spleißstelle an und spaltet die Phosphodiesterbindung an dieser Stelle, wodurch das Exon-1 freigesetzt wird.

Das 3′ OH am Ende von Exon-1 reagiert mit dem Phosphat an der 3’Spleißstelle, ligiert die beiden Exons und setzt ein lineares Intron frei (Abb. 3.59). Der Selbstspleißmechanismus von Gruppe-II-Introns ähnelt dem Spleißen von nuklearen prä-mRNAs, beinhaltet jedoch nicht die Bildung eines Spleißosoms. Diese Spleißreaktionen sind typischerweise intramolekular und verbinden Exons aus einem einzigen Transkript und werden als cis-Spleißen bezeichnet.

Im Gegensatz dazu werden bestimmte Gruppe-II-Introns von Pflanzen durch einen neuartigen Trans-Splicing-Mechanismus entfernt, an dem zwei oder mehr RNA-Moleküle beteiligt sind. Es kommt in Pflanzenchloroplasten und Mitochondrien vor. Nur bestimmte Spezies kleiner, stabiler RNAs, die von der RNA-Polymerase III transkribiert werden, durchlaufen keine umfangreiche Prozessierung.

Arten von RNA:

(i) Ribosomale RNA :

Der Großteil der zellulären RNA ist ribosomale RNA. Es ist der Hauptbestandteil von Ribosomen, aber seine definitive Rolle bei der Proteinsynthese ist nicht klar. Pflanzen, Algen und photosynthetische Protisten enthalten jeweils drei Klassen von Ribosomen: zytoplasmatische, plastidäre und mitochondriale. In E. coli-Ribosomen werden drei Arten von rRNA gefunden. Sie werden aufgrund ihres Sedimentationsverhaltens als 5S, 16S und 23S bezeichnet.

Jedes Ribosom enthält ein Molekül jeder dieser rRNA-Spezies. Eukaryotische Ribosomen enthalten jedoch jeweils ein Molekül der 5S-, 7S-, 18S- und 28S-rRNA-Spezies. Ribosomale RNA ist die am häufigsten vorkommende der 3 RNA-Typen in der Zelle.

Ribosomale RNA ist einzelsträngig, zeigt aber auch einen hohen Grad an sekundären Modifikationen aufgrund der Bildung von Doppelsträngen zwischen komplementären Regionen und Haarnadelschleifen. Jede Schleife enthält Duplexstämme. Die Schleifen und die Stiele stellen die spezifischen vektoriellen Bindungsstellen für verschiedene ribosomale Proteine ​​und andere Enzyme für die Proteinsynthese bereit.

Das 3′ -Ende der aus E. coli isolierten 16S-rRNA hat eine Shine- und Dalgarno-Sequenz, die als mRNA-Bindungsstelle im 30S-Ribosom dient. Diese Sequenz hilft, das Startende der mRNA zu erkennen. Die 5S-rRNA hat eine Sequenz, die komplementär zur TΨC-Sequenz aller tRNAs ist. Daher ist 5S-RNA für die Bindung von tRNA an die Ribosomen essentiell.

Die Verarbeitung von prä-rRNAs umfasst die nukleolytische Spaltung und Methylierung. Einige eukaryotische rRNA-Transkripte werden durch das Intron selbst gespleißt (selbstspleißend, Ribozym).

Die Transkriptionseinheiten im nuklearen rRNA-Gencluster, die für die 17S-, 5.8S- und 25S-rRNA-Moleküle kodieren, werden von der RNA-Polymerase I in ein einzelnes langes Vorläufermolekül transkribiert, das dann eine Reihe von Spaltungs- und Methylierungsschritten durchläuft, um 17S, 5.8S . zu ergeben und 25S-rRNA-Moleküle.

Die Transkription der 5S-rRNA aus den entsprechenden nukleären Genen ist unabhängig und wird durch die RNA-Polymerase III katalysiert. Es erfordert keine Verarbeitung.

Die 17S-, 5.8S- und 25S-rRNAs werden aus einem gemeinsamen 45S-rRNA-Vorläufermolekül durch Prozessierungsreaktionen hergestellt, die von mehreren RNasen katalysiert werden. Während der Prozessierung werden die 25S- und 5.8S-rRNAs Wasserstoffbrückenbindungen und bleiben nach Abschluss der Prozessierung gepaart (Abb. 3.60).

Vier plastidäre rRNA-Moleküle werden als polycistronische Transkriptionseinheit kodiert, die auch die beiden tRNA-Gene enthält, die für tRNA ala und tRNA lle in der Spacer-Region kodieren, die die 16S- und 23S-rRNA trennen, die jeweils ein langes Intron enthalten. Durch einen komplexen Prozessierungsweg wird die Vorläufer-RNA in 16S-, 23S-, 4.5S- und 5S-rRNAs und die tRNA-Vorläufer gespalten.

Die gespaltenen tRNA-Vorläufer werden dann zu funktionellen tRNA-II- und tRNA-ala-Molekülen prozessiert. Die tRNAs werden von der RNA-Polymerase III aus Clustern nuklearer Gene transkribiert, müssen aber im Gegensatz zur 5S-rRNA prozessiert werden (Abb. 3.61).

(ii) RNA übertragen :

Transfer-RNA wurde zuerst als eine Fraktion von RNA identifiziert, die bei 4S sedimentiert. Die tRNAs sind 75-85 Nukleotide lang. Sie werden auch als lösliche RNA oder zytoplasmatische RNA bezeichnet. Transfer-RNA ist ein Adaptermolekül, das Doppelfunktionen erfüllt. Es erkennt sowohl das Codon als auch die Aminosäure.

Die Nukleotidsequenz der tRNA ergibt die Form eines Kleeblattes. In dieser Struktur bilden die komplementären gepaarten Basen Stämme für einzelsträngige Schleifen. Die Stamm- und Schleifenstrukturen werden als Arme der tRNA bezeichnet.

Die Basensequenz eines tRNA-Moleküls wurde erstmals 1965 von Robert Holley bestimmt. Außer den üblichen A, G, C und U enthalten sie eine Vielzahl ungewöhnlicher Nukleoside, wie Pseudouridin (Ψ), Dihydrouridin (H2U), Ribothymidin (rT), Inosin (I), Mono- und Dimethylderivate von Adenosin und Guanosin und deren thiolierte Derivate.

Diese Modifikationen finden an einer der vier Basen erst statt, nachdem sie in die Polyribonukleotidkette eingebaut wurde. Es gibt vier Schleifen und vier Hauptarme im tRNA-Molekül. Die Arme sind nach ihren Strukturen und Funktionen benannt.

Der Akzeptorarm besteht aus einem basengepaarten Stamm, der immer in einem ungepaarten —C—C— endet. Eine Sequenz, deren freie 3′ OH-Gruppe aminoacyliert ist und das 5′ Ende im Allgemeinen entweder in G oder C endet.

Die anderen Arme bestehen aus gepaarten Stielen und ungepaarten Schlaufen. Der D-Arm ist nach der Anwesenheit von Dihydrouracilbase benannt. Der Anticodon-Arm enthält immer das Anticodon-Triplett in der Mitte der Schleife. Der TΨC-Arm ist nach dieser Triplettsequenz benannt.

Das variable Merkmal der tRNA ist der sogenannte Extraarm, der zwischen den TΨC- und Anticodon-Armen liegt. Aufgrund ihrer Beschaffenheit werden tRNAs in zwei Typen eingeteilt: – Klasse-I-tRNAs (mit einem kleinen Extraarm) und die Klasse -II-tRNAs (mit einem großen zusätzlichen Arm). Im Uhrzeigersinn um das Kleeblatt herum gibt es immer 7 Basenpaare im Akzeptorstamm, 5 im TΨC-Arm, 5 im Anticodn-Arm und normalerweise drei im D-Arm.

Die Position der nuklearen tRNA-Introns ist konserviert, ihre Sequenzen jedoch nicht. Eine Endonuklease spaltet die pre-tRNA an beiden Enden des Introns, was zur Bildung einer zyklischen 2′,3′-Phosphatgruppe am 3′ Ende des 5′ tRNA-Segments und einer freien 5′ . führt -Hydroxylgruppe des 3′ tRNA-Segments.

Die zyklische Phosphatgruppe wird abgespalten, um eine 2′-Phosphatgruppe zu bilden. Die freie 5′ Hydroxylgruppe wird dann phosphoryliert und beide Hälften werden durch eine RNA-Ligase verbunden. Eine 2′-Phosphatase entfernt die 2′-Phosphatgruppe, um die reife gespleißte tRNA zu erhalten.


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Diskussion

Diese Studie präsentierte einen qRT-PCR-basierten Ansatz, der verwendet werden kann, um den rekombinanten mRNA-Zerfall in Expressionssystemen zu überwachen, die durch niedermolekulare Moleküle induziert werden, deren Transport in und aus Zellen durch Diffusion erfolgt. Diese recht einfache Technik beeinflusst die behandelten Zellen nur minimal, im Gegensatz zu den meisten anderen Methoden zum Zugang zur mRNA-Stabilität, die eine globale Hemmung der bakteriellen RNA-Polymerase durch das Antibiotikum Rifampicin beinhalten [50]. Letzterer Ansatz kann zu möglicherweise unbekannten negativen Nebenwirkungen führen und zusätzlich wurden Rifampicin-insensitive Promotoren beschrieben [48].

Die Analyse von bla assoziierte 5′-UTRs zeigten direkt, dass die Stimulation der Transkriptebene durch die Varianten LV-2 und LII-11 auf einer erhöhten Transkriptionsrate und nicht auf stabilerer mRNA beruht (Abbildung 1). Wie auch durch die LII-11-Variante dokumentiert, führt eine effizientere Translation nicht immer zu einem besseren Schutz vor Transkriptabbau, wie für andere Gene berichtet wurde [37] [51]. In Übereinstimmung mit diesen Berichten haben wir hier jedoch gezeigt, dass eine im Leseraster an das 5′-Ende eines menschlichen Gens fusionierte Translokationssignalsequenz dessen mRNA-Stabilität stimulieren kann (Abbildung 4). Diese unvorhersehbaren Unterschiede sind vermutlich eine Folge der Komplexität der Beziehungen zwischen Transkription, mRNA-Zerfall und Translation. Das Hinzufügen einer 5′-Signalsequenz kann einen Einfluss auf die mRNA-Faltung haben und kann dann den RNase-E-vermittelten mRNA-Zerfall beeinflussen oder nicht. Alternativ können die beobachtete Erhöhung der Transkriptmenge und verlängerte mRNA-Halbwertszeiten im Fall von 5′-Fusionen auf einen möglichen Schutz der Transkripte durch die Translation von Ribosomen aufgrund einer effizienteren Translationsinitiation hinweisen. Weitere Studien, beispielsweise durch den Einsatz einer neuartigen Technik zur quantitativen Analyse der ribosomalen Dichte an translatierten mRNAs [52], könnten möglicherweise dazu dienen, detailliertere Erkenntnisse zu gewinnen, aber im Allgemeinen glauben wir, dass es sehr kompliziert ist, die zugrunde liegenden Mechanismen zu entschlüsseln durch derzeit verfügbare Techniken.

Ähnlich wie die bla assoziierte 5′-UTR-Varianten, Einführung synonymer Mutationen in der bla Die kodierende Sequenz 5′ führte zu einem Anstieg des akkumulierten Transkriptspiegels, ohne die mRNA-Stabilität offensichtlich zu beeinträchtigen (Abbildung 3). Die Gründe dafür mögen denen der LV-2-UTR-Mutationen zugrunde liegen [14], aber es ist interessant, dass die kodierende Sequenz eines Gens einen solchen Einfluss auf die Transkription selbst haben kann. Obwohl die kodierende Region 5′ durch ihre mRNA-Sekundärstrukturen und die Codon-Nutzung mehrfach mit der Kontrolle der Translation verknüpft wurde [53], [54] ist viel weniger darüber bekannt, wie sie die Transkription beeinflussen kann. Es wurde gezeigt, dass die benachbarte 5′-UTR-DNA-Region den Transkriptionsprozess durch Sequenzen beeinflussen kann, die dem �-Promotorelement (TATAAT) ähneln und in der Lage sind, eine σ 70 -abhängige Transkriptionspause zu induzieren [55], [56 ]. Beim Tryptophanase-Operon (tna). Eine Möglichkeit besteht daher darin, dass die synonymen Mutationen innerhalb der bla kodierende Region beeinflusst Pausenstellen im Wildtyp bla DNA-Sequenz in einer für die Transkription stimulierenden Weise.

Um die allgemeine Relevanz der neuen Methodik zur Bewertung der mRNA-Stabilität zu untermauern, haben wir ihre Verwendung auch auf einen IPTG-induzierbaren Promotor ausgeweitet. Der Zerfall von mRNAs (ompA-gm-csf und gm-csf, Bild 5 ) generiert aus dem Ptac Der Promoter bestätigte, dass die Methodik für dieses IPTG-induzierbare System genauso nützlich war wie für die m-toluat-induzierbares XylS/Uhr System. Eine potentielle Einschränkung dieses Verfahrens könnte darin bestehen, dass es die Verwendung eines induzierbaren Promotors mit niedrigem Hintergrundexpressionsniveau erfordert. Jede Hintergrundproduktion der untersuchten mRNA würde wahrscheinlich zu einer Mischung aus tatsächlichem Zerfall und einem gewissen Grad an neuer Transkriptsynthese führen, was einen Fehler bei der Berechnung der relativen Zerfallsrate verursachen würde.

Das Induktor-Auswaschverfahren wurde mit Plasmiden getestet, die sowohl eine niedrige (z. B. pIB11) als auch eine mäßig hohe Kopienzahl (z. B. pGM29) aufwiesen. Da die qRT-PCR im Allgemeinen als hochspezifische und sensitive Technik angesehen wird, glauben wir, dass die Methode problemlos verschiedene Expressionsniveaus adressieren kann. Darüber hinaus sollte das Induktor-Auswaschverfahren, wenn es zusammen mit der Bestimmung der Transkriptkonzentrationen und der jeweiligen Proteinmenge verwendet wird, nützlich sein, um verschiedene Faktoren aufzuklären, die das Gesamtexpressionsniveau eines rekombinanten Gens beeinflussen könnten. Das hier beschriebene Konzept kann höchstwahrscheinlich verwendet werden, um den mRNA-Zerfall für jedes Gen in praktisch jedem Zelltyp (sogar einigen Eukaryoten) zu messen, der in der molekularbiologischen Forschung stark verwendet wird. Der Grund dafür ist, dass Systeme auf Basis diffusionsfähiger Induktoren fast überall verfügbar sind. Was auch immer das interessierende Gen ist, es kann einfach mit seiner eigenen UTR PCR-amplifiziert und dann stromabwärts eines induzierbaren Promotors eingefügt werden. Dies ergibt wahrscheinlich das gleiche Transkript wie aus der natürlichen Umgebung, in der das Gen lokalisiert ist.


Schau das Video: mRNA splicing (Juli 2022).


Bemerkungen:

  1. Kerrick

    Es tut mir leid, das hat sich eingegriffen ... aber dieses Thema ist mir sehr nahe. Ich kann bei der Antwort helfen. Schreiben Sie in PM.

  2. Athmore

    Ich kann mich gerade nicht an der Diskussion beteiligen - sehr beschäftigt. Osvobozhus - unbedingt ihre Beobachtungen.

  3. Cyneheard

    Ich habe eine Idee, wenn Sie interessiert sind, können Sie darüber sprechen ...

  4. Bates

    Pindyk, ich weine nur)))

  5. Kazigore

    das Absurde, weil dies

  6. Trevyn

    Nun, was als nächstes?



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