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Wie würden Sie Readthrough als Teil eines genetischen Schaltungsdesigns verwenden?

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Traditionell versuchten Forscher in der synthetischen Biologie, einige Transkriptionsphänomene (wie das Blockieren von Tandem-Promotoren oder das Durchlesen schwacher Terminatoren) zu vermeiden, da sie nicht im Einklang mit dem Bestreben der Disziplin stehen, modulare, digitale genetische Schaltkreise zu entwerfen. Einige Forscher haben jedoch damit begonnen, diese "Probleme" als Teil des beabsichtigten Designs zu verwenden (siehe beispielsweise Bordoy et al.).

Wie könnte Ihrer Meinung nach transkriptionelles Durchlesen als Teil eines genetischen Schaltungsdesigns verwendet werden? Wann möchten Sie eine Durchsicht haben? Welche Art von Logik oder Funktion würde dies emulieren?


Readthrough wurde bereits verwendet, um transkriptionelle NOR-Gatter zu implementieren, wobei Tandem-Input-Promotoren einen Repressor exprimieren, der einen Output-Promotor reprimiert. (Ich erinnere mich zum ersten Mal hier: 21150903, hier weit verbreitet: 27034378, hier modelliert Roadblocking: 32141239.) Ein Vorteil dieses Designs besteht darin, dass der Repressor nur einmal in der DNA kodiert werden muss, was den DNA-Fußabdruck des Designs erheblich reduzieren kann und die Wahrscheinlichkeit einer Rekombination, wenn die DNA-Sequenz des Repressors lang ist (zB Repressoren auf Proteinbasis). OR-Gatter wurden in ähnlicher Weise als zwei Tandem-Promotoren implementiert, die ein gemeinsames Ausgabegen exprimieren. (Ein alternatives NOR-Design – das bei Repressoren mit kurzen DNA-Sequenzen (z. B. sgRNAs) üblich ist – besteht darin, den Repressor zu duplizieren und getrennt von beiden Input-Promotoren zu exprimieren. Dieser Ansatz umgeht das Roadblocking und die Input-Asymmetrie, die bei Tandem-Promotoren auftreten können. )

Readthrough wurde auch mit Antisense-Promotoren verwendet, um die Genexpression abzustimmen (siehe 26769567). In diesen Designs muss ein Input-Promotor einen Downstream-Antisense-Promotor durchlesen, und die Stärke des Antisense-Promotors kann verwendet werden, um die Reaktion des Input-Promotors abzustimmen.

Eine andere Anwendung, die mir in den Sinn kommt, ist die Codierung des relativen Expressionsverhältnisses mehrerer Gene, indem sie mit schwachen Terminatoren getrennt werden (z. B. um eine X-fache Expression des ersten Gens relativ zum zweiten zu erreichen). Dies beginnt, ein Operon hervorzurufen, als Jakebeal-Noten. Das nächste Beispiel, das mir einfällt, stammt aus diesem Artikel: 23727987, obwohl sie tatsächlich Readthrough verwendet haben, um das inverse Problem der Charakterisierung der Terminatorstärke anzugehen.


Ich denke, dies ist ein interessanter Vorschlag, um zu versuchen, ein Problem in einen Vorteil zu verwandeln.

Was Sie in Betracht ziehen, ähnelt konzeptionell der Organisation eines Operons, bei dem mehrere Gene von einem einzigen Promotor gesteuert werden, mit mehreren Ribosomenbindungsstellen (RBS)-Eintrittspunkten für die Translation, und auch in diesen Fällen kann sicherlich ein Durchlesen erfolgen. Strukturell wäre dies das gleiche Verhalten, außer dass die Eintrittspunkte Promotoren anstelle von RBSs sind.

Auf logischer Ebene führt der zweite Promoter tatsächlich eine von zwei Funktionen aus:

  • Wenn es positiv reguliert ist, dann wäre es ein OR, aktiviert entweder durch seinen eigenen Transkriptionsfaktor oder durchgelesen von der 5'-Sequenz.
  • Wenn es negativ reguliert wird, dann wäre es NICHT IMPLY, aktiviert durch die 5'-Sequenz, aber dominiert von seiner eigenen Repression, da sterische Repressionsmechanismen dazu neigen, auch das Durchlesen zu blockieren.

Es gibt viele potenzielle Bedenken hinsichtlich der Signalstärke des Read-Through, aber wenn man diesen Mechanismus nutzen möchte, gibt es keinen Grund zu der Annahme, dass sie nicht anfällig für Engineering sind.


Empfohlen

Höhepunkte

CRISPR ist ein unglaublich nützliches Werkzeug für Genetiker und Mikrobiologen. Kurz für geclusterte, regelmäßig angeordnete kurze palindromische Wiederholungen, klingt es allein aufgrund des Namens einschüchternd. Dennoch ist es ein Werkzeug, das Annie Taylor – eine leitende Angewandte und Technische Physik an der Cornell University – ausgiebig in ihrer Forschung verwendet. Was sie mit CRISPR macht, zeigt einige seiner Kräfte.

„Ich kann auf meinem Computer eine Nukleotidsequenz schreiben, ein maßgeschneidertes DNA-Fragment für diese Sequenz kaufen und damit das CRISPR-System so programmieren, dass es mit hoher Spezifität auf praktisch jede gewünschte DNA-Sequenz abzielt.“ Sie erklärt. Wenn man hört, wie sie es einsetzt, kann man sich leicht vorstellen, dass CRISPR einen enormen Einfluss auf die biologische Forschung hatte, mit Anwendungen in unzähligen Teildisziplinen.

Erstellen genetischer Schaltkreise, die wie Computerschaltkreise funktionieren

Taylor forscht in Guillaume Lamberts Labor Applied and Engineering Physics, das sich auf die Schaffung genetischer Schaltkreise in Zellen konzentriert – eine Anwendung von CRISPR in der synthetischen Biologie. Genetische Schaltungen sind analog zu logischen Schaltungen in der Elektrotechnik. Logikschaltungen bestehen aus vielen Logikgattern, die die Spannung und den Strom eines Systems ändern, wenn es durch sie hindurchgeht. Ähnlich wie Computer funktionieren, können genetische Schaltkreise schließlich verwendet werden, um komplexe logische Funktionen in einer Zelle auszuführen.

Viele Arten von Logikgattern führen eine Vielzahl von Funktionen aus. Taylor arbeitet an einem bestimmten Typ von Logikgattern, das als NICHT-Gatter oder Inverter bekannt ist. Der Eingang des Gates liegt auf einer hohen Spannung, während der Ausgang des Gates auf einer niedrigen Spannung liegt (oder umgekehrt). In der Elektrotechnik wird Hochspannung durch Eins repräsentiert, während Niederspannung Null ist. Eine Eins am Eingang eines NICHT-Gatters würde eine Null am Ausgang erzeugen. Das gleiche gilt umgekehrt.

In biologischen Systemen gibt es keine Hochspannung oder Niederspannung. Stattdessen würden eins und null einer hohen und einer niedrigen Proteinexpression entsprechen. Eine Eins würde bedeuten, dass ein bestimmtes Protein exprimiert wird, während eine Null bedeuten würde, dass das Protein inaktiv ist.

„Während die Systeme und Techniken biologisch sind, drehen sich viele der zugrunde liegenden Theorien unserer Arbeit um die Physik.“

In einer Zelle kann die Proteinexpression leicht untersucht werden. Man kann Markergene wie das Gen für das grün fluoreszierende Protein (GFP) einfügen. Eine Zelle, die GFP exprimiert, leuchtet in ultraviolettem Licht oder blauem Licht grün, so dass man erkennen kann, ob GFP exprimiert wird oder nicht, indem man einfach ein blaues Licht über die Kolonien richtet. Taylor fügt diese Markergene in eine Zelle ein, indem er sie in ein Plasmid einfügt, eine Struktur, die genetische Informationen trägt, die dann absorbiert und in Bakterienzellen eingebaut wird. Das Endergebnis ist eine Zellkolonie, die in blauem Licht grün leuchtet. Taylor verwendet dann das CRISPR-System, um auf dieses inserierte GFP-Gen abzuzielen.

So funktioniert CRISPR

„Das CRISPR-System ist von Natur aus ein bakterielles Immunsystem. Bakterien versuchen, sich vor Viren zu schützen, bei denen es sich im Grunde um Sequenzen fremder DNA handelt. Sie müssen erkennen können, welche Erbinformationen fremd und welche Erbinformationen ihre eigenen sind.“

Dazu produzieren Bakterienzellen Cas-Proteine, die an eine Leit-RNA-Sequenz binden. Dann untersucht das Cas-Protein jede DNA, auf die es stößt. Wenn irgendwelche Sequenzen auf der DNA mit der Leit-RNA-Sequenz übereinstimmen, erkennt das Cas-Protein sie als fremde DNA und zerstört sie.

Das am häufigsten verwendete Cas-Protein zur Gen-Editierung, Cas9, schneidet von Natur aus die DNA an der Stelle, an der sie mit der Leit-RNA-Sequenz identisch ist, aber Cas9 kann auf viele Arten modifiziert werden. Zum Beispiel verwendet das Lambert-Labor oft totes Cas9 – bekannt als dCas9) – das so modifiziert wurde, dass es katalytisch inaktiv ist. Wenn es eine DNA-Sequenz erkennt, bindet dCas9, anstatt die DNA zu schneiden, an diese Sequenz und hemmt die Transkription. Die Ziel-DNA-Sequenz wird nicht gespalten, kann aber das Protein, für das sie kodiert, nicht mehr exprimieren.

Die Stärke des CRISPR-Systems liegt in der Tatsache, dass man die 20 Basenpaare lange Leit-RNA-Sequenz, an die das Cas9-Protein bindet, modifizieren kann. Wenn man eine kritische DNA-Sequenz auf einem interessierenden Gen kennt, kann man eine entsprechende Leit-RNA-Sequenz erstellen, die dazu führt, dass das Cas9-Protein auf diesen DNA-Bereich abzielt. Wenn es sich um dCas9-Protein handelt, bindet es an diese DNA-Sequenz und hemmt die Transkription, die Expression eines Proteins an dieser Stelle.

Taylor kann eine Leit-RNA-Sequenz entwerfen, von der sie weiß, dass sie einer Sequenz auf einem der von ihr eingefügten Markergene entspricht. Sie kann beispielsweise eine RNA-Sequenz erstellen, die einem kritischen Teil des GFP-Gens entspricht. Bevor sie die Leit-RNA-Sequenz einfügt, exprimieren die Bakterienzellen das GFP-Gen. Wenn das dCas9 anschließend an die RNA-Sequenz gebunden, die entsprechende Sequenz auf der DNA erkannt und deaktiviert hat, produzieren die Kolonien kein GFP mehr und leuchten nicht mehr unter ultraviolettem Licht.

„Es gibt eine Vielzahl von Cas-Proteinen“, erklärt Taylor. „Jedes Cas-Protein kann eine andere Leit-RNA-Struktur haben oder Gene auf unterschiedliche Weise deaktivieren. Und während totes Cas9 Transkriptionen hemmt, gibt es andere Möglichkeiten, Cas-Proteine ​​zu modifizieren, um Gene zu aktivieren. Es gibt uns die Kontrolle darüber, welche Gene in einer Zelle exprimiert und welche gehemmt werden.“

Genetische Schaltkreise erstellen

Eines der Ziele des Lambert-Labors ist es, diese Kontrolle über die Genexpression zu nutzen, um einen genetischen Schaltkreis zu generieren. Sie möchten ein System entwickeln, in dem sie bestimmte Eingaben abgeben können und wissen, wie die Logikgatter in der Zelle mit den Eingaben interagieren, um ein vorhersehbares Ergebnis zu erzielen.

Lebende Systeme sind jedoch unglaublich komplex. Mehrere Logikgatter können dazu führen, dass sie sich gegenseitig in ihrer Funktion stören. Das Lambert-Labor arbeitet daran, die Grenzen des Systems zu verstehen. Wie viele Logikgatter können eingefügt werden, bis ihr Verhalten nicht mehr vorhersehbar und stabil ist? Was sind die Off-Target-Effekte des CRISPR-Systems?

„Wenn Sie ein Genom haben, das Millionen oder Milliarden Basenpaare lang ist, kann es mehrere Stellen geben, die das Cas-Protein unbeabsichtigt angreift, weil sie einfach zufällig mit der 20-Basenpaar-Guide-RNA-Sequenz übereinstimmen“, sagt Taylor. „Dies könnte für die Zelle katastrophal sein oder die Zelle scheint unberührt zu sein. Es hängt nur davon ab, wo sich diese Off-Target-Sequenzen befinden und wofür sie kodieren.“

Die Verschmelzung von Physik und Biologie

Taylor schätzt die Schnittstelle zwischen den Wissenschaften, auf die sich das Lambert-Labor konzentriert. Sie kam in Cornell mit Interesse an Luft- und Raumfahrttechnik, doch in ihrem letzten Jahr hat sie eine Leidenschaft für die Kombination von Physik und Biologie entdeckt. Als Nebenfach in Biowissenschaften konnte Taylor ihre Kursarbeiten auf ihre Laborarbeit anwenden.

„Während die Systeme und Techniken biologisch sind, drehen sich viele der zugrunde liegenden Theorien unserer Arbeit um die Physik“, sagt sie. Sie hofft, die Werkzeuge zur Genbearbeitung und -manipulation, die sie durch ihre Arbeit mit dem Lambert-Labor erlernt hat, in ihrer zukünftigen Forschung nutzen zu können.

CRISPR ist sowohl ein beängstigender Name als auch ein mächtiges Werkzeug, und wie Taylor durch ihre Arbeit mit dem Lambert-Labor erfahren hat, sind seine Anwendungen in der wissenschaftlichen Forschung weit verbreitet. Es hat das Potenzial, genetische Loci in logische Gatter und Zellen in Schaltkreise zu verwandeln, Proteine ​​nach Belieben ein- oder auszuschalten und unser wachsendes Wissen über die Funktionsweise von Zellen – und Leben – zu beeinflussen.


Einführung

Synthetische Biologen verwenden Bottom-up-Ansätze, um genetische Teile zu komplexeren Genschaltkreisen zusammenzusetzen, um die Programmierung neuer Funktionen in Zellen zu ermöglichen. Dieser Ansatz kombiniert einzelne Genexpressionsteile oder Module, die unabhängig voneinander charakterisiert und zum Aufbau neuer genetischer Schaltkreise verwendet werden können, indem mehrere Module kombiniert werden, die miteinander interagieren, um eine definierte Funktion in Zellen zu erfüllen. Die Anfänge der synthetischen Biologie begannen mit der Entwicklung von Prokaryoten mit neuartigen Funktionen [1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18], und bald folgten Bemühungen, Säugerzellen zu manipulieren. Die synthetische Biologie von Säugetieren hat sich traditionell auf die transkriptionelle und posttranskriptionelle Regulation konzentriert, um Zellen mit neuen Funktionen zu programmieren. Diese Bemühungen umfassen das Programmieren von Feedback [19,20,21], die Kontrolle der Genexpressionsniveaus [22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32], die Implementierung boolescher Logikfunktionen [33,34, 35,36,37,38,39] und zielen auf spezifische Krankheitszustände ab [40,41,42,43,44,45,46]. Neuere Ansätze, die auf spezifische Stellen im Genom abzielen, unter Verwendung von Zinkfinger-(ZF)-Proteinen, Transkriptionsaktivator-ähnlichen Effektoren (TALEs) und geclusterten regulatorischen interspaced short palindromic repeats (CRISPR), gekoppelt mit einem modifizierten Cas9-Protein mit entfernter Nukleaseaktivität (dCas9 ), wurden verwendet, um endogene Transkriptionsfaktoren abzufragen [47,48,49,50,51,52,53,54,56]. Diese Studien haben die Abfrage endogener DNA-Sequenzen ermöglicht, um die Rolle natürlicher Transkriptionsnetzwerke innerhalb von Zellen besser zu verstehen, um besser zu verstehen, wie Zellen diese Netzwerke kontrollieren [57, 58]. Die Details dieser genetischen Werkzeuge wurden an anderer Stelle ausführlich besprochen [59,60,61,62,63]. Daher wollen wir hier einen Rahmen für die Verwendung genetischer Schaltkreise zur Entwicklung neuer Therapien durch die Generierung von Geweben mit alternativen Funktionen bereitstellen.

Pluripotente Stammzellen sind Zellen, die das Potenzial haben, jede Zelle oder jedes Gewebe im Körper zu produzieren.

In der frühen Entwicklung komplexer Organismen durchlaufen pluripotente Stammzellen eine spezialisierte Entscheidungsfindung in einem bemerkenswert geordneten Prozess, um Gewebemuster, Morphogenese und Organogenese zu erzielen [64,65,66,67,68]. Die zugrunde liegenden Mechanismen dieses Abstammungsspezifikationsprozesses sind nicht vollständig verstanden. Allerdings haben sich koordinierte Cluster von Transkriptionsfaktoren oder Gennetzwerken als Schlüsselregulatoren der Pluripotenz und Differenzierung von Stammzellen herausgestellt. Darüber hinaus haben Studien gezeigt, dass eine Fehlregulation dieser natürlichen Gennetzwerke zum Ausbruch von Krebs und Gewebedegeneration beiträgt und damit mehreren Arten von menschlichen Krankheiten zugrunde liegt.

Stammzellen können ihre Abstammungslinie auf natürliche Weise steuern, indem sie den Zeitpunkt und das Ausmaß der Expression wichtiger Transkriptionsfaktoren kontrollieren, was zu gewünschten Differenzierungswegen führt [69]. Frühere Arbeiten zur Rekapitulation der Transkriptionsfaktorexpression in Stammzellen, um die Differenzierung in gewünschte Abstammungslinien voranzutreiben, umfassten die Überexpression von Schlüsseltranskriptionsfaktoren [70,71,72,73]. Diese Studien zeigten verbesserte gewünschte Differenzierungsergebnisse, jedoch produziert diese Methode oft ineffiziente Zellausbeuten, beruht auf der Selektion von Subpopulationen und erzeugt heterogene Zelltypen [74]. Diese Herausforderungen haben kürzlich zu Bemühungen von synthetischen Biologen geführt, genetische Schaltkreise zu implementieren, die eine genaue Genkontrolle ermöglichen und eine präzise räumliche und zeitliche Expression wichtiger Transkriptionsfaktoren in Stammzellen ermöglichen.

In diesem Review bieten wir einen Rahmen für die Implementierung der synthetischen Biologie in Stammzellen, um die Stammzelldifferenzierung in gewünschte Linien zu lenken. Wir beschreiben Studien, die genetische Schaltkreise in Stammzellen implementiert haben, und diskutieren die Ergebnisse dieser Studien zur Robustheit von Entscheidungen über das Schicksal von Stammzellen. Als nächstes erwägen wir die Verwendung der synthetischen Biologie, um künstliche Gewebe zu entwickeln, die mit alternativen Funktionen ausgestattet sind, um neue Therapien für kranke Zustände bereitzustellen.

Stammzellen und synthetische Biologie

Stammzellen spielen eine wichtige Rolle bei der Entwicklung und Regeneration von menschlichem Gewebe. Ein universelles Netzwerk endogener Transkriptionsfaktoren steuert das Zellschicksal und sendet und reagiert kontinuierlich auf physiologische Signale, die ihre zelltypspezifische Genexpression anpassen. Zum Beispiel ist die Überexpression der Master-Transkriptionsfaktoren Oct4, Sox2, Klf4 und c-Myc in der Lage, zuvor getroffene Entscheidungen über das Zellschicksal zu überschreiben, um somatische Zelltypen in einen pluripotenten Zustand zu überführen [75,76,77,78,79,80 ,81]. Die Differenzierung pluripotenter Vorläuferzellen in adulte Zelltypen erfordert jedoch eine streng kontrollierte räumliche und zeitliche Genexpressionsdynamik von linienspezifischen Mastertranskriptionsfaktoren. Die Differenzierung von Stammzellen und die Entwicklung von Organen beinhaltet eine komplexe Koordination sowohl intrinsischer als auch extrinsischer Signale, die das Zellverhalten steuern. Diese Koordination von Hinweisen ist für Stammzellen entscheidend, um Schicksalsentscheidungen zu treffen und sich robustes Gewebe zu entwickeln.

Derzeit werden erhebliche Anstrengungen unternommen, um Stammzellen mit genetischen Schaltkreisen zu programmieren, um ihre Differenzierung in gewünschte Linien zu bringen. Es wird angenommen, dass die Implementierung genetischer Schaltkreise zur dynamischen Kontrolle der Genexpression (z. Vor kurzem wurde ein neuer genetischer Schaltkreis konstruiert, der genetische Teile aus einer Form koppelt, Neorospora crassa, und das bakterielle Lac-Repressor-System, um einen orthogonalen genetischen Schalter zu schaffen, der in Säugerzellen verwendet werden kann [27]. Nachdem die Tunbarkeit in immortalisierten Zelllinien für den Machbarkeitsnachweis bestätigt wurde, wurden die strikte Genkontrolle und die Tunbarkeit der Genexpression dieses genetischen Schalters in pluripotenten Stammzellen demonstriert. Diese Ergebnisse legen nahe, dass synthetische Biologen Stammzellen mit künstlichen Entscheidungsfähigkeiten programmieren können, die verwendet werden können, um das Schicksal von Stammzellen in gewünschte Linien zu lenken. Durch die Verwendung genetischer Schaltkreise, die das Ausmaß und den Zeitpunkt der Expression mehrerer Transkriptionsfaktoren steuern, ist es beispielsweise möglich, wichtige Regulatoren des Zellschicksals an verschiedenen Differenzierungs-Checkpoints so abzustimmen, dass die Differenzierung von Stammzellen in ein oder mehrere gewünschte Zellschicksale vorangetrieben wird (Abb. 1 .). ).

Werkzeuge in der synthetischen Biologie zur Förderung der Stammzelldifferenzierung. Genetische Werkzeuge, die von synthetischen Biologen entwickelt wurden, ermöglichen eine strenge Kontrolle der Genexpression, die eine dynamische Kontrolle der Transkriptionsfaktor-Expression in Stammzellen ermöglicht. Dazu gehören verschiedene Expressionsniveaus (z. B. niedrig, mittel und hoch), zusätzlich zur Kontrolle der Expressionsniveaus in dynamischen Mustern, einschließlich Tuning, Pulsen, Oszillationen usw. Kontrolle des Niveaus, des Timings und der Muster der Genexpression an verschiedenen Kontrollpunkten von Das Schicksal von Stammzellen verbessert die Differenzierungsergebnisse

Um die Nützlichkeit der Verwendung genetischer Schaltkreise zur Steuerung der Entscheidungsfindung in Zellen zu demonstrieren, wurde ein genetischer Schaltkreis für die Zwei-Wege-Kommunikation entwickelt, um die natürlichen Genexpressionsmuster während der Angiogenese, der Bildung von Blutgefäßen, nachzuahmen [82]. Die Kommunikation von Zelle zu Zelle war der Rahmen für dieses synthetische Netzwerk. Insbesondere wurden Senderzellen mit einem genetischen Schaltkreis programmiert, um konstitutiv Tryptophan-Synthase (TrpB 26 ), ein Enzym aus E coli, das Indol (eine Verbindung in den Medien) in L-Tryptophan umwandelt. Die Autoren konstruierten auch Empfängerzellen mit einem genetischen Schaltkreis, der es den Zellen ermöglicht, das sekretierte L-Tryptophan wahrzunehmen und als Reaktion darauf die Expression eines Reportergens, der sekretierten alkalischen Phosphatase (SEAP), einzuschalten. Als nächstes verwendeten die Autoren dieses konstruierte Zell-Zell-Kommunikationssystem, um eine verbesserte Angiogenese zu implementieren. Während der natürlichen Angiogenese wirken zwei Transkriptionsfaktoren, der vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktor (VEGF) und Angiopoietin-1 (Ang1) sequentiell und koordiniert, um reife Blutgefäße zu produzieren [83]. In dem konstruierten Zell-Zell-Kommunikationssystem besaßen die Sender- und Empfängerzellen jeweils genetische Schaltkreise, die zu unterschiedlichen Zeiten exprimierte Ausgangsgene erzeugten, um die zelluläre Differenzierung zu steuern und Blutgefäße zu produzieren. Aufgrund der relativ geringen Diffusionslänge von Nährstoffen in Gewebe werden Vaskularisierungsstrategien, wie die Angiogenese in neu gebildetem Gewebe, für den Erfolg von manipulierten Geweben entscheidend sein.

Genetische Schaltkreise wurden auch verwendet, um Stammzellen mit Entscheidungsfähigkeiten zu programmieren, die es ihnen ermöglichen, eine effiziente Anzahl von Beta-(β)-Zellen zu produzieren. β-Zellen sind die in der Bauchspeicheldrüse vorkommenden Zellen, die als Reaktion auf Glukose im Blut in dosisabhängiger Weise Insulin synthetisieren und sezernieren. Typ-1-Diabetes ist eine chronische Erkrankung, bei der die Bauchspeicheldrüse wenig bis kein Insulin produziert, und es wird angenommen, dass die Hauptursache für Typ-1-Diabetes eine Autoimmunzerstörung der β-Zellen ist. Die daraus resultierende Zerstörung dieser Zellen verringert die Fähigkeit des Körpers, auf den Glukosespiegel zu reagieren, wodurch es fast unmöglich wird, den Glukosespiegel im Blutkreislauf richtig zu regulieren. Um alternative Therapien für Typ-1-Diabetes zu entwickeln, haben sich die Wissenschaftler auf die in vitro-Produktion von β-Zellen aus Pankreas-Vorläufer-Stammzellen durch Überexpression der drei Master-Regulator-Transkriptionsfaktoren Pdx1, Ngn3 und Mafa konzentriert. Dieser Ansatz führt zur Differenzierung von Pankreas-Vorläufer-Stammzellen in reife insulinproduzierende β-Zellen [76, 84]. Vor kurzem wurde ein genetischer Schaltkreis gebaut, der als Bandpassfilter fungiert, um die Expression der drei Master-Regulator-Transkriptionsfaktoren dynamisch zu kontrollieren [85]. Dieser genetische Schaltkreis ermöglichte die rechtzeitige Koordination der drei Transkriptionsfaktoren, was eine homogene Zellpopulation hervorbrachte, die eine robuste Insulinproduktion gegenüber Zellen zeigte, die mit traditionellen Wachstumsfaktor- und chemischen Techniken hergestellt wurden. Diese Studie unterstreicht die Notwendigkeit der zeitlichen Regulierung der Genexpression bei Entscheidungen über das Zellschicksal.

Zusätzlich zur Kontrolle, wann Schlüsseltranskriptionsfaktoren während der Differenzierung aktiviert werden, hat eine kürzlich durchgeführte Studie gezeigt, dass einige Zellschicksalswege die Expression von Schlüsseltranskriptionsfaktoren pulsieren erfordern [72]. In dieser Studie initiierte die pulsierende Expression von Gata6 in humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS) die Bildung aller drei Keimblätter, was zu einem komplexen dreidimensionalen (3D) mehrzelligen Gewebekonstrukt oder Organoid führte, das eine Leberknospe aufwies. wie Phänotyp. Ohne Pulsierung bildete sich nur eine Keimschicht. Genetische Schaltkreise ermöglichen eine fein abgestimmte Kontrolle über die Expression von Transkriptionsfaktoren, was darauf hindeutet, dass die möglichen Genexpressionsmuster, die mit genetischen Schaltkreisen implementiert werden können, praktisch grenzenlos sind. Muster wie Pulsieren, Stimmen, Oszillationen liegen alle im Bereich der Möglichkeiten. Daher bieten genetische Schaltkreise eine außergewöhnlich präzise Kontrolle über die Genexpression und das Zellschicksal, die ihre Anwendbarkeit in der Grundlagenforschung und der klinischen Forschung wahrscheinlich verändern werden.

Replikation physiologischer Funktionen in alternativen Zelltypen

Die genaue Kontrolle über die Intensität, Dauer und das Timing der Genexpression haben unsere Fähigkeit verbessert, das Schicksal von Stammzellen in gewünschte Linien zu lenken, zusätzlich zur Entwicklung von Organoiden. Mit den gleichen genetischen Werkzeugen haben synthetische Biologen auch therapeutische Zellen geschaffen, die in der Lage sind, verschiedene Signale auf therapeutische Weise wahrzunehmen und darauf zu reagieren [43,44,45, 86,87,88,89,90,91,92,93, 94,95,96,97,98,99,100,101,102,103,104]. In zwei getrennten Studien wurden beispielsweise genetische Schaltkreise verwendet, um den Blutzuckerspiegel von diabetischen Mäusen zu regulieren. In der ersten Studie wurde die Expression und Sekretion des Glucagon-like Peptids 1 (GLP-1), ein Peptid, das die Fähigkeit besitzt, den Blutzuckerspiegel im Blut zu senken, indem es die Insulinsekretion erhöht [105], beim Menschen kontrolliert embryonale Niere (HEK) 293-Zellen unter Verwendung eines optogenetisch kontrollierten genetischen Schaltkreises [106]. Dieser genetische Schaltkreis ermöglichte es den implantierten Zellen, blaues Licht zu erkennen und als Reaktion darauf die Transkription von GLP-1 zu initiieren, wodurch der Blutzuckerspiegel bei diabetischen Mäusen sinkt. In der zweiten Studie wurden Ovarialzellen des Chinesischen Hamsters (CHO) mit einem genetischen Schaltkreis konstruiert, der Insulin als Reaktion auf sinkende pH-Werte produzierte. Diese Studie zeigte eine kontrollierte Produktion von Insulin, wenn der pH-Wert der Umgebung unter den physiologischen Bereich fiel [41]. Als diese manipulierten Zellen in diabetische Mäuse implantiert wurden, konnten sie den Insulin- und Glukosespiegel auf das gleiche Niveau wie bei gesunden Mäusen wiederherstellen.

Neben der Entwicklung therapeutischer Zellen für Stoffwechselstörungen zeigte eine kürzlich durchgeführte Studie die Verwendung eines genetischen Schaltkreises, um HEK293-Zellen die Fähigkeit zu verleihen, eine Entzündungsreaktion zu kontrollieren [107]. Dieser Kreislauf bestand aus drei Grundmodulen, um Entzündungssignale zu erkennen und darauf zu reagieren: einem Sensor zum Erfassen von Entzündungssignalen, einem Verstärker mit positiver Rückkopplung, um die Nachhaltigkeit der Reaktion sicherzustellen, und einem Effektor, der die Entzündungsreaktion neutralisiert. Therapeutische Zellen, die mit der Fähigkeit ausgestattet sind, die Entzündungsreaktion des Körpers in Schach zu halten, sind ein aufregender Fortschritt auf diesem Gebiet, da diese Arten von Zellen nach einer Operation implantiert werden können, um zu verhindern, dass eine längere Entzündungsreaktion die Heilung behindert und die Wiederherstellung ermöglicht. eines gesunden Niveaus an entzündlichen Zytokinen.

Zukünftige Richtungen

Synthetische Biologen von Säugetieren haben große Fortschritte bei der Entwicklung neuartiger genetischer Werkzeuge gemacht, um die Genexpression in verschiedenen Zelltypen streng zu regulieren. Diese genetischen Werkzeuge wurden verwendet, um die Stammzelldifferenzierung zu steuern, um gewünschte Zelllinien zu erzeugen, um Organoide herzustellen und um therapeutische Zellen so zu entwickeln, dass sie Krankheiten erkennen und darauf reagieren. Angesichts dieser Errungenschaften liegt es nahe, dass synthetische Biologen implantierbare Minigewebe oder Organoide entwickeln können, die entwickelt wurden, um Krankheiten zu erkennen und darauf zu reagieren.

Können wir implantierbares Fettgewebe (Fett) mit der Fähigkeit, den Blutzuckerspiegel zu regulieren, anstatt zu versuchen, eine versagende Bauchspeicheldrüse für Diabetiker wiederherzustellen? Studien haben gezeigt, dass das Eigenfett eines Patienten entnommen und in die Gelenke des Patienten zurück injiziert werden kann, um Gelenkschmerzen zu lindern [108]. Tatsächlich sind Lipogeme ein von der FDA zugelassenes System, bei dem kleine Stückchen Fett entfernt, gewaschen und in verschiedene Gelenke reinjiziert werden, für diejenigen, die an Wirbelsäulenerkrankungen, Gelenkschmerzen, Arthritis oder Rotorschnittrissen leiden [109,110,111,112]. Man kann damit beginnen, personalisiertes synthetisches Fettgewebe abzubilden, indem man zunächst iPS-Zellen aus den Hautzellen eines Patienten herstellt und sie mit verschiedenen genetischen Schaltkreisen programmiert: einen, um die Differenzierung in Fettzellen voranzutreiben, und einen anderen mit einem Programm zur Regulierung des Blutzuckerspiegels ( Abb. 2). Diese kleinen synthetischen Gewebe können dann unter die Achselhöhle oder an andere unbemerkte Stellen injiziert werden, um den Blutzuckerspiegel über lange Zeiträume zu regulieren. Sobald man die Idee von injizierbarem synthetischem Fettgewebe akzeptiert, kann man sich natürlich leicht vorstellen, andere synthetische Organe (z.

Entwicklung synthetischer Gewebe für den Einsatz personalisierter Medizin. Die Entwicklung von synthetischem Fettgewebe zur Regulierung des Blutzuckerspiegels bei Diabetikern wird wahrscheinlich in naher Zukunft Realität werden. Bei dieser hypothetischen Therapie werden Fettzellen mit genetischen Schaltkreisen programmiert, die in der Lage sind, Glukosespiegel zu erfassen, und wenn vorprogrammierte physiologisch hohe Glukosespiegel erfasst werden, reagieren sie mit der Ausschüttung einer streng regulierten Menge an Insulin. Diese kleinen synthetischen Gewebe können an unauffälligen Stellen (z.B. in der Achselhöhle) unter die Haut implantiert werden, um den Blutzuckerspiegel über längere Zeit zu regulieren

Organoide sind ein weiterer Bereich, in dem synthetische Biologen einen signifikanten Einfluss haben können. Im Gegensatz zu gereinigtem Gewebe, wie Fettgewebe, sind Organoide miniaturisierte Versionen eines Organs, die aus Organvorläuferzellen oder pluripotenten Stammzellen isoliert und zu einer organähnlichen Struktur differenziert werden können. Diese Organoide haben mehrere Zelltypen, die sich selbst organisieren, um eine Struktur ähnlich einem in vivo gefundenen Organ zu bilden [113]. Da in Organoiden mehrere Zelltypen vorkommen, bietet dies Möglichkeiten, komplexere Interaktionen (z. B. synthetische Musterbildung, räumliche und zeitliche Kommunikation zwischen Zelltypen usw.) . Zum Beispiel kann ein synthetisches Organoid mit genetischen Schaltkreisen konstruiert werden, die gesunde Wege nachahmen können, um zugrunde liegende Krankheitszustände zu verändern und sie neu zu verdrahten, um den gesunden Zustand wiederherzustellen [114].


Sprecher-Bio

Chris Voigt

Chris Voigt erwarb seinen Bachelor in Chemieingenieurwesen an der University of Michigan und promovierte in Biochemie und Biophysik am California Institute of Technology. Wir waren Postdoktoranden an der University of California, Berkeley und wechselten später an die Fakultät der University of California, San Francisco. 2011 wechselte er in die Abteilung… Weiterlesen


Abstrakt

Mehrfache Eingangsänderungen können zu ungewollten Schaltschwankungen führen, oder Glitches, in der Ausgabe von genetischen kombinatorischen Schaltkreisen. Diese Störungen können drastische Auswirkungen haben, wenn die Ausgabe des Schaltkreises irreversible Veränderungen innerhalb oder mit anderen Zellen verursacht, wie zum Beispiel eine Reaktionskaskade, Apoptose oder die Freisetzung eines Pharmazeutikums in einem Gewebe außerhalb des Zielgewebes. Daher kann es für den sicheren Betrieb einer genetischen Schaltung von entscheidender Bedeutung sein, unerwünschte Schwankungen des Ausgangs einer Schaltung zu vermeiden. In diesem Beitrag wird untersucht, was unerwünschte Schaltvariationen in kombinatorischen genetischen Schaltkreisen mit Hilfe von Gefahrenanalysen und einem neuen dynamischen Modellgenerator verursacht. Die Analyse erfolgt in zuvor gebauten und modellierten genetischen Schaltkreisen mit bekanntem Störverhalten. Die erzeugten dynamischen Modelle sagen nicht nur die gleichen stationären Zustände wie frühere Modelle vorher, sondern können auch die experimentell beobachteten unerwünschten Schaltvariationen vorhersagen. Mehrfache Eingangsänderungen können aufgrund von Ausbreitungsverzögerungen innerhalb der Schaltung Störimpulse verursachen. Das Ändern des Schaltungslayouts, um diese Verzögerungen zu ändern, kann die Wahrscheinlichkeit bestimmter Störimpulse ändern, aber die Möglichkeit, dass der Störimpuls auftritt, kann nicht ausgeschlossen werden. Mit anderen Worten, Funktionsgefährdungen können nicht beseitigt werden. Stattdessen müssen sie vermieden werden, indem die zulässigen Eingabeänderungen in das System eingeschränkt werden. Logische Gefährdungen hingegen können durch die gefahrlose Logiksynthese vermieden werden. Dieses Papier demonstriert dies, indem es zeigt, wie eine Schaltung, die mit einem beliebten Automatisierungstool für genetisches Design entworfen wurde, umgestaltet werden kann, um logische Gefahren zu eliminieren.


Forscher enthüllen neue Erkenntnisse über synthetische Genschaltkreise

Die Forschung von Tian und Wang liefert neue Erkenntnisse über die komplexen Beziehungen zwischen synthetischen Genschaltkreisen und den Zellen, die sie beherbergen. Bildnachweis: Xiaojun Tian/ASU

Jüngste Entdeckungen von zwei Forschungsteams der Ira A. Fulton Schools of Engineering der Arizona State University bringen das Gebiet der synthetischen Biologie voran.

Assistant Professor Xiaojun Tian und Associate Professor Xiao Wang führten eine einjährige Zusammenarbeit mit ihren Laborgruppen an der School of Biological and Health Systems Engineering, einer der sechs Fulton Schools, durch. Ergebnisse ihrer neuartigen Erforschung der Art und Weise, wie manipulierte Genschaltkreise mit biologischen Wirtszellen interagieren, wurden diese Woche in der wissenschaftlichen Zeitschrift veröffentlicht Natur Chemische Biologie.

Die Synthetische Biologie wendet technische Methoden an, um neue biologische Netzwerke zu entwerfen oder Aspekte bestehender biologischer Systeme umzugestalten. Es ist ein sich schnell entwickelndes Studiengebiet, und in den letzten 20 Jahren wurden viele bedeutende Fortschritte erzielt.

Frühe Arbeiten umfassten die Erstellung synthetischer Genschaltkreise und deren Platzierung in natürlichen Wirtszellen.

"Aber das Konzept einer Schaltung ist hier abstrakt", sagt Wang. "Imagine a sequence of genetic segments in which the first one encodes or produces a particular protein. That protein, in turn, can either activate or inhibit the expression or protein production from another segment in the genetic sequence. If you keep expanding this idea, you can imagine it's like a network."

It is this chain of influence or inducement that is functioning as a circuit, rather than the physical connections within the genetic sequence. However, previous research has focused on just the behaviors of engineered genetic circuits themselves, with little attention to the background or context represented by host cells.

"It is hard to predict how these interactions affect the functions of the engineered genetic circuits," Tian says, "not to mention how to control them and make the circuits operate as desired within complicated, real-life environments."

Indeed, these synthetic gene circuits generally work only in a laboratory environment, not in more lifelike conditions. And this limitation greatly inhibits the application of engineered gene circuits in clinical settings.

Seeking to advance the field in that practical direction, the new research by Tian and Wang explored the relationship between the synthetic gene circuits and their host cells. Specifically, they examined the impact of "memory" circuits implanted within host cells, and the influence of gene circuit "topologies," or the architecture of interconnections among circuit components, in relation to host cell growth.

In the context of this work, the idea of memory relates to the continuation of influence or inducement within an engineered gene circuit even with the absence of a stimulus.

"Think about a light switch in your house," Wang says. "The light stays on even when you remove your finger from the switch. We refer to that persistent state as memory."

Tian and Wang's new research revealed that memory circuit topologies are significantly influenced by host cell behavior.

"We verified that influences are exchanged between the gene circuit and the host cell," Tian says. "That is, the circuit impacts the host cell, which in return has an impact on the circuit. It's like a loop.

"But we also demonstrated that the impact on a circuit's functionality is dependent on its topology," he says. "So, one circuit topology shows better performance than others within a dynamic host environment."

Their discovery relating circuit topology to a host cell's impact on circuit function is a first in the field of synthetic biology, and it expands meaningful scientific understanding of these complex interactions.

"It paves the way for building robust, engineered gene circuits," Tian says. "These could one day enhance interventions against the metastasis of cancer, for example, by slowing the ability of cancer cells to translate their development."

Progressing from the research that Tian and Wang have published includes examining the impact of adding additional synthetic gene circuits or modules into host cells, which substantially elevates the level of complexity as modules compete for resources within the cellular system.

Wang says that the School of Biological and Health Systems Engineering within the Fulton Schools is particularly well-placed for discoveries in synthetic biology.

"We have a critical mass of dedicated people who are strategically invested in advancing this area of research for the long term," he says. "So, we are seeking to be a leader in this field."


Synthetic biology, genetic engineering and you: Two-component signaling pathways as elements in synthetic circuit design

Schematics of native and transplanted two-component signaling pathways. (A) The native pathway consists of a receptor histidine kinase protein, which senses and propagates the signal to a cognate response regulator that regulates gene expression. (B) The envisioned adaptation to the mammalian host. Subscript “hum” indicates human-optimized codon sequence. DNAB, DNA binding. Pconst, constitutive mammalian promoter. P, phosphate Pmin, minimal mammalian promoter VP16, VP16 transactivator domain. Credit: Hansen J et al. (2014) Transplantation of prokaryotic two-component signaling pathways into mammalian cells. Proc Natl Acad Sci USA 111 (44):15705-15710.

(Phys.org) —Two of the most exciting areas of science and technology, synthetic biology and genetic engineering, have just taken a step towards a brave new future in which large-scale synthetic biological circuits composed of bioengineered logic gates, orthogonal to (that is, independent of) the host in which they operate, will enable a range of applications that include biosensors, gene expression control, cell motility, programmable gene circuits for cell physiology control, and other sophisticated gene circuits. This capability is based on the use of two-component regulatory system – basic stimulus-response coupling mechanisms that allow organisms to sense and respond to changes in many different environmental conditions. These systems consist of a membrane-bound histidine kinase that senses a specific environmental stimulus and a corresponding response regulator that mediates the cellular response, primarily through differential expression of target genes. ((A histidine kinase, or HK, is a multifunctional, typically transmembrane, protein involved in signal transduction across the cellular membrane a response regulator, or RR, protein is the second component in two-component signal transduction systems.)

A particularly promising type of two-component regulatory system – two-component signaling pathways – are the prevalent signal processing modality in prokaryotes and are also found in low eukaryotes and plants, but absent from vertebrate cells. Recently, scientists in the Department of Biosystems Science and Engineering at Eidgenössische Technische Hochschule Zürich (ETH Zurich, or Swiss Federal Institute of Technology Zurich), Basel, Switzerland transplanted two-component pathways into a mammalian host, demonstrating that these pathways could be partially reconstituted in mammalian cell culture and used for programmable control of gene expression. They found that the core biochemical processes are maintained, and while the capacity to sense chemical ligands is diminished or obscured and the preservation of basic biochemical processes during mammalian pathway transplantation is not guaranteed, they were able to use the pathways for multi-input gene regulation and show that they can be used as building blocks for gene expression control in mammalian cells, thereby creating new investigative possibilities in synthetic circuit design.

Prof. Dr. Yaakov (Kobi) Benenson discussed the paper that he, graduate student Jonathan Hansen and their co-authors published in Proceedings of the National Academy of Sciences. "The key step was to think about this possibility," Benenson tells Phys.org. "The idea occurred to me in the year 2007, when I was a Bauer Fellow at the Harvard FAS Center for Systems Biology. Michael Laub 1,2 , at the time also a Bauer fellow, worked on two-component signaling pathways in prokaryotes. I was exposed to this area through his research, and discussed with him the possibility of implementing these pathways in human cells." It was several years before Benenson and his group members started the project in their new lab at ETH Zurich. "The practical challenge to investigating whether the elements of prokaryotic two-component pathways are operational in mammalian cells was to first read a large volume of papers to identify the candidate pathways for trans-kingdom transplantation, and then to redesign them such that operation in mammalian cells was possible." The scientists built on their experience with mammalian gene circuit design to make a few informed decisions that turned out to be correct.

Benenson lists several other challenges the researchers faced, the first being using the pathways for multi-input gene regulation and showing that they can serve as a rich source of orthogonal building blocks for gene expression control in mammalian cells. The two challenges here, he notes, was to ensure that there was no crosstalk between the transplanted components, and that the observed prokaryote behavior is recapitulated in mammalian cells. Secondly, he continues, was implementing two-input logical AND-like gene regulation in mammalian cells. "Here in particular," Benenson says, "the challenge was the pathway's high sensitivity to low expression levels of the histidine kinase receptor. This made it difficult to achieve a low aus state."

The third issue Benenson describes was based on implementing the three conditions – preserving pathway internal operations, pathway components being orthogonal to the host, and host to pathway components – needed to preserve basic biochemical processes during mammalian transplantation. "Given the vast differences in just about any aspect of biological processes between the two hosts, there was no guarantee that the processes occurring in bacteria would take place in mammalian cells," Benenson explains.

Logic with TCS. (A) NOR-gate circuit schematics comprising antibiotic-regulated HK and RR genes. (B) Quantitative data for antibiotic-regulated NarXL pathway. (C) Quantitative data for antibiotic-regulated DcuSR pathway. PI and ET are at 10 μg/mL and 4 μg/mL, respectively. Plasmid composition and output values are in SI Appendix, Tables S13 and S14. (D) (Top) Schematic representation of an OR gate between NarX and NarQ. (Bottom) Quantitative data and representative images. Plasmid composition and output values are in SI Appendix, Tables S15 and S16. In all panels the images are shown with red pseudocolor indicating DsRed Transfection marker, and cyan pseudocolor indicating AmCyan output. The resultant data are presented as mean ± SD of biological triplicates. Credit: Hansen J et al. (2014) Transplantation of prokaryotic two-component signaling pathways into mammalian cells. Proc Natl Acad Sci USA 111 (44):15705-15710.

The scientists addressed these challenges though a number of insights and innovations. "One approach was to perform accurate trans-kingdom transplantation by codon optimization and placing the expression of the pathway genes under mammalian promoters," Benenson recounts. (EIN codon is a sequence of three nucleotides that together form a unit of genetic code in a DNA or RNA molecule.) "Another key innovation was the development of the regulated promoter controlled by the phosphorylated response regulators, where we used a novel minimal core promoter sequence developed in our lab as well as experimenting with the number of binding site repeats upstream of this core promoter – and it turned out that having two or more binding sites is essential for strong induction." Benenson adds that research 3,4,5 about synthetic two-component signaling in plants published by the June Medford Lab was valuable resource – especially in clarifying the role of nuclear localization signals. (A nuclear localization signal, or NLS, is an amino acid sequence that tags a protein for import into the cell nucleus by nuclear transport.)

Benenson discussed several key aspects of the study detailed in their paper, the first being the finding that in mammalian cells, core prokaryotic two-component biochemical processes are maintained but the capacity to sense chemical ligands is diminished or obscured. "We observed constitutive strong signaling via the pathway once both the histidine kinase and the response regulator components were constitutively expressed," he explains. "In prokaryotes, signaling is typically induced upon external stimulation." This led the scientists to speculate that there are multiple cytoplasmic and environmental components in mammalian cells and their growth medium that might stimulate the HK receptors. "More research is needed to understand this phenomenon in full," Benenson adds.

A fascinating aspect of two-component signaling is the support for complex logic signal integration in mammalian cells. "The two-component system naturally lends itself to performing two-input logic, because the expression of both histidine kinase and response regulator genes is required for downstream gene activation. While the natural way to control the pathway is via appropriate ligand or stimulus, another way to utilize this feature is by controlling the expression of these genes via gene regulatory tools, for example transcriptional regulation. In addition, having multiple pathways operating in parallel allows scaling of this approach to larger logic cascades.

In their paper, the scientists tie the two preceding points together by discussing the ability of two-component signaling to implement AND, NOR, and OR gates using constitutive and inducible histidine kinases and response regulators. "The core requirement of two-components naturally lends itself to an AND-like logic behavior," Benenson notes. "By appropriate wiring of upstream gene regulation, the gate can be converted into the NOR gate OR gates are possible with pathways of known cross-reactivity – for example, when two different histidine kinase receptors activate the same response regulator."

Activity of mutant TCS components. Full-length, truncated, and mutant TCS genes are shown with each protein domain color-coded and labeled. Experimental data are given below. Each bar represents mean ± SD of a biological triplicate. The output values for NarX + NarL and NarL are from Fig. 3B they are displayed again for side-by-side comparison. Plasmid composition and output values are in SI Appendix, Tables S17 and S18. TM, transmembrane domain. Credit: Hansen J et al. (2014) Transplantation of prokaryotic two-component signaling pathways into mammalian cells. Proc Natl Acad Sci USA 111 (44):15705-15710.

The researchers also state in their paper that their findings open new avenues in synthetic circuit design, citing the example of using histidine kinases as biosensors for cytoplasmic metabolites wenn cytoplasmic metabolites or media components can be responsible for histidine kinase activation. Benenson expands on this and gives additional examples of novel synthetic biology and genetic engineering technologies and applications that may be possible due to their results. "Apart from potential use as biosensors, new avenues arise due to the fact that these pathways enable AND, OR and NOR logic," he tells Phys.org. "Due to the multiple existing pathways that exhibit minimal cross-talk, large logic circuits can be envisaged via cascading of multiple pathways." Specifically, he points out that while building AND gates in mammalian cells is difficult, they are very useful because they produce an output when multiple conditions hold simultaneously – so having the building blocks of two-component pathways will facilitate the construction of such gates for precise actuation in mammalian cells. "In addition, we showed that certain response regulator mutants can act as efficient constitutive activators, meaning that the plethora of response regulators can therefore generate large sets of orthogonal transcriptional activators for gene circuits of increasing sophistication."

When asked if a longer-term implication of their study might be that an ability to implement robust logic circuits in mammalian cells could lead to a novel translational approach to medical protocols, Benenson replied, "I think that this novel methodology will mesh with existing synthetic biology tools to enable better, more robust, and more programmable gene circuits for rational control of cell physiology, including the control of cell fate or the detection of pathological cell states. Being a signaling cascade, transplanted two-component pathways might improve the speed of information processing in these circuits and enable new ways to sense metabolites." That said, he points that metabolite sensing will have to be experimentally demonstrated.

As to the planned next steps in their research, the scientists plan to investigate the sensory function of HKs, which Benenson says was obscured in their experiments to date. "We also plan to test how building blocks derived from the two-component pathways can lead to the construction of large synthetic circuits," he adds. "In the long run, it would be intriguing to see if more complex pathways based on two-component systems, such as chemotaxis, can be similarly transplanted and perhaps coupled with cell motility machinery." (Chemotaxis is movement of somatic cells, bacteria, and other single-cell or multicellular organisms in response to a chemical stimulus.)

Regarding other areas of research that might benefit from their study, Benenson tells Phys.org that their discovery that key steps of two-component signaling are functional in human cells "can enable a clean cell-based model system for researchers who investigate these pathways. Usually," he adds, "such studies involved labor-intensive purification of protein components, because it is difficult to study these pathways in isolation in bacteria where tens of pathways coexist. We showed that the components can be expressed in human cells, and cross-talk as well as mutant behavior mirrors those found in prokaryotes. We also found one instance of previously-unreported crosstalk, and we suspect that it might also manifest itself in prokaryotes. This," he concludes, "would be an interesting area to pursue."

1 Two-component signal transduction pathways regulating growth and cell cycle progression in a bacterium: a system-level analysis, PLoS Biologie (2005) 3(10):e334, doi:10.1371/journal.pbio.0030334

2 Specificity in Two-Component Signal Transduction Pathways, Annual Review of Genetics (2007) Vol. 41, pp 121–145, doi:10.1146/annurev.genet.41.042007.170548

3 Developing a Synthetic Signal Transduction System in Plants, Methods in Enzymology, Academic Press, 2011, Volume 497, Synthetic Biology, Part A, Chapter 25, Pages 581-602

4 Programmable Ligand Detection System in Plants through a Synthetic Signal Transduction Pathway, PLoSOne 6 (2011) e16292, doi:10.1371/journal.pone.0016292

5 Engineering Key Components in a Synthetic Eukaryotic Signal Transduction Pathway, Molekulare Systembiologie (2009) 5:270, doi:10.1038/msb.2009.28


Synthetic Biology Comes into Its Own

Richard A. Muscat
Jun 1, 2016

© ISTOCK.COM/FATIDO/FEORIS

E very two hours in Matthew Bennett&rsquos Rice University lab, cyan and yellow lights flashed in synchronization. Bennett and his team had engineered 12 components to generate the coordinated oscillations. This circuit wasn&rsquot electronic, however it was biological. Two populations of E coli, each carrying a synthetic gene circuit, cycled in synchronous pulses every 14 hours.
Bennett&rsquos work, published last year in Wissenschaft, 1 is a key application of modern synthetic biology: taking biological components and linking them together to form novel functional circuits. Instead of a program coded in Java and executed by a computer&rsquos working memory, commands were written in DNA and carried out by the microbes&rsquo cellular machinery. LEDs were replaced with fluorescent proteins, and molecular signaling cascades served as the system&rsquos wires.

Stripped back to its most basic components, a synthetic or natural biological network consists of a gene that either.

The first synthetic networks were created in 2000, when researchers built an oscillator and others constructed a bistable switch in E coli. In an oscillator circuit, three genes form a cascade, in which each gene triggers the inactivation of the next gene. In the case of the landmark oscillator constructed by Rockefeller University’s Stanislas Leibler, then at Princeton, and his graduate student Michael Elowitz, one of the three repressor genes was also linked to green fluorescent protein (GFP), resulting in visible pulses of light. 2 A bistable switch, on the other hand, consists of just two genes that inactivate each other. When one gene is on, the other is off. Due to variation in the expression of the active gene, the inactive gene occasionally gets the chance to switch on and suppress the expression of the first gene. Like Leibler and Elowitz, MIT bioengineer James Collins and his grad student Tim Gardner, then at Boston University, linked one of the genes with a sequence encoding GFP, and they were able to see the cells switch between states. 3 (See “Tinkering With Life,” Der Wissenschaftler, October 2011.)

Since these early studies, engineers, computer scientists, mathematicians, and physicists have been applying their expertise to engineer synthetic gene networks. In addition to supporting the creation of novel functions, synthetic networks can also give insight into how naturally occurring ones work. As physicist Richard Feynman once wrote on his office blackboard, “What I cannot create, I do not understand.” Studying gene circuits in their natural context is complicated by the complex cellular environment in which they function reconstructing and tuning gene interactions in vitro can provide a simplified model for how equivalent networks behave in nature. (See illustration below.)

“Naturally occurring gene oscillators, especially the circadian oscillator that regulates our daily rhythms, are hard to study,” says Bennett. “We can easily make changes and fine-tune synthetic gene circuits in ways that are difficult in natural systems. Though our synthetic circuits are inherently different from their natural counterparts, we can use them to study some of the basic principles of how genes dynamically regulate each other.”

Stripped back to its most basic com­ponents, a synthetic or natural biologi­cal network consists of a gene that either switches another gene on or turns it off.

Researchers at the J. Craig Venter Institute (JCVI) in San Diego have even gone so far as to create the smallest functional genome to date, a mycoplasma bacterium consisting of just 473 genes. 4 This stripped-down cell can now provide insights into what each of the genes and their respective proteins are doing to keep the organism alive.

Building man-made circuits can also lead to something entirely new, Bennett adds. “I try to find ways to engineer a new synthetic circuit that can mimic the unexplained phenomenon, even if my solution is not the same as nature’s. Sometimes this leads to new insights into the natural circuit and sometimes not. Either way it’s exciting.”

Genetic networking

In the early 2000s, Uri Alon of the Weizmann Institute of Science in Israel and colleagues studied the connections between genes in E coli, discovering common motifs, or patterns of gene connectivity. Importantly, the researchers found that these motifs occurred more often than could be expected if you took the same number of genes and randomly connected them, suggesting that biological networks have evolved these patterns. 5 After early studies demonstrated researchers’ ability to create novel gene circuits, many synthetic biologists began making synthetic replicas of these natural motifs.

DECIPHERING THE NETWORK: A naturally occurring gene network consists of many interacting genes that can activate or repress each other (top). But embedded within a larger network, their function can be hard to study. Synthetic biology can simplify the study of such gene interactions by engineering analogous circuits separate from the larger network (bottom).
See full infographic: WEB COURTESY OF RICHARD MUSCAT

By isolating a subset of genes and inserting them into a new cell, synthetic biologists can assemble a motif that has little interaction with the molecular machinery of that cell the genes are considered orthogonal. For example, viral promoters—sequences of DNA that drive gene expression—can be used to express GFP, a gene taken from jellyfish, inside mammalian cells. Modifications to promoters can allow them to be controlled by signaling molecules, not only allowing novel genes to be expressed, but giving synthetic biologists the ability to switch them on and off.

One of the simplest signaling motifs involves a gene that either activates or represses selbst. Positive autoregulation is when a protein triggers its own expression. At first, due to the absence or very low concentration of protein, its expression is very low. After a while, however, an intermediate level of the protein builds up, speeding up the rise in expression levels. The overall effect of positive autoregulation is thus a delay before the gene reaches normal expression rates. 6 Conversely, negative regulation, when a gene inhibits its own expression, allows the fast activation of a gene upon exposure to a signaling molecule, but then slows its own production once it reaches a critical level, allowing it to rapidly reach a steady state. 7 (See illustration below.)

Another common motif includes the interaction of several genes forming feed-forward loops, in which one gene activates or represses the expression of another only under certain conditions. Synthetic implementation of one particular feed-forward loop has been shown to produce a pulse of gene activation—a large peak of gene expression followed by steady state expression. 8

Autoregulation and feed-forward loops highlight how synthetic biology can create direct replicas of naturally occurring circuits to understand their function. However, synthetic biologists also have engineered a number of novel behaviors in cells: for example, different types of computation. One of the choices a synthetic biologist might make when constructing a synthetic circuit is whether to make it digital (i.e., on/off) or analog (varying levels of output). Researchers have constructed digital circuits implementing Boolean computations such as AND/OR and NOT/NOR logic with up to 10 regulators and 55 component parts in E coli. 9 Of course, many genes are not expressed in a digital manner neither completely on nor completely off, they are, rather, expressed dynamically over a range of levels. As a result, synthetic biologists are increasingly taking inspiration from nature and designing computational circuits in analog, implementing functions such as addition, subtraction, and division. 10

More than 15 years of constructing such biological gene networks has made waves in a wide variety of scientific fields. For example, Mary Dunlop of the University of Vermont is taking advantage of feedback circuits in the design of biofuel-producing bacteria. Her group has modified E coli to express biofuels such as alcohols, diesels, or jet fuels that are exported from the cell by efflux pumps. Too much biofuel accumulating in a cell is toxic, and expression of too many efflux pumps places a strain on the cell. Either of these problems can prevent cell growth and the production of more biofuel. Through mathematical simulation, Dunlop has demonstrated that a negative-feedback sensor could control the balance by delaying pump expression until it is needed, when there is enough biofuel inside the cell to necessitate pumping it out. 11

DYNAMIC GENE EXPRESSION: A number of motifs that appear in naturally occurring networks have been reconstructed in synthetic circuits. Positive autoregulation (left) occurs when a gene is activated by its own product this results in delayed activation. (The black dotted line provides a comparison to gene activation with no autoregulation.) Conversely, negative autoregulation occurs when a gene represses its own expression (middle), allowing its rapid activation until it reaches a steady state, and then preventing overexpression. Finally, a combination of several genes can form a motif known as a feed-forward loop (right). Depending on the way the genes are connected, activating a single gene triggers the simultaneous activation and repression of another gene, causing a pulse in expression followed by a lower steady state.
See full infographic: WEB COURTESY OF RICHARD MUSCAT

Synthetic circuits are also showing potential as valuable tools for diagnosing and treating disease. In one study, researchers created synthetic circuits designed to detect combinations of microRNAs associated with a particular case of cervical cancer, and inserted the circuits into cancer and noncancer cell lines. Using a combination of AND and OR logic allowed the detection of specific combinations of different microRNA species only present in HeLa cells. If the right microRNA combination was detected, the synthetic circuit expressed a gene that caused the cells to die. 12

While many technical challenges stand in the way of applying synthetic biology techniques in treating patients, a more near-term application may come in the form of paper-based diagnostics. In 2014, Collins and his colleagues at Harvard and Boston Universities developed synthetic gene circuits that function outside of cells and can be embedded in paper, which changes color through the expression of fluorescent proteins if certain markers are present in the sample. In this proof-of-concept study, the researchers showed that such paper-based diagnostics could be designed for a diverse range of applications, from glucose detection to the identification of different strains of Ebola virus, with outputs that can be seen by eye or a cheap microscope. 13 This year, the team updated the test to detect 24 RNA sequences found in the Zika genome when a target RNA is present, a series of interactions turns the paper purple. 14 Paper-based diagnostics are easy to store through freeze-drying and to move to low-resource settings out of the lab, and researchers are now working to design such diagnostics for use in the field.

Working in tandem

BACTERIAL MOSAIC: Two populations of E. coli fluoresce yellow and cyan in unison as they activate or repress the other’s expression as well as their own. (See illustration below.) SCIENCE, 349:986-89, 2015, COURTESY OF MATTHEW BENNETT The examples described so far have been of genetic circuits operating in isolation inside many identical cells or outside cells altogether. In nature, however, cells don’t exist in a vacuum rather, small signaling molecules that can be easily transmitted across cell membranes allow cells to communicate with their neighbors.

In the case of the oscillator created in 2000, each individual cell in a population of bacteria would act in isolation, with one cell oscillating out of phase from its neighbors. Ten years later, University of California, San Diego’s Jeff Hasty and his colleagues used small signaling molecules that could pass out of one cell and into another to regulate the gene network within that cell. As a result, the oscillations of entire populations of bacteria were linked together and cycled in unison. fünfzehn

Bennett’s group at Rice University took this idea one step further when they made use of two interacting populations of E coli carrying different genetic circuits to coordinate the long-term, stable oscillations of fluorescent protein expression. One population of bacteria acted as an activator strain while the other population acted as a repressor strain. The activator strain produced a signaling molecule that activated even more of its own signal production, triggering activation of the repressor strain. When activated, the repressor strain produced another signaling molecule that repressed both itself and the activator strain. Each strain also produced an enzyme that degraded the signaling molecules in the system, preventing the buildup of leftover signal.

“We took the circuitry of a single strain oscillator and reconfigured it so that two strains must work together to achieve the oscillations,” Bennett explains. “It’s similar to taking a book and giving the even pages to one person and the odd pages to another. To either individual, their portion of the book is useless. But if the two can communicate and work together, the book will make sense.”

COORDINATED OSCILLATIONS: Two populations of bacteria interact via signaling molecules to coordinate expression of fluorescent proteins. When using positive and negative autoregulation (top), the oscillations are robust as the two populations grow. The negative feedback loop of the repressor strain and the positive feedback loop of the activator strain thus reinforce oscillations when feedback is removed from the circuit (bottom), oscillations are less coordinated and prone to failure. “You can think of feedback loops as self-correction mechanisms,” says Bennett. “They are constantly assessing the current performance of the circuit and make changes if necessary.”
See full infographic: WEB COURTESY OF RICHARD MUSCAT

As each strain is activated, a fluorescent molecule is produced: cyan in the activator strain and yellow in the repressor strain. When mixed together, both populations are activated and repressed in unison, causing fluorescent oscillations over the entire cell population. When one strain is grown in isolation, no oscillations are observed.

Applying principles of basic gene motifs such as feedback loops with cell population biology can thus expand the repertoire of synthetic biologists looking to create novel genetic circuits. Likewise, implementing synthetic biological circuits in mixed cell populations that have coordinated behavior might illustrate ways in which complex synthetic tissues and organs could be engineered.

The decreasing cost of DNA synthesis and sequencing, the ability to share plasmids, the creation of databases describing genetic components, and the development of novel techniques to easily assemble and edit genomes have greatly accelerated progress in this area. As researchers engineer new genetic components, the relatively new field of synthetic biology could soon begin to bear actionable fruit, with applications that include compound synthesis, diagnostics, and even medical treatments. In addition, the design and study of synthetic systems will continue to give us a deeper understanding of the biology that exists around us.

“I take a great deal of inspiration from nature,” says Bennett. “Sometimes I see a circuit that is well-characterized and wonder if we can build it just as well as nature. Other times, I look at a phenomenon in nature that is unexplained. Then I get really excited.”

Richard A. Muscat works at the London-based Cancer Research UK, bringing together multidisciplinary teams of researchers using engineering and physical sciences to find new ways to tackle cancer.


Cell circuits remember their history: Engineers design new synthetic biology circuits that combine memory and logic

Engineers at MIT have developed genetic circuits in bacterial cells that not only perform logic functions, but also remember the results. Credit: LIANG ZONG AND YAN LIANG

MIT engineers have created genetic circuits in bacterial cells that not only perform logic functions, but also remember the results, which are encoded in the cell's DNA and passed on for dozens of generations.

The circuits, described in the Feb. 10 online edition of Natur Biotechnologie, could be used as long-term environmental sensors, efficient controls for biomanufacturing, or to program stem cells to differentiate into other cell types.

"Almost all of the previous work in synthetic biology that we're aware of has either focused on logic components or on memory modules that just encode memory. We think complex computation will involve combining both logic and memory, and that's why we built this particular framework to do so," says Timothy Lu, an MIT assistant professor of electrical engineering and computer science and biological engineering and senior author of the Nature Biotechnology paper.

Lead author of the paper is MIT postdoc Piro Siuti. Undergraduate John Yazbek is also an author.

Synthetic biologists use interchangeable genetic parts to design circuits that perform a specific function, such as detecting a chemical in the environment. In that type of circuit, the target chemical would generate a specific response, such as production of green fluorescent protein (GFP).

Circuits can also be designed for any type of Boolean logic function, such as AND gates and OR gates. Using those kinds of gates, circuits can detect multiple inputs. In most of the previously engineered cellular logic circuits, the end product is generated only as long as the original stimuli are present: Once they disappear, the circuit shuts off until another stimulus comes along.

Lu and his colleagues set out to design a circuit that would be irreversibly altered by the original stimulus, creating a permanent memory of the event. To do this, they drew on memory circuits that Lu and colleagues designed in 2009. Those circuits depend on enzymes known as recombinases, which can cut out stretches of DNA, flip them, or insert them. Sequential activation of those enzymes allows the circuits to count events happening inside a cell.

Lu designed the new circuits so that the memory function is built into the logic gate itself. With a typical cellular AND gate, the two necessary inputs activate proteins that together turn on expression of an output gene. However, in the new circuits, the inputs stably alter regions of DNA that control GFP production. These regions, known as promoters, recruit the cellular proteins responsible for transcribing the GFP gene into messenger RNA, which then directs protein assembly.

For example, in one circuit described in the paper, two DNA sequences called terminators are interposed between the promoter and the output gene (GFP, in this case). Each of these terminators inhibits the transcription of the output gene and can be flipped by a different recombinase enzyme, making the terminator inactive.

Each of the circuit's two inputs turns on production of one of the recombinase enzymes needed to flip a terminator. In the absence of either input, GFP production is blocked. If both are present, both terminators are flipped, resulting in their inactivation and subsequent production of GFP.

Once the DNA terminator sequences are flipped, they can't return to their original state—the memory of the logic gate activation is permanently stored in the DNA sequence. The sequence also gets passed on for at least 90 generations. Scientists wanting to read the cell's history can either measure its GFP output, which will stay on continuously, or if the cell has died, they can retrieve the memory by sequencing its DNA.

Using this design strategy, the researchers can create all two-input logic gates and implement sequential logic systems. "It's really easy to swap things in and out," says Lu, who is also a member of MIT's Synthetic Biology Center. "If you start off with a standard parts library, you can use a one-step reaction to assemble any kind of function that you want."

Such circuits could also be used to create a type of circuit known as a digital-to-analog converter. This kind of circuit takes digital inputs—for example, the presence or absence of single chemicals—and converts them to an analog output, which can be a range of values, such as continuous levels of gene expression.

For example, if the cell has two circuits, each of which expresses GFP at different levels when they are activated by their specific input, those inputs can produce four different analog output levels. Moreover, by measuring how much GFP is produced, the researchers can figure out which of the inputs were present.

That type of circuit could offer better control over the production of cells that generate biofuels, drugs or other useful compounds. Instead of creating circuits that are always on, or using promoters that need continuous inputs to control their output levels, scientists could transiently program the circuit to produce at a certain level. The cells and their progeny would always remember that level, without needing any more information.

Used as environmental sensors, such circuits could also provide very precise long-term memory. "You could have different digital signals you wanted to sense, and just have one analog output that summarizes everything that was happening inside," Lu says.

This platform could also allow scientists to more accurately control the fate of stem cells as they develop into other cell types. Lu is now working on engineering cells to follow sequential development steps, depending on what kinds of inputs they receive from the environment.

Michael Jewett, an assistant professor of chemical and biological engineering at Northwestern University, says the new design represents a "huge advancement in DNA-encoded memory storage."

"I anticipate that the innovations reported here will help to inspire larger synthetic biology efforts that push the limits of engineered biological systems," says Jewett, who was not involved in the research.


This work was supported by US Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) 1KM and SD2 awards HR0011-15-C-0084 and FA8750-17-C-0229 (C.A.V., A.E.B., and Y.P.), National Science Foundation Award CCF-1807575 (C.A.V.), U Colorado-Boulder/Dept of Energy subaward DE-SC0018368 (C.A.V., J.S.), and a Samsung Scholarship (Y.P.).

YP and CAV conceived the study and designed the experiments YP performed all the experiments JS designed and constructed plasmid-based genetic circuits used in the study YP and TEG developed new terminator prediction pipeline YP and AEB performed the RNA sequencing data analysis and YP, AEB, and CAV wrote the manuscript with input from all the authors.


Schau das Video: Hvordan vaske hendene dine på norsk (Juli 2022).


Bemerkungen:

  1. Lancelin

    verrückt werden !!! Afftaru Zachot!

  2. Kigami

    Es tut mir leid, dass ich mich einmischt, aber meiner Meinung nach ist dieses Thema nicht so tatsächlich.

  3. Yerik

    Bravo, es ist nur ein weiterer Satz :)

  4. Medus

    Darin ist etwas. Now all is clear, I thank for the information.

  5. Willie

    Zugegeben, dies ist eine wundervolle Botschaft



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