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C2: Lipidverteilung in Zellen - Biologie

C2: Lipidverteilung in Zellen - Biologie


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Um die Bewegung von Lipiden in einer tatsächlichen Zelle zu verstehen, ist ein besseres Verständnis der Lipidsynthese und des Transports in Zellen wichtig. et al) während die folgende Abbildung zeigt, wie die Lipide Zusammensetzung von Membranen Organellen Membranen.

Tabelle: Verteilung von Lipiden in ruhenden Makrophagen

Lipid-Kategorien

Kern

Mitochondrien

Endo. Reti.

Plasma-Mitglied

Mikrosom

Zytosol

Ganze Zelle

Glycerophospholipide

149

152

150

151

142

109

155

Prenollipide

5

5

5

5

5

5

5

Sphingolipide

48

47

48

48

48

47

48

Sterollipide

13

12

12

13

11

5

12

Gesamt

215

216

215

217

206

166

220

Abbildung: Ungefähre Verteilung von Phospholipiden in ruhenden Säugetierzellen

Lipide in Membranen sind oft asymmetrisch verteilt. Das innere und äußere Segel einer biologischen Membran haben normalerweise unterschiedliche PL-Zusammensetzungen. In den Membranen der roten Blutkörperchen besteht beispielsweise das äußere Segel hauptsächlich aus Sphingomylein (SM) und PC, während das innere Segel hauptsächlich aus PE und Phosphatidylserin (PS) besteht. Dieses Phospholipid enthält die Aminosäure Serin, die über seine Seitenkette (-CH2OH) an Phosphat in Position 3 von Diacylglycerol gebunden ist. Mit einer negativen Ladung des Phosphats und Carboxylats und einer positiven Ladung des Amins von PS ist dieses Phospholipid sauer mit einer negativen Nettoladung. Alle PS befindet sich in der inneren Broschüre! Diese Beobachtung wird später wichtig, wenn wir über den programmierten Zelltod sprechen. Eine sterbende Zelle wird PS im äußeren Segel freilegen. Dies ist in der Tat einer der Marker einer sterbenden Zelle.

Die Membranlipidzusammensetzung in einer durchschnittlichen Säugerzelle

Lipid%
PC45-55
SPORT15-25
PI10-15
PS5-10
PA1-2
SM5-10
Cardiolipin (bis-PG)2-5
Cholesterin10-20

Intermediate Filament-assoziierte Proteine

Günther A. Rezniczek, . Gerhard Wiche, in Methoden der Enzymologie, 2016

4.7.2.2 Koimmunpräzipitation aus Zellfraktionen

Führen Sie die Zellfraktionierung wie in Abschnitt 4.2.1 beschrieben durch. Verwenden Sie die Zytosol- und Membranfraktionen für die Coimmunpräzipitation. Vor der Zugabe von Primärantikörpern kann ein optionaler Vorklärungsschritt durchgeführt werden. Fügen Sie primäre Antikörper hinzu und inkubieren Sie 3 h bis über Nacht mit End-Over-End-Rotation. Fügen Sie Protein A (oder G) Sepharose hinzu und inkubieren Sie für 3 h bis über Nacht (Inkubationszeiten müssen individuell zwischen Spezifität und Effizienz der Präzipitation abgewogen werden). Entfernen Sie die Beads durch vorsichtiges Zentrifugieren (siehe oben) und waschen Sie 3–4 × mit der jeweiligen Lyselösung (Inhibitoren sind nicht erforderlich).


Hintergrund

Die Fähigkeit zur Produktion von Phosphatidylserin (PtdSer) ist essentiell für das Überleben von Säugetieren [1], während die fehlende PtdSer-Produktion in Hefe zu Wachstumsdefekten und einem Anstieg anderer negativ geladener Lipide als Ausgleichsversuch führt [2, 3]. Darüber hinaus führt eine Überproduktion von PtdSer zur angeborenen Erkrankung Lenz-Majewski-Syndrom, die durch die Kombination von sklerosierender Knochendysplasie, geistiger Behinderung und ausgeprägten kraniofazialen, dentalen, kutanen und distalen Extremitätenanomalien gekennzeichnet ist [4].

PtdSer spielt eine wichtige Rolle bei der Apoptose und der Blutgerinnung, und das meiste, was über PtdSer bekannt ist, trifft auf diese Rollen zu. Bei der Homöostase wird PtdSer jedoch in der Regel nicht von außen exponiert, spielt jedoch in gesunden Zellen eindeutig eine entscheidende Rolle. Die Funktion von PtdSer wird, wie bei allen Lipiden, sowohl durch seine Konzentration als auch durch seine Einseitigkeit in einzelnen Organellenmembranen bestimmt. Mitochondria-assoziierte Membranen (MAMs) des endoplasmatischen Retikulums (ER) weisen eine hohe PtdSer-Syntheserate auf und dienen als Kanal für den Lipidtransfer zwischen dem ER und benachbarten Mitochondrien [5, 6]. Die subzelluläre Verteilung von PtdSer resultiert aus der koordinierten Wirkung von Stoffwechselenzymen in Verbindung mit vesikulären und nichtvesikulären Transportwegen, während die Topologie von PtdSer aus der Wirkung von Transmembranenzymen resultiert, die PtdSer zwischen Lipiddoppelschichten bewegen können PtdSer-Flippasen, -Floppasen und -Scramblases [ 7, 8]. Bis vor relativ kurzer Zeit hingen Studien zur PtdSer-Verteilung und -Topologie ausschließlich von der Fraktionierung und anschließenden chemischen Analyse von Zellorganellen ab. Diese frühen Studien zeigten, dass die Verteilung von PtdSer in der Zelle unausgewogen ist (Abb. 1a), da es in der Plasmamembran (PM) konzentrierter ist (

10–15% Gesamtlipid) mit niedrigeren Spiegeln im ER (

1 %), wobei letzteres PtdSer als Quelle für Phosphatidylethanolamin (PtdEtn) verwendet (Übersicht in [7, 9, 10]). Der PtdSer-Gehalt von weniger häufig vorkommenden Organellen, einschließlich des endosomalen Systems, ist im Allgemeinen aufgrund der Schwierigkeit, sie bis zur Homogenität zu reinigen, weniger gut definiert.

Intrazelluläre Verteilung von PtdSer. ein Relative Häufigkeit von PtdSer in Membranen als Mol-% der Gesamtlipide in allen Organellen der Zelle. ER – Endoplasmatisches Retikulum, PM – Plasmamembran. B, C Die Sonde LactC2 markiert zytoplasmatische Segel, die PtdSer enthalten. Bei Koexpression mit zusätzlichen organellen Markern (wie der Plasmamembran-Markierung PH-PLC (B)) relative Korrelationen, bestimmt durch Berechnung der korrelativen Co-Lokalisierung nach Pearson (C) kann als Proxy für die relativen Mengen von PtdSer in den zytoplasmatisch zugewandten Blättchen von Organellen bestimmt werden (wie erstmals in Hirama et al. [48] veröffentlicht). Marker für Plasmamembran (PH-PLC), ER (Sec61), Golgi (GalT), Mitochondrien (Mito (MitoTracker)), frühe Endosomen (Rab5), schnelle und langsame Recycling-Endosomen (Rab4 bzw. Rab11) und Lysosom (LAMP1 .) ) werden gezeigt. Das Fehlen von ER- und Golgi-Markierung durch LactC2 deutet auf einen Mangel an PtdSer in den zytoplasmatischen Segeln hin, wie im Text diskutiert

Neben dem unterschiedlichen PtdSer-Gehalt zwischen den Organellen wird seit langem die ungleiche Doppelschichtverteilung von PtdSer an der PM geschätzt [11], ebenso wie die Bedeutung der Bewegung von PtdSer von der zytoplasmatischen zur exofazialen Seite der PM, die an kritischen Signalereignissen beteiligt ist einschließlich Blutgerinnung [12] und apoptotische Zellerkennung und Entfernung durch Makrophagen [13]. Darüber hinaus hat die PM eine negative Nettoladung auf ihrer zytoplasmatischen Seite [14] und spielt folglich eine wesentliche Rolle bei ladungsbasierten Signalgebungsereignissen [15]. Der Beitrag von PtdSer zu dieser Ladung sowie die genaue Lokalisierung und Dynamik von PtdSer oder auch anderer Organellen innerhalb ganzer und lebender Zellen bleiben jedoch ein Bereich aktiver Forschung, der kürzlich durch neue Werkzeuge zum Nachweis und Visualisierung von PtdSer. In diesem Aufsatz werden wir aktuelle Beiträge zum Verständnis der PtdSer-Verteilung und ihrer Rollen innerhalb einer normalen Zelle hervorheben.

Verteilung und Dynamik von Phosphatidylserin

Die Entwicklung der PtdSer-spezifischen LactC2-Sonde, basierend auf der PtdSer-spezifischen Calcium-unabhängigen C2-Bindungsdomäne vom Discoidin-Typ von Lactadherin (auch bekannt als Milchfettkügelchen-EGF-Faktor 8 (MFGE8)) [16] hat die Visualisierung von PtdSer . ermöglicht in lebenden Zellen (Abb. 1b-c). Tatsächlich zeigte die anfängliche Studie mit dieser Sonde zum ersten Mal die zytoplasmatische Verteilung von PtdSer in lebenden Zellen. Diese erste LactC2-Studie unterstrich die Bedeutung von PtdSer für die Bereitstellung der negativen Ladung des PM und fand heraus, dass kationische Sonden das Vorhandensein von LactC2-identifiziertem PtdSer verfolgen, auch in Abwesenheit von Polyphosphoinositiden [16]. Die Studie hob auch das Vorhandensein von PtdSer in und seine Fähigkeit hervor, ladungsbasierte Proteinsonden in endosomale Kompartimente zu rekrutieren, während es in den dem Zytoplasma zugewandten cis-Golgi, ER oder Mitochondrien nicht nachweisbar ist. Es ist zwar möglich, dass die LactC2-Sonde nicht hoch genug empfindlich ist, um die relativ geringen PtdSer-Spiegel in diesen Organellen nachzuweisen [9, 10], aber es ist auch möglich, dass die Verteilung von PtdSer-Blättchen in intrazellulären Organellenmembranen, wie bei der PM, asymmetrisch [17]. Tatsächlich gab es vor der Entwicklung der LactC2-Sonde signifikante Hinweise darauf, dass dies zumindest im ER der Fall ist [18,19,20,21]. Diese Beweise wurden seitdem durch zusätzliche Daten untermauert, die keine biochemische Isolierung und potenzielle Zerstörung dieser komplizierten röhrenförmigen Organelle erfordern. Unter Verwendung eines kombinierten Lichtmikroskopie- und On-Section-Färbungs-Elektronenmikroskopie(EM)-Ansatzes konnte die LactC2-Sonde PtdSer auf der luminalen, aber nicht zytoplasmatisch zugewandten ER-Membran nachweisen [22]. Eine modifizierte ER-gerichtete LactC2-Sonde wurde auch verwendet, um PtdSer im ER-Lumen lebender Zellen erfolgreich nachzuweisen [23].

Die Fähigkeit von PtdSer, Membransegel zu verändern, steht einer hohen Energiebarriere gegenüber, wobei die spontane Translokation schätzungsweise nur in der Größenordnung von Stunden pro einzelnem molekularen Translokationsereignis auftritt [24, 25]. Es wurden drei Kategorien von Proteinen charakterisiert, die die Trans-Leaflet-Bewegung von Lipiden ermöglichen: Flippasen, die Lipide vom extrazellulären oder organellären luminalen Segel der PM auf das zytosolische Segel übertragen, Floppasen, die in die entgegengesetzte Richtung (aus dem zytosolischen zugewandten Segel) übertragen, und Scramblases, die bidirektional sind [26,27,28]. Da sich im zytoplasmatischen Segel des ER das aktive Zentrum der Glycerophospholipid-Enzyme befindet [29], wurde allgemein angenommen, dass die meisten Glycerophospholipide im ER gleichmäßig zwischen den Segeln verteilt sind, um eine ordnungsgemäße ER-Membranexpansion und Segelkopplung zu ermöglichen [30, 31 ]. Wie dies mit PtdSer mit einer polarisierten Verteilung im Lumen des ER vereinbar sein kann, ist unklar. Allerdings führt die Expression der Gain-of-Function-PtdSer-Synthase 1, die bei Patienten mit Lenz-Majewski-Syndrom identifiziert wurde, zum Auftreten von zytosolischem PtdSer im ER, was zeigt, dass der/die normale(n) Mechanismen, die PtdSer auf das luminale Segel beschränken, sättigbar sind [32 ]. Eine Möglichkeit besteht darin, dass PtdSer, einmal im luminalen Segel, durch Interaktionen mit luminalen Proteinen und/oder Ca 2+ dort gehalten wird [33]. Andere, sich nicht gegenseitig ausschließende Möglichkeiten sind, dass PtdSer vom zytoplasmatisch zugewandten Segel am MAM in die Mitochondrien transportiert wird, wo es für die Produktion von PtdEth verwendet wird [34] oder PtdSer durch nicht-vesikulären Transport aus dem zytoplasmatischen Segel entfernt wird Lipidtransferproteine ​​(LTPs).

LTPs sind zusammen mit dem vesikulären Transport die Art und Weise, wie sich Lipide zwischen Zellmembranen bewegen [9, 33, 35]. Jüngste Studien haben die Fähigkeit von spezifischen LTPs, den Oxysterol-bindenden Homologie-(Osh)-Proteinen 6 und 7 in Hefe [36, 37] und den Oxysterol-bindenden Proteinen (OSBP)-verwandten Proteinen (ORPs) 5 und 8 in Säugerzellen hervorgehoben [36 , 38], um PtdSer zwischen Membranen zu bewegen. Die Existenz dieser PtdSer-spezifischen LTPs stellt somit einen potentiellen Mechanismus für die Erzeugung und/oder Aufrechterhaltung des in Zellen vorhandenen zellulären PtdSer-Membrangradienten bereit. Tatsächlich haben neuere Studien gezeigt, dass ein LTP-vermittelter Transfer von PtdSer gegen seinen Konzentrationsgradienten durch Austausch mit Phosphatidylinositol-4-phosphat (PtdIns4P) entlang seines Konzentrationsgradienten vom PM zum ER möglich ist, wo die Phosphatase Sac1 PtdIns4P in PtdIns umwandelt [38 , 39]. Neuere Erkenntnisse deuten jedoch darauf hin, dass dieser Austausch hauptsächlich zur Feinabstimmung der PM-Gehalte von PtdIns4P und PtdIns(4,5)P . verwendet werden kann2 anstatt für die Massenbewegung von PtdSer in die PM verantwortlich zu sein [39, 40]. Es gibt auch überzeugende Beweise für die Bedeutung des vesikulären Handels als Hauptweg für den PtdSer-Handel und die Konzentration innerhalb der PM. Zum Beispiel wird in Hefe mit temperaturempfindlichen Mutationen in den sekretorischen Proteinen Sec6 und Sec1 die Polarisation von PtdSer in der PM, die normalerweise an einer sich bildenden Knospe zu sehen ist, gehemmt und PtdSer reichert sich stattdessen an den Vesikel an, die daran gehindert werden, mit der PM zu fusionieren [2] . Darüber hinaus ist das endosomale Recycling wichtig für die Aufrechterhaltung hoher PtdSer-Spiegel, wobei die Hemmung eine Umverteilung von PtdSer im gesamten endosomalen System in Hefe bewirkt [41]. In ähnlicher Weise wurde festgestellt, dass die Unterbrechung der LTP-Funktion in Säugerzellen zu einer geringfügig veränderten, aber nicht unterbrochenen PtdSer-Verteilung in der Zellmembran führt [38, 39]. Darüber hinaus wurde Snx4, ein Mitglied der sortierenden Nexin-Familie von Proteinen, die an der endosomalen Ladungssortierung und -recycling beteiligt sind [42], das spezifisch am Recycling von Snc1 in Hefe [43] und Transferrinrezeptor in Säugerzellen [44] beteiligt ist, kürzlich mit Dies führt zu einer Veränderung der endosomalen PtdSer-Spiegel [41].

Während also der nichtvesikuläre Lipidtransport, vermittelt durch LTPs, eine wichtige Rolle spielt, scheint der vesikuläre Transport einen signifikanten Beitrag zur Aufrechterhaltung des Intermembran-PtdSer-Gradienten innerhalb der Zelle zu leisten. Obwohl die vollständigen molekularen Mechanismen, wie PtdSer von anderen Lipiden getrennt wird, noch vollständig aufgeklärt werden müssen, weisen biochemische Studien darauf hin, dass ein signifikanter Anteil von PtdSer in Säugerzellen in PM-abgeleiteten detergenzienresistenten, cholesterinangereicherten „Lipid-Rafts“ angereichert ist [45 ]. Diese biochemischen Daten werden sowohl durch eine elektronenmikroskopische Analyse gestützt, die zeigt, dass PtdSer nicht homogen über die PM verteilt ist [22] als auch durch den Befund, dass Cholesterin und PtdSer in den subzellulären Kompartimenten co-segregieren, wobei sie am stärksten in den PM- und frühen endosomalen Kompartimenten konzentriert sind und in das ER [22, 46, 47]. Darüber hinaus sind akute Veränderungen in beiden Fällen für die normale Verteilung von PtdSer erforderlich [2, 48] und akute Veränderungen der PM-Spiegel von PtdSer verändern die Verteilung des Cholesterins [46]. Es gibt auch Hinweise auf die Wahrscheinlichkeit, dass äußere Segelfloss der Plasmamembran, abhängig von Glycerphingolipiden und Cholesterin [49], an innere Segelfloss gekoppelt sind [50, 51]. Die Bedeutung von PtdSer bei dieser Kopplung, sowohl in der PM- als auch in der endosomalen Membran, ist Gegenstand einer kürzlich erschienenen exzellenten Übersicht [52] und wird daher hier nicht weiter behandelt.

Rollen von intrazellulärem Phosphatidylserin

Wie in Hintergrund beschrieben, ist PtdSer in Säugerzellen essentiell [1], während Hefen, denen PtdSer fehlt, lebensfähig sind, aber eine stark reduzierte Wachstumskinetik aufweisen [2, 3]. Da die PtdSer-vermittelte extrazelluläre Signalübertragung, wie zum Beispiel während der Blutgerinnung und Apoptose, kürzlich besprochen wurde [53, 54, 55], konzentrieren wir uns hier auf Informationen über die Rolle von PtdSer in gesunden nicht-apoptotischen Zellen (Abb. 2).

Aktuelles Wissen zu Rollen und intrazellulärem Transport von PtdSer. PtdSer wird im ER produziert und von dort in der Zelle verteilt. PtdSer kann durch mitochondria-assoziierte Membranen (MAMs) in die Mitochondrien übertragen werden (1), wo es meistens in PtdEtn umgewandelt wird. Die Verteilung an das PM und das endosomale System kann sowohl über den traditionellen vesikelvermittelten Transport als auch über die direkte Bewegung über PtdSer-spezifische Lipidtransferproteine ​​erfolgen (2). Die relative Bedeutung beider Handelsmethoden ist derzeit unklar. Um die PN (3), PtdSer wird im zytoplasmatisch zugewandten Segel gehalten und ist wichtig für die Erzeugung einer hohen Netto-Negativladung. Eine Reihe wichtiger Signalmoleküle werden durch Ladungs- und/oder direkte PtdSer-Erkennungsbindung an die PM rekrutiert, wobei PtdSer somit eine wesentliche Rolle in vielen Signalkaskaden und bei der Proteinlokalisierung spielt. PtdSer spielt auch eine wichtige Rolle bei der Endozytose (4). PtdSer kann auch eine Rolle bei der Golgi-Funktion spielen (5), im Zusammenhang mit der Ladungssortierung und dem Knospung vom Trans-Golgi. PtdSer scheint auch für das Recycling von Fracht und die Interaktion mit der Recyclingmaschinerie (z. B. Evectin2, EHD1, Snx4) am Recycling-Endosom wichtig zu sein (6). Diese Interaktionen mit der Recyclingmaschinerie tragen wahrscheinlich auch dazu bei, sicherzustellen, dass PtdSer zum PM zurückkehrt und seine Anreicherung auf diesem aufrechterhält, während gleichzeitig reduzierte PtdSer-Spiegel auf den späten Endosomen und Lysosomen verursacht werden. Mito – Mitochondrien, ER – Endoplasmatisches Retikulum, PM – Plasmamembran, EV – Exozytisches Vesikel, EE – Endozytisches Vesikel, RE – Recycling-Endosom, Lys – Lysosom

Wie beschrieben, macht PtdSer im stationären Zustand in einer gesunden Zelle bis zu

15 Mol-% des Gesamtlipids in der PM. Da es sich außerdem fast ausschließlich im inneren (zytoplasmatisch zugewandten) Segel befindet, kann es daher bis zu

30 Mol-% des Lipids auf dieser Packungsbeilage. Als Hauptlipid mit einer netto-negativen Ladung ist PtdSer daher dafür verantwortlich, einen Großteil der Ladungsdichte des inneren Segels bereitzustellen. Eine bedeutende Rolle von PtdSer besteht dann darin, mit Proteinen auf eine unspezifische ladungsbasierte Weise zu interagieren, um deren geeignete Lokalisierung innerhalb der Zelle zu ermöglichen (Tabelle 1). Beispielsweise sind die Proteinkinase Src und Ras GTPase-Familienmitglieder Rac1 und K-Ras Proteine, deren Membran-Targeting zusätzlich zu Lipidmodifikationen eine polykationische Dehnung erfordert [56, 57]. Der polykationische Abschnitt von K-Ras4B hat eine Nettoladung von + 8, was dazu führt, dass er fast ausschließlich am PM lokalisiert ist. Wenn PtdSer entfernt wird [58] oder wenn die Nettoladung dieses Abschnitts variiert wird, werden die resultierenden Mutanten zusätzlich auf andere Membranen gelenkt, die Konstrukte mit mittlerer Ladung (z. B. + 5) an endosomalen Membranen lokalisieren [16]. In ähnlicher Weise weist Src neben seinem myristoylierten Rest am N-Terminus einen polykationischen Abschnitt mit einer Nettoladung von + 5 auf, und es wurde gefunden, dass die Kinase nicht nur mit dem PM, sondern auch weitgehend mit PtdSer-angereicherten endosomalen Membranen assoziiert [16].

Weitere Hinweise auf die Bedeutung von PtdSer in ladungsbasierten Proteinverteilungen wurden beim Phagozytoseprozess beobachtet. Wenn Krankheitserreger eine PtdSer-Verarmung aus Phagosomen verursachen, geht auch Src verloren [59]. In anderen Fällen reichen solche geladenen Motive nicht aus, um Proteine ​​an eine Membran zu lenken, beeinflussen aber dennoch ihr Targeting und spielen wahrscheinlich eine komplementäre Rolle [56, 60]. Beweise dafür, dass dies der Fall ist, stammen aus Studien an Hefe, bei denen polarisiertes PtdSer für die Rekrutierung des signalgebenden und polaritätsregulierenden Moleküls Cdc42 an den sich bildenden Knospenhals ohne PtdSer erforderlich ist Wachstum [2]. In ähnlicher Weise sind Cdc42 und Rho1 für ihre korrekte Lokalisierung und Funktion in von der PtdSer-Polarisation abhängig Schizosaccharomyces pombe [61]. In einem weiteren Beispiel scheint das pflanzliche GTPase Rho of Plants (ROP)-Familienmitglied ROP6 kein PtdSer für seine PM-Assoziation zu benötigen, erfordert jedoch, dass PtdSer bei Aktivierung in Nanodomänen innerhalb der Membran stabilisiert wird, was eine ordnungsgemäße Signalübertragung ermöglicht [62 ]. Ob PtdSer für die Signalübertragung anderer Mitglieder der ROP-Familie erforderlich ist oder diese modulieren kann, die alle einen polybasischen Abschnitt von Aminosäuren an ihrem C-Terminus enthalten [62], bleibt abzuwarten.

Traditionell wurde angenommen, dass die Wechselwirkungen zwischen polykationischen Abschnitten in Proteinen und anionischen Phospholipid-Kopfgruppen streng ladungsbasiert mit geringer Spezifität sind. Neuere Beweise stellen diese Annahme jedoch in Frage. Beispielsweise wurde kürzlich gezeigt, dass K-Ras4B, das sechs Lysinreste neben einem farnesylierten Cysteinrest enthält, bevorzugt mit PtdSer interagiert [63]. Die Schwanzregion von K-Ras4B nimmt eine Reihe von Konformationen an, ungeordnet, geordnet und intermediär, wobei die ungeordnete die bevorzugte Konformation ist. Diese Konformation ist auch in der Lage, PtdSer effektiver zu verbinden als die anderen beiden Bestätigungen [63]. Umgekehrt zeigen andere Proteine ​​wie K-RasG12V und Rac1 keine Präferenz für PtdSer [63,64,65]. Obwohl dies nur erste Studien sind, deuten die Ergebnisse darauf hin, dass einige polybasische Proteine ​​PtdSer oder andere anionische Lipide gegenüber einfachen elektrostatischen Wechselwirkungen bevorzugen.

Es gibt auch mehrere Beweislinien, die darauf hindeuten, dass die Ladung von PtdSer zur PM-Krümmung beiträgt und für die Bildung einiger Formen endozytischer Vesikel wichtig ist. Caveolae sind beispielsweise knollenförmige Nanodomänen (50–100 nm) des PM, die mit vielen physiologischen Funktionen in Verbindung gebracht wurden, einschließlich Mechanosensorik und endozytischem Transport [66]. Während Caveolae bekanntermaßen für Cholesterin und spezifische Glycerosphingolipide, einschließlich GM3, angereichert sind [67], wurde kürzlich PtdSer als für ihre Bildung und Aufrechterhaltung benötigt [68]. Dies ist wahrscheinlich zumindest teilweise auf die ladungsbasierte PtdSer-Bindung des Cavin1-Proteins [69] zurückzuführen, das zusammen mit Caveolin1 für die in vivo Caveola-Bildung benötigt wird [70]. PtdSer ist auch in der Lage, bei akuter Entfernung von Cholesterin eine Membrankrümmung zu verursachen und eine Endozytose zu induzieren, wiederum eine Folge der geladenen Kopfgruppe von PtdSer [48]. Es ist wahrscheinlich, dass Cholesterin, aus dem

40 Mol-% PM-Lipide [10], tragen dazu bei, die Ladungsdichte der PtdSer-Kopfgruppe auf dem inneren Segel niedrig genug zu halten, um keine spontane Krümmung zu induzieren. Sobald das Cholesterin jedoch entfernt ist, wird der Abstand zwischen den Phospholipid-Kopfgruppen verringert, was zu einer hohen spontanen Krümmung führt, die zur Bildung von endozytischen Tubuli fähig ist [48, 71]. Tatsächlich reicht es auch aus, die PtdSer-Spiegel auf der Innenseite der PM über die homöostatischen Spiegel (und damit die Ladungsdichte) ohne gleichzeitige Cholesterinentfernung zu erhöhen, um die Bildung von endozytischen Vesikeln zu erhöhen [48]. Es ist verlockend zu spekulieren, dass die Cavin- und Caveolin-Proteine ​​diese krümmungsinduzierende Eigenschaft von PtdSer ausnutzen, um Caveolae zu induzieren. Während Cholesterin für die zelluläre Lokalisierung von PtdSer wichtig zu sein scheint, scheint es daher auch für die Modulation des PtdSer-Abstands und die Induktion der Membrankrümmung wichtig zu sein. Diese enge Beziehung zu Cholesterin spielt wahrscheinlich auch bei anderen PtdSer-Funktionen eine wichtige Rolle, wie die PtdSer-Dynamik und die Interaktionen mit Caveolae [68] und Signalproteinen [2, 59, 62] nahelegen.

Das Verständnis der Rolle von PtdSer in internen Membranen bleibt noch weniger klar als die Rolle bei der PM. Ähnlich wie die Plasmamembran sind Recycling-Endosomen reich an PtdSer [72] und neuere Arbeiten haben gezeigt, dass PtdSer eine Vielzahl von Funktionen in diesen Endosomen unterstützt. Das endosomale Protein Evectin-2 enthält eine Pleckstrin-Homologiedomäne, die eher an PtdSer als an Phosphoinositide bindet [72]. Die Erschöpfung von Evectin-2 oder die Verringerung der Verfügbarkeit von PtdSer verhindert die Bewegung des Cholera-Toxins vom Recycling-Endosom zum Golgi. In ähnlicher Weise führt eine Erschöpfung von Evectin-2 und eine Verringerung der PtdSer-Spiegel dazu, dass Golgi-Proteine ​​(z. B. TGN38) nicht aus Endosomen gewonnen werden können [72, 73]. Zusätzlich zum Vorhandensein von PtdSer auf der zytosolischen Packungsbeilage von Recycling-Endosomen sind auch PtdSer-Flippasen (z. B. ATP8A1, ATP8A2) erforderlich, um Handelsereignisse zu unterstützen. Ein kritischer Effektor stromabwärts von Flipped PtdSer ist das Eps15-Homologiedomänen-enthaltende Protein-1 (EHD1), eine ATPase mit Dynamin-ähnlicher Aktivität und einer Rolle beim Membranumbau, die für den retrograden Transport von Shiga-Toxin zum Golgi erforderlich ist [74, 75] . Seltsamerweise wurden PtdSer, Evectin-2 und ATP8A1 alle kürzlich als Regulatoren des Yes-assoziierten Proteins (YAP)-Signalwegs und der Zellproliferation in Verbindung gebracht [76]. Der ATP8A1-Knockdown führt zur Aktivierung von Lats, das wiederum YAP phosphoryliert und seine Translokation in den Zellkern verhindert. Die Stilllegung von Evectin-2 führt zu einer Abnahme der Nedd4-vermittelten Ubiquitinierung von Lats1, was zu erhöhten Spiegeln führt, die auch zu einer erhöhten Phosphorylierung und Inaktivierung von YAP führen. Diese Studien werfen mehrere Fragen auf, wie PtdSer und sein Flipping in Recycling-Endosomen diese Effektoren kontrollieren. Da Recycling-Endosomen viel von der asymmetrischen Plasmamembran einströmende Membran erhalten, ist es außerdem unklar, woher das luminale Blättchen PtdSer als Substrat für die Flippasen kommt. Über die Zellphysiologie von PtdSer muss noch viel gelernt werden und wir gehen davon aus, dass die gleichen biophysikalischen Eigenschaften, die PtdSer der Plasmamembran auferlegt, auch in Endosomen und trans-Golgi.


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Zufällig organisierte Lipide und marginal stabile Proteine: eine Kopplung schwacher Wechselwirkungen zur Optimierung der Membransignalübertragung

Eukaryotische Lipide in einer Doppelschicht werden von schwachen kooperativen Wechselwirkungen dominiert. Diese Wechselwirkungen verleihen der Membran hochdynamische und biegsame Eigenschaften. C2-Domänen enthaltende Proteine ​​in der Membran interagieren auch schwach und kooperativ, was zu einem hohen Grad an Konformationsplastizität führt. Wir schlagen vor, dass diese Eigenschaft der schwachen Energetik und Plastizität, die von Lipiden und C2-Domänen-haltigen Proteinen geteilt wird, die Fähigkeit einer Zelle verbessert, Informationen durch die Membran zu übertragen. Wir untersuchten diese Hypothese mit Hilfe der Informationstheorie, um die Informationsspeicherkapazität von Modell- und Mastzellmembranen zu bewerten, sowie Differentialscanningkalorimetrie, Carboxyfluorescein-Freisetzungsassays und Tryptophanfluoreszenz, um die Protein- und Membranstabilität zu beurteilen. Die Verteilung von Lipiden in Mastzellmembranen kodierte 5,6-5,8 Bit an Information. In den Acylketten befanden sich mehr Informationen als in den Kopfgruppen und im inneren Blatt der Plasmamembran als im äußeren Blatt. Wenn die Lipidzusammensetzung und der Informationsgehalt von Modellmembranen variiert wurden, erfuhren die assoziierten C2-Domänen große Veränderungen in Stabilität und Denaturierungsprofil. The C2 domain-containing proteins are therefore acutely sensitive to the composition and information content of their associated lipids. Together, these findings suggest that the maximum flow of signaling information through the membrane and into the cell is optimized by the cooperation of near-random distributions of membrane lipids and proteins. This article is part of a Special Issue entitled: Interfacially Active Peptides and Proteins. Guest Editors: William C. Wimley and Kalina Hristova.

Schlüsselwörter: C2 domain Disorder Information theory Membrane domain Signaling.


Materialen und Methoden

Antikörper

The anti-RCP affinity-purified antibody has been described previously (Lindsay et al., 2002). The Rab11 and Rab11-FIP2 antibodies were raised in rabbits against Escherichia-coli-purified 6×His-Rab11 and 6×His-Rab11-FIP2(1-277). The resulting antisera were affinity purified and used at dilutions of 1:250 and 1:25, respectively. The anti-haemagglutinin (anti-HA) mouse monoclonal antibody was from Roche and used at a 1:1000 dilution. Mouse monoclonal anti-ZO1 antibody was purchased from BD Transduction Laboratories and used at a 1:150 dilution.

Plasmid constructs

Fusions between green fluorescent protein (GFP) and RCP and Rab11-FIP2 have been described previously (Lindsay et al., 2002 Lindsay and McCaffrey, 2002). GFP-Rip11 was generated by polymerase chain reaction (PCR) using pBluescriptIISK KIAA0857 (Kazusa DNA Research Institute) as template and the primers Rip11FWD (5′-CGGAATTCGCCCTGCGGGGCGCGGAG-3′) and Rip11REV (5′-CGGAATTCGCACAGAACCTGATGCCTCCAAG-3′). The product was digested and ligated into the ÖkoRI site of pEGFP-C1 (Clontech). GFP-RCP(1-199) was generated by ligating the ∼600 bp SalI fragment from pEGFP-C3 RCP into the SalI site of pEGFP-C3. GFP-RCP(200-649) was constructed by ligating the SalICH-BamHI fragment from pEGFP-C3 RCP into the SalICH-BamHI site of pEGFP-C1. GFP-Rab11-FIP2(1-284) was generated by PCR using Rab11-FIP2FWD (5′-CGGAATTCCCTGTCCGAGCAAGCCCAAAAG-3′) and Rab11-FIP2ΔC2REV (5′-CGGAATTCGAAACCAGCCACAGGATCAATTC-3′) and ligating into the ÖkoRI site of pEGFP-C1. GFP-Rab11-FIP2(277-512) was generated by ligating the HindIII-BamHI fragment from pEGFP-C1 Rab11-FIP2 into the HindIII-BamHI site of pEGFP-C2 (Clontech). GFP-Rip11(1-218) was generated by digesting pEGFP-C1 Rip11 with BamHI and religating the backbone. GFP-Rip11(219-653) was constructed by ligating the ∼2.2 kb BamHI fragment from pBSKII KIAA0857 into pEGFP-C1. RCP(1-199) was subcloned into pGEX2T (Amersham Biosciences). Rip11(1-218) was subcloned into the BamHI site of pGEX3X and Rab11-FIP2(1-284) was subcloned into the ÖkoRI site of pGEX3X (Amersham Biosciences). All constructs generated by PCR were confirmed by sequencing.

Expression and purification of GST fusion proteins

Glutathione-S-transferase (GST) fusion-protein expression was induced in E coli XL-1 Blue cells with 0.1 mM isopropylthiogalactoside (IPTG) at 30°C for 4 hours. The bacterial cells were resuspended in 1× PBS and lysed with 1% Triton X-100 plus 5 mM dithiothreitol. The lysate was clarified by centrifugation at 12,000 g and the protein was bound to glutathione-agarose (Sigma), which was washed twice with PBS. The protein was eluted with 10 mM glutathione and subsequently dialysed overnight in PBS.

Protein-phospholipid assays

The protein-phospholipid overlay assays were carried out according to the manufacturers instructions. Briefly, PipArrays™ (Echelon Biosciences) were blocked in 3% bovine serum albumin (BSA) in Tris-buffered saline-0.1% Tween-20 (TBST) and then incubated overnight with 0.5 μg ml –1 GST fusion protein. The membranes were then washed extensively with 3% BSA in TBST and probed with anti-GST antibody (Amersham Biosciences). After washing, the membranes were incubated with horseradish peroxidase (HRP)-coupled anti-rabbit IgG and then visualized by autoradiography. Densitometry was performed using GeneTools analysis software (Syngene). The intensity of each phosphoinositide spot, at a concentration at which the signal was not saturated, was measured. The spot with the highest intensity was set at 100 [this was PtdIns(3,4,5)P3 in every case]. The intensity of the other phosphoinositide signals, at the same concentration, were normalized against PtdIns(3,4,5)P3. The results presented are the mean of three independent experiments. PipArrays with PA, phosphatidylcholine (PC), phosphatidylserine (PS) and phosphatidylethanolamine (PE) (Sigma) were made as described previously (Dowler et al., 2002).

Cell culture and immunofluorescence

HeLa and A431 cells were maintained in culture in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) (BioWhittaker) supplemented with 10% foetal bovine serum, 100 units ml –1 penicillin, 100 μg ml –1 streptomycin and 2 mM glutamine. Transfections were carried out using Effectene transfection reagent (Qiagen) according to the manufacturers instructions. 8 hours after transfection, the medium was replaced with fresh medium and, 16 hours later, the cells were fixed with 3% paraformaldehyde and mounted with Mowiol. For antibody labelling, the cells were permeabilized with 0.05% saponin supplemented with 0.2% BSA. Images were acquired on a confocal microscope (Zeiss LSM 510) using a PlanApo 63× 1.4 NA oil-immersion objective. Images were processed using Image Examiner software (Carl Zeiss) and imported into Adobe Illustrator.


Cell membranes and chemicals

Chemicals (foods, medicines, drugs of abuse, industrial chemicals) can enter the human body by various means including ingestion, inhalation, injection (intravenous, subcutaneous, intramuscular), skin application, use of a suppository and application to mucous membranes (eye, oral and nasal cavities). Except for injection directly into the bloodstream, the chemical must pass through a complex system of living cell membranes before it can enter the bloodstream.

For example, chemicals that enter the digestive tract must be absorbed by the cells lining the small intestine and then be transferred through the cell to the other side where the chemical can then be absorbed by the capillary cells into the bloodstream. Likewise, chemicals that are inhaled, as would occur from those released following the derailment, must pass through the alveolar cells to get to the capillary cells lying close to the alveoli to enter the bloodstream.

As chemicals pass into and out of cells, they must cross the cell membrane (Figure 1). It is the membrane that keeps all of the cell contents securely inside, but which allows some materials to pass in and out of the cell via several different mechanisms. The cell membrane consists mainly of phospholipid and protein in the form of a lipid bilayer. The two lipid layers face each other inside the membrane, and the more water soluble parts of the phospholipid molecule (phosphate groups) face the aqueous media inside the cell (cytoplasm) as well as outside the cell (intercellular fluid). The structural relationship of the proteins and phospholipids in the membrane was determined by two scientists, S.J. Singer and G. Nicolson, and is termed a "fluid mosaic model."

Abbildung 1: The Cell Membrane. Chemicals must pass through the membrane to enter or exit cells.

Chemicals can enter the body through our eyes.


Materialen und Methoden

Mice were housed in constant temperature at 23 °C ± 1 °C with 40% humidity under a 12 h light–dark cycle. Eight-week-old female B6D2F1 [BDF1, cross between C57BL/6 J (B6) female x DBA/2 J (D2) male] mice were purchased from Orient Bio (Gyunggi-do, Korea). Mice between 10 and 14-weeks-old were used in the “young” group, whereas mice older than 45 weeks were used in the “old” group. All experiments were conducted in accordance with the policies of the Konkuk University Institutional Animal Care and Use Committee (Approval number KU17067). Mice were sacrificed under anesthesia, and all efforts were made to minimize suffering of the mice.

Oocyte collection

Mice received 10 IU of pregnant mare’s serum gonadotropin (PMSG, Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) intraperitoneally, and 10 IU of human chorionic gonadotropin (hCG, Sigma-Aldrich) 48 h later (7–8 pm). Ovulated cumulus-oocyte complex (COCs) were retrieved from the oviduct 13 h post-hCG (8–9 am). 20 IU of PMSG and hCG injections were used for better induction in older mice, as in previously conducted research [10, 23]. To remove the cumulus cells, the COCs were treated with hyaluronidase (300 mg/ml, H4272, Sigma Aldrich) in Quinn’s Advantage Medium with HEPES (SAGE Media, ART-1023, Trumbull, CT, USA) for 2 min at room temperature. Denuded metaphase II (MII) oocytes were washed and collected in Quinn’s Advantage Medium with HEPES containing 20% fetal bovine serum (FBS, Gibco Grand Island, NY, USA).

Vitrification and warming

Vitrification was performed as previously described by Cha et al. [24]. Ethylene glycol (EG, 102466, Sigma-Aldrich) and dimethyl sulfoxide (DMSO, D2650, Sigma-Aldrich) were used as cryoprotectants in the vitrification solution. Oocytes were equilibrated in PBS based media containing 7.5% EG, 7.5% DMSO, and 20% FBS for 2.5 min, and then transferred to media containing 15% EG, 15% DMSO, and 0.5 M sucrose (Fisher Scientific, Fair Lawn, USA) for 20 s. Equilibrated oocytes (20 to 25) were loaded onto a copper grid (Ted Pella Inc., Redding, USA) and dipped directly into liquid nitrogen (LN2). Vitrified oocytes were stored in a LN2 tank for 2–4 weeks. For the warming procedure, the grid was taken out from the LN2 tank and serially incubated in 20% FBS containing PBS with descending concentrations of sucrose (0.5, 0.25, 0.125, 0 M) for 2.5 min each. The vitrified-warmed oocytes were washed in Quinn’s Advantage medium containing HEPES and 20% FBS. Washed oocytes were cultured in M16 media (M7292, Sigma-Aldrich) at 37 °C, in 5% CO2 for 1 or 3 h. For Necrostatin-1 (Nec1, N9037, Sigma-Aldrich) supplementation, 1 μM of Nec1 [25] was added to the final vitrification solution (15% EG, 15% DMSO, and 0.5 M sucrose). Oocytes without any marked morphological deformation and discoloration under an inverted microscope were considered as survived ones and used for further analysis.

RNA extraction and quantitative real-time polymerase chain reaction analysis

MII oocytes obtained from multiple mice were pooled and randomly grouped in 20 for RNA extraction. mRNA was extracted from 20 oocytes in all experimental groups, using Dynabeads™ mRNA DIRECT™ Purification Kit (Life Technologies, Forster City, CA, USA) according to the manufacturer’s protocol. The mRNA was kept in − 80 °C before use. First strand cDNA was synthesized from total mRNA sample using a Superscript TM III Reverse Transcriptase (Invitrogen, 18,080–044, Carlsbad, CA, USA), RNaseOUT™ Recombinant Ribonuclease Inhibitor (Invitrogen, 10,777–019), Oligo (dT)20, and random hexamer primers (Roche, Basel, Switzerland). Real-time quantitative PCR (qPCR) was performed using 2 μl of oocyte cDNA (equivalent to one oocyte per reaction) and Applied Biosystems™ Power Up™ SYBR™ Green Master Mix (Invitrogen, A25742, Carlsbad, CA, USA) in a final volume of 20 μl on the ABI 7500 real-time PCR system. The PCR conditions were as follows: hold for 10 min at 95 °C, followed by each cycle consisting of denaturation at 95 °C for 15 s, annealing and elongation at 58 °C for 1 min each. The relative gene expression was normalized with H2afz mRNA expression and relative quantification was performed using the ddCt method [26, 27]. PCR was performed by using Econo Taq PLUS GREEN 2X Master Mix (Lucigen, Middleton, WI, USA). Three biological replicates were used per experimental group and all reactions were run in duplicates. Primers used are shown in Table 1.

Cell culture and necroptosis induction

L929 fibroblast cell line derived from mouse adipose tissue was obtained from Korean Cell Line Bank (Seoul, Korea). L929 cells were cultured in RPMI1640 media supplemented with L-glutamine (300 mg/L), 25 mM HEPES, 25 mM NaHCO3, and 10% FBS. To induce necroptosis, cells were treated with a mixture of 30 ng/mL TNFα (PeproTech, Rocky Hill, NJ), 10 μM LCL-161 (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA), and 20 μM Z-VAD-FMK (R&D Systems) for 40 min [28]. Cells were fixed and subjected to immunofluorescence staining with anti-pMLKL and anti-pRIPK1 antibodies to establish specificity of these antibodies.

Immunfluoreszenzfärbung

Oocytes were fixed with 4% paraformaldehyde containing 0.05% polyvinyl alcohol in phosphate buffered saline (PFA-PVA) for 10 min. Fixed oocytes were washed three times with phosphate-buffered saline containing 0.05% polyvinyl alcohol (PBS-PVA) for 10 min each. For permeabilization, oocytes were transferred to a solution containing 0.25% Triton X-100 and incubated for 10 min. To prevent nonspecific binding, oocytes were blocked with 2% BSA in PBS for 1 h, followed by incubation with primary antibody at 4 °C overnight. The primary antibodies used were anti-pMLKL (1:100, ab196436, Abcam) [21], anti-pericentrin (1:500, 611,814, BD Bioscience, San Jose, CA, USA) [29], and anti-pRIPK1 (1:150, 31,122, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA). Following incubation with primary antibodies, oocytes were washed three times with PVA-PBS for 10 min. The oocytes were then incubated with Alexa Fluor 488 or Alexa Fluor 568 conjugated secondary antibody (1:250, Invitrogen) for 1 h at room temperature. DNA was stained with TOPRO-3-iodide (1:250, Invitrogen). The oocytes were mounted on glass slides with Vectashield mounting medium (Vector Laboratories, Peterborough, UK) and observed under the confocal microscope (Zeiss LSM710, Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany). Specificity of anti-pMLKL and anti-pRIPK1 antibodies was confirmed in necroptosis-induced L929 cells [21]. In all experiments, rabbit IgG was used as a negative control and it did not generate any specific signal.

Live imaging of oocytes by confocal microscopy

Oocytes were washed with M16 media three times and stained with CellMask™ Plasma Membrane Stain (2.5 μg/ml C10046, Life technologies), BODIPY 500/510 dodecanoic acid (10 μg/ml D-3823, Invitrogen), or ER Tracker™ Red dye (1 μg/ml E34250, Invitrogen) for 30 min. The oocytes were rinsed with fresh M16 media three times and transferred to a glass bottom confocal dish. Live images of oocytes were obtained directly with a confocal microscope (Zeiss LSM710).

Statistische Analyse

Data analysis and graph preparation were done using GraphPad Prism 5 software. For statistical analysis, Student’s T-test or one-way analysis of variance (ANOVA) were conducted on the experimental groups. Tukey’s range test was then performed to identify whether a significant difference exists among the groups. Statistical significance was depicted as *: P < 0.05, **: P < 0.01 and ***: P < 0,001.


DISKUSSION

The distribution of aminophospholipids (PE and PS) in the membranes of Gram-positive bacteria was known to be asymmetric from previous experiments using TNBS probe. PE distribution was 67%/33% and 80%/20% favoring the cytoplasmic leaflet of Bacillus megaterium (12, 15) and eukaryotic cells (22), bzw. At the same time, the PE in Bacillus amyloliquefaciens was found to be located predominantly in the outer leaflet of cytoplasmic membrane (33). Although still controversial, these studies indicate that PE is asymmetrically distributed in bacterial membranes and raised the question of its transmembrane distribution in Gram-negative bacteria, which have a more complex envelope system of IMs and OMs. No similar investigations have been reported for Gram-negative bacteria. Thus, we exploited permeant and nonpermeant amino group–specific probes to determine the aminophospholipid head group distribution, followed by assessment of their acyl group asymmetries in the E coli IM. Characterization of labeled lipids with independent radiolabeled, normal-phase LC/MS/MS, TLC elution–based, and TLC-less spectrophotometric assays allowed us to reveal asymmetrical, dynamic, and cell shape–dependent PE distribution in the IM of Gram-negative bacteria.

Our work represents a technical and conceptual breakthrough in the following areas:

1) Quantitative analysis of PE sidedness led to the first unambiguous demonstration of PE asymmetry in IM of Gram-negative bacteria such as E coli (Figs. 2 and 3) and Y. pseudotuberculosis (fig. S4), which has long remained unknown.

2) Asymmetry of PE is a remarkable dynamic. PE appears first on the periplasmic side of the IM of E coli cells, followed by dynamic and disproportional distribution to the cytoplasmic leaflet (Fig. 5).

3) Rod-shaped and filamentous E coli cells display an opposite distribution of PE in their IMs (Figs. 3 and 4, E to H). This very intriguing finding suggests that PE distribution facilitates or results from changes in bacterial shape. The rates of de novo fatty acid and CL biosynthesis can dictate bacterial shape, as was demonstrated recently (34, 35). The rate of CL biosynthesis and cells shape of logarithmically grown E coli cells are interrelated quantitatively (35). Gradual changes in distribution of PE/CL amounts between the IM leaflets during de novo PE biosynthesis in E coli cells initially lacking PE coincides with progressive reduction of cell size (Fig. 5A). PE is progressively accumulated, but CL is dissipated from the cytoplasmic leaflet of the IM. These transmembrane redistributions of CL and PE correlate with gradual changes in lipid packing order predominantly in the luminal leaflet of ISOv (corresponding to periplasmic leaflet of IM) (Fig. 6, C and D), demonstrating the possible coinvolvement of all these events in bacterial size control.

4) Lipid asymmetry is most likely metabolically controlled, regulated, and maintained in the IM of Gram-negative bacteria. The transmembrane distribution of PE and PS presumably reflects the relative rates of synthesis, translocation, and utilization of these aminophospholipids and their metabolic precursors. The asymmetric distribution of PE in IM can result from the balance between its translocation to the cytoplasmic leaflet, biosynthetic buildup on this leaflet, and loss from the periplasmic leaflet due to biosynthetical utilization and flow to the OM (illustrated in Fig. 6E). This balance is likely to be different in rod-shaped and filamentous cells because of different relative areas of IM and OM and different dynamics of membrane growth. This may explain the opposite asymmetric distribution of PE in the IM of rod-shaped and filamentous cells (Fig. 4 and fig. S7, D and E illustrated in Fig. 6F).

5) At any given time, more and more PE molecules are required at the outer leaflet of IM to generate mature triacylated lipoprotein precursor (Lpp) and provide material for exclusive building of the PE-enriched periplasmic leaflet of the OM (Fig. 6E). This is consistent with initial appearance of nascent PE in the outer IM leaflet in all cell types examined (Fig. 5). Although it may be advantageous to have the precursor of PS initially present in the IM periplasmic leaflet, a puzzling aspect of PS localization and accumulation in this leaflet in the psd conditionally lethal mutant (Fig. 4, A to D, and fig. S7, B and C) can be explained by its inability to serve as an acyl donor in the reaction with mature Lpp catalyzed by apolipoprotein n-acyltransferase (Fig. 6E). Nevertheless these results pose a provocative question as to the localization of the active site of PS decarboxylase and necessitate anterograde and retrograde movement of PS and PE, respectively.

6) No changes in acyl group asymmetry of PE, PG, or PS were observed in the IM of wild-type E coli and its lipid mutants (fig. S6). Our observations suggest rather an existence of a link between PE distribution, CL content, and lipid order within the IM. Since PE may increase the bilayer rigidity in the range comparable with that of cholesterol (36), our results suggest that bacteria may maintain membrane leaflet composition and the lipid order and rigidity not only by regulating the saturation state of the newly synthetized phospholipids, as widely accepted, but also by a fine-tuning of PE and CL content of individual leaflets. Thus, compositional asymmetries and physical order can be intrinsically coupled in bacterial membranes (Fig. 6, A to D, and fig. S8, A to D illustrated in Fig. 6G).

Although membrane asymmetry is largely related to lipid distribution, a full understanding of the physiological significance and detailed molecular mechanisms by which membrane phospholipid asymmetry is generated and maintained is lacking. In this work, we report novel methodology for determination of aminophospholipid asymmetry, which is based on complementary labeling of their head groups by two vectorial chemical probes, TNBS and DFDNB. To determine both head group and acyl asymmetry, the labeled lipids could be further characterized to determine head group and acyl asymmetry of aminophospholipids using radiometric, mass spectrometric methods, and spectrophotometric approaches. These methods are suitable for investigation of transbilayer dynamics, steady-state sidedness, and physiological significance of aminolipid asymmetry in Gram-negative (PE, PS, and ornithine lipids) and Gram-positive (Ö-lysylphosphatidylglycerol) bacteria and in any single-membrane cellular organelle (exosomes and apoptotic bodies).

Our results reveal unexpected opposite asymmetry of PE in the cytoplasmic and periplasmic leaflets of E coli IM of rod-shaped and filamentous cells. PE is dynamically redistributed within the IM either reflecting or facilitating the changes in cell shape. In eukaryotic cells, lipid asymmetry is maintained by the interplay of glycerophospholipid flippases and scramblases, which have not been discovered in bacterial cells. Thus, bacterial cells have to rely on different mechanisms for maintaining the membrane asymmetry. One of such mechanism is the dynamic balance between the incorporation of phospholipids into the cytoplasmic leaflet (due to their continuous synthesis) and their removal from the periplasmic leaflet (due to transport to the OM or usage in metabolic pathways involving periplasmic lipoproteins). This may create a steady-state concentration gradient of the lipids resulting in IM lipid asymmetry. Still unknown mechanisms of anterograde transport from IM to OM may accommodate the rates of de novo glycerophospholipid biosynthesis and dictate bacterial size, as was proposed recently (37). Thus, PE asymmetry in the IM might originate metabolically and play a central role in regulating the size and morphology of Gram-negative bacteria along with balanced synthesis of certain cell cycle proteins (20).

We also revealed that compositional asymmetries and physical order can be intrinsically coupled in the biogenic IM. The change in transmembrane distribution of two nonbilayer prone lipids, PE and CL, is tightly coupled to adjust the collective physical properties of the membrane. It is possible to speculate that this fundamental feature may be a main architectural principle for most, if not all, living biological membranes.

Obviously, further studies are necessary to fully elucidate the mechanisms and physiological consequences of our findings. Nevertheless, our results provide a conceptual basis and experimental tools for studying the transbilayer dynamics and regulatory function of various aminolipids (PE, PS, Ö-lysylphosphatidylglycerol, ornithine lipids, and some sphingolipids) in different organisms. These approaches offer the possibility of investigating the sidedness of aminolipids and establishment of their head and acyl group asymmetries in different single-membrane systems ranging from intact cell membranes of bacteria to erythrocytes, cell-derived organelles, and liposomes.


Calcium and Lipid selectivity

C2 domains are unique among membrane targeting domains in that they show wide range of lipid selectivity for the major components of cell membranes, including phosphatidylserine and phosphatidylcholine. This C2 domain is about 116 amino-acid residues and is located between the two copies of the C1 domain in Protein Kinase C (that bind phorbol esters and diacylglycerol) (see PDOC00379) and the protein kinase catalytic domain (see PDOC00100). Regions with significant homology Δ] to the C2-domain have been found in many proteins. The C2 domain is thought to be involved in calcium-dependent phospholipid binding Ε] and in membrane targeting processes such as subcellular localisation. Although most C2 domains interact with the membrane (phospholipids) in a Ca 2+ -dependent manner, some C2 domains can interact with the membrane without binding to Ca 2+ . Similarly, C2 domains have been evolved to have different specificities for lipids. Many C2 domains such as synaptotagmin C2A, bind to anionic phospholipids (PS or PIP2 containing phospholipids). However, other C2 domains such as cPLA2-α C2 domain bind to zwitterionic lipids (e.g. PC). This diversity and selectivity in Ca 2+ and lipid binding suggest that C2 domains are evolved to have different functions. Ζ]


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