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Berechnung der ungefähren UV-Dosis eines Virus


Ich mache eine sehr ungefähre Berechnung, um die UV-Dosis zu bestimmen, die ein Virus während einer bestimmten Zeit in einer Entfernung von 1,5 cm von einer UV-Quelle empfängt. Bitte lassen Sie mich wissen, wenn mein Gedankengang falsch ist.

Angenommen, ich verwende eine LED, die 2 mW Strahlungsfluss emittiert. Nebenbemerkung: Ich habe einen gefunden, der damit 20 mA Strom verbraucht, wenn eine Durchlassspannung von 6,5 V angelegt wird, was zu einer Leistungsaufnahme von 130 mW führt. Somit beträgt die LED-Effizienz 2 mW/130 mW = 1,67 %. Ich denke, LEDs sind sehr effizient ... )

Um komplizierte Berechnungen zu vermeiden, nehmen wir an, dass 80% des gesamten Flusses in einem 45-Grad-Kegel konzentriert sind. Angenommen, der Fluss pro cm2 ist konstant (ich kenne den Namen für diesen Wert nicht) auf einer flachen Kreisfläche in einem Abstand von 1,5 cm von der Lichtquelle und der Stelle, an der das Virus platziert wird. Die LED wird für 5 Sekunden eingeschaltet. Daher beträgt die vom Virus aufgenommene Dosis:

$$ Dosis = 80\%* frac{2mW}{(pi*(1,5cm)^2)}*5sec $$

Stimmt diese Gleichung?

Vielen Dank


Um komplizierte Berechnungen zu vermeiden, nehmen wir an, dass 80% des gesamten Flusses in einem 45-Grad-Kegel konzentriert sind.

Die tatsächliche Lichtverteilung ist wahrscheinlich nicht so. Dioden neigen dazu, bei höheren Winkeln erhebliche Mengen an Leistung abzugeben, so dass weniger als 80% in der Mitte landen, und innerhalb des zentralen Punkts erreichen sie ihren Höhepunkt in der Mitte und fallen dann allmählich ab: https://photonsystems.com/wp- content/uploads/2017/03/280nm-LED-LeistungsinformationenV3.pdf

Üblicherweise werden Strahlmuster entweder anhand von Hersteller-Strahldaten simuliert oder gemessen. Da es sich um Dioden mit geringem Stromverbrauch und sehr niedrigem Wirkungsgrad handelt und angesichts der Kosten für UVC-LEDs, vermute ich, dass dies überzählige oder unter den Spezifikationen liegende Teile sind, die bei eBay oder ähnlichem verkauft werden, und Sie haben keinen Zugriff auf die zugrunde liegenden Werte Datenblätter. In diesem Fall ist dies eine vernünftige Schätzung.


Berechnung der ungefähren UV-Dosis eines Virus - Biologie

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Abstrakt

Angesichts des Mangels an COVID-19 N95 ist das medizinische Personal an vorderster Front gezwungen, dieses Einweg-, aber hochentwickelte, mehrschichtige Atemschutzgerät wiederzuverwenden. UV-C-Licht wird häufig zur Dekontamination nicht poröser Oberflächen verwendet und hat eine keimtötende Wirksamkeit bei porösen, nicht ebenen N95-Atemschutzgeräten gezeigt, wenn alle Oberflächen eine Dosis von ≥ 1,0 J/cm 2 erhalten. Von größter Bedeutung für alle Disziplinen ist, dass die Umsetzung empirischer Beweise in die Umsetzung auf UV-C-Messungen beruht, die häufig durch die Komplexität der Radiometer verwechselt werden. Um rigorose Messungen am Beatmungsgerät zu ermöglichen, führen wir eine photochrome Indikatordosisquantifizierungstechnik ein für: (1) UV-C-Behandlungsdesign und (2) prozessinterne UV-C-Dosisvalidierung. Während die herausragenden Indikatorbeschränkungen der qualitativen Anzeige und des unzureichenden Dynamikbereichs angegangen werden, stellt unsere Methodik fest, dass die Farbänderungsdosimetrie die erforderliche Genauigkeit (>90%), Unsicherheit (<10%) und UV-C-Spezifität (>95%) erreichen kann, die für UV- C-Dosismessungen. Bei einer mit Radiometern nicht durchführbaren Messung beobachten wir ein auffälliges

20-fache Dosisvariation über N95s innerhalb eines Dekontaminationssystems. Darüber hinaus passen wir Unterhaltungselektronik für eine zugängliche quantitative Auslesung an und verwenden optische Abschwächer, um den Dynamikbereich des Indikators um >10× zu erweitern, um die für die N95-Dekontamination relevanten Dosen zu quantifizieren. Durch die Umwandlung photochromer Indikatoren in quantitative Dosimeter beleuchten wir kritische Überlegungen sowohl für photochrome Indikatoren selbst als auch für UV-C-Dekontaminationsprozesse.

Zitat: Su A, Grist SM, Geldert A, Gopal A, Herr AE (2021)Quantitative UV-C-Dosisvalidierung mit photochromen Indikatoren für eine informierte N95-Notfalldekontamination. PLoS ONE 16(1): e0243554. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0243554

Editor: Jaeyoun Kim, Iowa State University, VEREINIGTE STAATEN

Empfangen: 12. August 2020 Akzeptiert: 23. November 2020 Veröffentlicht: 6. Januar 2021

Urheberrechte ©: © 2021 Su et al. Dies ist ein Open-Access-Artikel, der unter den Bedingungen der Creative Commons Attribution License vertrieben wird und die uneingeschränkte Verwendung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium gestattet, sofern der ursprüngliche Autor und die Quelle angegeben werden.

Datenverfügbarkeit: Alle relevanten Daten befinden sich in der Veröffentlichung und in den Dateien mit den Hintergrundinformationen.

Finanzierung: Wir danken der University of California, dem COVID-19 Emergency Research Fund des Berkeley College of Engineering Dean, dem NIH-Ausbildungsstipendium unter der Auszeichnung #T32GM008155 (A. Su und A. Geldert), dem National Science Foundation Research Fellowship Award #DGE 1106400 ( A. Su), National Defense Science and Engineering Graduate (NDSEG) Fellowship (A. Geldert), the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) Postdoc-Stipendium (PDF, SM Grist) und Postgraduiertenstipendium (PGS-D 487496, A. Gopal), University of California, Berkeley-Siebel-Stipendien (A. Su und A. Gopal) und das Chan Zuckerberg Biohub Investigator Program (PI: AE Herr).

Konkurrierende Interessen: Die Autoren haben erklärt, dass keine konkurrierenden Interessen bestehen.


Ergebnisse

Um die Gleichwertigkeit der Proben in Bezug auf die Infektionsdauer (die die Viruslast und die Genomdiversität beeinflusst haben könnte) sicherzustellen, wurden selbstberichtete Informationen von Patienten verwendet. Die Proben wurden so ausgewählt, dass es keinen signifikanten Unterschied in der mittleren Zeit bis zum Einsetzen der Symptome für die hospitalisierte Überlebende-Gruppe (6,4 Tage) und für die hospitalisierte tödliche Gruppe (5,9 Tage) gab. Hinsichtlich der Sequenzqualität wurden Daten aus den Blutproben einbezogen, wenn die endgültig assemblierte dominante EBOV-Genomsequenz länger als 18.800 Nukleotide und ohne Lücke (N) war. Unter Verwendung sowohl der Äquivalenz der Infektion als auch der Sequenzlesequalität, um die Probenqualität zu filtern, betrug die Anzahl der Vergleichsproben 38 Überlebende im Krankenhaus und 96 tödliche Fälle im Krankenhaus. Die allgemeine Statistik dieser Fälle ist in Zusatzdatei 1: Tabelle S1 zusammengefasst.

Entsprechend den Beobachtungen aus Guinea [2] war die EBOV-Belastung bei Akutpatienten bei der Vorstellung in der hospitalisierten Gruppe mit tödlichem Ausgang im Durchschnitt signifikant höher als in der Gruppe mit hospitalisierten Überlebenden (Abb. 1a). Um die virale Genompopulation in einem Individuum zu bestimmen, wurden Reads einem Referenz-EBOV-Genom zugeordnet, um eine dominante virale Genomsequenz zu nennen. Dies wurde als Vorlage in der zweiten Kartierungsrunde verwendet, um das Referenz-EBOV-Genom für jeden einzelnen Patienten zu generieren. Die Variation in den vier Nukleotiden an jeder Stelle entlang des Referenz-EBOV-Genoms wurde für den einzelnen Patienten gezählt. Ein gleitendes Fenster von 200 Nukleotiden wurde verwendet, um die durchschnittliche Häufigkeit der Nukleotidvariation entlang des Genoms abzuleiten und zu vergleichen.

Ebola-Genom-weite Mutations-Bias und Viruslast. ein Vergleich der Viruslast (1/Ct) bei hospitalisierten tödlichen versus hospitalisierten überlebten Blutproben, die während der Akutphase bei Aufnahme in ein Ebola-Virus-Behandlungszentrum entnommen wurden. Diese Daten folgten der Normalverteilung, also P Werte wurden mit einem zweiseitigen . berechnet T Prüfung. B Vergleich der Nukleotidvariation von der dominanten Genomsequenz bei einem einzelnen Patienten in hospitalisierten tödlichen versus hospitalisierten überlebten Fällen. Die Variationshäufigkeit wurde durch Transversions- oder Übergangsabweichungen unter Verwendung eines 200-Nukleotid-Gleitfensters berechnet, und die P Die Werte wurden mit einem einseitigen Wilcoxon-Rangsummentest berechnet, da die Daten keiner Normalverteilung entsprachen. C Q-Q-Plots wurden verwendet, um die Verteilung der durchschnittlichen Nukleotidabweichung bei einem einzelnen Patienten in hospitalisierten tödlichen gegenüber hospitalisierten überlebten Fällen zu vergleichen, wobei ein 200-Nukleotid-Gleitfenster entlang des Genoms für hospitalisierte überlebte gegenüber hospitalisierten tödlichen Fällen verwendet wurde. D Durchschnittliche Nukleotidvariation entlang des Ebola-Genoms, berechnet durch Substitutionen, die entweder zu Transversions- oder Übergangsänderungen unter Verwendung eines 200-Nukleotid-Gleitfensters führen. e Vergleich der Viruslast (1/Ct) in hospitalisierten tödlichen versus hospitalisierten überlebten Fällen. Ein zweiseitiger Spearman-Rangkorrelationstest wurde verwendet, um die Korrelation der durchschnittlichen Nukleotidvariation und der Viruslast (1/Ct) jeder Probe eines Patienten abzuschätzen, wobei die R Wert ist der Korrelationskoeffizient im Bereich von − 1 (starke negative Korrelation) und + 1 (starke positive Korrelation) und P ist der P Wert für diesen Test

Die Daten lieferten Informationen über die dominante virale Genomsequenz und die Häufigkeit und Position von Nebenvarianten im EBOV-Genom zwischen der Gruppe der hospitalisierten Überlebenden und der Gruppe der hospitalisierten Todesopfer. Diese entsprachen den Transitions- und Transversionsvariationen der dominanten viralen Genomsequenz (Abb. 1b, c). Im Allgemeinen war die Häufigkeit von Nebenvarianten, die Übergänge darstellten, höher als die Häufigkeit von Transversionen. Die Variation in der Häufigkeit sowohl von Transitions- als auch Transversionsabweichungen war in der hospitalisierten Überlebendengruppe größer als in der hospitalisierten Gruppe mit tödlichem Ausgang (Abb. 1b). Um die Verteilung dieser Abweichungen über das Genom zu untersuchen, wurde die durchschnittliche Häufigkeit der Nebenvarianten entlang des EBOV-Genoms aufgetragen (Abb. 1d). Dies zeigte, dass es Regionen entlang des Genoms gab, einschließlich des L-Gens, die eine größere Abweichung von der dominanten viralen Genomsequenz aufwiesen, und auch, dass in einer Region von GP Transversionen häufiger auftraten als Übergänge in EBOV-Genomen von hospitalisierten Überlebenden im Vergleich zu hospitalisierten tödlichen Fällen (Zusatzdatei 1: Abb. S1).

Die Häufigkeit der Abweichung von der dominanten viralen Genomsequenz kann durch die Viruslast beeinflusst worden sein, und je mehr Genome vorhanden sind, desto mehr Variationen könnten existieren. Um dies zu untersuchen, wurde ein Spearman-Rangkorrelationstest durchgeführt (Abb. 1e). Dies zeigte, dass die Häufigkeit von Transitions- und Transversionsabweichungen von der dominanten viralen Genomsequenz negativ mit der Viruslast zusammenhing. Die Daten deuteten auf eine größere Diversität der EBOV-Genome bei Patienten mit niedrigerer Viruslast im Vergleich zu Patienten mit hoher Viruslast hin. Ein verallgemeinertes lineares Modell (glm) wurde verwendet, um diese Beobachtung zu untersuchen und zeigte keinen signifikanten Unterschied in der Steigung und dem Schnittpunkt zwischen Überlebenden und Getöteten in irgendeinem Diagramm von Abb. 1e (Zusätzliche Datei 1: Tabelle S2). Dies deutete darauf hin, dass es bei der dominanten viralen Genomsequenz, die in hospitalisierten Überlebenden und in hospitalisierten tödlichen Fällen bei der Präsentation mit derselben Viruslast vorhanden war, keine Unterschiede in den Übergängen oder Transversionen gab.

Die Population der Nebenvarianten kann zu nicht-synonymen Veränderungen geführt haben, die eine funktionelle Divergenz von der dominanten viralen Genomsequenz aufwiesen, was zu Unterschieden in der primären Aminosäuresequenz von der durch das dominante virale Genom kodierten führte. Dies würde zu Neutralität, Verlust oder Funktionsgewinn des betroffenen viralen Proteins führen. Wenn die Nebenvariante einen signifikanten Anteil der Viruspopulation ausmachte, können jegliche Veränderungen der viralen Proteinfunktion aufgrund der Nebenvariante eine Gesamtwirkung auf die Aktivität des viralen Proteins bei der Infektion gehabt haben.

Um dies zu untersuchen, wurde der Aminosäuresequenzraum für alle EBOV-Proteine ​​bestimmt und der Beitrag von Nebenvarianten zur dominanten viralen Genomsequenz verglichen (Abb. 2a und Zusatzdatei 1: Abb. S2). Im Allgemeinen führten kleinere Varianten zu einer geringen Häufigkeit von Veränderungen der Hintergrundproteinsequenz in allen EBOV-Proteinen (die dominante virale Genomsequenz war definitionsgemäß immer noch die Mehrheitssequenz). In VP24 und L gab es jedoch mehrere Peaks, bei denen die Häufigkeit der Nebenvarianten dazu geführt hätte, dass 20 % oder mehr des Proteinraums eine andere Aminosäure an dieser Position aufwiesen ( 2a ). Die geringfügigen Variantenänderungen in VP24 führten dazu, dass eine Aminosäure in den kleineren Varianten vorhanden war, die sich von der dominanten viralen Genomsequenz unterschied, aber sowohl für hospitalisierte Überlebende als auch für hospitalisierte tödliche Fälle ähnlich war ( 2a ). Beim L-Protein zeigten drei dieser Stellen zwischen hospitalisierten Überlebenden und hospitalisierten tödlichen Fällen den höchsten Unterschied mit dem signifikantesten P Werte als alle anderen Aminosäurestellen von EBOV-Proteinen: Positionen 572, 986 und 2061 (Abb. 2a, b Zusätzliche Datei 1: Abb. S2). Diese Abweichungen von der dominanten viralen Genomsequenz korrelierten stark negativ mit der Viruslast (für jede Position R Wert war kleiner als − 0,69 (Bereich − 1 bis + 1) (Abb. 2c–e). Diese Veränderungen waren hauptsächlich Transversionen, außer an Position 986, wo es sich überwiegend um Übergänge handelte (Abb. 3). Außerdem zeigte ein glm signifikante Unterschiede in Steigung und Abschnitt zwischen Überlebenden und Getöteten in den in Abb. 2c–e dargestellten Daten (Zusatzdatei 1: Tabelle S2). Dies deutet darauf hin, dass die Häufigkeit nicht-synonymer Veränderungen an den Positionen 572, 986 und 2061 des L-Proteins bei gleicher Viruslast (1/Ct-Wert) zwischen hospitalisierten Überlebenden und hospitalisierten Todesfällen signifikant unterschiedlich war.

Analyse nicht-synonymer Veränderungen und deren Korrelation mit der Viruslast bei Akutpatienten. ein Die durchschnittliche nicht-synonyme Variation der Codonfrequenz an jeder Aminosäurestelle jedes EBOV-Proteins. B Vergleich der nicht-synonymen Nukleotid-Substitutionshäufigkeit im L-Protein an den Positionen 572, 986 und 2061 und der P Die Werte wurden mit einem einseitigen Wilcoxon-Rangsummentest berechnet. C Ein zweiseitiger Spearman-Rangkorrelationstest wurde verwendet, um die Korrelation der durchschnittlichen nicht-synonymen Abweichung in viralen Genomen mit der Viruslast (1/Ct) an den Positionen 572, 986 und 2061 bei Patienten zu schätzen, die entweder im Krankenhaus mit tödlichem Ausgang oder im Krankenhaus überlebten Fällen behandelt wurden. bei dem die R Wert ist der Korrelationskoeffizient im Bereich von − 1 (starke negative Korrelation) und 1 (starke positive Korrelation) und P ist P Wert für diesen Test

Vergleich zwischen Ts- und Tv-Verhältnissen, die zu einer nicht-synonymen Änderung der Positionen 572, 986 und 2061 im L-Protein und Position 28 in VP24 führten. Die P Werte wurden mit einem einseitigen Wilcoxon-Rangsummentest berechnet

Die vorherrschenden Aminosäureveränderungen, die durch Nebenvarianten an den Positionen 572, 986 und 2061 im L-Protein verursacht werden, sind in Zusatzdatei 1 gezeigt: Abb. S3. Diese umfassen N572S, Q986R und F2061S und sind häufiger in der Population der kleineren EBOV-Varianten in der Gruppe der hospitalisierten Überlebenden als in der Gruppe der hospitalisierten Todesopfer (Abb. 4a). Darüber hinaus korrelierte ihre Verwendung mit einer geringeren Viruslast bei den Patienten und damit der Kategorie der hospitalisierten Überlebenden (Abb. 4b). Eine der Abweichungen von der dominanten Genomsequenz im L-Protein an Position 986 betraf ein Stop-Codon und hätte zu einem verkürzten L-Protein geführt. Dieses Stoppcodon war häufiger, wenn auch bei weniger Patienten, in den hospitalisierten Überlebenden gegenüber den hospitalisierten tödlichen Fällen vorhanden (Abb. 5a, b). Zum Beispiel erreichte bei einem hospitalisierten Überlebenden das Stoppprotein an Position 986 eine Häufigkeit von ungefähr 15% in der Population der Nebenvarianten. Tatsächlich waren Stopcodons in allen EBOV-Proteinen mit geringer Häufigkeit vorhanden (Fig. 5a), aber sie erschienen häufiger an Position 986 im L-Protein als an irgendeiner anderen Position in viralen Proteinen (Fig. 5c). Ähnlich wie bei den anderen Aminosäureveränderungen, die durch kleinere Varianten an den Positionen 572, 986 und 2061 verursacht wurden, war die Stoppcodon-Frequenz an Position 986 bei hospitalisierten Überlebenden häufiger als bei hospitalisierten tödlichen Fällen (Abb. 5a, b) und war auch negativ mit viralen korreliert Belastung (Abb. 5d). Der glm zeigte signifikante Unterschiede in Steigung und Achsenabschnitt zwischen den Daten von hospitalisierten Überlebenden und hospitalisierten tödlichen Fällen in Abb. 5d (Zusätzliche Datei 1: Tabelle S2). Dies deutete darauf hin, dass das Stoppcodon in einer größeren Häufigkeit an Position 986 des L-Proteins unter der gleichen Viruslast (1/Ct-Wert) vorhanden war.

ein Vergleich von drei Aminosäurevariationshäufigkeiten im L-Protein an den Positionen 572, 986 und 2061. P Die Werte wurden mit dem einseitigen Wilcoxon-Rangsummentest berechnet. B Ein Spearman-Rangkorrelationstest wurde verwendet, um die Korrelation dieser drei Aminosäurevariationshäufigkeiten mit der Viruslast (1/Ct) an den Positionen 572, 986 und 2061 abzuschätzen, wobei die R Wert ist der Korrelationskoeffizient im Bereich von − 1 (stark negative Korrelation) bis + 1 (stark positive Korrelation) und P ist der P Wert für diesen Test. In ein und B, es werden nur die Proben mit mindestens Aminosäurevariation angezeigt

Analyse der Häufigkeit der Substitution von Stopcodons in viralen Proteinen und der Viruslast. ein Vergleich der Stoppcodonfrequenz im L-Protein an Position 986. P Die Werte wurden mit dem einseitigen Wilcoxon-Rangsummentest berechnet, wobei die durchschnittliche Stoppcodon-Frequenz an Position 986 im EBOV L-Protein und das Verhältnis zwischen hospitalisierten tödlichen und hospitalisierten überlebten Fällen lag. B Ein Q-Q-Plot wurde verwendet, um die Verteilung des Stopcodons an Position 986 im L-Protein zwischen hospitalisierten tödlichen und hospitalisierten überlebten Fällen zu vergleichen. Die Werte unterhalb der Linie deuten darauf hin, dass die Daten, d. h. das Vorhandensein des Stoppcodons, bei den hospitalisierten Überlebenden häufiger vorkamen. C Die Zusammenfassung der Stoppcodon-Häufigkeit in allen EBOV-Proteinen im Vergleich zwischen hospitalisierten tödlichen und hospitalisierten überlebten Fällen. D Ein zweiseitiger Spearman-Rangkorrelationstest wurde verwendet, um die Korrelation der Stoppcodon-Frequenz mit der Viruslast (1/Ct) an Position 986 abzuschätzen, wobei die R Wert ist der Korrelationskoeffizient im Bereich von − 1 (stark negative Korrelation) bis + 1 (stark positive Korrelation) und P ist der P Wert für diesen Test. In B, D und e, werden nur die Proben mit mindestens einem Stopcodon gezeigt. In ein, C und D, es werden nur die Proben mit mindestens einem Stopcodon angezeigt

Wir postulierten, dass Änderungen der Häufigkeit der Nebenvarianten und die gleichzeitige Änderung des Aminosäureverbrauchs im L-Protein an den Positionen 572, 986 und 2061 einen negativen Einfluss auf die Virusbiologie gehabt hätten – angesichts der Korrelation mit einer verringerten Viruslast bei Patienten (Abb. 2c .). –e, Abb. 4b und Abb. 5d). Das L-Protein der Filoviren und der weiteren Familie der Mononegavirales hat eine konservierte Struktur mit funktionellen Domänen, die durch Hinge-Regionen getrennt sind (Fig. 6a). Obwohl das Vorhandensein eines Stoppcodons ein verkürztes Protein erzeugen würde ( 6b ), könnte dieses biologisch aktiv geblieben sein, da es C-terminal der katalytischen Domäne für die RNA-Synthese war [17]. Mehrere Studien haben gezeigt, dass einzelne Domänen des L-Proteins in Mononegavirales haben biologische Aktivität, und eine exogene Sequenz kann in die Scharnierregionen eingefügt werden, während die Funktion erhalten bleibt [18,19,20]. Ebenso kann die Expression von L-Protein innerhalb eines bestimmten Bereichs für eine optimale virale RNA-Synthese erforderlich sein [21].

Funktionalität von LHALT und ich3mut in einem EBOV-Transkriptions-/Replikationsplasmid-basierten System (Mini-Genom) in Zellkultur. ein, B Schematische Darstellung der konservierten Domänen (graue Kästchen), funktionellen Motive (lila) und variablen Regionen oder Scharnieren (unstetige grüne Linie) in EBOV L3mut und ichHALT. Dieses Diagramm basiert auf Daten für Filovirus- und Mononegavirus-Modelle für das L-Protein. Die konservierten Blöcke I–III bilden eine RdRp, die eng mit einer Capping-Domäne (Cap) verbunden ist. Block VI weist Methyltransferase (MTase)-Aktivität auf und befindet sich stromabwärts davon in einer kleinen C-terminalen Domäne (CTD). Rot markierte die Aminosäureposition, an der die ein drei am häufigsten gefundene Aminosäureveränderungen im L-Protein an den Positionen 572, 98s und 2061 lokalisiert sind und B das verkürzte Protein aufgrund des Stoppcodons in L. C Aktivität des EBOV-Mini-Genomsystems bei unterschiedlichen Verhältnissen zwischen EBOV L und LHALT und D bei gleichem EBOV L aber unterschiedlichem LHALT Beträge. Die Ergebnisse sind als Mittelwert ± S.D. aus einem Experiment, das in dreifacher Ausführung durchgeführt wurde. ***P < 0,001 **P < 0,01 *P < 0,05. Western-Blot für Luciferase (LUC), EBOV L/LHALT und die haushaltsmäßige GAPDH-Proteinhäufigkeit in Zellen, die mit dem Mini-Genomsystem transfiziert wurden. e Aktivität des EBOV-Mini-Genomsystems in Gegenwart von L, no L und L3mut und bei unterschiedlichen Verhältnissen zwischen L und L3mut. Blotting zeigte LUC- und GAPDH-Häufigkeit in Zellen, die mit den Mini-Genomsystem-Plasmiden transfiziert waren. F VP35-eGFP wurde in einem Co-Immunpräzipitations-(coIP)-Assay verwendet, um seine Wechselwirkung mit EBOV L . zu untersuchenHALT. Blotting zeigte die Anwesenheit von eGFP und viralen Proteinen VP35/eGFP, VP35, L und NP in den Zelllysaten (Input (I)) und der coIP-Fraktion (Eluat (E)). g Vorgeschlagenes Modell des Wettbewerbs zwischen EBOV L und LHALT für den viralen RdRp-Cofaktor VP35 und die potenzielle Verringerung der EBOV-RNA-Synthese, die bei Patienten mit niedrigerer Viruslast beobachtet wurde (Einschubfeld)

Um die Aktivität eines verkürzten L-Proteins aufgrund des Stopcodons an Position 986 und Aminosäureveränderungen aufgrund kleinerer Varianten zu untersuchen, haben wir ein im Labor entwickeltes Mini-Genomsystem für das Ebola-Virus Makona verwendet [22]. Hier werden die für die RNA-Synthese benötigten viralen Proteine ​​L, NP, VP30 und VP35 bereitgestellt in trans aus Helferexpressionsplasmiden. Diese treiben die Replikation des Mini-Genoms und die Transkription einer Luciferase-Reporter-mRNA an, deren cDNA zwischen den 3'- und 5'-UTRs des EBOV-Genoms eingefügt wurde. Es wurde gezeigt, dass solche Systeme die virale RNA-Synthese getreu rekapitulieren [23]. Die Insertion der Luciferase-cDNA und die damit einhergehende Aktivität des Luciferase-Reporterproteins stellt durch Substitution in den Helferexpressionsplasmiden ein schnelles Auslesen für die funktionelle Analyse von viralen Proteinen und Varianten bereit.

Die Aktivität des verkürzten L-Proteins durch den Austausch des Q an Position 986 durch ein Stoppcodon (bezeichnet als LHALT) wurde mit dem Wildtyp-L-Protein verglichen. Hier wurde die Aktivität von Luciferase zwischen Mini-Genomsystemen verglichen, die durch das L-Protein-Expressionsplasmid unterstützt wurden oder bei denen dieses Plasmid ausgeschlossen wurde, oder eine Kombination von sowohl dem L-Protein als auch LHALT Expressionsplasmide oder die LHALT nur Expressionsplasmid. Alle anderen Trägerplasmide, die NP, VP30 und VP35 exprimieren, wurden wie üblich bereitgestellt (Fig. 6c, Zusätzliche Datei 1: Fig. S4). Western Blot bestätigte die Expression von L und LHALT. In Übereinstimmung mit früheren Beobachtungen führte der Ausschluss des L-Proteins zu einer im Hintergrund beobachtbaren Luciferase-Aktivität im Vergleich zum Wildtyp-L-Protein (Fig. 6c, Zusätzliche Datei 1: Fig. S4). Da das Verhältnis von LHALT zu L-Expressionsplasmid erhöht war, gab es eine abnehmende Luciferase-Aktivität, so dass mit LHALT nur unterschied sich der Luciferasespiegel nicht signifikant vom Ausschluss des L-Protein-Expressionsplasmids (Fig. 6c, Zusätzliche Datei 1: Fig. S4). Dies deutete darauf hin, dass die LHALT konnte nicht als RdRp funktionieren. Um den möglichen Verlust der Gesamtfunktion der L-Proteinaktivität zu untersuchen, wurden steigende Mengen an LHALT Expressionsplasmid wurden eintitriert, wobei äquivalente Mengen an pUC57 zugegeben wurden, um die Gesamtmenge an DNA während der Transfektion aufrechtzuerhalten. Hier gilt für alle Beträge des LHALT des getesteten Expressionsplasmids gab es eine signifikante Verringerung der Luciferase-Aktivität durch die ausschließliche Verwendung des L-Expressionsplasmids (Fig. 6d, Zusätzliche Datei 1: Fig. S5). Es gab jedoch keinen signifikanten Unterschied in der Luciferase-Aktivität für alle Mengen des L .HALT. Da N572S-, Q986R- und F2061S-Substitutionen als Folge von Nebenvarianten beim gleichen Patienten vorliegen könnten (Zusatzakte 1: Abb. S3). Um die Aktivität dieser Mutationen im Zusammenhang mit dem L-Protein zu bewerten, wurde eine Expressionsvariante namens L3mut wurde konstruiert, wo alle drei Mutationen vorhanden waren. Die Daten zeigten, dass die Aktivität von L3mut war im Vergleich zum Wildtyp-L-Protein signifikant reduziert (Abb. 6e, zusätzliche Datei 1: Abb. S6), auch wenn sowohl Wildtyp-L-Protein als auch L3mut wurden gleichzeitig geäußert.

Daraus postulierten wir, dass diese Nebenproteinvarianten nicht nur keine (LHALT) oder reduzierte Aktivität (L3mut), können sie auch als Senke gewirkt haben, um andere virale Proteine, die für die virale RNA-Synthese benötigt werden, von der dominanten viralen Genomsequenz für das L-Protein zu sequestrieren. Um diese Hypothese zu testen, ist die Fähigkeit von LHALT Wechselwirkungen mit VP35, einem bekannten Polymerase-Cofaktor für das L-Protein und essentiell für die Replikation und Transkription [24,25,26], wurde untersucht. Die Fähigkeit von LHALT mit VP35 zu assoziieren wurde mit L-Protein unter Verwendung eines Co-Immunpräzipitationsassays verglichen. Hier wurde VP35 C-terminal im Leseraster mit Enhanced Green Fluorescence Protein (eGFP) markiert (unter Bildung von VP35-eGFP), um eine Co-Immunpräzipitation mit einem hochspezifischen einkettigen Antikörper zu ermöglichen. Dieser Ansatz wurde verwendet, um die Interaktionspartner einer Vielzahl von viralen Proteinen zu untersuchen, z. [22, 27, 28]. Obwohl im Vergleich zu Wildtyp-VP35 etwas verringert, ermöglichte VP35-eGFP im Kontext des Mini-Genomsystems immer noch die Erzeugung von Luciferase-Aktivität (Daten nicht gezeigt), was darauf hindeutet, dass das Protein durch seine Wechselwirkungen mit den L-Protein. Co-Immunpräzipitation zeigte, dass VP35-eGFP verwendet werden könnte, um entweder das L-Protein oder L . herunterzuziehenHALT Protein, aber nicht NP (Abb. 6f, Zusatzdatei 1: Abb. S7). Insgesamt stützen die Daten ein Modell (Abb. 6g), in dem das Vorhandensein von LHALT Protein trägt zur Verringerung der Viruslast bei Patienten bei ( 6g , Einschubfeld) möglicherweise sowohl durch das Fehlen von RdRp-Aktivität als auch durch die Fähigkeit, als Senke für virale Proteine ​​zu wirken, die ansonsten für die RNA-Syntheseaktivität benötigt werden.


Warum diese Berechnung zu einfach sein kann

Diese Berechnung ist möglicherweise zu einfach, da ihre Annahmen über die Eingaben — x und R0 — kann falsch und insbesondere zu optimistisch sein. Es kann auch zu einfach sein, denn während es davon ausgeht x und R0 sind feste Zahlen, sie können tatsächlich variieren. Insbesondere kann der Infektionsschutz x im Laufe der Zeit abnehmen und R0 variiert wahrscheinlich von Ort zu Ort. Es gibt auch einige Faktoren, die helfen könnten, den Anteil zu reduzieren, den wir impfen müssen, um dies zu erreichen Rvac(T) <1.

Unsicherheit und Variation in R0

Wie oben erwähnt, gab es viele frühe Schätzungen von R0 in den frühen Tagen von COVID-19. Bei allen neuen Epidemien sind diese Schätzungen schwierig. Die meisten Schätzungen verwenden die exponentielle Wachstumsrate in Fällen und das serielle Intervall oder die Zeit zwischen einer Infektion und einer Übertragung durch diese Infektion [5]. Jede dieser Größen wird auf seit langem verstandene Weise mit Fehlern gemessen. Frühe Fallzahlen unterliegen beispielsweise einer unterschiedlichen Erkennungsempfindlichkeit, da Überwachungssysteme sich bemühen, eine neue Herausforderung zu meistern. Im Laufe der Zeit kann die Überwachung empfindlicher werden, da mehr Tests durchgeführt werden, oder weniger empfindlich, wenn die Systeme überfordert sind [6], diese Zeittrends können sich als schnelleres bzw. langsameres Wachstum der Epidemie tarnen. Verzögerungen bei der Berichterstattung können dazu führen, dass der jüngste Teil einer Epidemiekurve weniger steil aussieht, was zu Unterschätzungen der Wachstumsraten führt [7]. Serielle Intervalle können sich ändern (normalerweise verkürzen), wenn Kontrollmaßnahmen ergriffen werden [8,9], wobei Schätzungen von . verzerrt werden R0 auf komplexe Weise. Abgesehen von diesen Vorurteilen, R0 ist sowohl eine soziale als auch eine biologische Variable, die Demografie und Verhaltensmuster in der Bevölkerung widerspiegelt, daher ist zu erwarten, dass sie selbst bei derselben Infektionskrankheit zwischen den Bevölkerungsgruppen variiert [10]. Das Ergebnis ist, dass einige der höheren Schätzungen deutlich über dem Bereich von 2-3 für . liegen R0 von SARS-CoV-2, zumindest für einige Bevölkerungsgruppen mit hohen Kontaktraten, nicht ausgeschlossen werden [11].

Unsicherheit in x, Teil 1

Der primäre Endpunkt in allen randomisierten klinischen Studien mit SARS-CoV-2-Impfstoffen war bisher die Verringerung der durch SARS-CoV-2 verursachten symptomatischen COVID-19-Erkrankung. Dies ist der Endpunkt, an dem die Schätzungen von

95 % wurden für die beiden mRNA-Impfstoffe erhalten. Impfstoffe können drei verschiedene Arten von vorteilhaften Wirkungen haben [12]. Sie können reduzieren:

  • Anfälligkeit für Infektionen. Das bedeutet, dass eine geimpfte Person, die dem Virus ausgesetzt war, mit größerer Wahrscheinlichkeit nicht infiziert bleibt, als wenn sie ungeimpft gewesen wäre. Die Wirksamkeitskomponente, die diese Aktivität widerspiegelt, wird als Impfstoffwirksamkeit für die Anfälligkeit bezeichnet oder VES.
  • Fortschreiten zu Symptomen. Dies bedeutet, dass eine geimpfte Person, die sich ansteckt, weniger Symptome hat als wenn sie ungeimpft ist und sich infiziert. Diese Komponente ist als Impfstoffwirksamkeit gegen das Fortschreiten bekannt. VEP.
  • Ansteckungsgefahr für andere. Das bedeutet, dass eine geimpfte Person, die sich infiziert, weniger andere Menschen ansteckt, als wenn sie ungeimpft wäre und sich infiziert. Diese Komponente ist als Impfstoffwirksamkeit gegen Infektiosität bekannt. VEich.

Der in Studien gemessene primäre Endpunkt ist eine Kombination aus VES und VEP. Eine Person kann den Endpunkt (symptomatische Infektion) vermeiden, indem sie eine Infektion vermeidet oder indem sie sich ansteckt, aber Symptome vermeidet. Allein aus dem primären Ergebnis können wir etwas über die möglichen Werte von ableiten VES und VEP, aber nicht trennen. Das Ergebnis von 95 % könnte zum Beispiel darauf zurückzuführen sein, dass Personen rein vor einer Infektionsanfälligkeit geschützt waren, ohne die Progression zu beeinflussen (VES= 95% und VEP= 0) oder genau umgekehrt — kein Schutz vor Ansteckung, aber Schutz vor Progression (VEP= 95% und VES= 0).

Für Herdenimmunität ist uns wichtig VES und VEich. Wenn sich eine Person nicht ansteckt, kann sie nicht übertragen, also VES trägt bei zu x. Wenn sie sich infizieren, aber für andere weniger ansteckend sind, trägt dies zur Herdenimmunität bei VEich trägt bei zu x. Tatsächlich ist die Beziehung diese: x = 1 – (1 – VES)(1 – VEich). Größere Werte von VES und VEich in größere Werte von übersetzen x, und wenn einer von beiden 100% ist, dann x ist 100 %.

Der primäre Endpunkt sagt uns nichts über VEich und während es uns einige Informationen über wahrscheinliche Werte von . gibt VES, es schließt keinen von ihnen aus [13].

Zwei der abgeschlossenen Impfstoffstudien enthalten einige Informationen über VES. Die Moderna-Impfstoffstudie zeigte eine 63%ige (95%-KI 32-80%) Reduktion der PCR+-Abstriche bei den Impfstoff- vs. Placebo-Teilnehmern, wenn sie zum Zeitpunkt ihrer zweiten Impfstoffinjektion abgetupft wurden. In einer der beiden Impfdosen, die in der Astra-Zeneca-Schimpansen-Adenovirus-vektorisierten Impfstoffstudie [14] verabreicht wurden, kam es zu einer 58,9 %igen (1,0-82,9 %) Reduktion der asymptomatischen Verschleppung auf Abstrichen von geimpften vs. Placeboempfängern, ohne statistischer Unterschied in der anderen Dosis. Zusammen spiegeln diese Ergebnisse wahrscheinlich positive Werte von VES und/oder VEich und damit positive Werte von x, aber die Unsicherheit ist groß. Einige, aber nicht alle Tierstudien der bisher in dieser Mitteilung besprochenen Impfstoffe deuteten auf Auswirkungen auf die Anfälligkeit und/oder Infektiosität hin, so dass es nicht überraschend ist, einige Hinweise auf eine Wirkung beim Menschen zu sehen.

Es ist erwähnenswert, dass viele andere virale Impfstoffe die Übertragung dramatisch reduzieren, zum Beispiel Masern [15] und Influenza [16]. Einige Impfstoffe gegen Atemwegserreger, wie Pneumokokken-Impfstoffe [17] und azelluläre Pertussis-Impfstoffe [18], scheinen jedoch einen wesentlich höheren Schutz vor Krankheiten als vor Infektionen und Übertragungen zu bieten.

Alles in allem ist es sehr wahrscheinlich, dass auch die bestehenden Impfstoffe mit sehr hoher Wirksamkeit gegen symptomatische Infektionen einen Beitrag zur Reduzierung der Übertragung leisten. Es scheint jedoch sehr wahrscheinlich, dass sie nur einen teilweisen Schutz vor Infektionen und Übertragungen bieten, und die Höhe des Schutzes ist für die Berechnung von x und damit zur Abschätzung des kritischen Impfanteils F*.

Unsicherheit in x, Teil 2

Die Wirksamkeit von Impfstoffen gegen SARS-CoV-2 wurde sehr schnell gemessen, mit der Folge, dass die meisten Daten aus einer sehr kurzen Zeit stammen (

2 Monate) nach der Impfung. Es ist völlig normal, dass die Impfung Antikörperkonzentrationen produziert, die mit der Zeit, schnell über Monate und dann langsamer über Jahre [19] abnehmen, manchmal mit einem gleichzeitigen Rückgang des Schutzes. Bei anderen Impfstoffen ist die Antikörperkonzentration, die zum Schutz im Nasopharynx (wo eine SARS-CoV-2-Infektion stattfindet) erforderlich ist, höher als die, die zur Vorbeugung von Krankheiten erforderlich ist [20]. Es ist daher möglich, dass alle Maßnahmen zur Impfstoffwirksamkeit, einschließlich der Maßnahmen gegen die Übertragung, mit der Zeit seit der Impfung nachlassen.


Die Herstellung viraler Impfstoffe im kommerziellen Maßstab erfordert die Produktion großer Virusmengen als Antigenquelle. Um diese Mengen zu liefern, wird eine Reihe von Systemen für die Virusreplikation verwendet, die auf Säuger-, Vogel- oder Insektenzellen basieren. Um die inhärenten Beschränkungen der Produktionsergebnisse bei der seriellen Vermehrung von Zellen zu überwinden, können Säugerzellen immortalisiert werden, wodurch sich die Anzahl der Teilungen in Kultur erhöht. Modifikationen, die Zellen immortalisieren, werden typischerweise durch Mechanismen erreicht, die denen ähnlich sind, die normale Zellen in Krebszellen umwandeln. Somit würde das Vorhandensein restlicher Wirtszell-Nukleinsäuren in den endgültigen Impfstoffprodukten erhebliche Bedenken hinsichtlich des Potenzials für den Transfer und die Integration in das genetische Material eines Patienten aufwerfen.

PRODUKTFOKUS: IMPFUNGEN
PROZESSFOKUS: WEITERVERARBEITUNG
WER SOLLTE LESEN: VERFAHRENSINGENIEURE, QA/QC, ANALYTISCHE
SCHLÜSSELWÖRTER: CHROMATOGRAPHIE, BIOKATALYSE, TANGENTIALFLUSSFILTRATION, NUKLEINSÄURE NACHWEISASSAYS
NIVEAU: DAZWISCHENLIEGEND

Die Nukleinsäuren von Wirtszellen in Futtermitteln hängen vom Zell-/Virustyp und von den bei der Ernte verwendeten Methoden und Techniken ab. Das Vorhandensein von DNA kann zur Viskosität der Prozessflüssigkeit und zur Verschmutzung der Trennmedien beitragen, die nutzbare Kapazität verringern, eine gemeinsame Ausfällung verursachen und die Produktsicherheit gefährden. Das Risiko der Onkogenität und Infektiosität von Wirtszell-Nukleinsäure kann durch Unterdrückung ihrer biologischen Aktivität minimiert werden. Dies kann erreicht werden, indem die Menge an restlicher DNA und RNA verringert und deren Größe (mit enzymatischer/Nuklease- oder chemischer Behandlung) auf unter die funktionelle Genlänge von . verringert wird

Kationische Detergenzien — z. B. Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB) oder Domiphenbromid (DB)

Kurzkettige Fettsäuren (z. B. Caprylsäure)

Geladene Polymere — z. B. Polyethylenimin (PEI) und Polyacrylsäure (PAA)

Tri(n-butyl)phosphat (TNBP) mit Triton X-100 Reinigungslösung

Normal-Flow-Filtration (NFF) mit tiefengeladenen oder Kieselgur-haltigen Medien

Tangentialflussfiltration (TFF)

Chromatographie und Membranadsorber:

Anionenaustauschchromatographie (AEX)

Gelfiltration (Größenausschluss) Chromatographie

Hydrophobe Ladungs-Induktions-Chromatographie (HCIC)

Alkylierungsmittel (z. B. β-Propylacton)

Gesundheitsbehörden und Aufsichtsbehörden wie die US-amerikanische Food and Drug Administration (FDA) und die Europäische Arzneimittelbehörde (EMA) haben Grenzwerte für akzeptable Mengen an DNA-Resten in biologischen Endprodukten festgelegt. Gemäß den von der FDA veröffentlichten Anforderungen ist eine parenteral verabreichte Dosis auf 100 pg Rest-DNA begrenzt. Die EMA und die Weltgesundheitsorganisation (WHO) erlauben 10 ng pro parenterale Dosis und 100 μ g/Dosis für einen oral verabreichten Impfstoff (1). Oral verabreichte DNA wird etwa 10.000 &# weniger effizient aufgenommen als parenteral verabreichte Nukleinsäure.

Die biopharmazeutische Industrie verbessert weiterhin ihre Reinigungsverfahren, um potenzielle Risiken im Zusammenhang mit schädlichen immunologischen und biologischen Reaktionen durch Restverunreinigungen aus Wirtszellen und Kulturmedien zu minimieren. Hier beschreiben wir ein neues Verfahren zur Entfernung von Wirtszell-DNA- und/oder RNA-Verunreinigungen, das einige Vorteile gegenüber bekannten Ansätzen bietet. Wir fassen auch unsere Entwicklung eines Prozesses zusammen, der diesen neuen Ansatz berücksichtigt.

Ein typischer Zellkultur-basierter viraler Impfstoff-Produktionsprozess beginnt mit der Vermehrung einer ausgewählten “seed”-Zelllinie. Wenn die Kultur eine vorbestimmte Zelldichte erreicht hat, wird das interessierende Virus eingeführt (geimpft) und beginnt sich zu replizieren. Einige Tage später wird das Virus direkt aus den Wirtszellen, aus dem Kulturüberstand oder beidem geerntet.

Wenn das Virus direkt aus den Wirtszellen geerntet wird, ist ein Zellaufschlussschritt erforderlich, um intrazelluläre Viren freizusetzen. Verfügbare Methoden zum Zellaufschluss lassen sich in zwei Hauptkategorien unterteilen: chemische (Detergenzien und Tenside, Enzyme, osmotischer Schock) und physikalisch-mechanisch (Hitze, Scherung, Rühren, Beschallung, Gefrieren-Auftauen). Säugetierzellen sind leicht zu brechen, daher sind die zu ihrem Aufbrechen verwendeten Methoden relativ mild und können Behandlungen wie die Verwendung von Detergenzien und/oder hypotonischem Puffer umfassen.

Wenn das Virus aus dem Überstand geerntet wird, ist kein Zellbruchschritt erforderlich, der Überstand kann direkt von Zelltrümmern geklärt werden. Wenn ein Virus sowohl aus Zellen als auch aus dem Überstand geerntet werden muss, werden die gesammelten Zellen aufgeschlossen, bevor die Virussuspension geklärt wird.

Methoden zur Entfernung von Nukleinsäuren

Die Menge an Wirtszellen-bezogenen Verunreinigungen (einschließlich Nukleinsäuren) in einer Prozessflüssigkeit variiert erheblich in Abhängigkeit von den für die Zelllyse und/oder Virusernte verwendeten Methoden. Der Kasten “DNA Removal” listet mehrere Techniken auf, die zur Reduktion und/oder Entfernung von genomischer DNA aus Zellkulturprozessströmen angewendet werden können. Aber all diese Methoden sind in der Art der Produkte und Prozesse, für die sie angewendet werden könnten, begrenzt.

Die Aufreinigung von Viren aus Zellsubstratbestandteilen wie DNA ist aus mehreren Gründen eine besonders anspruchsvolle Aufgabe bei der Herstellung viraler Impfstoffe:

Physikalische Ähnlichkeiten von Viren und Nukleinsäuren könnten die Auflösung und Selektivität einer angewandten Methode einschränken. Beispielsweise führen ähnliche elektrische Ladungen (sowohl Viren als auch Nukleinsäuren sind bei neutralem pH typischerweise negativ geladen) und Größe zu Einschränkungen bei der Trennung mit Chromatographie- und Filtrationsverfahren (Tabelle 1). Und Ähnlichkeiten im Sedimentationsverhalten könnten zu einer Copräzipitation führen.

Angewandte Techniken und Reagenzien können die Aktivität und Integrität der biologischen Viren beeinträchtigen und zu einem Verlust der Infektiosität und/oder Wirksamkeit aufgrund des Abbaus durch physikalische Kräfte (Scheren) oder Chemikalien (Detergenzien) führen. Caprylsäure kann beispielsweise behüllte Viren inaktivieren.

Einige Verfahren können dazu führen, dass Nukleinsäuren an ein interessierendes Produkt (Virus/Glykoprotein/Protein) binden, was die Effizienz nachgeschalteter Reinigungsverfahren beim Erreichen des erforderlichen Reinheitsgrads des Endprodukts verringert und die Verfahrensausbeuten und die Wirtschaftlichkeit beeinträchtigt.

Die meisten dieser Einschränkungen und Herausforderungen können minimiert werden, wenn die Menge der Nukleinsäure-Verunreinigung durch enzymatischen Abbau mit Endonukleasen reduziert wird. Solche Enzyme wirken, indem sie spezifisch die Hydrolyse der internen Phosphodiesterbindungen in DNA- und RNA-Ketten katalysieren und die Nukleinsäuren in kleinere Nukleotide zerlegen. Diese Enzyme, die von Natur aus in Bakterien vorkommen, schützen Zellen vor dem Eindringen fremder DNA. Die verschiedenen Typen dieser Nukleasen stammen aus unterschiedlichen Quellen.

Serratia marcescens ist ein Gram-ne
gatives pathogenes Bakterium, das (neben anderen Proteinen) eine sehr aktive Endonuklease sezerniert, die alle Formen von DNA und RNA (einzelsträngig, doppelsträngig, linear und zirkulär) ohne Sequenzspezifität spaltet. Die Nuklease spaltet Nukleinsäuren sehr schnell, mit einer katalytischen Geschwindigkeit, die fast 15&# schneller ist als die von Desoxyribonuklease I (DNase I) (2). Das Enzym zeigt Langzeitstabilität bei Raumtemperatur und ist sowohl in Gegenwart von ionischen als auch nichtionischen Detergenzien sowie vielen reduzierenden und chaotropen Mitteln aktiv. Aber es hat seine eigene proteolytische Aktivität. All diese Eigenschaften machen dieses Enzym nützlich für biotechnologische und pharmazeutische Anwendungen.

Eine gentechnisch veränderte Form von Serratia Nuklease (Benzonase von Merck Millipore, Darmstadt, Deutschland) wird unter Verwendung von Escherichia coli und rekombinante Technologie. Das Benzonase-Enzym ist ein Dimer aus identischen Untereinheiten mit einem Molekulargewicht

je 30 kDa (bei einer Gewichtssumme von

60kDa). Sein isoelektrischer Punkt liegt bei pH 6,85 und es ist in einem pH-Bereich von 6󈝶 und bei Temperaturen von 0󈞖 &176C funktionsfähig. Die Anwesenheit von Mg2 + (bei einer Konzentration von 1𔃀 mM) ist für die Aktivität dieses Enzyms erforderlich.

Das Benzonase-Enzym verdaut alle Formen von Nukleinsäuren, indem es sie in kleinere Oligonukleotide mit +-Konzentrationen, Temperatur, pH und der Anwesenheit (und Konzentration) von Benzonase-Inhibitoren und multivalenten oder monovalenten Salzen in Medien und deren Konzentrationen hydrolysiert. Und typische enzymatische Reaktionen können durch die Kinetik von Michaelis– Menten beschrieben werden (Gleichung 1).

Die volumetrische Reaktionsgeschwindigkeit (vrr) ist proportional abhängig von der maximalen Reaktionsgeschwindigkeit bei unendlicher Eduktkonzentration (vrrmax) und von der Substratkonzentration (S) der Nukleinsäuren DNA und RNA und die Michaelis-Konstante (Km).

Der höchste Km wird durch den Betrieb bei optimalem pH (8𔃇) und Temperatur (37 °C) erreicht. Obwohl höhere Temperaturen die Reaktionskinetik beschleunigen, führen die Notwendigkeit einer vereinfachten Kontrolle und/oder Bedenken hinsichtlich der Produktstabilität oft dazu, bei Raumtemperatur oder niedriger zu arbeiten. Mg2 + -Ionen werden benötigt, um eine optimale enzymatische Aktivität zu erreichen.

Ein weiterer kritischer Parameter ist die Startaktivität des Enzyms, daher wird die Enzymkonzentration in Einheiten (wie oben beschrieben) und nicht in tatsächlichen Konzentrationen angegeben. Bei einer hohen Konzentration von Wirtszell-Nukleinsäuren im Ausgangsfuttermaterial ist die maximale Reaktionsgeschwindigkeit unabhängig von deren Konzentration. Wenn der enzymatische Verdau fortschreitet und die Nukleinsäurekonzentration verringert wird, wird die Reaktion erster Ordnung und die Entfernungsrate wird verringert.

Einige Prozessadditive und -mittel beeinflussen die Benzonase-Aktivität. Das Enzym kann durch hohe Salzkonzentrationen gehemmt werden (Abbildung 3): > 300 mM monovalente Kationen, > 100 mM Phosphat, > 100 mM Ammoniumsulfat oder > 100 mM Guanidin-HCl. Andere bekannte Inhibitoren umfassen Chelatbildner. EDTA zum Beispiel könnte einen Verlust an freien Mg2 + -Ionen verursachen (EDTA-Konzentrationen > 1 mM hemmen nachweislich die enzymatische Reaktion), ein Effekt, der durch Zugabe von mehr MgCl . rückgängig gemacht werden kann2. Und die Anwesenheit von Komponenten wie 4M Harnstoff könnte einen gegenteiligen Effekt haben und die Benzonaseaktivität erhöhen.


Aerosolmodellierung erkennt infektiöse Dosis von SARS-CoV-2, Tröpfchen

Assistenzprofessor Saikat Basu vom Department of Mechanical Engineering der SDSU nutzte die strömungsmechanische Modellierung des Aerosoltransports sowie Daten aus anderen Forschungsstudien, um zu bestimmen, welche Tröpfchengrößen das neuartige Coronavirus am wahrscheinlichsten an die dominante Erstinfektionsstelle übertragen und abschätzen die minimale Anzahl von Viruspartikeln, die erforderlich ist, um eine Infektion auszulösen.

Newswise — Da immer mehr Amerikaner COVID-19-Impfungen erhalten, atmen wir vorerst gemeinsam auf. Trotzdem hilft ein Forscher der South Dakota State University bei der Vorbereitung auf die nächste Atemwegspandemie.

&bdquoAls die COVID-19-Pandemie ausbrach, mussten sich die Wissenschaftler weitgehend auf luftgestützte Übertragungsdaten verlassen, die nach der Grippepandemie von 1918 generiert wurden&rdquo, sagte der Assistenz-Maschinenbauprofessor Saikat Basu. &bdquoWir waren völlig unvorbereitet. Wir müssen quantitative Daten generieren und einen mehrstufigen Modellierungsrahmen entwickeln, der Wissenschaftlern hilft, nicht nur mit dieser Pandemie, sondern auch mit der nächsten umzugehen.&rdquo

Basu nutzte seine Expertise in der strömungsmechanischen Modellierung des Aerosoltransports in den menschlichen Atemwegen sowie Daten aus anderen Forschungsstudien, um zu bestimmen, welche Tröpfchengrößen das neuartige Coronavirus am wahrscheinlichsten in den Nasopharynx, die dominante Erstinfektion, tragen Seite? ˅. Darüber hinaus integrierte er andere COVID-19-Daten in das Modell, um die Mindestanzahl an Viruspartikeln abzuschätzen, die zum Auslösen der Infektion erforderlich ist, die als Infektionsdosis bekannt ist.

&bdquoMeines Wissens ist dies das erste Papier, das die Infektionsdosis von SARS-CoV-2 quantifiziert&rdquo, sagte Basu. Er räumte jedoch ein, „dies ist immer noch eine offene Herausforderung und wird durch epidemiologische Daten gestützt werden müssen.“

Basu beschrieb die infektiöse Dosis als „ein grundlegendes virologisches Maß für jede Infektion. Sie hat Einfluss darauf, wie wir topische antivirale Therapeutika und gezielte intranasale Impfstoffe entwickeln. Außerdem würde eine weltweite Impfung eine Weile dauern und wir brauchen ein robusteres Behandlungsschema für diejenigen, die krank werden.&rdquo

Die Ergebnisse werden in der aktuellen Ausgabe von Scientific Reports veröffentlicht, einer online begutachteten Open-Access-Publikation von Nature Research. &bdquoDies ist eine interdisziplinäre Herausforderung, die die Talente derjenigen erfordert, die in Bereichen wie Strömungsmechanik, Virologie und anderen Bereichen der biomedizinischen Wissenschaften arbeiten&rdquo, sagte Basu und merkte an, dass diese Veröffentlichung diese breite wissenschaftliche Gemeinschaft anspricht.

Basu's Forschung war Teil eines von der National Science Foundation finanzierten Projekts zur Entwicklung einer Maske mit einem wiederverwendbaren Atemschutzgerät, das das neuartige Coronavirus einfängt und inaktiviert. Darüber hinaus nutzte er Anschubfinanzierungen des Department of Mechanical Engineering der SDSU, um die numerische Strömungssimulation durchzuführen.

Berechnung von Tröpfchengrößen

Eine Zellkulturstudie der University of North Carolina in Chapel Hill zeigte, dass der Nasopharynx, der der obere Teil des Rachens hinter den Nasengängen ist und sich über der Speiseröhre und dem Kehlkopf befindet, als „am leichtesten zugängliche Saatzone&rdquo dient, erklärte Basu. Andere Studien, darunter eine an der Oxford University, haben diese Tatsache bestätigt.

"Die Schleimschicht in den vorderen Nasengängen erschwert es dem Virus, diese Zellen zu infizieren", sagte Basu. Darüber hinaus haben die Flimmerepithelzellen, die den Nasopharynx hinter der vorderen Nasenhöhle auskleiden, einen Oberflächenrezeptor, bekannt als ACE2, den das Virus verwendet, um in die Zellen einzudringen. Von dieser anfänglichen Infektionsstelle breitet sich die Infektion dann durch Aspiration der virusbeladenen Nasen-Rachen-Flüssigkeiten in die Lunge aus.

Um zu bestimmen, welche Tröpfchengrößen am ehesten den Nasopharynx erreichen, entwickelte Basu CT-basierte digitale Modelle des nasalen Luftraums zweier gesunder Erwachsener und simulierte vier Inhalationsraten von 15, 30, 55 und 85 Liter pro Minute.

&bdquoDie 15-Liter-Rate passiert, während Sie still sitzen und sanft atmen, und 30 würden ungefähr Ihrer Atemfrequenz beim Gehen entsprechen&ldquo, erklärte er. Kraftvolles Atmen fällt in den Bereich von 50 bis 75 Liter pro Minute.

&bdquoWenn die Virusübertragung über verschiedene Atemfrequenzen gemittelt wird, landen Tröpfchen mit einer Größe von 2,5 bis 19 Mikron am besten im Nasopharynx“ Diese Tröpfchengrößen waren größer als erwartet.

Abschätzung der Infektionsdosis

Basierend auf den Berichten über die Chorgruppe des Skagit Valley, in der eine Person COVID-19 auf 52 der 61 Chormitglieder übertrug, leitete Basu eine konservative Schätzung von etwa 300 Viruspartikeln oder Virionen als Infektionsschwelle ab und quantifizierte damit die Infektionsdosis SARS-CoV-2.

&bdquoDie Tatsache, dass die Anzahl der zum Auslösen der Infektion erforderlichen Viruspartikel im Bereich von Hunderten liegt, ist sehr bemerkenswert und zeigt, wie ansteckend dieses spezielle Virus ist“ Typischerweise erfordert eine inhalative Virusinfektion wie Influenza A 1.950 bis 3.000 Virionen.

Um die Wahrscheinlichkeit abzuschätzen, dass ein Tröpfchen mindestens ein Virion enthält, hat Basu eine Studie zur Virusmenge im Sputum und Schleim von COVID-19-Patienten verwendet und dann die umweltbedingte Dehydration berücksichtigt.

Eine prognostizierte Verringerung der Tröpfchengröße um ein Drittel bedeutet, dass die Wahrscheinlichkeit, dass ein 10-Mikrometer-Tröpfchen mindestens ein Virion enthält, von 0,37 % auf 13,6 % steigt, erklärte er. Für ein Tröpfchen von 15 Mikrometer erhöht sich diese Wahrscheinlichkeit auf 45,8%. Dies geschieht aufgrund der nichtflüchtigen Bestandteile in den virushaltigen Tröpfchen. Wenn der Wasseranteil der Tröpfchen verdunstet, steigt die Konzentration der Viruspartikel in den Tröpfchen deutlich an.

&bdquoDie Tröpfchen, die nach der Dehydration in der Außenluft eingeatmet werden, tragen eine größere Viruslast„, sagte Basu. Wenn die relative Luftfeuchtigkeit sinkt, führt dies zu einer höheren Dehydrierung der ausgestoßenen Atemtröpfchen, was die Wahrscheinlichkeit einer Virusübertragung erhöht.

Das gleiche Modell kann laut Basu möglicherweise auch verwendet werden, um die infektiöse Dosis neuer COVID-19-Varianten abzuschätzen. Er müsste die Viruslast im Sputum von Patienten kennen, die mit der neuen Variante infiziert sind und Daten von einem Superspreader-Ereignis gemeldet haben.

&bdquoEs ist wichtig, dass Menschen unserer Generation Forschung hinterlassen, die für die nächste Generation nützlich ist&ldquo schloss Basu.


Ergebnisse

UVC-Empfindlichkeit von SARS-CoV-2

In Tabelle 1 vergleichen wir die genomische und UV254 Eigenschaften von SARS-CoV-2 (die COVID-19 verursachen) mit denen anderer Coronaviren und Viren, die eine ähnliche Nukleinsäurezusammensetzung aufweisen. Die ersten drei Coronaviren verursachen beim Menschen Krankheiten. Studien mit MHV und EtoV haben ähnliche Werte für D . gefunden37s ( 36, 39 ). Daher ist eine vernünftige Schätzung für D37s für die SARS- und MERS-CoV-Viren wäre 3,0 J m −2 . Vergleich mit anderen ssRNA-Viren ergibt einen ähnlichen D37 Wert. Da die Genome von Influenza A 2,2-mal kürzer sind als die der Coronaviren, ist es weiterhin vernünftig, dass die Coronaviren (größere UV-Targets) mindestens doppelt so empfindlich gegenüber UVC sind wie das reziproke Verhältnis der Genomgrößen mal D37 für die Influenzaviren ergibt einen geschätzten D37 für SARS-CoV-2 von 4,7 J m −2 . Bei einem ähnlichen Vergleich mit den Viren der anderen ssRNA-Familien in Tabelle 1 ergibt sich der Medianwert für SARS-CoV-2 D37 war 5,0 Jm –2 . Das D37 Wert von 3,0 J m −2 wurde in den folgenden Berechnungen verwendet, da er aus Werten folgt, die direkt von Mitgliedern desselben abgeleitet wurden Coronaviridae Familie D10 (6,9 J m –2 ) wurde verwendet, da es 10 % Überleben (90 % Inaktivierung) darstellt.

Virusfamilie Genom Größe † † Größe des Genoms, ausgedrückt in Tausend Nukleotidbasen (Knt).
(Knoten)
Gemessene ‡ ‡ UVC-Fluenz, die im Durchschnitt ein tödliches Ereignis pro Virus verursacht, was zu einer Überlebensrate von 37 % führt.
D37 (Jm -2 )
SNS § § Größennormalisierte Sensitivität definiert als das Produkt des D37 und die Genomgröße in Tausenden von Basen ist für einen bestimmten Genomtyp relativ konstant, kann aber für verschiedene Genomtypen sehr unterschiedlich sein. Wenn Größe und Genomtyp für ein ungetestetes Virus bekannt sind, wird das D37 kann aus dem SNS vorhergesagt werden.
(J m −2 Knt)
Vorhergesagtes D37 (Jm -2 ) Verweise
Coronaviridae
SARS-CoV-2 ssRNA+ 29.8 89 3.0
SARS-CoV ssRNA+ 29.7 89 3.0
MERS ssRNA+ 30.1 89 3.0
MHV ssRNA+ 31.6 2.9 91 ( 36 )
EToV ssRNA+ 28.5 3.1 88 ( 39 )
Togaviridae
SINV ssRNA+ 11.7 19 220 ( 43 )
VEEV ssRNA+ 11.4 23 260 ( 44 )
SFV ssRNA+ 13.0 7.2 94 ( 39 )
Paramyxiviridae
NDV ssRNA- 15.2 11-13.5 170-210 ( 45, 46 )
MeV ssRNA- 15.9 8.8-10.9 140-170 ( 47 )
Orthomyxoviridae
FLUAV ssRNA- 13.6
Melbourne H1N1 10.2 139 ( 48 )
NIB-4 H3N2-3 11 150 ( 40 )
NIB-6 H1N1 9.6 131 ( 40 )
ISAV ssRNA- 14.5 4.8 70 ( 49 )
Rhabdoviridae
RABV ssRNA- 11.9 4.3 51 ( 39 )
  • * Ausgewählte Viren verschiedener genetischer Familien mit ssRNA als Genom.
  • † Größe des Genoms, ausgedrückt in Tausenden von Nukleotidbasen (Knt).
  • ‡ UVC-Fluenz, die im Durchschnitt ein tödliches Ereignis pro Virus verursacht, was zu einer Überlebensrate von 37 % führt.
  • § Größennormierte Sensitivität, definiert als Produkt des D37 und die Genomgröße in Tausenden von Basen ist für einen bestimmten Genomtyp relativ konstant, kann aber für verschiedene Genomtypen sehr unterschiedlich sein. Wenn Größe und Genomtyp für ein ungetestetes Virus bekannt sind, wird das D37 kann aus dem SNS vorhergesagt werden.

Es kann nützlich sein, die Sonnenexposition für 99% Virusinaktivierung (1% Überleben) oder für noch niedrigere Überlebensraten abzuschätzen. Da das Material in Aerosolen, die von COVID-19-Patienten und -Trägern erzeugt werden, das Virus vor UV-Strahlung schützen kann, wie in Laborexperimenten mit Viren in Kulturmedium gezeigt wurde, zeigen die Virus-Überlebenskurven, dass das Virus anscheinend weniger UV-empfindlich wird ( 33, 36 .). , 40-42). Dies führte in Experimenten mit Ebola-, Lassa- und Influenza-A-Viren zu einer etwa 4-fachen Änderung der Steigung und betraf mehrere Prozent der Viruspopulation (33, 42). Daher ist für ein Überleben über 10 % eine UV-Fluenz von dem 4-fachen des gewählten D10 (28 J m −2 ) wurde angenommen. Dieser Wert wurde verwendet, um die Sonnenexposition abzuschätzen, die für eine 99%ige Inaktivierung erforderlich ist. Unter der Annahme, dass die Überlebenskurve diese 4-fach höhere UV-Resistenz bei niedrigeren Überlebensniveaus beibehält, würde eine 99,9%ige Inaktivierung (Desinfektionsniveau) 56 J m –2 eine Sterilisationsniveau-Inaktivierung (10 –6 Überleben) erfordern würde 140 J m –2 .

Geschätzte Zeit für die Inaktivierung des SARS-Co V-2-Virus

Tabelle 2 zeigt den berichteten solaren viruziden Fluss am Sonnenmittag zusammen mit den geschätzten Minuten der Sonneneinstrahlung, die in verschiedenen bevölkerungsreichen nordamerikanischen Metropolen benötigt werden, um 90% von SARS-CoV-2 zu inaktivieren. Das (+)-Zeichen in Tabelle 2 zeigt an, dass 99% von SARS-CoV-2 im Sommer in den meisten US-Städten südlich des Breitengrads 43°N innerhalb von zwei Stunden um die Mittagszeit inaktiviert werden können. Außerdem werden 99% des Virus im Herbst in mehreren Städten südlich des 35. Im Winter erhalten die meisten Städte nicht genug Sonneneinstrahlung, um eine 90-prozentige Virusinaktivierung während einer 2-stündigen Mittagsexposition zu bewirken (unterstrichene Werte in Tabelle 2).

Metropolregion Breite Solar viruzider UV-Fluss (J/m 2 254 2 /min) ‡ ‡ Methodik: Die maximalen täglichen solaren UVB-Fluenzwerte für die ausgewählten Orte zu bestimmten Jahreszeiten wurden in den Tabellen 1 und 2 im vorherigen Artikel über die vorhergesagte Influenza-Inaktivierung durch solare UVB ( 34 ) dargestellt. 35 % der gesamten täglichen UVB-Fluenz dividiert durch 120 min ergibt den Mittags-UVB-Fluss in J m −2 min −1 an den Orten und Zeiten in den Tabellen 2 und 3.
/Zeit für 90% Reduktion der Infektiosität (min) § § Die UVB-Fluenz D10 zur Inaktivierung von SARS-CoV-2 90% (10% Überleben) wurde auf 6,9 J m −2 geschätzt.
Sommersonnenwende Tagundnachtgleiche Wintersonnenwende
Feder Herbst
Miami, Florida 25,8 °N 0.51/14 + ∥ ∥ "+" bedeutet, dass solares UV unter idealen Bedingungen SARS-CoV-2 zu 99% (1% Überleben) während eines 2-stündigen Zeitraums um den Sonnenmittag inaktivieren könnte. Viermal das D10 wurde gewählt, um die wahrscheinliche zweiphasige Inaktivierung aufgrund der das Virus umgebenden Schutzelemente zu berücksichtigen.
0.34/20 + 0.41/17 + 0.13/53
Houston, Texas 29,8 °N 0.44/16 + 0.25/28 + 0.33/21 + 0.08/86
Dallas, TX 32,8 °N 0.39/18 + 0.20/34 0.28/25 + 0.06/115
Phoenix, AZ 33,4 °N 0.39/18 + 0.19/36 0.26/27 + 0.05/ 138 ¶ ¶ Unterstrichene Werte zeigen an, dass solares UVB wahrscheinlich nicht ausreicht, um SARS-CoV-2 zu 90% (10% Überleben) während eines zweistündigen Zeitraums um den Sonnenmittag zu inaktivieren.
Atlanta, GA 33,7 °N 0.39/18 + 0.18/38 0.26/27 + 0.05/ 138
Los Angeles, Kalifornien 34,1 °N 0.38/18 + 0.18/38 0.26/27 + 0.05/ 138
San Francisco, Kalifornien 37,7 °N 0.34/20 + 0.13/53 0.20/34 0.03/ 230
Washington, D.C. 38,9 °N 0.33/21 + 0.12/57 0.19/36 0,02/> 300
Philadelphia, PA 39,9 °N 0.32/22 + 0.11/63 0.18/38 0,02/> 300
New York City, NY 40,7 °N 0.32/22 + 0.10/69 0.17/41 0,02/> 300
Chicago, Illinois 41,9 °N 0.31/22 + 0.10/69 0.16/43 0.01 / >300
Boston, MA 42,3 °N 0.30/23 + 0.09/77 0.15/46 0.01/ >300
Detroit, Michigan 42,3 °N 0.30/23 + 0.09/77 0.15/46 0.01/ >300
Toronto, Ontario 43,6 °N 0.29/24 0.08/86 0.14/49 0.01/ > 30 0
Minneapolis, MN 45,0 °N 0.28/25 0.07/99 0.13/53 0.01/ > 30 0
Seattle, WA 47,6 °N 0.26/27 0.06/115 0.11/63 0.01/ >300
  • * Maximale Sonneneinstrahlung ohne Wolken, Dunst, Luftverschmutzung oder Schatten, um die Exposition zu reduzieren, unabhängig von der Standorthöhe.
  • † Erhalten unter Verwendung des Virusinaktivierungs-Wirkungsspektrums, normalisiert auf Eins bei 254 nm (30).
  • ‡ Methodik: Die maximalen täglichen solaren UVB-Fluenzwerte für die ausgewählten Orte zu bestimmten Jahreszeiten wurden in den Tabellen 1 und 2 im vorherigen Artikel über die prognostizierte Influenza-Inaktivierung durch solares UVB ( 34 ) dargestellt. 35 % der gesamten täglichen UVB-Fluenz dividiert durch 120 min ergibt den Mittags-UVB-Fluss in J m −2 min −1 an den Orten und Zeiten in den Tabellen 2 und 3.
  • § Die UVB-Fluenz D10 zur Inaktivierung von SARS-CoV-2 90% (10% Überleben) wurde auf 6,9 J m −2 geschätzt.
  • ∥ „+“ bedeutet, dass solares UV unter idealen Bedingungen SARS-CoV-2 zu 99% (1% Überleben) während eines 2-stündigen Zeitraums um den Sonnenmittag inaktivieren könnte. Viermal das D10 wurde gewählt, um die wahrscheinliche zweiphasige Inaktivierung aufgrund der das Virus umgebenden Schutzelemente zu berücksichtigen.
  • ¶ Unterstrichene Werte zeigen an, dass solares UVB wahrscheinlich nicht ausreicht, um SARS-CoV-2 zu 90% (10% Überleben) während eines zweistündigen Zeitraums um den Sonnenmittag zu inaktivieren.

Tabelle 3 zeigt die keimtötenden Sonnenflusswerte und die daraus resultierende Inaktivierung von SARS-CoV-2 für bevölkerungsreiche Ballungsräume auf anderen Kontinenten. Die Werte in den Tabellen 2 und 3 veranschaulichen deutlich, dass SARS-CoV-2 in Umgebungen, die dem Sonnenlicht ausgesetzt sind, in verschiedenen Städten und zu verschiedenen Jahreszeiten unterschiedlich inaktiviert wird. Zum Beispiel würde zur Wintersonnenwende (Dezember, auf der Nordhalbkugel), gerade zu Beginn der COVID-19-Pandemie, das Virus, das der vollen Mittagssonne ausgesetzt ist, um mindestens 90 % reduziert (1 Log10) während 22 Minuten in Mexiko-Stadt und wird genügend keimtötenden Sonnenstrom erhalten, um 99% des Virus zu inaktivieren, wie durch (+) in Tabelle 3 angegeben. Eine 90%ige Inaktivierung von SARS-CoV-2 im Dezember hätte erheblich länger dauern sollen in Shanghai (99 Minuten) und Kairo (86 Minuten). In den in Tabelle 3 aufgeführten europäischen Städten (in denen COVID-19 schwerwiegend war) sollte im Winter (Dezember) eine nahezu vollständige Viruspersistenz auftreten. Der gleiche Trend gilt natürlich auch für die südliche Hemisphäre, wo der Winter im Juni beginnt und 90% von SARS-CoV-2 in Sao Pablo (Brasilien) in 41 Minuten inaktiviert sein sollten, jedoch nicht innerhalb der 2-Stunden-Sonnenmittagsperiode in Buenos Aires (Argentinien) oder Sydney (Australien) in der kommenden Wintersaison.

Stadt Breite Solar viruzider UV-Fluss (J/m 2 254 2 /min) ‡ ‡ Methodik: Die maximalen täglichen solaren UVB-Fluenzwerte für die ausgewählten Orte zu bestimmten Jahreszeiten wurden in den Tabellen 1 und 2 im vorherigen Artikel über die vorhergesagte Influenza-Inaktivierung durch solare UVB ( 34 ) dargestellt. 35 % der gesamten täglichen UVB-Fluenz dividiert durch 120 min ergibt den Mittags-UVB-Fluss in J m −2 min −1 an den Orten und Zeiten in den Tabellen 2 und 3.
/Zeit für 90% Reduktion der Infektiosität (min) § § Die UVB-Fluenz D10 zur Inaktivierung von SARS-CoV-2 90% (10% Überleben) wurde auf 6,9 J m −2 geschätzt.
Sommersonnenwende Tagundnachtgleiche Wintersonnenwende
Feder Herbst
Zentral-und Mittelamerika
Bogota Kolumbien 4,6 °N 0,64 # # Flusswerte über 0,62 sind wahrscheinlich Unterschätzungen. Daher sind die Zeiten für 90% und 99% Inaktivierung möglicherweise überschätzt.
/11+ ∥ ∥ Unter idealen Bedingungen könnte solares UV SARS-CoV-2 zu 99% (1% Überleben) während eines 2-stündigen Zeitraums um den Sonnenmittag inaktivieren. Viermal das D10 wurde gewählt, um die wahrscheinliche zweiphasige Inaktivierung aufgrund der das Virus umgebenden Schutzelemente zu berücksichtigen.
0.64/11+ 0.64/11+ 0.64/11+
Mexiko-Stadt, Mexiko 19,5 °N 0.64/11+ 0.62/11+ 0.62/11+ 0.31/22+
Sao Paulo, Brasilien 23,3 °S 0.55/13+ 0.40/17+ 0.48/14+ 0.17/41
Buenos Aires, Argentinien 34,6 °S 0.37/19+ 0.17/41 0.24/29 0.04/ 172 ¶ ¶ Unterstrichene Werte zeigen an, dass solares UVB wahrscheinlich nicht ausreicht, um SARS-CoV-2 zu 90% (10% Überleben) während eines zweistündigen Zeitraums um den Sonnenmittag zu inaktivieren.
Europa
Barcelona, ​​Spanien 41,4 °N 0.31/22+ 0.10/69 0.16/43 0.01 />300
Paris, Frankreich 48,9 °N 0.25/28+ 0.05/ 138 ¶ ¶ Unterstrichene Werte zeigen an, dass solares UVB wahrscheinlich nicht ausreicht, um SARS-CoV-2 zu 90% (10% Überleben) während eines zweistündigen Zeitraums um den Sonnenmittag zu inaktivieren.
0.10/69 0.00 />300
London, Vereinigtes Königreich 51,5 °N 0.23/30 0.04/ 173 0.09/77 0.00 />300
Moskau, Russland 55,7 °N 0.20/34 0.03 / 230 0.07/99 0.00 />300
Naher Osten
Baghdad, Iraq 33,3 °N 0.39/18+ 0.19/36 0.26/27+ 0.05/ 138
Teheran, Iran 35,7 °N 0.36/19+ 0.16/43 0.23/30 0.04/ 172
Istanbul, Türkei 41,0 °N 0.31/22+ 0.10/69 0.16/43 0.02 />300
Afrika
Kinshasa, Kongo 4,3 °S 0.64/11+ 0.64/11+ 0.64/11+ 0.64/11+
Lagos, Nigeria 6,4 °N 0.64/11+ 0.64/11+ 0.64/11+ 0.64/11+
Khartoum, Sudan 15,6 °N 0.64/11+ 0.64/11+ 0.64/11+ 0.32/22+
Kairo, Ägypten 30,0 °N 0.43/16+ 0.25/28+ 0.32/22+ 0.08/86
Asien
Mumbai (Bombay), Indien 19,0 °N 0.64/11+ 0.62/11+ 0.62/11+ 0.32/22+
Shanghai, China 31,2 °N 0.42/16+ 0.22/31 0.31/22+ 0.07/99
Seoul, Republik Korea 33,5 °N 0.38/18+ 0.19/36 0.26/27+ 0.05/ 138
Tokyo, Japan 35,7 °N 0.36/20+ 0.16/43 0.23/30 0.04/ 172
Australien
Sydney, Australien 33,9 °S 0.38/18+ 0.18/38 0.26/27+ 0.05/ 138
  • * Maximale Sonneneinstrahlung ohne Wolken, Dunst, Luftverschmutzung oder Schatten, um die Exposition zu reduzieren, unabhängig von der Standorthöhe.
  • † Erhalten unter Verwendung des Virusinaktivierungs-Wirkungsspektrums, normalisiert auf Eins bei 254 nm (30).
  • ‡ Methodik: Die maximalen täglichen solaren UVB-Fluenzwerte für die ausgewählten Orte zu bestimmten Jahreszeiten wurden in den Tabellen 1 und 2 im vorherigen Artikel über die prognostizierte Influenza-Inaktivierung durch solares UVB ( 34 ) dargestellt. 35 % der gesamten täglichen UVB-Fluenz dividiert durch 120 min ergibt den Mittags-UVB-Fluss in J m −2 min −1 an den Orten und Zeiten in den Tabellen 2 und 3.
  • § Die UVB-Fluenz D10 zur Inaktivierung von SARS-CoV-2 90% (10% Überleben) wurde auf 6,9 J m −2 geschätzt.
  • ∥ Unter idealen Bedingungen könnte solares UV SARS-CoV-2 zu 99% (1% Überleben) während eines 2-stündigen Zeitraums um den Sonnenmittag inaktivieren. Viermal das D10 wurde gewählt, um die wahrscheinliche zweiphasige Inaktivierung aufgrund der das Virus umgebenden Schutzelemente zu berücksichtigen.
  • ¶ Unterstrichene Werte zeigen an, dass solares UVB wahrscheinlich nicht ausreicht, um SARS-CoV-2 zu 90% (10% Überleben) während eines zweistündigen Zeitraums um den Sonnenmittag zu inaktivieren.
  • # Flusswerte über 0,62 sind wahrscheinlich Unterschätzungen. Daher sind die Zeiten für 90% und 99% Inaktivierung möglicherweise überschätzt.

Berechnung der ungefähren UV-Dosis eines Virus - Biologie

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Dosis-Wirkungs-Beziehung

In diesem Abschnitt diskutieren wir die statistische Bestimmung der Behandlungsinteraktion, wenn Experimente zum Überleben von Zellen/Organismen mit verschiedenen Dosierungen durchgeführt werden. Es werden zwei Arten von Analysen vorgestellt: (a) modellfreie statistische Bestimmung, wenn Überlebensexperimente mit den Einzel- und Kombinationsbehandlungen parallel dosiseskaliert werden, und (b) Schätzung einer bivariaten Dosis-Wirkungs-Beziehung mit einem beliebigen Dosissatz.

Modellfreie statistische Ermittlung von Synergien

Diese Methode wurde ursprünglich von Webb [5] vorgeschlagen und wird allgemein als Fraktionalproduktmethode bezeichnet [1]. Die Idee besteht darin, die SF aus der Kombinationsgruppe mit der SF zu vergleichen, die als Produkt der SFs aus den beiden Einzelagentengruppen berechnet wird. Obwohl die Idee einfach ist, wurde kein strenges statistisches Modell oder statistischer Test für Synergien entwickelt. [33] schlagen beispielsweise vor, den Beta-Steigungskoeffizienten in der linearen Regression des SF in der Kombinationsgruppe auf das Produkt der SF aus den Einzelwirkstoff-Behandlungsgruppen zu schätzen. Dieser Ansatz hat jedoch eine Reihe von Einschränkungen: (i) er entspricht nicht der Annahme der Normalverteilung, da der SF im Bereich von 0 bis 1 liegt (ii) er geht davon aus, dass die SF mit einem einzigen Agenten keine Variation aufweisen ( behoben), aber die SF aus der Kombinationsgruppe tut dies, (iii) kein statistischer Test für die Bliss-Unabhängigkeitshypothese h0: β = 1 wurde entwickelt. Im Gegensatz dazu entsprechen die unten beschriebenen statistischen Verfahren der Normalverteilung, da die Analyse des SF auf der logarithmischen Skala durchgeführt wird und strenge statistische Tests der Bliss-Unabhängigkeit für verschiedene Assay-Designs entwickelt werden.

Wir schlagen vor, die Unabhängigkeit von Bliss zu testen, indem wir die Theorie eines linearen Modells verwenden, das dem oben diskutierten ANOVA-Modell ähnlich, aber nicht äquivalent ist. Hier werden zwei Arten von Design untersucht: unvollständiges und vollständiges paarweises Design. Bei unvollständigem Design wird die gleiche Anzahl von Dosen bei Einzel- und Kombinationsbehandlungen verwendet. Im vollständigen Design sind alle paarweisen Kombinationen von Behandlungen erforderlich. Ein Vorteil der modellfreien statistischen Synergiebestimmung besteht darin, dass keine Dosis-Wirkungs-Beziehung erforderlich ist, sondern Experimente mit kombinierten Behandlungen mit den gleichen Konzentrationen wie Einzelbehandlungen eingeschlossen werden müssen. Obwohl die unten beschriebenen Modelle keine betroffene Kontrollgruppe berücksichtigen, ist ihre Verallgemeinerung nach der Idee des vorherigen Abschnitts einfach.

Unvollständiges paarweises Design.

Lassen SAi und SBi seien SFs von Zellen in der ichExperiment mit Dosis DAi von Drogen EIN und dosieren DBi von Drogen B zum ich = 1, 2, . n. Lassen SDi sei der SF in der ichExperiment bei Drogen EIN und B werden mit Dosen (DAi, DBi). Wenn Medikamente unabhängig wirken ln SAi + ln SBi und ln SDi muss nah sein. Um den Unterschied zu testen, wird das folgende statistische Modell unter multiplikativem Fehlerschema vorgeschlagen. Bezeichnen xich = ln SAi, jaich = ln SBi, und zich = ln SDi und lass wo μich und τich sind die wahren SFs von Gruppen EIN und B auf der logarithmischen Skala und εich, ζich, ηich sind unabhängige und identisch normalverteilte Fehlerterme mit Nullmittelwert und konstanter Varianz. Parameter δ ist von Interesse: wenn δ = 0, Medikamente wirken unabhängig, wenn δ < 0, wir haben Synergie, wenn δ > 0, wir haben Antagonismus. Um die Nullhypothese zu testen h0: δ = 0 nehmen wir die Differenz zich − (xich + jaich) und schätzen Sie den Delta-Parameter so, dass der Balken den Durchschnitt anzeigt. Das gepaarte T-test mit n − 1 Freiheitsgrad wird verwendet, um die Nullhypothese zu testen. Beachten Sie, dass die traditionelle (ungepaarte) T-Test zum Vergleichen zich mit xich + jaich ist hier nicht angebracht, da diese Beobachtungen/Messungen Mittelwerte haben, die von ich weil SF von der Dosis abhängt.

Exemplarisch veranschaulichen wir diesen Test anhand der Daten aus [34]. Für diese Daten beträgt die Schätzung des Delta-Parameters 1,64, was darauf hinweist, dass ein Antagonismus zwischen den Arzneimitteln mit zweiseitigen P = 6.43 × 10 −7 .

Komplettes paarweises Design.

Bei dieser Konstruktion wird die gleichzeitige Verabreichung von Arzneimitteln bei allen Dosispaaren durchgeführt. Lassen SAi sei der SF von Zellen im ichExperiment mit Dosis DAi von Drogen EIN wo ich = 1, 2, …, nEIN. In ähnlicher Weise lass SBj sei der SF in der JDrogenexperiment B mit Dosis DBj, wo J = 1, 2, …, nB. Es wird davon ausgegangen, dass in nEINnB Experimente (Gruppe D), Medikamente werden in Kombination gegeben (DAi, DBj) und resultieren in der SF SDija. Gemäß der Unabhängigkeit von Bliss müssen wir die Werte ln . vergleichen SAi + ln SBj mit ln SDija. Wie im vorherigen Modell nehmen wir ein multiplikatives Fehlerschema mit xich = ln SAi, jaJ = ln SBj, und zij = ln SDija, wo wo μich und τJ sind unbekannt und unterliegen der Schätzung log SF, δ der interessierende Parameter ist, und εich, ζJ, und ηij sind Fehlerterme und gelten als unabhängig und identisch normalverteilt mit Nullmittelwert und konstanter Varianz σ 2. Drogen EIN und B sind unabhängig, wenn δ = 0. Die Medikamente sind synergistisch, wenn δ < 0 und antagonistisch, wenn δ > 0. Wie in den vorherigen Modellen Hypothesentest von δ reduziert sich auf die T-Verteilung mit der Teststatistik wo ist die gepoolte Varianz und nEIN + nB + nEINnB − 3 ist Freiheitsgrade.

Wahl der Wirkstoffkonzentration

Es ist wichtig, den richtigen Dosissatz für die Durchführung von Experimenten auszuwählen, wenn die Dosis-Wirkungs-Beziehung geschätzt wird oder wenn Synergien mit statistischen Mitteln getestet werden. Eine einfache Regel zur Schätzung individueller Dosis-Wirkungs-Kurven wurde in [29] entwickelt, um Wirkstoffkonzentrationen, die die Mortalität induzieren (oder die SF reduzieren) optimal auf 0,122 und 0,878, die Dreh- und Angelpunkte auf der logistischen Wirkungskurve, zu wählen.

Bei der Auswahl optimaler Wirkstoffkonzentrationen zum Nachweis von Synergien sollte daran erinnert werden, dass unter der Nullhypothese der Arzneimittelwechselwirkung der SF das Produkt einzelner SF ist. Die optimale statistische Identifikation des Produkts (z.B. wann P-Wert ist minimal) ist, wenn die Varianz maximal ist. Wenn SFs aus Bernoulli-Zufallsvariablen (tot/lebendig) für zwei Drogen berechnet werden x und Ja, wir wollen maximieren var(XY) wobei Pr(x = 1) = SEIN und Pr(Ja = 1) = SB. Die optimale Wahl ist, wenn SEINSB = 0,5. Als Beispiel schlagen wir die Kombinationen von Medikamenten vor, die zu den Produkten 0,4, 0,5 und 0,6 führen, die mit den folgenden Einzel-SFs erreicht werden können: 0,6, 0,7 und 0,77 oder deren Kombination, je nach Größe der Studie.

Die Copula-Mortalitätsfunktion für zwei Medikamente

In der obigen Analyse beschäftigten wir uns mit statistischen Tests auf Synergien. Aber wenn Synergien erkannt werden, wie können wir dann die Sterblichkeitswahrscheinlichkeit bei zwei synergistischen Behandlungen vorhersagen? Die Antwort beruht auf der Dosis-Wirkungs-Funktion mit zwei Medikamenten. Als Teil der Response Surface Methodik wurden mehrere Dosis-Wirkungs-Beziehungen zwischen zwei Medikamenten vorgeschlagen [1], aber keine erfüllt die unten formulierten Eigenschaften. Die meisten Beziehungen wurden im Zusammenhang mit CI entwickelt, nicht mit Bliss-Unabhängigkeit, wie [14] siehe Übersichtsartikel [2] und [35]. Mehrere Autoren haben den Wechselwirkungseffekt mit dem Produkt der Wirkstoffkonzentrationen in Verbindung gebracht, wie es üblicherweise im Rahmen des linearen Modells verwendet wird [36], aber es fehlt eine Begründung. Ein typisches Beispiel für eine Ad hoc Das Dosis-Wirkungs-Modell [37] ist ein quadratisches Polynom und kann als solches negativ und/oder keine ansteigende Funktion der Dosiskonzentration sein.

Das Ziel dieser Arbeit ist die Präsentation einer neuartigen rigorosen Copula-Mortalitätsfunktion m(DEIN, DB), das die folgenden Eigenschaften erfüllt:

  1. Log-Skala: Modell m wird auf der logarithmischen Skala ausgedrückt (d. h. Wirkstoffkonzentrationen gehen in das Modell als ln . ein DEIN und ln DB).
  2. Vererbung einzelner Medikamente in Abwesenheit des anderen Medikaments kollabiert das Copula-Modell mit zwei Wirkstoffen zu einem Modell mit nur einem Medikament. mEIN(DEIN), oder m(DEIN, 0) = mEIN(DEIN), die Mortalitätsfunktion des Medikaments EIN allein angewendet. Ebenso verlangen wir, dass m(0, DB) = mB(DB), die Mortalitätsfunktion des Medikaments B.
  3. Unabhängigkeits-/Synergieparameter: Das Modell hängt vom Parameter ab ρ, die Unabhängigkeit, Synergie oder Antagonismus bestimmt, oder strenger, (a) wenn ρ = 0 kollabiert das Modell zum Bliss-Unabhängigkeitsmodell m(DEIN, DB) = mEIN(DEIN) + mB(DB) − mEIN(DEIN)mB(DB), (b) wenn ρ < 0 wir haben Synergie m(DEIN, DB) > mEIN(DEIN) + mB(DB) − mEIN(DEIN)mB(DB) und (c) wenn ρ > 0 haben wir Antagonismus, d.h. m(DEIN, DB) < mEIN(DEIN) + mB(DB) − mEIN(DEIN)mB(DB).

Ein Zwei-Medikamenten-Modell vereinfacht die statistische Bestimmung von Unabhängigkeit, Synergie oder Antagonismus: Schätzung ρ wenn die Nullhypothese h0: ρ = 0 wird nicht abgelehnt, ansonsten behaupten wir Bliss-Unabhängigkeit, Synergie oder Antagonismus je nach Vorzeichen von ρ. Keines der zuvor vorgeschlagenen Dosis-Wirkungs-Modelle mit zwei Wirkstoffen erfüllt die obigen Eigenschaften. Das Ziel dieses Abschnitts ist es, eine Familie neuartiger Dosis-Wirkungs-Funktionen vorzustellen, die den Mortalitätseffekt in Gegenwart von zwei Medikamenten beschreiben (DEIN, DB) für beliebige Einzelwirkstoffmodelle mEIN(DEIN) und mB(DB) und zur statistischen Ermittlung von Synergien verwenden.

Die Grundlage für unsere Erstellung ist (a) die Erkenntnis, dass die Mortalitätsfunktion mit einem oder mehreren Arzneimitteln als kumulative Verteilungsfunktion (cdf) einer oder mehrerer Zufallsvariablen angesehen werden kann, die routinemäßig in der Wahrscheinlichkeitstheorie verwendet wird, und (b) die Anwendung Copula zur Konstruktion einer Zwei-Agenten-Mortalitätsfunktion unter Verwendung individueller Mortalitätsfunktionen, die in der Wahrscheinlichkeitstheorie als marginale cdfs behandelt werden [38] [39] [40] [41]. Wie im Anhang (Hintergrundinformationen) gezeigt, wird die Copula-Mortalitätsfunktion für zwei Medikamente durch ein Doppelintegral über die bivariate Standardnormaldichte mit dem Korrelationskoeffizienten . ausgedrückt ρ wie (11) wobei Φ für die kumulative Standardnormalverteilungsfunktion mit Φ −1 deren Inversen und . steht x = ln DEIN und ja = ln DB sind die Wirkstoffkonzentrationen auf der logarithmischen Skala. Es wird gezeigt, dass dieses Integral durch ein einzelnes Integral ausgedrückt werden kann. Tatsächlich definiert unser Ansatz nicht nur eine Zwei-Wirkstoff-Funktion, sondern eine Familie von Funktionen mit einer beliebigen Kombination von Einzelwirkstoff-Modellen wie Hill, Probit oder Weibull [30].

Korrelationskoeffizient ρ erhält in unserer Copula-Mortalitätsfunktion eine neue Bedeutung. Wann ρ < 0, Arzneimittel ergänzen einander und daher nimmt die Abtötungswirkung zu. Umgekehrt, wenn ρ > 0 nimmt die Abtötungswirkung ab, wenn Medikamente gleichzeitig verabreicht werden. Das folgende Theorem definiert die Grenzen der Sterblichkeit, wenn zwei Medikamente vollständig antagonistisch oder synergistisch sind, als Extremfälle, wenn ρ nähert sich 1 oder -1.

Der Beweis befindet sich im Anhang (Hintergrundinformationen). Vollständiger Antagonismus zeigt an, dass die Medikamente eine vollständig überlappende Wirkung haben, z. Wenn die Medikamente denselben Satz zellulärer Rezeptoren beeinflussen, wird die Sterblichkeit durch die maximale Dosis definiert. Eine vollständige Synergie tritt auf, wenn die betroffenen zellulären Rezeptoren nicht überlappen, dann ist die gemeinsame Mortalität die Summe der Einzelsterblichkeiten.

Die Copula-Funktion mit zwei Wirkstoffen ist in Fig. 4 durch die Konturen der Funktion mit zwei Wirkstoffen (11) veranschaulicht, wobei die Sterblichkeit bei 50% gehalten wird. Um dem Loewe-Additivitätsansatz zu entsprechen, weisen die Einzeldrogensterblichkeitsfunktionen für dieses Beispiel die gleiche Steigung auf m und führen daher zur Zwei-Drogen-Funktion. Insbesondere Medikamente EIN und B das selbe haben m = 1, 2 aber anders und EC50 = 0,5 und daher wird die Loewe-Unabhängigkeit als Segment (schwarz) dargestellt, das die beiden verbindet EC50S. Dass die Unabhängigkeit von Loewe und Bliss nicht gleichbedeutend ist, ist bekannt und lässt sich an diesem Plot erkennen (die schwarzen und grünen Linien sind unterschiedlich). Wann m = 1 Synergie wird überschätzt und Antagonismus wird bei Loewe-Unabhängigkeit im Vergleich zu dem aus unserem Zwei-Drogen-Copula-Modell abgeleiteten unterschätzt, da die grüne Konturlinie (ρ = 0) liegt unterhalb des schwarzen Loewe-Segments. Die untere linke Ecke zeigt Synergie und die obere rechte Ecke zeigt Antagonismus. Wenn sich Medikamente ergänzen (ρ = −0,5), kann eine geringere Dosis zu denselben 50 % Abtötung führen, und andererseits sind höhere Dosen erforderlich, um eine Abtötung von 50 % zu erreichen. Haben Medikamente dagegen eine überlappende Wirkung (ρ = 0,5) und sind daher antagonistisch. Die Schlussfolgerungen ändern sich, wenn Medikamente einen stärkeren Einfluss auf die Sterblichkeit haben (m = 2): Synergie kann nach dem Copula-Modell beansprucht werden, während der Loewe-Ansatz den Antagonismus abschließt (grüne Konturlinie liegt über dem schwarzen Loewe-Segment).


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