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Warum konzentrieren sich die meisten negativ geladenen Phospholipide in der inneren Packungsbeilage?

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Aufgrund der Asymmetrie der Lipidmembran konzentrieren sich negativ geladene Phospholipide wie Phosphatidylserin, Phosphatidylinositol im inneren Segel, wodurch eine unterschiedliche Ladungsverteilung zwischen den beiden Segeln entsteht.

Warum konzentrieren sich die meisten der negativ geladenen Phospholipide im inneren Blatt?


A7. Molekulare Basis hochaffiner Wechselwirkungen

  • Beigetragen von Henry Jakubowski
  • Professor (Chemie) am College of St. Benedict/St. Johns Universität

Was unterscheidet High- und Low-Affinity-Bindung auf molekularer Ebene? Haben Wechselwirkungen mit hoher Affinität viele intramolekulare H-Brücken, Salzbrücken, Van-der-Waals-Wechselwirkungen oder sind hydrophobe Wechselwirkungen am wichtigsten? Vor kurzem wurden die Kristallstrukturen einer Vielzahl von Antikörper-Protein-Komplexen bestimmt, um die Grundlage der Affinitätsreifung von Antikörpermolekülen zu untersuchen. Es ist allgemein bekannt, dass Antikörper, die bei Exposition gegenüber einem fremden Molekül (Antigen) ausgelöst werden, anfänglich eine geringere Affinität aufweisen als Antikörper, die später in der Immunantwort freigesetzt werden. Aufgrund genetischer Mechanismen (Kombination verschiedener variabler Regionen von Antikörpergenen durch Spleißen, ungenaues Spleißen und Hypermutation kritischer Nukleotide in den Genen von Antigen-bindenden Regionen von Antikörpern) kann eine unglaubliche Anzahl verschiedener Antikörper von Antikörper-produzierenden B-Zellen hergestellt werden. Klone von Antikörper-produzierenden Zellen mit höherer Affinität werden durch Bindung und klonale Expansion dieser Zellen selektiert. Die Forscher untersuchten die Kristallstruktur von 4 verschiedenen Antikörpern, die an dieselbe Stelle (Epitop) des Proteinantigens Lysozym banden. Eine erhöhte Affinität korrelierte mit einer erhöhten vergrabenen apolaren Oberfläche und nicht mit einer erhöhten Anzahl von H-Bindungen oder Salzbrücken.

Li, Y. et al. Natur: Strukturbiologie. 6, S. 484 (2003)

Elektrostatische Wechselwirkungen zwischen biologischen Molekülen sind immer noch sehr wichtige Wechselwirkungen, auch wenn wir sie als unspezifisch betrachten. Erleben Sie die Interaktion von DNA-bindenden Proteinen mit positiven Domänen mit dem negativen Polyanion DNA. Die anfängliche Begegnung wird elektrostatischen Ursprungs sein und ist offensichtlich wichtig, um die Proteine ​​auf die DNA zu lenken, wo zusätzliche spezifische Wechselwirkungen stattfinden können.

In einem ähnlichen Beispiel (Yeung, T et al.) wurde kürzlich berichtet, dass mäßig positiv geladene Proteine ​​durch Wechselwirkungen mit negativ geladenem Membran-Phosphatidylserin (PS) zu Endosomen und Lysosomen gelenkt werden, während positiv geladene Proteine ​​auf die innere Oberfläche gelenkt werden der Plasmamembran, die mit PS und phosphorylierten Phosphatidylinositol-Derivaten (PIP2, PIP3) angereichert ist, wie unten gezeigt.

Abbildung: negativ geladene Phospholipide in biologischen Membranen

Um dies zu untersuchen, verwendeten sie die C2-Domäne von Lactadherin (Lact-C2) aus Milch, die PS in Gegenwart von Kalzium bindet. Die C2-Domäne wurde kovalent an das grün fluoreszierende Protein gebunden, ein Protein, das ein internes Fluorophor enthält, das aus drei Aminosäuren besteht (Ser65-Tyr66-Gly67), die bei der Faltung spontan cyclisieren, um ein Fluorophor zu erzeugen, das grünes Licht emittiert. Ein Fusionsgen von Lact-C2 und GFP wurde in Wildtyp (WT) und mutierte Hefe ohne PS eingeführt. Es war in WT-Zellen an das innere Segel und an Endosomen- und Lysosomenvesikel gebunden, wurde jedoch in mutierten Zellen durch das Zytoplasma diffundiert gefunden. Sie stellten auch kationische Sonden mit angehängten Farnesyl-Schwänzen her, die die löslichen Sonden an Membranen verankern konnten. Die am stärksten positiv geladenen Sonden wurden an das innere Segel der Plasmamembran rekrutiert, während weniger geladene an die inneren Vesikel rekrutiert wurden. Die Autoren spekulieren, dass PS auf zytoplasmatischen Membranschichten Signaltransduktionsproteine ​​in diese Regionen lenken kann.

Antikörper mit unendlicher Affinität. Chmuraet al. PNAS. 98, S. 8480 (1998)


Pharmazeutische Nanotechnologie: Kurze Perspektive auf die Lipid-Wirkstoffabgabe und ihr aktuelles Szenario

Karthik Siram, . R. Hariprasad, in Biomedizinische Anwendungen von Nanopartikeln, 2019

2.4 Phospholipide

Phospholipide sind eine wichtige Klasse von Membranlipiden, die zwei Kategorien von Lipiden enthalten, Glycerophospholipide und Sphingolipide. Glycerophospholipide sind Triglyceriden ähnlich, außer dass eine Hydroxylgruppe des Glycerins durch den Ester der Phosphorsäure und einen Aminoalkohol ersetzt wird, der über eine Phosphodiesterbindung verbunden ist. Sie bilden einen sehr wichtigen Teil der Zellmembranen, was der mögliche Grund für den Erfolg von Liposomen (die aus Phospholipiden bestehen) sein könnte. Im Körper, einschließlich des Gehirns, gibt es verschiedene Arten von Phospholipiden. Lecithine sind eine Art von Phospholipiden, die vom Körper synthetisiert werden können, in den Körperzellen vorkommen und auch an der Verdauung beteiligt sind ( Jannin et al., 2008 O’Driscoll und Griffin, 2008 ).

Sphingolipide (oder Gehirnlipide) sind eine andere Art von Phospholipiden, die Ester eines 18-Kohlenstoff-Alkohols namens Sphingosin sind. Sie ähneln Phospholipiden, aber das Glycerin-Rückgrat (in Phospholipiden) ist durch Sphingosin ersetzt. Sie sind essentiell für die Struktur von Zellmembranen und sind in Hirngeweben und Nervenzellmembranen reichlich vorhanden. Zu den Sphingolipiden zählen die Sphingomyeline und Cerebroside, die auf dem Molekül Sphingosin basieren. Wie der Name schon sagt, sind diese Lipide mit der Myelinscheide verbunden, die die Zellen der Neuronen umgibt. Sphingomyeline machen etwa 25 % der Lipide in der Myelinscheide aus und ihre Schlüsselrolle besteht darin, elektrische Signale zu übertragen. Cerebroside sind keine Phospholipide, sondern enthalten Sphingosin.


Einführung

Eine der grundlegenden Voraussetzungen für die Funktion von Epithelzellen ist die Polarisation entlang ihrer apikal-basalen Achse. Diese apikal-basale Polarität wird durch eine Reihe von hochkonservierten Polaritätsdeterminanten (Tabelle 1) hergestellt und reguliert, die auf antagonistische Weise wirken, um das Gleichgewicht zwischen der apikalen und der basolateralen Plasmamembrandomäne aufrechtzuerhalten. Bemerkenswerterweise regulieren die meisten Schlüsseldeterminanten dieser apikal-basalen Polarität des Epithels auch die anterior-posteriore Polarität in der Zygote von Caenorhabditis elegans und die Eizelle von Drosophila sowie die Polarität von vorne nach hinten in wandernden Zellen (für eine Übersicht siehe St Johnston und Ahringer, 2010 Tepass, 2012 Rodriguez-Boulan und Macara, 2014 Campanale et al., 2017).

Tabelle 1. Zusammenfassung konservierter Polaritätsregulatoren und ihrer berichteten Phospholipid-Bindungskapazität.

Um dieses Gleichgewicht zu erreichen, gruppieren sich Polaritätsdeterminanten in apikalen und basolateralen Polaritätskomplexen: Insbesondere der PAR/aPKC-Komplex und der Crumbs-Komplex bestimmen die apikale Plasmamembrandomäne, während die Scribble (Scrb)/Discs Large (Dlg)/ Lethal (2) Giant Larvae (Lgl)-Komplex zusammen mit den Kinasen PAR-1 und LKB1 (PAR-4 in C. elegans) belegen die (baso-)laterale Domäne (Abbildung 1). Die Kernkomponenten des PAR/aPKC-Komplexes sind die Gerüstproteine ​​PAR-3 (Bazooka in Drosophila) und PAR-6 (PAR-6α/β/γ bei Säugetieren) und die Serin/Threonin-Kinase aPKC (atypische Proteinkinase C, Proteinkinase Cζ und ι bei Säugetieren). Darüber hinaus wird PAR-6 durch die kleine GTPase Cdc42 reguliert, die ebenfalls dynamisch mit dem PAR-Komplex assoziiert.

Abbildung 1. (EIN) Vereinfachtes Schema einer differenzierten Epithelzelle mit apikal-basalen Polaritätsregulatoren und deren beschriebener Phospholipid-Interaktion. Die apikal-basale Polarisation beginnt mit der Rekrutierung und Aktivierung von PI3-Kinase an fokale Adhäsionen (Integrin-Komplexe) und an den Dystroglykan-Komplex, der die basale Seite der Epithelzelle bestimmt. Anschließend wird der PAR/aPKC-Komplex (PAR-3, PAR-6, aPKC) durch PAR-3 an den Tight Junctions (TJ) lokalisiert. PAR-3 rekrutiert auch PTEN, das den Wechsel von PI(3,4,5)P3 zu PI(4,5)P2 katalysiert. Darüber hinaus bindet PAR-3 den Rac1-Aktivator Tiam1 und das PAR-6/aPKC-Ziel Cdc42 an den Komplex. Zusammen und teilweise in Redundanz mit dem zweiten TJ-assoziierten Komplex, dem Crb-Komplex (Crb, Pals1 und PATJ), bestimmt der PAR/aPKC-Komplex die PI(4,5)P2-angereicherte apikale Plasmamembrandomäne, die ausgeglichen ist durch die basolateralen Zellpolaritätsregulatoren. Auch hier weisen das Lgl/Dlg/Scrb-Modul und die Kinase LKB1/PAR-1 Phospholipid-Bindungskapazitäten auf, die für deren Lokalisation und Funktion essentiell sind. (B) Polaritätskomplexe und Phospholipide, die die Zellmigration regulieren. Im Gegensatz zur apikal-basalen Polarität weisen wandernde Zellen eine Front-Rear-Polarität auf, wobei apikale und basolaterale Polaritätsregulatoren an der Vorderkante lokalisiert sind und Zellvorsprünge (Lamellipodien insbesondere über Rac1 und Filopodien über Cdc42) durch Modulation des Aktinzytoskeletts (graue Fasern) regulieren ) oder Mikrotubuli (grüne Fasern) beeinflussen.

Innerhalb des Crumbs (Crb)-Komplexes wird das Transmembranprotein Crb in der Plasmamembran durch sein Adapterprotein Pals1 (Stardust in Drosophila), das wiederum die Adapterproteine ​​Pals1-assoziiertes Tight Junction Protein (PATJ) und Lin-7 zum Komplex rekrutiert (Übersicht von Bulgakova und Knust, 2009). Mehrere Studien zeigten jedoch ein Crosstalk zwischen diesen beiden apikalen Komplexen, was darauf hindeutet, dass ihre Zusammensetzung hochdynamisch ist und vom Zelltyp, dem Differenzierungsstatus und anderen Stimuli des Epithels abhängt (Hurd et al., 2003b Gao und Macara, 2004 Lemmers et al ., 2004 Penkert et al., 2004 Sotillos et al., 2004 Wang et al., 2004 Kempkens et al., 2006 Krahn et al., 2010a Sen et al., 2015 Whitney et al., 2016). Die basolateral lokalisierten Scrb, Dlg und Lgl sind Gerüstproteine, die als Modul fungieren, um die basolaterale Plasmamembrandomäne zu bestimmen und den Aufbau von Zellkontakten zu regulieren. Bemerkenswerterweise führt die Deletion dieser Komponenten nicht nur zu Polaritätsdefekten, sondern auch zu Gewebeüberwucherung (in Drosophila und in gewissem Maße bei Wirbeltieren), was zur Identifizierung dieser Proteine ​​als Tumorsuppressoren führte (Übersicht von Stephens et al., 2018).

Um apikale und basolaterale Determinanten gegenseitig auszuschließen, phosphoryliert aPKC Lgl und PAR-1, die anschließend in der aPKC-aktiven apikalen Zone der Epithelien und apikal-basal polarisierten neuralen Stammzellen (Neuroblasten) von der Plasmamembran dissoziieren Drosophila (Betschinger et al., 2003 Plant et al., 2003 Hurov et al., 2004 Suzuki et al., 2004 Wirtz-Peitz et al., 2008 Doerflinger et al., 2010). Umgekehrt phosphoryliert PAR-1 PAR-3 und aPKC und verdrängt sie aus dem basolateralen Kortex (Benton und St. Johnston, 2003 Hurd et al., 2003a Krahn et al., 2009). In Drosophila Neuroblasten schließt aPKC auch das Adapterprotein Miranda und den Notch-Inhibitor Numb durch Phosphorylierung aus dem basalen Kortex aus und kontrolliert so die asymmetrische Zellteilung (Smith et al., 2007, Atwood und Prehoda, 2009).

Phospholipide sind ein wichtiger Bestandteil biologischer Membranen und nicht nur für dynamische Membranfluktuationen verantwortlich, sondern fungieren auch als Signalhub (Übersicht siehe Liu et al., 2013 Schink et al., 2016 Yang et al., 2018 Kay und Fairn, 2019) . Phosphatidylcholin (PC), Phosphatidylethanolamin (PE), Phosphatidylserin (PS) und Sphingomyelin sind am häufigsten und bilden das Gerüst biologischer Membranen, die durch Cholesterin stabilisiert werden. Es wurde jedoch festgestellt, dass die weniger häufig vorkommende Phosphatidsäure (PA) und Phosphoinositide (PI) eine entscheidende Rolle bei der Rekrutierung membranassoziierter Proteine ​​spielen und als Signalknoten fungieren. Darüber hinaus ist die Akkumulation verschiedener Phospholipide (insbesondere der PI-Familie) ein charakteristisches Merkmal verschiedener zellulärer Kompartimente, die phospholipidbindende Proteine ​​in diese Kompartimente lenken. Ein Überblick über die Bildung und den Metabolismus der wichtigsten Phospholipide, die in diesem Aufsatz diskutiert werden, ist in Abbildung 2 gegeben.

Figur 2. Metabolismus wichtiger Phospholipide, die an der Zellpolarität beteiligt sind. DGK, Diacylglycerinkinase. CDP-DG, Cytidindiphosphatdiacylglycerin. CDS, CDP-Diacylglycerin-Synthase. FIG4, FIG4 Phosphoinositid-5-Phosphatase. Zinkfinger vom Typ FYVE. INPP4, Inositolpolyphosphat-4-phosphatase. OCRL, OCRL Inositolpolyphosphat-5-Phosphatase. PIKfyve, Phosphoinositidkinase. PIS, PI-Synthase. PTEN, Phosphatase und Tensin-Homolog. SHIP, Src-Homologie-2-(SH2)-Domäne, die Inositolpolyphosphat-5-Phosphatase enthält. TPTE, Transmembranphosphatase mit Tensinhomologie.


Pflanzenöle: Zusammensetzung und Analyse

Phosphatide

Phosphatide sind Diglyceride, die mit einer Phosphatgruppe an der sn-3-Position, die wiederum mit der Hydroxylgruppe der als X bezeichneten Verbindungen verestert werden kann: Cholin, Ethanolamin oder Inosit. Die resultierenden Phosphatide werden als Phosphatidylcholin (PC), Phosphatidylethanolamin (PE) und Phosphatidylinositol (PI) bezeichnet. Die Struktur, in der R1 und R2 Fettsäureketten darstellen ist im nachfolgenden Text angegeben:

Die Phosphatgruppe hat eine freie Hydroxylgruppe übrig, die ziemlich sauer ist (pKa < 3,5). In Rohöl kann es ein Metallgegenion (Kalium, Calcium oder Magnesium) oder Wasserstoff enthalten. Dieser Wasserstoff wird titriert, wenn der Säuregehalt des Öls gemessen wird. Wenn die Gruppe X ein Wasserstoffatom ist, wird das Phosphatid als Phosphatidsäure (PA) bezeichnet. Es entsteht bei der Trocknung, Konditionierung und Extraktion der Ölsaaten. Wenn PA als freie Säure oder als Kaliumsalz vorliegt, wird es bei der Wasserentschleimung durch Hydratation aus dem Öl entfernt. Liegt PA als Calcium- oder Magnesiumsalz vor, verbleibt dieses Salz bei der Wasserentschleimung als sogenanntes nichthydratisierbares Phosphatid im Öl.

Neben PC, PE, PI und PA gibt es einige kleinere Phosphatide wie Phosphatidylserin, bei denen die Phosphatgruppe mit der Aminosäure Serin verestert wurde. Es gibt die Lysoverbindungen, bei denen einer der Fettsäurereste eliminiert wurde. Es gibt das Acetylphosphatidylethanolamin, bei dem die Aminogruppe acetyliert wurde. Es gibt das Phosphatidylglycerin, bei dem die Phosphatgruppe mit einer Glycerineinheit verestert wurde.


Manipulation der Membranasymmetrie

Es wird gezeigt, dass die Membranen in lebenden Zellen von Natur aus asymmetrisch sind. Membranmodelle, die für In-vitro-Studien verwendet wurden, waren schwierig, asymmetrische Doppelschichten wie in lebenden Zellen herzustellen [16]. Die Methode der unterstützten Lipiddoppelschicht (SLB) war einer der ersten Ansätze zur Manipulation der Membranasymmetrie. SLB bestehen aus einer Lipiddoppelschicht, die auf einem physikalischen Träger (Oberfläche) ausgedehnt ist, der ein Feststoff, ein Polymer-"Kissen" oder eine selbstorganisierte Monoschicht sein kann [17]. Darüber hinaus kann SLB an die Oberfläche gebunden, frei suspendiert sein oder eine feststoffgestützte Lipiddoppelschicht kann als Träger für vesikuläre Schichten dienen (Abbildung (PageIndex<9>)). Die Vesikel werden zunächst an der Oberfläche platziert und platzen nach trägerbedingter Verformung. Letztendlich vereinigen sich die Doppelschichten der gebrochenen Vesikel und bilden den SLB (Abbildung (PageIndex<1>)0). Studien mit SLB ermöglichen die Analyse der molekularen Zusammensetzung, der molekularen Verteilung und der Krümmung von Membranen, die die für die Membranasymmetrie verantwortlichen Faktoren sind.

Abbildung (PageIndex<9>). Unterstützte Lipiddoppelschichten: Grundtypen und Abbildung (PageIndex<1>)0. SLB-Bildung (Aus: Richter et al, Langmuir, Bd. 22 Nr. 8, 2006).

Probleme wie ungewollte Wechselwirkungen zwischen Doppelschicht und Träger und die Tatsache, dass in einigen Fällen die getragene Doppelschicht vollständig immobil wird, sind für die Schwierigkeiten bei der Kontrolle der Membranasymmetrie verantwortlich [16]. Außerdem hat ein wesentlicher Teil der Forschung mit SLBs Vesikel mit symmetrischer Zusammensetzung in beiden Flugblättern verwendet [18]. In den letzten Jahren gibt es neue laufende Ansätze, die darauf abzielen, die Membranasymmetrie gezielt zu manipulieren. Diese Methodiken umfassen Doppelschichten mit Tröpfchengrenzflächen, invertierte Emulsionstechniken sowie den durch Methyl-beta-Cyclodextrin katalysierten Austausch. Der letztgenannte Ansatz besteht im Wesentlichen darin, Phospholipide vom äußeren Segel eines Donor-Liposoms in das äußere Segel eines Akzeptor-Liposoms zu transportieren [19]. Dieses Verfahren ist in der Lage, asymmetrische Liposomen in einem weiten Durchmesserbereich herzustellen und gilt als einfaches Verfahren zur Übertragung von anionischen Phospholipiden wie PS auf ein äußeres Segel einer Lipiddoppelschicht, wodurch es der Membranasymmetrie biologischer Membranen ähnelt. In den letzten Jahren konnten quantitative Studien zu Lipid-Flip/Flop-Raten durchgeführt werden, was neue Möglichkeiten zur Analyse der molekularen Zusammensetzung und Verteilung biologischer Membranen eröffnet [18].


Funktion

Phospholipide sind sehr wichtige Moleküle, da sie ein lebenswichtiger Bestandteil der Zellmembranen sind. Sie helfen Zellmembranen und Membranen, die Organellen umgeben, flexibel und nicht steif zu sein. Diese Fluidität ermöglicht die Vesikelbildung, die es Substanzen ermöglicht, durch Endozytose und Exozytose in eine Zelle einzutreten oder diese zu verlassen. Phospholipide fungieren auch als Bindungsstellen für Proteine, die an die Zellmembran binden. Phospholipide sind wichtige Bestandteile von Geweben und Organen, einschließlich des Gehirns und des Herzens. Sie sind für das reibungslose Funktionieren des Nervensystems, des Verdauungssystems und des Herz-Kreislauf-Systems notwendig. Phospholipide werden in der Zell-Zell-Kommunikation verwendet, da sie an Signalmechanismen beteiligt sind, die Aktionen wie Blutgerinnung und Apoptose auslösen.


Struktur eines Phospholipidmoleküls

Ein Phospholipid ist ein amphipathisches Molekül, was bedeutet, dass es sowohl eine hydrophobe als auch eine hydrophile Komponente hat. Ein einzelnes Phospholipidmolekül hat an einem Ende eine Phosphatgruppe, die als “Kopf” bezeichnet wird, und zwei nebeneinander liegende Fettsäurenketten, aus denen die Lipid-“schwänze bestehen. ” Die Phosphatgruppe ist negativ geladen, was den Kopf polar und hydrophil macht oder “wasserliebend” Die Phosphatköpfe werden so von den Wassermolekülen in ihrer Umgebung angezogen.

Die Lipidschwänze hingegen sind ungeladen, unpolar und hydrophob oder “Wasser fürchtend” Ein hydrophobes Molekül stößt Wasser ab und wird von Wasser abgestoßen. Einige Lipidschwänze bestehen aus gesättigten Fettsäuren und einige enthalten ungesättigte Fettsäuren. Diese Kombination trägt zur Fließfähigkeit der Schwänze bei, die ständig in Bewegung sind.


Behandlung von Infektionen bei Verbrennungen

James J. Gallagher, . David N. Herndon, in Total Burn Care (Dritte Ausgabe), 2007

Polymyxine

Die Polymyxine sind amphipathische Moleküle, die mit dem Lipopolysaccharid (LPS) in der bakteriellen Außenmembran interagieren. Ein Eintritt in die Zelle ist nicht erforderlich, da Polymyxin B, das kovalent an Agarosekügelchen gebunden ist, die Fähigkeit behält, die Membranpermeabilität zu verändern und die Bakterienatmung zu hemmen. Anfängliche Bindung an die äußere Membran findet statt, wenn der polykationische Anteil von Polymyxin B Ca ++ - und Mg ++ -Brücken verdrängt, die normalerweise LPS-Moleküle im äußeren Segel der bakteriellen äußeren Membran stabilisieren. 77 Die Bindung kann durch hohe Konzentrationen zweiwertiger Kationen antagonisiert werden. Eine zusätzliche Komplexierung mit LPS wird durch eine hydrophobe Wechselwirkung zwischen dem Lipid-A-Anteil von LPS und der Fettsäure des Antibiotikums erleichtert. Das Einbringen des Antibiotikums in die äußere Membran zerstört die Membran und setzt LPS in das umgebende Milieu frei. Sie haben auch starke antiendotoxische Eigenschaften und eine antibakterielle Wirkung gegen P. aeruginosa und viele der Enterobacteriaceae.

Nach Storm et al. sind die Polymyxine bei niedrigen Konzentrationen bakteriostatisch und bei hohen Konzentrationen bakterizid. Nord und Hoeprich berichteten, dass Polymyxin B-Sulfat bei einer Konzentration von 0,01 mmol/ml auf 88% der . bakterizid wirkte P. aeruginosa Stämme getestet. 77 Bakterizide Wirkung gegen P. aeruginosa wird bei Colistin erst bei einer Konzentration von 0,1 μmol/ml beobachtet. 77 Polymyxin B und Colistin (Polymyxin E) werden normalerweise in Dosen von 1,5–2,5 bzw. 5 mg/kg/Tag in zwei geteilten Dosen verabreicht. Bei Niereninsuffizienz muss die Dosierung angepasst werden, da die Niere der primäre Eliminationsweg ist. Die Verteilung in Pleuraflüssigkeit, Gelenke und Liquor ist schlecht.

Polymyxine werden für schwere systemische Infektionen empfohlen, die durch gramnegative Bakterien verursacht werden, die gegen andere Wirkstoffe resistent sind und eine eindeutige Rolle bei der Therapie von Infektionen mit multiresistenten gramnegativen Bakterien spielen. Das pädiatrische Krankenhaus für Verbrennungen, Shriners Burns Hospital in Galveston, Texas, überprüfte die Verwendung von Colistimethat-Natrium von 2000 bis 2004 bei 109 Patienten, 72 Männern und 37 Frauen (mittleres und mittleres Alter von 9 Jahren) mit einem TBSA von 21 % bis 99 % ( Median 60 % und Durchschnitt 62 %). Die Gesamtüberlebensrate betrug bei allen 109 Patienten 80 %. Colistimethat-Natrium stellte eine wichtige Rettungsoption für Verbrennungspatienten mit ansonsten unvollständig behandelten und lebensbedrohlichen gramnegativen Infektionen dar. 2005 bei SBH-G, A. baumannii/haemolyticus, E. cloacae, E. coli, und K. pneumoniae alle zeigten eine 100%ige Anfälligkeit für Colistin und Polymyxin B, während P. aeruginosa zeigte eine 96%ige bzw. 99%ige Empfindlichkeit gegenüber Colistin bzw. Polymyxin B.

Allerdings ist die Überwachung der dosisabhängigen Nephrotoxizität und ZNS-Toxizität im Zusammenhang mit der systemischen Anwendung erforderlich, um ein therapeutisches Ergebnis zu erzielen. Wenn Polymyxin B Tieren oder Menschen verabreicht wird, bindet es über seine freien Aminosäuregruppen an negativ geladene Phospholipide im Gewebe. Kunin und Bugg zeigten, dass die Bindung an Nieren- und Hirngewebe am größten ist, gefolgt von Leber-, Muskel- und Lungengewebe. 77 Nach wiederholter Gabe akkumuliert das Arzneimittel im Gewebe bis zu Konzentrationen, die vier- bis fünfmal höher sind als die maximalen Serumkonzentrationen und bleibt mindestens 5–7 Tage im Gewebe bestehen. 77 Die Entfernung des Arzneimittels durch Dialyse kann aufgrund der ausgedehnten Gewebebindung schwierig sein. In unserer Studie scheint Colistimethat-Natrium die Inzidenz von proportional zu erhöhen C. schwierig-assoziierte Kolitis, Nierenfunktionsstörungen und Neuropathien in Abhängigkeit von der Dauer der Anwendung.


Methoden

Lipide und Peptide/Proteine

Grobes mutiertes LPS aus Salmonella enterica Serovar Minnesota (Minnesota) Stämme R595 (LPS R595), R4 (LPS R4), R7 (LPS R7), Rz (LPS Rz), R5 (LPS R5), R345 (LPS R345) und R60 (LPS R60) sowie Deep Rough Mutant LPS von Escherichia coli Stamm F515 (LPS F515) und Proteus mirabilis Stamm R45 (LPS R45) verwendet wurden [45–50]. LPS wurde nach der Phenol/Chloroform/Petrolether-Methode [51] extrahiert, gereinigt, lyophilisiert und in die Triethylaminsalzform überführt. Die chemischen Strukturen sind in Abb. 1 angegeben. Die Mengen an nichtstöchiometrischen Substitutionen durch Fettsäuren (Daten nicht gezeigt), Ara4N, zusätzliche Phosphate und Phosphoethanolamin wurden durch Massenspektrometrie analysiert. In LPS R595 war das an das 4'-Phosphat gebundene Ara4N in einer Konzentration von 40% vorhanden. In LPS R45 wurden ungefähr 50 % des 4'-Phosphats von Lipid A und 50 % des ersten Kdo durch Ara4N ersetzt. Unter Berücksichtigung der Mengen an negativ geladenen Phosphatgruppen und Kdo's und der positiv geladenen Ara4Ns ergeben sich die Nettoladungen der LPSs, wie sie in Tab. 1, berechnet.

Phosphatidylcholin (PC) aus Eidotterlecithin, Phosphatidylglycerol (PG) aus Eidotterlecithin (Natriumsalz) und synthetisches Diphosphatidylglycerol (DPG) wurden von Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL, USA) bezogen und ohne weitere Reinigung verwendet.

Polymyxin B (PMB) und sein Nonapeptid (PMBN), Lactoferrin aus Muttermilch, Lactalbumin aus Rindermilch, Lysozym aus Hühnereiweiß und Humanhämoglobin wurden von Sigma Aldrich (Deisenhofen, Deutschland) und rekombinantes Humanserumalbumin (rHSA) bezogen. von Welfide Corporation (Osaka, Japan). Rekombinanter BPI1–193 (rBPI21) war ein freundliches Geschenk von XOMA (Berkeley, CA, USA). Das Kaninchen CAP18106–137 war ein freundliches Geschenk von J.W. Larrick (Palo Alto Institute of Molecular Medicine, Mountain View, CA, USA).

Bestimmung des Oberflächenpotentials

Feste Ladungen innerhalb der Kopfgruppen von Lipidmolekülen bewirken ein elektrisches Potential an der Lipiddoppelschichtoberfläche gegenüber der umgebenden Badelösung, das Oberflächenpotential [27, 52]. Das ζ-Potential hängt mit dem Oberflächenpotential der Lipidaggregate zusammen und kann aus der elektrophoretischen Mobilität der Aggregate nach der Smoluchowski-Näherung berechnet werden [53]:

wobei ζ das ζ-Potential ist, μ die elektrophoretische Mobilität, η die Viskosität (0,89·10 -3 kg m -1 s -1 ), ε0 die Dielektrizitätskonstante des Vakuums (8.854·10 -12 A 2 s 4 kg -1 m -3 ) und εR die dielektrische Permittivität von Wasser (78,54).

Um das Oberflächenpotential von Phospholipid- und LPS-Aggregaten zu untersuchen, haben wir deren ζ-Potentiale bestimmt. Die Messungen wurden auf einem ZetaSizer4 (Malvern Instruments GmbH, Herrsching, Deutschland) bei 25°C und mit einem elektrischen Antriebsfeld von 19,2 V cm –1 durchgeführt.

Aggregate wurden als 1 mM wässrige Dispersionen von Lipid in Puffer (10 mM Tris, 2 mM CsCl&sub2;2, pH7). Kurz gesagt wurden die Lipiddispersionen 20 Minuten lang bei 60 °C beschallt, 30 Minuten lang auf 4 °C abgekühlt und zweimal zwischen 60 °C und 4 °C (jeweils 30 Minuten) temperaturzyklisiert. Die Dispersionen wurden über Nacht bei 4°C äquilibriert. Vor den ζ-Potentialmessungen wurden Lipiddispersionen auf eine Endkonzentration von 0,01 mM verdünnt. Dargestellte Werte (Abb. 3) sind Mittelwerte mit Standardableitungen aus 3 bis 5 unabhängigen Experimenten.

Herstellung von Lipidmonoschichten, die in Filmbalance-Experimenten verwendet werden

Im Allgemeinen wurden zwei Arten von Langmuir-Pockels-Filmbalance-Experimenten verwendet: (i) bei einer konstanten und (ii) bei einer variablen Filmfläche. In beiden Versuchstypen wurden die Phospholipide in Chloroform gelöst und die LPSs in einer 10:1 (v:v) Mischung aus Chloroform und Methanol bei einer Konzentration von 1 mM. Alle Lipide wurden in den angegebenen Mengen auf der Subphase abgeschieden und die Lösungsmittel 5 min verdampfen gelassen.

Bestimmung der Calciumadsorption an und Verdrängung von Lipidmonoschichten

Die Calciumadsorption an aus Phospholipiden oder LPSs hergestellte Lipidmonoschichten wurde durch Abscheiden von 10 nmol des jeweiligen Lipids auf 60 ml einer wässrigen Subphase, die mit 5 mM HEPES gepuffert und auf pH 7 eingestellt war, bestimmt. Nach Äquilibrierung des Monolayers wurden der Subphase 5 Aliquots von 200 µl einer 1,5 mM Calciumlösung, eingestellt auf eine relative β-Aktivität von 24 kBq/ml mit radioaktivem 45 Ca 2+ (Amersham Buchler, Braunschweig, Deutschland) zugesetzt, was in einer Calcium-Endkonzentration von 25 µM. Calciumionen binden an die negativ geladenen Kopfgruppen der Lipide, und die vom gebundenen 45 Ca 2+ ausgehende niederenergetische β-Strahlung wird nicht mehr von der Hydratationshülle absorbiert und daher wurde mit a . eine Zunahme der β-Intensität beobachtet β-Zähler (Gasionisationsdetektor LB124, Berthold, Wildbad, Deutschland) (Abb. 2, Schritt 1 & 2). Somit ermöglicht diese Methode die Bestimmung der relativen Menge an Calcium, die an die Monoschicht gebunden ist [24]. Um die Zahl der Lipidmoleküle und damit die potentielle Zahl der Bindungsstellen für Calcium unterhalb der Nachweisfläche des β-Zählers konstant zu halten, wurden die Versuche in einer Acrylglaswanne mit einer insgesamt konstanten Filmfläche von 112 cm 2 durchgeführt.

Die β-Intensität ich Monoaus 45 Ca 2+, das bei einer gegebenen Ca 2+ -Konzentration an die Lipidmonoschicht gebunden war, wurde nach folgender Gleichung berechnet:

(Gl. 5) ich Mono= ich Knirps- ich unter,

wo ich Knirpsist die β-Intensität, die von der Monoschicht und der Subphase ausgeht und ich unterist die β-Intensität der reinen Subphase. Diese und die folgenden Experimente wurden bei einer Subphasentemperatur von 20 °C statt 37 °C durchgeführt, um eine Kondensation am β-Zähler zu vermeiden.

Um die Fähigkeit verschiedener Peptide/Proteine ​​zu untersuchen, divalente Ca 2+ -Ionen aus LPS F515-Monoschichten zu verdrängen, wurde eine Subphase mit 12,5 μM Ca 2+ dotiert mit radioaktivem 45 Ca 2+ (was eine relative β-Aktivität von 250 Bq/ml ergibt) , gepuffert mit 5 mM HEPES bei pH 7 verwendet. Auch bei den Verdrängungsexperimenten wurde die Zahl der LPS-Moleküle konstant gehalten. Die Wirkstoffe wurden der Subphase bei konstanter Gesamtfilmfläche und relativ geringem Seitendruck der Monoschicht (

10 mNm –1 ). Damit lag der Enddruck nach Sättigung der Wirkstoffinterkalation noch im Bereich der lateralen Drücke in biologischen Membranen [41, 42]. Die Peptide/Proteine ​​wurden der Subphase in unterschiedlichen Konzentrationen zugesetzt und die Gleichgewichts-β-Zählraten wurden aufgezeichnet (Abb. 2, Schritt 3). Der Verwandte ich rel(C) in Abhängigkeit von der Peptid-/Proteinkonzentration C wurde berechnet aus

wo ich Knirps(C) ist die absolute β-Intensität, ich unterdie aus der reinen Subphase stammende β-Intensität und ich Monodie β-Intensität stammt von der Monoschicht. Aus den Verdrängungskurven werden die Konzentrationen, bei denen 50% des Calciums verdrängt wurden (IC50 -Wert) durch die Peptide/Proteine ​​bestimmt und in Tab. 1 zusammengefasst. 1.

Alle angegebenen Werte sind Mittelwerte mit Standardableitungen aus 3 bis 4 unabhängigen Experimenten.

Einfluss des lateralen Drucks auf die Adsorption von Calcium an LPS-Monoschichten

Eine Langmuir-Pockels-Filmwaage, ausgestattet mit einem Wilhelmy-System (Munitech, München, Deutschland), wurde verwendet, um die Lipiddruck/Flächen-Isothermen von LPS F515-Monoschichten zu bestimmen. Der seitliche Druck, die Fläche und die β-Intensität wurden bestimmt. Für die Experimente wurden 36 µl des LPS F515 auf die Pufferflächen von 290 cm 2 verteilt. Das Lösungsmittel wurde 5 Minuten bei Nulldruck verdampfen gelassen. Anschließend wurden die Monoschichten mit einer Geschwindigkeit von 1,5 mm 2 s –1 isotherm auf einen Seitendruck von 40 mN m –1 komprimiert.


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