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Wie würde man die Verfügbarkeit von Nukleotiden für ein Enzym berechnen?

Wie würde man die Verfügbarkeit von Nukleotiden für ein Enzym berechnen?


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Wie würde man die Verfügbarkeit von Nukleotiden für ein Enzym wie eine Polymerase berechnen?

Ich stelle mir eine Antwort in Einheiten wie Nukleotiden pro Sekunde pro Enzym vor, aber ich stelle mir auch eine Antwort vor, die keine einfache Reaktionsgeschwindigkeit ist. k_on-Berechnungen und k_off bieten keine mechanistische Erklärung.

Ich würde gerne wissen, ob es einen theoretischen Ansatz für diese Frage gibt: Wie weist eine Polymerase ein falsches Nukleotid ab?


Ich konnte diese Frage mehr als auf eine Weise lesen. Reden Sie von einem Enzym in einer Zelle oder einer Reaktion in vitro? Kinetik und mechanische Erklärungen können sich überschneiden, sind aber nicht ganz gleich und werden normalerweise getrennt behandelt - Kinetik mit der Beobachtung der Reaktionsgeschwindigkeit in einer Röhre und des Mechanismus in einer Kristallstruktur oder möglicherweise der magnetischen Kernresonanz.

Proteinstrukturen sind normalerweise statisch – in den meisten Fällen erhalten Sie nur einen Zeitraffer-Schnappschuss der Reaktion. Kinetik ermöglicht es Ihnen, zu sehen, wie schnell diese Dinge verlaufen, und kann Ihnen helfen, die Reihenfolge der Bindung zu verstehen, wenn mehr als eine Komponente für die Reaktion benötigt wird usw.

Die Polymerase hat eine Bindungstasche, in der der Matrizenstrang und der wachsende Strang verwendet werden, um gemeinsam eine Doppelhelix aufzubauen. wenn die eingeführte Base keine Watson-Crick-Basenpaarbindungen bildet, erlaubt die Geometrie der Reaktion nicht, dass die Base dem wachsenden Strang hinzugefügt wird.

Hoffe das hilft? Wenn ich das klarer machen kann, können Sie mir einen Kommentar hinterlassen und ich werde es überarbeiten…


Prinzipien der RNA- und Nukleotid-Diskriminierung durch das RNA-prozessierende Enzym RppH

Die Autoren möchten wissen, dass ihrer Meinung nach die ersten beiden Autoren als gemeinsame Erstautoren anzusehen sind.

Ang Gao, Nikita Vasilyev, Abhishek Kaushik, Wenqian Duan, Alexander Serganov, Prinzipien der RNA- und Nukleotiddiskriminierung durch das RNA-prozessierende Enzym RppH, Nukleinsäureforschung, Band 48, Ausgabe 7, 17. April 2020, Seiten 3776–3788, https://doi.org/10.1093/nar/gkaa024


Frage 1: Müssen Sie die Sequenzgenauigkeit beibehalten?

Manchmal müssen Sie nur ein PCR-Produkt erkennen oder seine Größe schätzen, z. B. wenn Sie Mäuse genotypisieren oder nach rekombinanten Klonen suchen. Für diese Art von Routine-PCR sollten Sie eine thermostabile Standard-DNA-Polymerase (wie Taq DNA-Polymerase), um die Anwesenheit oder Abwesenheit von Ziel-DNA zu bestätigen.

Wenn Sie jedoch Klonexperimente oder Next-Generation-Sequencing (NGS) durchführen, ist Genauigkeit wichtig. Um eine exakte DNA-Kopie zu erhalten, stellen Sie sicher, dass Sie eine DNA-Polymerase mit hoher Wiedergabetreue wählen. High-Fidelity-PCR-Enzyme haben die Fähigkeit, die DNA-Sequenz, die durch 3'- bis 5'-Exonuklease-Aktivität amplifiziert wird, Korrektur zu lesen. Wenn ein fehlgepaartes Basenpaar eingebaut wird, wird die DNA-Polymerase blockiert, was zu einer Verzögerung der Synthese führt. Diese Verzögerung ermöglicht, dass das fehlgepaarte Nukleotid entfernt und durch das richtige Nukleotid ersetzt wird.

Eine ausgezeichnete Wahl für eine DNA-Polymerase, die die Sequenzgenauigkeit bewahrt, ist die Thermo Scientific Phusion Plus DNA-Polymerase. Dieses Enzym bietet eine hohe Wiedergabetreue, die >100x genauer ist als Taq DNA-Polymerase. Für eine noch höhere Genauigkeit von Sequenzen ist die Invitrogen Platinum SuperFi II DNA Polymerase erhältlich und bietet >300x als Taq Treue der DNA-Polymerase.


Antworten auf alle Probleme finden Sie am Ende dieses Buches. Ausführliche Lösungen finden Sie im Student Solutions Manual, Study Guide und Problems Book. Quantitative Beziehungen zwischen Geschwindigkeitskonstanten zur Berechnung von K m , kinetischer Effizienz ( k cat /K m ) und V max - IV Carboanhydrase katalysiert die Hydratation von CO 2 : CO 2 + H 2 O H 2 CO 3 Der K m der Carboanhydrase für CO 2 beträgt 12 m M. Carboanhydrase ergab eine Anfangsgeschwindigkeit v 0 = 4,5 μ mol gebildetes H 2 CO 3 /mL ⋅ sec, wenn [ CO 2 ] = 36 m M. a. Was ist V max für dieses Enzym? B. Unter der Annahme, dass in diesem Experiment 5 pmol/ml (5 × 10 -12 mol/ml) Enzym verwendet wurden, was ist k cat für dieses Enzym? C. Wie hoch ist die katalytische Effizienz dieses Enzyms? D. Nähert sich Carboanhydrase der "katalytischen Perfektion"?

Quantitative Beziehungen zwischen Geschwindigkeitskonstanten zur Berechnung von Km, Kinetische Effizienz (kKatze/Km) und Vmax - NS Carboanhydrase katalysiert die Hydratation von CO 2 :

CO 2 +H 2 O ⇌ H 2 CO 3 The Km der Carboanhydrase für CO 2 beträgt 12 mM. Carboanhydrase ergab eine Anfangsgeschwindigkeit v 0 = 4,5 μ mol   gebildetes H 2 CO 3/ml ⋅ s bei [ CO 2 ] = 36 mM.

A. Was ist Vmax für dieses Enzym?

B. Unter der Annahme, dass 5 pmol/ml (5 × 10 -12 mol/ml) Enzym in diesem Experiment verwendet wurden, was ist kKatze für dieses Enzym?


Polymerisation von Nukleotiden (Phosphodiesterbindungen)

Nukleotide werden ähnlich wie andere biologische Moleküle durch eine Kondensationsreaktion miteinander verbunden, die ein kleines, stabiles Molekül freisetzt. Im Gegensatz zu Proteinen, Kohlenhydraten und Lipiden handelt es sich bei dem freigesetzten Molekül jedoch nicht um Wasser, sondern um Pyrophosphat (zwei miteinander verbundene Phosphatgruppen). Wenn Pyrophosphat durch Zugabe von Wasser gespalten wird, wird viel freie Energie freigesetzt, so dass der umgekehrte Prozess (Hydrolyse der Phosphodiesterbindung zu freien Nukleotiden) sehr unwahrscheinlich ist.

Wie wird freie Energie freigesetzt?
die Reaktion vorantreiben?

Klicken Sie unten auf die Schrittnummern, um die Polymerisation von Nukleotiden anzuzeigen. Klicken Sie mit der linken Maustaste, um die Bilder und den Text zu löschen.

Die 5'-Gruppe eines Nukleotidtriphosphats wird nahe der freien Nukleotidkette gehalten.

Die 3'-Hydroxylgruppe bildet eine Bindung zum Phosphoratom des freien Nukleotids, das dem 5'-Sauerstoffatom am nächsten ist. Währenddessen bricht die Bindung zwischen dem ersten Phosphoratom und dem Sauerstoffatom, die es mit der nächsten Phosphatgruppe verbindet.

Eine neue Phosphodiesterbindung verbindet nun die beiden Nukleotide. Eine Pyrophosphatgruppe wurde freigesetzt.

Die Pyrophosphatgruppe wird hydrolysiert (durch Zugabe von Wasser gespalten), wodurch viel Energie freigesetzt wird und die Reaktion bis zum Abschluss vorangetrieben wird.


Antworten auf alle Probleme finden Sie am Ende dieses Buches. Ausführliche Lösungen finden Sie im Student Solutions Manual, Study Guide und Problems Book. Quantitative Beziehungen zwischen Rale-Konstanten zur Berechnung von Km, kinetischer Effizienz (kcat/Km) und Vmax-II Triosephosphatisomerase katalysiert die Umwandlung von Glyceraldehyd-3-phosphat zu Dihydroxyacetonphosphat. Glyceraldehyd − 3 − P ⇌ Dihydroxyaceton − P Der K m dieses Enzyms gegenüber seinem Substrat Glyceraldehyd-3-phosphat beträgt 1,8 × 10 -5 M . Bei [Glyceraldehyd-3-phosphat] = 30 µM betrug die Reaktionsgeschwindigkeit v 82,5 µmol ml -1 s -1 . A. Was ist V max für dieses Enzym? B. Unter der Annahme, dass in diesem Experiment 3 Nanomol pro ml Enzym verwendet wurden ([ E total ]) = 3 Nanomol/ml), was ist k cat für dieses Enzym? C. Wie hoch ist die katalytische Effizienz ( k cat / K m ) für die Triosephosphatisomerase? D. Zeigt der Wert von k cat /K m an, ob sich die Triosephosphatisomerase der "katalytischen Perfektion" nähert? e. Was bestimmt die ultimative Geschwindigkeitsgrenze einer enzymkatalysierten Reaktion? Das heißt, was setzt der kinetischen Perfektion die physikalische Grenze auf?

Quantitative Beziehungen zwischen zu berechnenden Regelkonstanten Km, Kinetische Effizienz (kKatze/Km) und Vmax - II Triosephosphatisomerase katalysiert die Umwandlung von Glycerinaldehyd-3-phosphat zu Dihydroxyacetonphosphat.

Glyceraldehyd − 3 − P ⇌ Dihydroxyaceton − P The Km dieses Enzyms für sein Substrat Glyceraldehyd-3-phosphat beträgt 1,8 × 10 -5 m. Wenn [Glyceraldehyd-3-phosphat] = 30 μM, die Reaktionsgeschwindigkeit, v, betrug 82,5 μmol ml -1 s -1 .

A. Was ist Vmax für dieses Enzym?

B. Angenommen, in diesem Experiment wurden 3 Nanomol pro ml Enzym verwendet ([Egesamt]) = 3 Nanomol/ml), was ist kKatze für dieses Enzym?

C. Wie hoch ist die katalytische Effizienz (kKatze/Km) für Triosephosphatisomerase?

D. Ist der Wert von kKatze/Kmenthüllen, ob Triosephosphat-Isomerase sich der "katalytischen Perfektion" nähert?

e. Was bestimmt die ultimative Geschwindigkeitsgrenze einer enzymkatalysierten Reaktion? Das heißt, was setzt der kinetischen Perfektion die physikalische Grenze auf?


Metabolische Netzwerkinferenz aus Zeitreihen

Antonio E. N. Ferreira, . Carlos Cordeiro , in Systemmedizin , 2021

Abstrakt

In metabolischen Netzwerken sind chemische Verbindungen und andere kleine chemische Spezies, allgemein als Metaboliten bekannt, durch eine Vielzahl gleichzeitiger chemischer Reaktionen und Transportprozesse verbunden. Metabolitenkonzentrationen und Reaktionsflüsse sind messbare Größen, mit denen auf die Eigenschaften des Stoffwechselnetzwerks auf struktureller, kinetischer und regulatorischer Ebene geschlossen werden kann. Von besonderem Interesse sind Zeitreihendaten der Metabolitenkonzentration, die in Metabolomics-Experimenten generiert werden. Die Verfügbarkeit dieser Art von Daten steigt aufgrund der ständigen technologischen Verbesserungen der Technologien, die in der Metabolomik und insbesondere in der Kernspinresonanz und Massenspektrometrie verwendet werden. Die Schlussfolgerung von metabolischen Netzwerkeigenschaften aus Zeitreihendaten beruht auf der Konstruktion und Verfeinerung von Computermodellen von Stoffwechselwegen, die oft als Systeme gewöhnlicher Differentialgleichungen (SODE) ausgedrückt werden. In Verbindung mit diesen Modellen wurden Zeitreihendaten als Grundlage für drei Hauptmethoden des Modellentwurfs und der Modellverbesserung verwendet: 1) Parameterschätzung, bei der Modelle an Konzentrationsdaten angepasst werden, indem optimale Parameterwerte gefunden werden, 2) Flussschätzung, wobei Flussprofile werden aus Anpassungsmodellen an Schätzungen der Konzentrationsableitungen berechnet und 3) Modellunterscheidung, bei der experimentelles Design Experimente leitet, bei denen Zeitreihendaten Anhaltspunkte für die Auswahl des besten Modells aus einer Reihe von Kandidatenmodellen liefern. In diesem Artikel geben wir einen kurzen Überblick über den aktuellen Stand der Qualität metabolomischer Zeitreihendaten und erläutern die grundlegenden Konzepte und Verfahren hinter diesen drei prominenten Methoden sowie ihre Herausforderungen und jüngsten Entwicklungen.


Genome, Gene und Genomkarten

Um die Bedeutung des Wissens über das menschliche Genom zu verstehen, muss man zunächst die Funktionen des Genoms verstehen.

Genome bestehen aus DNA-Molekülen, die viele Gene enthalten

Das Genom aller lebenden Organismen besteht aus DNA, einem sehr langen zweisträngigen chemischen Polymer (Abbildung 2-1). Jeder DNA-Strang besteht aus vier verschiedenen Einheiten, Nukleotiden genannt, die Ende an Ende verbunden sind, um eine lange Kette zu bilden (Abbildung 2-2). Diese vier Nukleotide werden als A, G, C und T symbolisiert, die für die vier Basen �nin, Guanin, Cytosin und Thymin stehen, die Teile der Nukleotide sind. Ein DNA-Molekül, das zusammen mit einigen assoziierten Proteinen ein Chromosom bildet, unterscheidet sich in seiner Länge und in der Reihenfolge seiner Nukleotide von einem anderen. Jedes DNA-Molekül enthält viele Gene, die seine funktionellen Einheiten sind. Diese Gene sind in einer definierten Reihenfolge entlang des DNA-Moleküls angeordnet. Die meisten Gene kodieren für Proteinmoleküle, Enzyme oder Strukturelemente, die die Eigenschaften einer Zelle bestimmen. Bei Bakterien sind die kodierenden Sequenzen eines Gens kontinuierliche Nukleotidketten, aber bei Säugetieren sind die kodierenden Segmente eines Gens (Exons genannt) im Allgemeinen durch nichtkodierende Segmente (Introns genannt) voneinander getrennt (Abbildung 2-3). Oft kodiert jedes Exon eine andere strukturelle Region (oder Domäne) eines größeren Proteinmoleküls. Es wurde festgestellt, dass viele Exons Teil einer Familie verwandter kodierender Sequenzen sind, die bei der Konstruktion vieler verschiedener Gene verwendet werden (Doolittle et al., 1986). Aufgrund der vielen Introns in Säugetiergenen ist ein einzelnes Gen oft länger als 10.000 Nukleotide, und Gene, die 100.000 Nukleotide umfassen, sind keine Seltenheit (Tabelle 2-1).

Abbildung 2-1

Zwei Möglichkeiten, die DNA-Doppelhelix darzustellen. Diagramme zeigen einen sehr kurzen Abschnitt des DNA-Moleküls in jedem Chromosom. Das menschliche Genom enthält etwa 200 Millionen Mal so viel DNA wie gezeigt. Die beiden Stränge der DNA-Doppelhelix verlaufen gegenläufig (mehr.)

Abbildung 2-2

Die Nukleotide, die ein DNA-Molekül bilden. (A) Spezifische Wasserstoffbrücken-Wechselwirkungen zwischen G und C und zwischen A- und T-Basen erzeugen komplementäre Nukleotidpaare (dh G bindet immer an C und A bindet immer an T). Ein haploides menschliches Genom enthält (mehr.)

Abbildung 2-3

Wie Gene in menschlichen Zellen exprimiert werden. Jedes Gen kann die Synthese eines bestimmten Proteins spezifizieren. Ob ein Gen ausgeschaltet oder eingeschaltet ist, hängt von Signalen ab, die auf die regulatorische Region des Gens wirken. Wenn das Gen eingeschaltet ist, wird das gesamte Gen transkribiert in (mehr.)

TABELLE 2-1

Die Größe einiger menschlicher Gene.

Damit die Informationen in den kodierenden Sequenzen eines Gens exprimiert werden können, muss die DNA eines Gens zunächst in ein RNA-Molekül transkribiert werden (Abbildung 2-3). Bevor der RNA-Strang den Zellkern verlässt, werden die Intron-Sequenzen aus diesem RNA-Strang durch einen Prozess namens RNA-Splicing herausgeschnitten, wodurch die Exon-Sequenzen in Kontiguität gebracht werden. Dann kann die RNA entsprechend dem genetischen Code (jede Gruppe von drei Nukleotiden kodiert für eine Aminosäure) in ein Proteinmolekül übersetzt werden. Nukleotidsequenzen neben den kodierenden Sequenzen in jedem Gen kodieren regulatorische Signale zur Aktivierung oder Inaktivierung der Transkription des Gens. Die Genaktivität ist ein dynamischer Prozess zu einem bestimmten Zeitpunkt und in einem bestimmten Zelltyp ist nur eine Teilmenge von Genen aktiv. Diese aktiven Gene bestimmen den Verlauf der embryonalen Entwicklung und die Eigenschaften von Zellen und Organismen.

Das menschliche Genom besteht aus 24 verschiedenen Arten von DNA-Molekülen

Menschliche DNA ist in physisch getrennte Einheiten verpackt, die Chromosomen genannt werden. Menschen sind diploide Organismen, die zwei Sätze genetischer Informationen enthalten, einen von der Mutter und einen vom Vater geerbten. Somit hat jede Körperzelle 22 Chromosomenpaare, die Autosomen genannt werden (ein Mitglied jedes Paares von jedem Elternteil) und zwei Geschlechtschromosomen (ein X- und ein Y-Chromosom bei Männern und zwei X-Chromosomen bei Frauen). Jedes Chromosom enthält ein einzelnes sehr langes, lineares DNA-Molekül. In den kleinsten menschlichen Chromosomen besteht dieses DNA-Molekül aus etwa 50 Millionen Nukleotidpaaren, die größten Chromosomen enthalten etwa 250 Millionen Nukleotidpaare.

Das diploide menschliche Genom besteht somit aus 46 DNA-Molekülen von 24 verschiedenen Typen. Da menschliche Chromosomen in fast identischen Paaren vorkommen, müssen nur 3 Milliarden Nukleotidpaare (das haploide Genom) sequenziert werden, um vollständige Informationen über ein repräsentatives menschliches Genom zu erhalten. Das menschliche Genom soll daher 3 Milliarden Nukleotidpaare enthalten, obwohl die meisten menschlichen Zellen 6 Milliarden Nukleotidpaare enthalten.

DNA ist eine Doppelhelix: Jedes Nukleotid auf einem DNA-Strang hat ein komplementäres Nukleotid auf dem anderen Strang. Die Information über den einen DNA-Strang ist daher redundant zu der des anderen (dh wegen komplementärer Basenpaarung (Abbildung 2-2A) kann man im Prinzip die Nukleotidsequenz des einen Strangs vom anderen bestimmen). Derzeit ist es jedoch erforderlich, die Sequenzen der Nukleotide auf den beiden DNA-Strängen getrennt zu bestimmen, um die gewünschte Genauigkeit jeder DNA-Sequenz zu erreichen, wobei die Sequenz jedes Strangs als Kontrolle des anderen verwendet wird. Aus diesem Grund müssen tatsächlich insgesamt 6 Milliarden Nukleotide sequenziert werden, um die 3 Milliarden Nukleotidpaare im haploiden menschlichen Genom zu ordnen.

Die durchschnittliche Größe eines Proteinmoleküls erlaubt es, vorherzusagen, dass pro Gen ungefähr 1.000 Nukleotidpaare kodierender Sequenzen vorhanden sind. Da der Mensch etwa 100.000 Gene besitzt, müssen im menschlichen Genom insgesamt etwa 100 Millionen Nukleotidpaare kodierender DNA vorhanden sein. Dass dies nur etwa 3 Prozent der Gesamtgröße des Genoms ausmacht, lässt den Schluss zu, dass weniger als 5 Prozent des menschlichen Genoms für Proteine ​​kodieren. Der Großteil der menschlichen DNA liegt zwischen den Genen und in den Introns. Ein Teil der nichtkodierenden DNA spielt eine Rolle bei der Regulierung der Genaktivität, während andere Teile für die Organisation der DNA in Chromosomen und für die Chromosomenreplikation wichtig sind (Alberts et al., 1983 Lewin, 1987). Die Funktion der meisten nichtkodierenden Regionen des menschlichen Genoms ist jedoch unbekannt, ein Großteil dieser DNA hat möglicherweise überhaupt keine Funktion.

Das menschliche Genom kann auf viele verschiedene Arten kartiert werden

Es wäre enorm nützlich, die Reihenfolge und den Abstand aller Gene zu bestimmen, aus denen das Genom besteht. Solche Informationen sollen eine Gen- oder Genomkarte darstellen. Da es im menschlichen Genom 24 verschiedene DNA-Moleküle gibt, besteht eine vollständige menschliche Genkarte aus 24 Karten, jede in der linearen Form des DNA-Moleküls selbst.

Ein Typ einer nützlichen Genomkarte ist die Boten-RNA (mRNA) oder Exon-Karte. Zelluläre Enzyme transkribieren oder kopieren alle Gene eines Organismus in mRNAs, damit die Funktionen der Gene exprimiert werden können. Komplementäre DNA (cDNA) aller in einem Organismus vorhandenen mRNAs kann enzymatisch mit reverser Transkriptase synthetisiert werden. Diese cDNAs können dann kloniert und verwendet werden, um die entsprechenden Gene auf einer Chromosomenkarte zu lokalisieren. Auf diese Weise können die Gene ohne Kenntnis ihrer Funktion kartiert werden. Eine andere Art von Genomkarte würde aus einem geordneten Satz überlappender DNA-Klone bestehen, die ein ganzes Chromosom bilden. Sowohl die Exon-Karte als auch der geordnete Satz von DNA-Klonen werden gewöhnlich als physikalische Karten bezeichnet. Alternativ kann die Position eines Gens kartiert werden, indem die Wirkung der Expression des Gens auf die es enthaltenden Zellen verfolgt wird. Hier wird eine Karte auf der Grundlage der Häufigkeiten der gemeinsamen Vererbung von zwei oder mehr genetischen Markern erstellt. Diese Art von Karte wird als genetische Verknüpfungskarte bezeichnet. Die Unterscheidung zwischen physikalischen und genetischen Kopplungskarten wird in Kapitel 4 ausführlich diskutiert.

Karten des menschlichen Genoms können in vielen verschiedenen Maßstäben oder Auflösungsstufen erstellt werden. Aus den charakteristischen Mustern von Banden, die entlang jedes Chromosoms durch Lichtmikroskopie gefärbter Chromosomen beobachtet werden, wurden physikalische Karten mit niedriger Auflösung abgeleitet. Gene wurden auf verschiedene Weise physikalisch mit bestimmten Banden oder Clustern von Banden in Verbindung gebracht. Diese Assoziationen erlauben eine nur annähernde Kartierung von Genen, da ein gegebenes Gen einer Region von etwa 10 Millionen Nukleotiden zugeordnet werden könnte, die mehrere hundert Gene enthält. Seine genaue Position auf dem Chromosom muss durch genauere Methoden bestimmt werden.

Karten mit höherer Auflösung basieren auf Stellen in der DNA, die von speziellen Proteinen, den sogenannten Restriktionsenzymen, geschnitten werden. Jedes Enzym erkennt eine spezifische kurze Sequenz von vier bis acht Nukleotiden (eine Restriktionsstelle) und schneidet die DNA-Kette an einer Stelle innerhalb der Sequenz (Watson et al., 1983). Da Dutzende verschiedener Sequenzen von dem einen oder anderen Enzym erkannt werden und diese Sequenzen im gesamten Genom eng beabstandet sind, können hochauflösende physikalische Karten erstellt werden, indem die relative Position verschiedener Restriktionsstellen genau bestimmt wird. Von besonderem Wert bei der Humangenkartierung sind Restriktionsstellen, die in der Population stark variabel (oder polymorph) sind. DNA, der eine spezifische Restriktionsstelle fehlt, ergibt ein größeres Restriktionsfragment, wenn sie durch das Enzym geschnitten wird, als DNA, die die Stelle enthält, daher die Bezeichnung Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP). Hunderte von polymorphen Restriktionsschnittstellen wurden bisher identifiziert und im menschlichen Genom kartiert. Einige krankheitsbezogene Gene wurden bereits durch die Bestimmung der Häufigkeit der Kovererbung von RFLPs und genetischen Erkrankungen lokalisiert (Gusella et al., 1983). Beispiele für diese Krankheiten umfassen Mukoviszidose, Duchenne-Muskeldystrophie, Alzheimer-Krankheit und Neurofibromatose. Die Identifizierung einer viel größeren Zahl nützlicher polymorpher Restriktionsstellen sollte es ermöglichen, krankheitsbezogene Gene genau genug zu kartieren, um die Isolierung jedes menschlichen Gens stark zu erleichtern.

Einen besonderen Wert hat die Karte, die auf einer Sammlung geordneter Klone genomischer Fragmente basiert (siehe Kapitel 4). In einer solchen Karte sind nicht nur die genomischen Positionen von Restriktionsfragmenten bekannt, sondern jedes Fragment ist als Klon verfügbar, der vermehrt und an interessierte Forscher verteilt werden kann. Solche Klone sind immens wertvoll, weil sie als Ausgangspunkt für die Genisolierung, für Funktionsanalysen und für die Bestimmung von Nukleotidsequenzen dienen.

Die ultimative Karte des menschlichen Genoms mit der höchsten Auflösung ist die Nukleotidsequenz, in der die Identität und Lage jedes der 3 Milliarden Nukleotidpaare bekannt ist (siehe Kapitel 5). Nur eine solche Sequenz enthüllt alle oder fast alle Informationen im menschlichen Genom. Auf diese Weise wurden bereits eine Reihe spezifischer Bereiche der menschlichen DNA analysiert, die Aufschluss über die Struktur von Genen und deren kodierten Proteinen sowohl bei normalen als auch bei abnormalen Individuen geben und über Sequenzen, die die Genexpression regulieren (Abbildung 2-4). Gegenwärtig ist jedoch die Nukleotidsequenz von wesentlich weniger als 0,1 Prozent des menschlichen Genoms bekannt. Dazu gehört die Sequenz, die 0,5 Prozent unserer Gene enthält.

Abbildung 2-4

Die DNA-Sequenz des menschlichen Gens für Beta-Globin (ein Protein aus 146 Aminosäuren, das Teil des Hämoglobinmoleküls ist, das Sauerstoff im Blut transportiert). Die Reihenfolge von nur einem der beiden DNA-Stränge ist angegeben, da der andere eine exakte (mehr.)


Inhalt

Oligonukleotide werden chemisch unter Verwendung von Bausteinen, geschützten Phosphoramiditen von natürlichen oder chemisch modifizierten Nukleosiden oder in geringerem Maße von nichtnukleosidischen Verbindungen synthetisiert. Der Zusammenbau der Oligonukleotidkette schreitet in der 3'- zu 5'-Richtung fort, indem einem Routineverfahren gefolgt wird, das als "synthetischer Zyklus" bezeichnet wird. Der Abschluss eines einzelnen Synthesezyklus führt zur Addition eines Nukleotidrestes an die wachsende Kette. Eine Ausbeute von weniger als 100 % jedes Syntheseschrittes und das Auftreten von Nebenreaktionen setzen der Effizienz des Verfahrens praktische Grenzen. Im Allgemeinen sind Oligonukleotidsequenzen gewöhnlich kurz (13-25 Nukleotide lang). [4] Die maximale Länge synthetischer Oligonukleotide überschreitet kaum 200 Nukleotidreste. HPLC und andere Verfahren können verwendet werden, um Produkte mit der gewünschten Sequenz zu isolieren.

Die Herstellung chemisch stabiler kurzer Oligonukleotide war die früheste Herausforderung bei der Entwicklung von ASO-Therapien. Natürlich vorkommende Oligonukleotide werden leicht von Nukleasen abgebaut, einem Enzym, das Nukleotide spaltet und in jedem Zelltyp reichlich vorhanden ist. [5] Kurze Oligonukleotidsequenzen haben auch schwache intrinsische Bindungsaffinitäten, was zu ihrem Abbau in vivo beiträgt. [6]

Backbone-Modifikationen Bearbeiten

Nukleosidorganothiophosphat (PS)-Analoga von Nukleotiden verleihen Oligonukleotiden einige vorteilhafte Eigenschaften. Die wichtigsten vorteilhaften Eigenschaften, die PS-Rückgrate Nukleotiden verleihen, sind die Diastereomerenidentifizierung jedes Nukleotids und die Fähigkeit, Reaktionen, an denen die Phosphorothioat-Nukleotide beteiligt sind, leicht zu verfolgen, was bei der Oligonukleotid-Synthese nützlich ist. [7] PS-Rückgrat-Modifikationen an Oligonukleotiden schützen diese vor unerwünschtem Abbau durch Enzyme. [8] Die Modifikation des Nukleotidrückgrats ist weit verbreitet, da sie bei den meisten Nukleotiden relativ einfach und genau erreicht werden kann. [7] Fluoreszierende Modifikationen am 5'- und 3'-Ende von Oligonukleotiden wurden berichtet, um die Oligonukleotid-Strukturen, -Dynamik und -Wechselwirkungen in Bezug auf die Umgebung zu bewerten. [9]

Zuckerringmodifikationen Bearbeiten

Eine weitere Modifikation, die für medizinische Anwendungen von Oligonukleotiden nützlich ist, sind 2’-Zuckermodifikationen. Die Modifikation des Zuckers in 2'-Position erhöht die Wirksamkeit von Oligonukleotiden, indem die Zielbindungsfähigkeiten von Oligonukleotiden verbessert werden, insbesondere bei Antisense-Oligonukleotid-Therapien. [6] Sie verringern auch die unspezifische Proteinbindung und erhöhen die Genauigkeit beim Targeting spezifischer Proteine. [6] Zwei der am häufigsten verwendeten Modifikationen sind 2’-O-Methyl und 2’-O-Methoxyethyl. [6] Auch fluoreszierende Modifikationen an der Nukleobase wurden beschrieben. [9]

Antisense-Oligonukleotide sind Einzelstränge von DNA oder RNA, die zu einer ausgewählten Sequenz komplementär sind. [4] Im Fall von Antisense-RNA verhindern sie die Proteintranslation bestimmter Boten-RNA-Stränge, indem sie sich an diese binden, in einem als Hybridisierung bezeichneten Prozess. [10] Antisense-Oligonukleotide können verwendet werden, um auf eine spezifische, komplementäre (kodierende oder nicht-kodierende) RNA abzuzielen. Wenn eine Bindung stattfindet, kann dieses Hybrid durch das Enzym RNase H abgebaut werden. [10] RNase H ist ein Enzym, das RNA hydrolysiert und bei Verwendung in einer Antisense-Oligonukleotid-Anwendung zu einer 80-95%igen Herunterregulierung der mRNA-Expression führt. [4]

Die Verwendung von Morpholino-Antisense-Oligonukleotiden für Gen-Knockdowns bei Wirbeltieren, die heute eine Standardtechnik in der Entwicklungsbiologie ist und verwendet wird, um veränderte Genexpression und Genfunktion zu untersuchen, wurde zuerst von Janet Heasman mit Xenopus entwickelt. [11] Zu den von der FDA zugelassenen Morpholino-Medikamenten gehören Eteplirsen und Golodirsen. Die Antisense-Oligonukleotide wurden auch verwendet, um die Influenzavirus-Replikation in Zelllinien zu hemmen. [12] [13]

Neurodegenerative Erkrankungen, die auf ein einzelnes mutiertes Protein zurückzuführen sind, sind gute Ziele für Antisense-Oligonukleotidtherapien, da sie in der Lage sind, sehr spezifische RNA-Sequenzen mit hoher Selektivität anzusteuern und zu modifizieren. Viele genetische Erkrankungen, darunter die Huntington-Krankheit, die Alzheimer-Krankheit, die Parkinson-Krankheit und die amyotrophe Lateralsklerose (ALS), wurden mit DNA-Veränderungen in Verbindung gebracht, die zu falschen RNA-Sequenzen und falsch übersetzten Proteinen mit toxischer physiologischer Wirkung führen. [14]

Chromatographie Bearbeiten

Als chromatographische stationäre Phasen können Alkylamide verwendet werden. [15] Diese Phasen wurden zur Trennung von Oligonukleotiden untersucht. [16] Ionenpaar-Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie wird verwendet, um die Oligonukleotide nach der automatisierten Synthese zu trennen und zu analysieren. [17]

Massenspektrometrie Bearbeiten

Als Matrix für die Oligonukleotidanalyse in der MALDI-Massenspektrometrie kann eine Mischung aus 5-Methoxysalicylsäure und Spermin verwendet werden. [18] Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie (ESI-MS) ist auch ein leistungsfähiges Werkzeug zur Charakterisierung der Masse von Oligonukleotiden. [19]

DNA-Mikroarray Bearbeiten

DNA-Mikroarrays sind eine nützliche analytische Anwendung von Oligonukleotiden. Im Vergleich zu Standard-cDNA-Mikroarrays haben Mikroarrays auf Oligonukleotidbasis eine kontrolliertere Spezifität gegenüber der Hybridisierung und die Fähigkeit, das Vorhandensein und die Prävalenz von alternativ gespleißten oder polyadenylierten Sequenzen zu messen. [20] Ein Subtyp von DNA-Mikroarrays kann als Substrat (Nylon, Glas usw.) beschrieben werden, an das Oligonukleotide in hoher Dichte gebunden wurden. [21] Es gibt eine Reihe von Anwendungen von DNA-Mikroarrays in den Biowissenschaften.


Danksagung

Die Autoren danken Michael Gossing, Sunjae Lee, Johan Björkeroth, Amir Feizi und Henning Redestig für wertvolle Beiträge. Dieses Projekt wurde vom Forschungs- und Innovationsprogramm Horizon 2020 der Europäischen Union im Rahmen der Finanzhilfevereinbarungen Nr. 686070 und 720824, der Novo Nordisk Foundation, der Knut and Alice Wallenberg Foundation und dem US Department of Energy, Office of Science, Office of Biological and Umweltforschung, Genomic Science Programm (DE-SC0008744). B.J.S. dankt CONICYT für die finanzielle Unterstützung (Grant #6222/2014).


Schau das Video: ENZYMER (Kann 2022).