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Rolle von Calciumchlorid bei der kompetenten Zellpräparation


Ich bin mir der Tatsache bewusst, dass sich $CaCl_2$ an der Zellwand absetzt und diese weniger negativ macht, möglicherweise durch die Bildung einer Bindung mit Teichonsäure. Auch aufgrund der positiven Ladung zieht es DNA an (DNA ist aufgrund der Phosphatgruppe negativ geladen). Aber tut $CaCl_2$ noch etwas anderes? Auch wenn es die Arbeit von $CaCl_2$ ist, warum fügen wir $MgCl_2$ zuerst in das Standardprotokoll der chemischen Herstellung kompetenter Zellen ein?


Obwohl wir keinen schlüssigen Beweis dafür haben, wie $CaCl_2$ funktioniert, ist der vorgeschlagene Mechanismus dem von Ihnen vorgeschlagenen sehr ähnlich. Wenn $CaCl_2$ in wässriger Lösung dissoziiert, binden $Ca^{2+}$-Ionen an die Phosphatgruppen in der DNA sowie an den inneren Kern der Lipopolysaccharide in der Zellmembran (Dagert et al, 1979) und neutralisiert sie. Danach ermöglicht ein Hitzeschock die Aufnahme dieser DNA in den Wirt (wie der Hitzeschock funktioniert, ist ebenfalls nicht bekannt; es wird vermutet, dass eine erhöhte Temperatur Poren in der Zellmembran erzeugt, siehe diese Antwort). Zur visuellen Darstellung siehe dieses Diagramm (von hier):

Auch bezüglich $MgCl_2$ ist die Rolle von $Mg^{2+}$ noch nicht vollständig verstanden. Es ist jedoch bekannt, dass $Mg^{2+}$ das Zellwachstum fördert (Hanahan et al, 1983). Dies könnte daran liegen, dass $Mg^{2+}$ ein wichtiger Faktor ist, der für das Funktionieren von Ribosomen erforderlich ist (Nierhaus et al, 2014). Jedenfalls scheint seine Rolle bei der Steigerung der Kompetenz geringer zu sein als die von $Ca^{2+}$.

PS: während des Experiments arbeiten $Mn^{2+}$, $Rb^+$ und $K^+$ zusammen mit $Ca^{2+}$ ebenfalls effektiv (Hanahan et al, 1983).

Verweise:

  1. Dagert, M.; Ehrlich, S. (1979). "Längere Inkubation in Calciumchlorid verbessert die Kompetenz von Escherichia coli Zellen". Gen. 6 (1): 23-28. doi:10.1016/0378-1119(79)90082-9. PMID 383576

  2. Douglas Hanahan, Studien zur Transformation von Escherichia coli mit Plasmiden, Journal of Molecular Biology, Band 166, Ausgabe 4, 1983, Seiten 557-580, ISSN 0022-2836, http://dx.doi.org/10.1016/S0022-2836(83)80284-8.

  3. Nierhaus K. H. $Mg^{2+}$, $K^+$ und das Ribosom J. Bacteriol. 2014 196 3817-3819


Rolle von Calciumchlorid bei der kompetenten Zellpräparation - Biologie

Ein verbessertes System für kompetente Zellpräparation und hocheffiziente Plasmidtransformation unter Verwendung verschiedener Escherichia coli Stämme

Zhiming Tu
China-UK HUST-Res gemeinsames Labor für Pflanzengenetik und Genomik
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Guangyuan He*
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Kexiu X. Li
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Mingjie J. Chen
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Junli Chang
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Ling Chen
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Qing Yao
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Dongping P. Liu
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Huan Ye
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Jiantao Shi
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Finanzielle Unterstützung: Entwicklungsplan der Staaten für Hochtechnologie (Plan "863).

Schlüsselwörter:
kompetente Zellen, E coli, Plasmid, Lagerung, Transformation.

cfu: Koloniebildende Einheiten
TB: Transformationspuffer von CaCl2 Lösung.

Dieser Artikel beschreibt ein effizientes bakterielles Transformationssystem, das für die Herstellung von kompetenten Zellen, die Plasmidpräparation und für die Lagerung in Bakterienstämmen in unserem Labor etabliert wurde. Mit dieser Methode wurden eine Reihe verschiedener Plasmide für weitere Experimente amplifiziert. Kompetente Zellen für die bakterielle Transformation wurden nach der Calciumchlorid-Methode mit einer optimalen Konzentration von 75 mM hergestellt. Drei verschiedene Sorten von Escherichia coli Getestet wurden DH5α, TG1 und XL1 blue, und der effizienteste Stamm ist XL1 blue. Die optimale optische Dichte (OD600) Bereich für kompetente Zellpräparation variierte für jeden der untersuchten Stämme, und für XL1 blue betrug er 0,15–0,45, für TG1 0,2–0,5 und für DH5α 0,145–0,45. Die Lagerzeit von kompetenten Zellen und ihre Korrelation mit der Transformationseffizienz wurde untersucht, und das Ergebnis zeigte, dass kompetente Zellen 7 Tage bei –20°C und 15 Tage bei –70°C gelagert werden können. Drei kritische Änderungen an früheren Methoden wurden vorgenommen, nämlich die Änderung des normalen CaCl2 Lösung zu TB-Lösung, der Wechsel des Mediums von LB zu S.O.C. und Zugabe von DMSO oder PEG8000 während der Transformation kompetenter Zellen mit Plasmiden. Ein Wechsel des Mediums von LB zu S.O.C. führte zu einem viel schnelleren Wachstum der Transformanten und die Transformationseffizienz wurde erhöht. Zugabe von DMSO oder PEG8000 erhöhte Transformationseffizienzen um das 100- bis 300-fache. Unser verbessertes bakterielles Transformationssystem kann die Transformationseffizienz um das 10 3-fache steigern, wodurch es zu einem hocheffizienten bakteriellen Transformationssystem wird.

Die Plasmidtransformation in kompetente Bakterienzellen ist eine Schlüsseltechnik beim molekularen Klonen. Anfang der 1970er Jahre transformierte Cohen (Cohen et al. 1973) erfolgreich den R-Faktor und rekombinante Plasmide in E coli Zellen mit einer Calciumchlorid-Methode. Seitdem ist diese Methode aufgrund ihrer Bequemlichkeit weit verbreitet. Ein alternatives Transformationsverfahren, das verwendet wird, ist die Elektroporation, die zu einer höheren Transformationseffizienz von bis zu 10 9 – 10 10 Transformanten/μ g DNA führt (Ryu und Hartin, 1990). McCormac (McCormac et al. 1998) veröffentlichte eine einfache Methode zur Herstellung hochkompetenter Zellen von Agrobakterium Tunrefacier/Rhizobium zur Umwandlung durch Elektroporation. Okamoto (Okamoto et al. 1997) berichtete auch über eine hocheffiziente Transformation von Bacillus brevis B. durch Elektroporation, jedoch ist für die Elektroporation eine spezielle Ausrüstung erforderlich, die viele Labors nicht bereitstellen können. Tsen hat bestimmte Stämme von . gefunden E coli können extrazelluläre Plasmide „natürlich“ mit geringer Häufigkeit in das Zytoplasma einbauen (Tsen et al. 2002). Kurien und Scofield haben ein schnelles und mäßig effizientes Verfahren zur bakteriellen Kolonietransformation beschrieben (Kurien und Scofield, 1995). In jüngerer Zeit hat Chen eine alternative bequeme und schnelle Methode für die genetische Transformation von . vorgeschlagen E coli mit Plasmiden. Durch Mischen der Empfängerzellen und Plasmid-DNA und direktes Verteilen auf selektiven Mediumplatten, die Ca 2+ enthalten, könnte die sogenannte 'Plattentransformation' fast die gleiche Transformationseffizienz wie die klassische Transformationsmethode mit Calcium erreichen, aber das gesamte Protokoll dauert nur ca. 2 min (Chen et al. 2001). Basierend auf dieser Methode haben wir ein effizientes System mit E coli kompetente Zellen für Transformationsplasmide. Plasmide können dann als Bakterienstamm in unserem China-UK-Gemeinschaftslabor gelagert werden, was die Amplifikation von Plasmiden für zukünftige Experimente ermöglicht.

Die E coli DH5α und E coli TG1 waren von der Wuhan University (China) E coli XL1 blue stammte von der Hubei University (China) und Rothamsted Research (UK).

Die folgenden in unserem Labor verwendeten Plasmide wurden aus verschiedenen Quellen bezogen und in unserem Labor gelagert:

Markergen-Plasmide. pUC18, pDE4, pDE108, pDE 110, pCal-gus, pCal-neo, pAct1D-gus, pAHC 25, pRT99-gus, PRT99, pAHC20, pUGFP, pCX GFP.

HMW-Glutenin-Plasmide. p1Ax1, p1Dx5, p1Dy10, p1Dy12, pHMW-gus, pHMW-nos, pGAD2.

Medien für Bakterienwachstum

LB-Mittel. 10 g/l Bacto-Trypton, 5 g/l Bacto-Hefeextrakt, 5 g/l NaCl, stellen Sie den pH-Wert mit NaOH-Autoklaven auf 7,5 ein, um zu sterilisieren. Lassen Sie das autoklavierte Medium auf 55 °C abkühlen und fügen Sie Ampicillin hinzu (Endkonzentration 100 µg/ml). Bei LB-Platten wurde vor dem Autoklavieren 1,5% Bacto-Agar (15 g/l) zugegeben.

S.O.C. Mittel. 2% Trypton (Bakto), 0,5% Hefeextrakt, 10 mM NaCl, 2,5 mM MgCl2, 10 mM MgSO4, 20 mM Glukose.

Puffer und Zusatzlösungen

TB (CaCl2)-Lösung (Inoue et al. 1990). 10 mM Rohre, 55 mM MnCl2, 15 mM CaCl2, 250 mM KCl. (ROHRE 3,021 g/l, CaCl2.2H2O 2,205 g/l, KCl 18,637 g/l, MnCl2.4H2O 10,885 g/l). Alle Komponenten außer MnCl2 wurden gemischt und der pH wurde mit KOH auf 6,7 eingestellt. Dann ist MnCl2 gelöst, die Lösung durch eine vorgespülte 0,45 &mgr;m Filtereinheit sterilfiltriert und bei 4 °C gelagert, alle Salze als Feststoffe zugegeben, immer kalt aufbewahrt und verwendet.

DMSO, gekauft von ALPHA Biotechnologies Company, LTD (SigmaD5879).

ANBINDUNG8000 werden von Sino-American Company (Wuhan, China), PEG . gekauft8000 (40%) Lösung, gelagert bei –20°C.

Vorbereitung kompetenter Zellen

Es gibt zwei Hauptmethoden zur Transformation kompetenter Bakterienzellen, die Calciumchlorid- und die Elektroporationsmethode (Dargert et al. 1979 Okamoto et al. 1997 Topcu, 2000). Wir wählen die Calciumchlorid-Methode.

Calciumchlorid-Methode. Ein 10 μl Glycerinvorrat von einem E coli Stamm, der keine Plasmide enthielt, wurde bei Raumtemperatur auftauen gelassen und zu 40 ml flüssigem S.O.C. Medien. Diese Kultur wurde 1 Stunde bei 37 °C inkubiert, dann in einen Inkubator-Schüttler bei 37 °C überführt, wobei 2-3 Stunden bei 200 U/min geschüttelt wurde, bis eine OD&sub2;600 von 0,2-0,4 erreicht. Die optimale OD600 für die verschiedenen Bakterienstämme variiert. Die Bestimmung ihrer frühen Log-Phase ist wichtig. Die Zellen wurden durch Zentrifugation bei 8000 U/min für 1 Minute bei 4 °C pelletiert, dann in einem halben Volumen (20 ml) steriler kalter TB (CaCl&sub2;2) Lösung und inkubiert auf Eis für 25 min. Nach einem weiteren Zentrifugationsschritt wie oben wurde das resultierende Zellpellet in einem Zehntel Volumen (4 ml) steriler kalter TB (CaCl&sub2;2)-Lösung, um die endgültige kompetente Zellsuspension zu erhalten. Kompetente Zellen können bis zu 3 Tage bei 4ºC gelagert werden.

Vorbereitung kompetenter Zellen zur Lagerung als Glycerinstock. Übertragen Sie 1,6 ml der kompetenten Zellsuspension in sterile Kryo-Aufbewahrungsröhrchen und fügen Sie 0,4 ml steriles 100 % Glycerin hinzu, um eine Endkonzentration von 20 % Glycerin zu ergeben, und mischen Sie dann zusammen. Die Glycerinvorräte werden für die spätere Verwendung separat bei -4°C, -20°C und -70°C platziert.

Bakterielle Transformation

Plasmidtransformation und Antibiotikaselektion. Die Behandlung von Bakterienzellen mit Calciumchlorid erzeugt kompetente Zellen, die nach einem Hitzeschockschritt DNA aufnehmen. DNA-Moleküle, d.h. Plasmide, die durch dieses Verfahren eingeführt werden, werden dann in den bakteriellen Wirtszellen repliziert. Um die Erholung der Bakterienzellen zu unterstützen, werden die Zellen nach der Hitzeschockbehandlung kurz mit nicht-selektivem Wachstumsmedium inkubiert. Aufgrund des geringen Prozentsatzes an Bakterienzellen, die mit dem Plasmid transformiert wurden, und der Möglichkeit, dass sich das Plasmid nicht in allen Tochterzellen selbst vermehrt, ist es jedoch notwendig, auf Bakterienzellen zu selektieren, die das Plasmid enthalten. Dies wird üblicherweise durch Antibiotika-Selektion durchgeführt.

E coli Sorten wie XL1 blau, DH5α und TG1 sind empfindlich gegenüber gängigen Antibiotika wie Ampicillin. Plasmide, die für das Klonieren und Manipulieren von DNA verwendet werden, wurden daher gentechnisch verändert, um Gene für Antibiotikaresistenz beispielsweise gegen Ampicillin zu beherbergen. Wenn nach dem Transformationsverfahren Bakterien auf Ampicillin enthaltende Medien ausplattiert werden, haben somit nur Bakterien, die die Plasmid-DNA besitzen, die Fähigkeit, Ampicillin zu metabolisieren und Kolonien zu bilden. Auf diese Weise können Bakterienzellen selektiert werden, die Plasmid-DNA enthalten.

Bakterientransformationsprotokoll unseres Labors

  1. Platten aus festem S.O.C. und S.O.C. Ampicillin (Endkonzentration 100 µg/ml) bei 37 °C für 1 Stunde.
  2. Nehmen Sie 100 μl kompetente Zellen und fügen Sie 1 μg/μl Plasmid-DNA 0,5 μl hinzu.
  3. DMSO oder PEG hinzufügen8000 (40%) 1 μl.
  4. 30 min auf Eis inkubieren.
  5. Hitzeschock bei 42ºC für 90 s. (Für eine noch schnellere Transformationsmethode kann dieser Schritt vernachlässigt oder weggelassen werden).
  6. 2 min auf Eis inkubieren.
  7. 400 μl flüssige S.O.C. Mittel.
  8. Inkubieren bei 37ºC für 45 min in einem Inkubations-Schüttler.
  9. Die Hälfte der Mischung (50 μl) auf eine vorgewärmte Platte mit Ampicillin verteilen und die andere Hälfte auf eine Kontrollplatte ohne Ampicillin.
  10. Platten bei 37 °C über Nacht inkubieren, um S.O.C. mittel (12-16 Std.).

Die Verwendung von Zellen in der frühen logarithmischen Wachstumsphase ist ein wichtiger Faktor für die Herstellung kompetenter Zellen. Durch die Untersuchung von Wachstumskurven wird die optimale OD600 Reichweite bestimmt werden kann. Die Wachstumskurven von drei verschiedenen E coli Dehnungen sind in Abbildung 1 dargestellt. Unser Experiment zeigt, dass die optimale optische Dichte (OD600) der Bereich für die kompetente Zellpräparation variierte für jeden der untersuchten Stämme (Abbildung 2), und für XL1 blue betrug er 0,15–0,45, für TG1 0,2–0,5 und für DH5α 0,145–0,45. Ein weiterer wichtiger Faktor ist die Konzentration von CaCl2. Es können zwar 50-100 mM Calciumchlorid verwendet werden, aber 75 mM CaCl2 in TB-Lösung erwies sich als optimale Konzentration.

Berechnung der Transformationseffizienz (koloniebildende Einheiten [KBE])

Die Transformationseffizienz ist definiert als die Anzahl der KBE, die von 1 &mgr;g Plasmid-DNA produziert wird, und wird gemessen, indem eine Kontrolltransformationsreaktion unter Verwendung einer bekannten DNA-Menge durchgeführt wird und dann die Anzahl der pro Mikrogramm DNA gebildeten KBE berechnet wird.

Gleichung für Transformationseffizienz (cfu/µg)

Transformante cfu = Anzahl der Bakterienkolonien &mal Verdünnungsverhältnis &mal ursprüngliches Transformationsvolumen/Plattenvolumen

Beispiel: Wenn 21 Kolonien auf der Platte beobachtet wurden, wurden die transformierten kompetenten Zellen vor dem Ausplattieren 10000-fach verdünnt und das ursprüngliche Transformationsvolumen betrug 100 &mgr;l, 50 &mgr;l wurden zum Ausplattieren verwendet, dann ist die transformierte cfu:

21 &mal 10000 &mal 100/50 = 4,2 &mal 10 5

Transformationseffizienz = Transformante cfu/Plasmid-DNA (µg).

Wenn die Plasmid-DNA 0,5 &mgr;l (1 &mgr;g/&mgr;l) zugegeben wurde, war die Transformationseffizienz = 4,2 × 10 5 /0,5 = 8,4 × 10 5 cfu/&mgr;g.

Die Transformationseffizienz pro Mikrogramm Plasmid-DNA in verschiedene Bakterienstämme ist in Tabelle 1 gezeigt. Dies sind die durchschnittlichen Daten von 6 Wiederholungen, die zeigen, dass der effizienteste Stamm XL1 blue ist. Unser verbessertes Verfahren kann die Transformationseffizienz ungefähr 1000-fach mehr erhöhen als die normale Methode (Sambrook et al. 1989), aber die Quick-Methode (Chen et al. 2001) verringert die Transformationseffizienz ungefähr 60-150-fach weniger als die normale Methode (Sambrook et al. 1989). ).

Die Transformationseffizienz verschiedener Plasmide mit verschiedenen Methoden auf verschiedene Bakterienstämme ist in Abbildung 3 dargestellt. Wir haben pUC18 verwendet, um unser System aufzubauen, und pUGFP, pAHC25, p1Ax1, p1Dx5, p1Dy10 verwendet, um unser System zu testen, dann berechneten wir die durchschnittliche Transformation Effizienz und erhielten die Abbildung 3. Dann verwenden wir diese verbesserte Methode, um andere Plasmide wie pDE 110, pRT99, pAHC20, pABPIgus, pRT101, pRTL2, pCX GFP, p1Dy12, pJD2, pHMW-gus, pHMW-nos, pGAD2 zu amplifizieren, pGAD12 usw., was zeigt, dass unser verbessertes Verfahren die Transformationseffizienz viel stärker erhöhen kann als das normale Verfahren (Sambrook et al. 1989), aber das Quick-Verfahren (Chen et al. 2001) verringert die Transformationseffizienz offensichtlich im Vergleich zum normalen Verfahren (Sambrook et al.) . 1989).

Einfluss der Lagerungszeit kompetenter Zellen bei unterschiedlichen Temperaturen auf die Transformationseffizienz

Die Wirkung der Lagerungszeit kompetenter Zellen bei unterschiedlichen Temperaturen auf die Transformationseffizienz wurde untersucht. Wir verwenden das pAHC25-Plasmid, um kompetente XL1-Blue-Zellen zu transformieren, die bei -4ºC, -20ºC und -70ºC getrennt für 1 Stunde, 1 Nacht, 1 Tag, 2 Tage, 3 Tage, 5 Tage, 7 Tage, 10 Tage gelagert wurden , 15 Tage und 20 Tage. Es wurde ein normales Transformationsverfahren verwendet. Das Endergebnis ist in Abbildung 4 dargestellt. Die Auswirkung der Aufbewahrungszeit kompetenter Zellen bei -20 °C auf die Transformationseffizienz zeigt, dass XL1 blue kompetente Zellen bei -20 °C gelagert und in 1 Stunde bis 7 Tagen ohne offensichtliche Verringerung der Transformationseffizienz verwendet werden können im Gegensatz dazu stieg die Transformationseffizienz von 3 Tagen auf 7 Tage und nahm dann allmählich ab. Abbildung 4 zeigt die Wirkung der Lagerungszeit kompetenter Zellen bei verschiedenen Temperaturen auf die Transformationseffizienz, was zeigt, dass kompetente Zellen 7 Tage lang bei –20 °C und 15 Tage lang bei –70 °C gelagert werden können, ohne offensichtlich ihre Kompetenz zu verlieren.

Die Transformationseffizienz ist bei molekularen Klonierungsexperimenten sehr wichtig und kann von vielen Faktoren beeinflusst werden. Takahashi haben über eine einfache Methode zur Plasmidtransformation von . berichtet E coli durch schnelles Einfrieren (Takahashi et al. 1992). Ryu und andere Autoren haben auf die Bedeutung der frühen logarithmischen Phase für die Transformation hingewiesen (Ryu und Hartin, 1990). Bakterien, die DNA aufnehmen können, werden als "kompetent" bezeichnet und Kompetenz kann durch Behandlung mit Calciumchlorid in der frühen logarithmischen Wachstumsphase induziert werden. Die Bakterienzellmembran ist durchlässig für Chloridionen, aber nicht durchlässig für Calciumionen. Wenn die Chloridionen in die Zelle eintreten, begleiten Wassermoleküle das geladene Teilchen. Dieser Wassereinstrom lässt die Zellen anschwellen und ist für die Aufnahme von DNA notwendig. Der genaue Mechanismus dieser Aufnahme ist unbekannt. Unsere Experimente haben gezeigt, dass verschiedene Stämme von E coli haben unterschiedliche Wuchseigenschaften, wie z E coli: XL1 blau, TG1 und DH5α, daher das optimale OD600 Der für die Präparation kompetenter Zellen zu verwendende Bereich variiert: Für XL1 blue beträgt dieser 0,15-0,45, für TG1 0,2-0,5 und für DH5α 0,145-0,45. Kompetente Zellen, die aus den Überwucherungs- oder Unterwuchsbakterienkulturen außerhalb dieser optimalen OD . hergestellt wurden600 Reichweite reduzierte oder keine Transformationskapazität haben. In unserem Labor wurde festgestellt, dass XL1 blue die höchste Transformationseffizienz aufweist und daher häufiger verwendet wird. Bakterien zur Herstellung kompetenter Zellen würden routinemäßig auf OD . kultiviert600 = 0.2-0.4.

Ein zweiter Faktor, der sich auf die Transformationseffizienz auswirken kann, besteht darin, dass die kompetenten Zellen sowohl während der Lagerung als auch im Gebrauch in einer kalten Umgebung gehalten werden müssen. Dargert (Dargert und Ehrlich, 1979) berichtete, dass kompetente Zellen bei 4°C in Calciumchlorid für 24-48 Stunden gelagert werden konnten. In den besten 12-24 Stunden steigt die Transformationseffizienz um das 3- bis 5-fache an und sinkt dann auf das durchschnittliche Niveau. Unsere Experimente zeigen, dass kompetente Zellen bei -70 °C für 15 Tage gelagert werden können, ohne dass ihre Transformationskapazität offensichtlich reduziert wird. Wenn die kompetenten Zellen jedoch bei -20 °C gelagert werden, treten die höchsten Transformationseffizienzen nach 2-7 Tagen auf. Wenn die Lagerzeit jedoch mehr als 7 Tage betrug, wurde die Transformationseffizienz dramatisch reduziert. Wenn kompetente Zellen bei 4ºC gelagert wurden, verlieren sie ihre Kompetenz in nur 3 Tagen. Kompetente Zelle kann unter flüssigem N . nicht langfristig gelagert werden2 und kann nicht mehr als einmal aufgetaut werden.

Ein weiterer wichtiger Faktor ist die Konzentration von CaCl2. Es können zwar 50-100 mM Calciumchlorid verwendet werden, aber 75 mM CaCl2 in TB-Lösung erwies sich als optimale Konzentration. Brian und Heler (Brian und Heler, 1996) verwendeten zuerst TFB als Ersatz für das traditionelle CaCl2 Lösung. Wir haben eine TB-Lösung verwendet, die die Transformationseffizienz um mehr als das 100-fache erhöht hat. Verwendung des traditionellen CaCl2 Methode bei 37ºC, die Nr. der Transformanten/μg Plasmid-DNA war 1 &mal 10 5

10 &mal 10 5 . Die Verwendung von TB unter den gleichen Bedingungen führte zu der Nr. Transformanten/μg Plasmid-DNA von 1 &mal 10 7

Die Zugabe von DMSO oder PEG8000 während der bakteriellen Transformation kann auch die Transformationseffizienz beeinflussen. Hanahan (Hanahan et al. 1991) stellte fest, dass die Zugabe von DMSO die Transformationseffizienz stark erhöhte. Auch die Inkubation kompetenter Zellen und Plasmid-DNA in einer Lösung von Polyethylenglycol/Calciumchlorid (PEG/CaCl2), gefolgt von einer kurzen Inkubation und einem Hitzeschock, führte zu einer effizienten Aufnahme von DNA (Kurien und Scofield, 1995). Unsere Experimente zeigen, dass die Zugabe von DMSO oder PEG8000 während des Transformationsprozesses kann eine Transformationseffizienz von 100-300 mal höher als bei der Cohen-Methode ergeben.

Auch das Bakterienkulturmedium kann die Transformationseffizienz beeinflussen. Jessee (Fierro, 2004 Maeda et al. 2004) schlug S.O.C. Medium zum Wachstum von Bakterien zur Herstellung kompetenter Zellen. S.O.C. ist ein reicheres Medium als LB-Medium, was daher zu einem schnelleren Bakterienwachstum führt, nicht nur, dass Transformanten in S.O.C. früher beobachtet werden können. Medium nach 12 Stunden im Gegensatz zu 24 Stunden in LB-Medium, aber die Transformationseffizienz ist viel höher S.O.C. 10-30 mal höhere Effizienz als LB.

Es ist bekannt, dass die Wirkung einer Calciumchlorid-Behandlung durch einen anschließenden Erhitzungsschritt verstärkt werden kann, obwohl es einige Diskussionen darüber gibt, ob der Hitzeschock-Schritt für die Aufnahme von DNA entscheidend ist (Chen et al. 2001, Kimoto und Taketo, 2003). . Wann E coli einer Temperatur von 42°C ausgesetzt wird, wird eine Reihe von Genen, die als Hitzeschockgene bezeichnet werden, exprimiert, die es den Bakterien ermöglichen, bei solchen Temperaturen zu überleben. Bei Temperaturen über 42 °C verringert sich jedoch die Fähigkeit der Bakterien, DNA aufzunehmen, und bei extremeren Temperaturen sterben die Bakterien ab. Obwohl dies nicht unbedingt erforderlich ist, kann ein Hitzeschock die Umwandlungseffizienz erhöhen. Van der Rest (Van der Rest et al. 1999) beschrieb die Anwendung eines Hitzeschocks nach der Elektroporation, um eine hocheffiziente Transformation von Wildtyp- Corynebacterium glutamicum mit xenogener Plasmid-DNA. Obwohl Chen (Chen et al. 2001) eine bequeme und schnelle Methode zur genetischen Transformation von Escherichia coli bei Plasmiden wurde der Hitzeschockschritt weggelassen und die resultierende Transformationseffizienz ist etwa 100-fach geringer.

Die Autoren danken Prof. Peter Shewry von Rothamsted Research (UK) für seine hilfreichen Diskussionen und Professor Caroline Sparks von Rothamsted Research (UK) für ihre kritische Durchsicht und Korrektur des Manuskripts. Wir danken unseren Familien, Kollegen und Schülern für die Unterstützung dieser Arbeit.

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Welche Funktion hat Magnesiumchlorid bei der Bildung kompetenter Zellen?

Da E. coli nicht natürlich transformierbar ist, muss die Fähigkeit zur DNA-Aufnahme oder Kompetenz durch chemische Verfahren unter Verwendung von zwei- und mehrwertigen Kationen (Calcium, Magnesium, Mangan, Rubidium oder Hexamin-Kobalt) induziert werden. Eine Veränderung der Permeabilität der Membranen ermöglicht es der DNA, die Zellhülle von E. coli zu durchqueren, die aus einer äußeren Membran, einer inneren Membran und einer Zellwand besteht. Die äußere Membran von E. coli kann durch Anwendung des Fluidmosaikmodells für Membranen verstanden werden und besteht aus Phospholipiden, Proteinen und Lipopolysacchariden. Viele Adhäsionskanäle oder -zonen werden durch die Verschmelzung der äußeren Membran und der inneren Membran durch die Zellwandschicht gebildet. Obwohl der Transformationsmechanismus nicht bekannt ist, weisen frühere Studien darauf hin, dass diese Kanäle den Transport von DNA-Molekülen durch die Zellmembran ermöglichen. Die negativen Ladungen der einfallenden DNA werden jedoch von den negativ geladenen Anteilen der Makromoleküle auf der äußeren Oberfläche des Bakteriums abgestoßen. Die Zugabe von CaCl2 dient dazu, die ungünstigen Wechselwirkungen zwischen der DNA und den Polyanionen der äußeren Schicht zu neutralisieren. Die DNA und die kompetenten Zellen werden 30 Minuten auf Eis weiter inkubiert, um die Lipidmembran zu stabilisieren und verstärkte Wechselwirkungen zwischen Calciumionen und den negativen Komponenten der Zelle zu ermöglichen. Das Reaktionsgemisch wird dann einem kurzen Hitzeschock bei 42 °C ausgesetzt. Die Temperaturänderung verändert die Fluidität des bei 0 °C erreichten halbkristallinen Membranzustands, wodurch das DNA-Molekül durch die Adhäsionszone in die Zelle eindringen kann.

Frühere Studien zeigten, dass einige E. coli-Stämme aufgrund von Unterschieden in der Zusammensetzung des Lipopolysaccharids anfälliger für eine Transformation sind als andere. E. coli mit einem langen O-verknüpften Polysaccharid blockiert oder hindert die DNA daran, in die Zelle einzudringen. Die Zugabe von Magnesium zu den Medien erhöht die Umwandlungsausbeute, indem die ionische Wechselwirkung der Moleküle auf der Oberfläche verstärkt wird und somit die Geschmeidigkeit der Membran für eine effizientere Umwandlung verändert wird.


Rolle von Calciumchlorid bei der kompetenten Zellpräparation - Biologie

Herstellung kompetenter Zellen

Mehrere supereffiziente Methoden zur Zubereitung E coli Kompetente Zellen für die Transformation wurden beschrieben (z.B. Hanahan-Methode und Inoue-Methode). Sie liefern normalerweise gute Ergebnisse bei der routinemäßigen Transformation. Wenn die Protokolle jedoch auf verschiedene E coli Stämme, die für genetische Studien verwendet werden, neigen einige Stämme dazu, wenige Transformanten zu ergeben, wahrscheinlich weil diese Protokolle für spezifische . optimiert sind E coli zur Transformation geeignete Stämme, e. g. DH1, DH5, JM109 und ihre Derivate. Das unten beschriebene Calciumchlorid-Verfahren liefert im Allgemeinen gute Ergebnisse (z. B. 10 6 Transformanten/Mikrogramm pBR322) für alle E coli Stämme, obwohl die Transformationseffizienz relativ geringer ist als bei den supereffizienten Methoden, die auf die optimalen Stämme angewendet werden.

1. E. coli bei 37 °C über Nacht in 3 ml LB schütteln.

2. 0,5 ml der Übernachtkultur in 50 ml LB in einem 200-ml-Kolben zugeben. Die Brühe sollte auf 37 C vorgewärmt werden. Schütteln Sie die Kultur bei 37 C.

3. Überwachen Sie OD 600 . Wenn eine OD 600 von 0,35–0,4 erreicht ist, die Kultur auf Eis kühlen. Wenn die höchste Transformationseffizienz nicht erforderlich ist, ernte ich die Zellen einfach 100-120 Minuten nach der Inokulation, ohne die OD 600 zu überwachen.

4. Überführen Sie die Kultur in ein steriles Zentrifugenröhrchen und sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 6.000 U/min für 8 Minuten bei 4 °C. Den Überstand verwerfen.

5. Resuspendieren Sie die Zellen in 20 ml eiskaltem 50 mM CaCl 2 . Inkubieren Sie die resuspendierten Zellen für 20 Minuten auf Eis. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation wie in Schritt 4.

6. Resuspendieren Sie die Zellen in 2,5 ml eiskaltem 50 mM CaCl 2 , oder resuspendieren Sie die Zellen in 2,5 ml eiskaltem 50 mM CaCl 2 , das 10 % Glycerin enthält, wenn Sie die kompetenten Zellen für längere Zeit als gefrorene Stammlösung lagern .

7. 100-200 Mikroliter der kompetenten Zellen für die Transformation verwenden oder die kompetenten Zellen in Aliquote von 100-200 Mikroliter verteilen und in flüssigem Stickstoff zur späteren Verwendung einfrieren.

Diese Methode kann leicht nach oben und unten skaliert werden. Wenn ich eine verwandeln möchte E coli schnell abseihen, 3 ml LB mit 0,05 ml einer Übernachtkultur beimpfen und nach 100-120 min Schütteln bei 37 °C die Zellen mit eiskalter Calciumlösung waschen. Die in 100-150 Mikroliter der Calciumlösung resuspendierten Zellen werden zur Transformation verwendet.

1. Tauen Sie die kompetenten Zellen auf Eis auf, wenn sie gefroren gelagert werden. Fügen Sie zu 100 Mikrolitern der kompetenten Zellen die entsprechende Menge an Plasmidlösungen in TE hinzu. Die Plasmidlösung sollte weniger als 5 Mikroliter betragen.

2. Keep the cells on ice for 30 minutes.

3. Quickly transfer the tube to 42 C water bath. Incubate for 1 minute, then transfer onto ice.

4. Add 1 ml of LB. Incubate at 37 C for 30 minutes. Spread the cells on agar plate(s) containing appropriate antibiotics.


OPINION article

Azka Asif 1 , Hareem Mohsin 1 , Rabia Tanvir 2 and Yasir Rehman 1 *
  • 1 Department of Microbiology and Molecular Genetics, University of the Punjab, Lahore, Pakistan
  • 2 University Diagnostic Lab, Department of Microbiology, University of Veterinary and Animal Sciences, Lahore, Pakistan

Bacterial transformation is a crucial part of cloning process and has been widely used in many studies (Swords, 2003 Gigova et al., 2006). The mechanism is marked by two phases, the first phase involves the uptake of the DNA across the cellular envelope and the second phase involves the setting up of the DNA in the cell as a stable genetic material (Hanahan, 1983). The procedure of transformation is of physicochemical nature rather than strictly being a chemical or a physical procedure, since the cells are manipulated with cations (or a combination of cations) and temperature imbalances to render them competent to uptake foreign DNA. It is a common understanding that the chemical manipulation is linked to the induction of competency while the physical manipulation is linked to the uptake of foreign DNA. The two methods act together to bring about the act of 𠇊rtificial DNA internalization.”

Over time various methods have been used to make cells competent such as by using dimethyl sulfoxide (DMSO), divalent cations, or polyehtylene glycol (PEG) (Klebe et al., 1983 Chan et al., 2013). Other than these chemical methods, electroporation has also been tested and used to induce competency (Dower et al., 1988 Yoshida and Sato, 2009 Liu et al., 2013). The use of divalent cations has been the most effective chemical treatment to bring about transformation (Day, 2004). Among various cations, divalent calcium cation (Ca 2+ ) has proven to be the most effective one (Weston et al., 1981) both alone (Dagert and Ehrlich, 1979) and in various combinations. A combination of divalent and monovalent ions, such as calcium and magnesium (Taketo, 1974 Wensink et al., 1974), calcium and manganese (Enea et al., 1975), calcium, rubidium, and dimethyl sulfoxide (Kushner, 1978) and other alkali metals with a prolonged incubation at 0ଌ (Taketo, 1972 Dagert and Ehrlich, 1979) has also been reported to be effective (Roychoudhury et al., 2009). Generally, all divalent cations enhance the transformation process. Hanahan (1983) found that the presence of magnesium in bacterial culture media increases the transformation efficiency by 15- to 20-folds as compared to the cells grown in the absence of magnesium. He also observed that the addition of magnesium in the media 30 min before the time of collection of cells also enhances the transformation up to 繠%. However, addition of magnesium as the cells are harvested and incubated on ice enhances transformation up to 繀%. The addition of calcium or manganese ions has also shown almost the same stimulatory effect as that of the magnesium ions (Hanahan, 1983). However, incubation time with calcium chloride or any other divalent cation for that matter, should be optimized. It was observed that a period of 24 h incubation in cold calcium chloride makes the bacterial cells 20� times more competent and 4𠄶 times more efficient for transformation as compared to the cells that are obtained immediately after CaCl2 treatment (Blattner et al., 1977 Dagert and Ehrlich, 1979). Curtiss et al. (1977) experimented on E coli strain X1776 and observed the effect of various set of conditions on the efficiency of transformation. He treated the bacterial culture with a combination of manganese, calcium, rubidium, and potassium ions along with DMSO and sucrose at 0ଌ followed by a heat pulse at 42ଌ. However, these conditions did not give successful results when other strains of E coli were used (Hanahan, 1983). Meselson and Yuan (1968) found these conditions promising for successful transformation in case of a strain of E coli MM294 than the standard �lcium chloride” protocol. Bolivar et al. (1977) reported 10 6 transformants when the cells were treated with calcium alone while Kushner (1978) reported to obtain 10 7 transformants after treating the cells with rubidium along with calcium chloride. Norgard et al. (1978) was also able to obtain 10 7 transformants with the method followed by Kushner (1978) in case of K-12 strain X1776 of E coli. However, transformants yield varied from specie to specie and strain to strain (Mercer and Loutit, 1979). It was reported by Sjöström et al. (1972) that the optimum concentration of calcium chloride for the uptake of DNA by S. aureus is 0.1 M CaCl2. The repulsion between foreign DNA and the bacterial cell, owing to negative charges on them both, are overcome by these divalent cations. This is applicable for linear DNA fragments as well as circular DNA molecules such as plasmids (Mandel and Higa, 1970 Tsen et al., 2002). It is thought that the divalent cations bind both to the cell and the DNA, thus neutralizing the charge altogether. The calcium bound to the DNA further helps the DNA to adsorb to the competent cell (Panja et al., 2008b). Moreover, DNA binding proteins present in the cell membrane could also aid in this interaction. The anchorage of the DNA to the membrane eliminates the risk of detachment or expulsion of DNA (Clark et al., 2002). Further, the low temperatures used in transformation protocols congeals the lipid moiety and consequently restricts the fluidity of the cell membrane which strengthens calcium-cell surface interaction. In this way calcium ions, bound with cell surface as well as the foreign DNA, brings the DNA to the cell. Clark et al. (2002) showed that the relative association of divalent cations (e.g., Ca 2+ ) is more with the cell membrane as compared to its association with foreign DNA, whereas certain trivalent cations (e.g., spermidine) interact more readily with the DNA (Li et al., 2004). It was also reported in this study that Ca 2+ has more pronounced role to play in development of competency as compared to spermidine or trivalent cations (Clark et al., 2002). Membranes absorb calcium very readily and once inside the cell the calcium ions are neutralized by membrane phosphates present on the cytosolic side (Melcrová et al., 2016). The binding of calcium ions to the membrane also cause changes in the membrane permeability (Li et al., 2004).

Treatment with divalents or trivalents on ice is followed by treatment with elevated temperature as a heat-shock, which produces a temperature imbalance. Molecules with increased Brownian motion outside the cell are likely to push the DNA molecule inside the cell. However, it is unclear if this kinetic force is sufficient enough to push the adsorbed DNA molecules inside. Panja et al. (2008a) studied the efficacy of cooling and heating cycles by increasing the number of cycles until maximum transformation efficiency was achieved. It was inferred that lowering of temperature actually contributes to protein loss, while heating contributes to lipid loss, and thus together these cycles increase transformation efficiency (Panja et al., 2008a) as it enlarges the pore size on the cell surface. Moreover, due to loss of lipids and proteins, the membrane is depolarized, further reducing the repulsion between the DNA molecule and the membrane. Moreover, cell density can also affect the efficiency of transformation and it has been reported that maximum competency is observed at cell density ranging from 10 7 to 10 8 cells ml in the log phase (Taketo, 1974 Norgard et al., 1978).

However, the question remains whether the pores (through which foreign DNA enters a cell) are formed by the calcium treatment or are they naturally present. There exist natural channels, often called Bayer's bridges, in the membrane that can serve as potential pathway for DNA uptake (Dreiseikelmann, 1994 Sperandeo et al., 2007 Srivastava, 2013). Hanahan (1983) stated that the competent cells have many sites or channels and all these sites and channels have an independent chance of taking part in the uptake of DNA moving toward the process of transformation. All the cells, whether competent or not, compete for the uptake of plasmid but if only competent cells are used for the transformation, the efficiency will be increased up to 50-folds as discussed by Hanahan (1983). The DNA uptake factor is the sum of all the probabilities of DNA uptake through each channel. It was reported that the chances of transformation are not increased by increasing the concentration of DNA but by the increase in the number of channels through which the uptake of DNA takes place (Hanahan, 1983 Nikaido and Vaara, 1985). Moreover, calcium has a dual role in this process it not only neutralizes the charge but also weakens the cell membrane to produce invaginations (Stein, 1990 Thomas and Rice, 2014).

While it was known that the divalent cations help neutralize the charge, the complex ions can also serve to produce static force of attraction within the DNA molecule. This leads to the folding of DNA into a compact ball-like structure that facilitates its entry into the cell (Clark et al., 2002). A supercoiled ball like structure of the plasmid will have more chances of entering the competent cell for transformation than the extended open circular form of the plasmid. However, if the size of the DNA approaches the size of the pore, the probability of the transformation decreases sharply. When using spermidine or other trivalents, the size of the ball-like structure of DNA might exceed the size of pores in the cell membrane, which can be only solved by altering the physical parameters used in the protocol, primarily the heating and cooling cycles. Whether using divalents or trivalents, their concentrations need to be optimized such that all the phosphates of the DNA are not rendered inaccessible, because some parts of the DNA have to adsorb onto the cell surface and for that free phosphates are required, as inferred by Panja et al. (2008b).

The transformation efficiency is greatly affected by the type of the host cell, as they have different cell surface structures, especially in relation to O-polysaccharides that protrude from the surface of the cell. These surface structures interact with the divalent cations and the DNA, thus making the cell competent for transformation. Different strains of E coli, as discussed above, have been reported to show variance in transformation efficiency, owing to the differences in chemical properties of their cellular envelope (Taketo, 1972). A very dense O-polysaccharide will become a deterrent for the DNA to pass through. However, it has also been claimed that extensive removal of LPS by excessive ethanol-pretreatment reduces transformation efficiency (Roychoudhury et al., 2009). This can be explained by the aforementioned hypothesis that the DNA first attaches to some external component of the cell membrane, which then assists its movement inside the cell. Along with the density, the composition of the O-polysaccahride also plays a role in the reception of the incoming DNA molecule (Lacks, 1977). Moreover, calcium ions also interacts with the membrane and at 100 mM CaCl2 concentration, almost all calcium is absorbed by the cell membrane's phosphatidylcholine and phosphatidylserine (Melcrová et al., 2016). Therefore, the membrane properties play a major role in DNA adsorption.

The evidences clearly indicate that the physical and chemical treatments used during transformation, i.e., the temperature imbalances and CaCl2 treatment, help deal with the barriers to DNA uptake, such as charge repulsions and pore sizes (Figure 1). Magnesium and calcium combinations are seldom used in transformation protocols, the importance of which should be considered. A combination of divalent and trivalent cations with prolonged incubation times can be suggested to improve the transformation efficiency as in addition to the charge stabilization, trivalent cations can compact DNA, further aiding its internalization. Bacterial cells could also be grown in presence of CaCl2 and MgCl2 before inducing competency. Heating and cooling cycles used just once in transformation protocols could also be increased to three times for higher transformation efficiencies. These conditions need to be adjusted and optimized for different bacterial species and strains, owing to the differences in their surface properties. However, there is a need for concrete evidences based on experiments designed exclusively to elaborate this phenomenon.

Abbildung 1. shows the barriers /limitations in uptake of DNA by a bacterial cell, which are the repulsion caused by negative charges on the cell membrane and DNA and the porosity of the membrane. These are manipulated by chemical treatment, such as calcium ions which neutralize negative charges. Physical parameters can be applied to improve porosity and permeability.


Transformation of Escherichia coli Made Competent by Calcium Chloride Protocol

The protocol described here represents a standard protocol. However, other protocols can be used that will increase transformation efficiency.

LB broth (Lysogeny broth, also called Luria-Bertani broth)

Adjust pH to 7.5 with NaOH and autoclave for 20 minutes.

LB plates, add 15 g of agar to LB broth before autoclaving.

For LB plates with antibiotic, add the appropriate amount of the selective antibiotic to sterile LB-agar media that has been precooled to 48 o C (see molecular biology textbook (1, 14) for stock and working concentration of a specific antibiotic).

SOC (Super Optimal Catabolite repression) Mittel

1. Add the following to 900 ml of distilled H2Ö

  • 20 g of Bacto tryptone
  • 5 g of Bacto yeast extract
  • 2 ml of 5M NaCl
  • 2.5 ml of 1M KCl
  • 10 ml of 1M MgCl2
  • 10 ml of 1M MgSO4
  • 20 ml of 1M glucose

2. Adjust to 1 liter with distilled H2Ö.

3. Sterilize by autoclaving.

Chemicals and biological supplies required:

LB plates containing selective antibiotic

Filter-sterilized antibiotic solution (see molecular biology textbook (1, 14) for stock and working concentration of a specific antibiotic)

E coli K12 derivatives (TB1, JM109) or other commercially available strains (Carolina Biological, New England Biolab, Fisher Scientific, etc.)

Plasmid vector or other DNA (pUC 19, pBR322, pBLU, other cloning vectors) (Carolina Biological Supply Company, Bio-Rad Laboratories, New
England Biolabs)

1x Tris-EDTA (TE) buffer pH 8.0 (10 mM Tris Cl, 1 mM EDTA pH 8.0)

Sterile 60 mM cold CaCl2 solution (60 mM CaCl2, 15% glycerol, 10 mM piperazine-N,N’-bis(2-hydroxypropanesulfonic acid) (PIPES), pH 7)

Styrofoam bucket with crushed ice

Equipment required:

  • 37°C incubator
  • Water bath shaker set at 37°C
  • 42°C water bath (using a thermometer ensure the temperature is exactly 42°C for the 2 minutes of heat shock)
  • Centrifuge
  • Roller drum in a 37°C incubator

1. Inoculate 5 ml of LB media with E coli and grow overnight at 37 o C in a roller drum.

2. Inoculate 1 ml of overnight culture into a sterile Erlenmeyer flask containing 100 ml of LB broth.

3. Shake culture in a 37 o C water bath until cell density reaches mid-log growth phase (about 5 x 10 7 cells/ml). This should take 2 to 4 hours. The growth rate of the culture is determined by removing a 1-ml aliquot at various times and reading the optical density at 550 nm wavelength using a spectrophotometer. The relationship between optical density and cell number will vary depending on the bacterial strain. For a strain such as MM294 (rec + ), 1 OD550 = 0.2 (5 x 10 7 cells/ml) for a strain such as HB101 (rec-), 1 OD550 = 0.5 (5 x 10 7 cells/ml).

4 .Chill the culture on ice for 10 minutes.

5. Spin the cell suspension at 4,000 g in a centrifuge for 5 minutes at 4 o C.

6. Discard the supernatant.

7. Resuspend the cells in half the volume (50 ml) of the original culture with ice-cold sterile 60 mM CaCl2.

8. Place the cell suspension in an ice bath for 30 minutes.

9. Centrifuge the suspension at 4,000 g for 5 minutes at 4 o C.

10. Discard the supernatant.

11. Gently resuspend the cells in 5 ml of sterile ice-cold CaCl2 using precooled pipettes. Cells will remain competent for up to 24 hours at 4 o C. Transformation efficiency increases four- to six-fold during this time. For long-term storage, dispense 250-ml aliquots into prechilled, sterile microfuge tubes and store at -70 o C until needed. Depending on the strain used, some E colicells will remain competent to take up DNA for as long as 6 months. A competency test (see below) should be performed each time an aliquot is removed from storage and used for transformation. The most recent number of transformants is then compared to the number obtained during the initial preparation.

12. Add 10 to 40 ng (10 to 25 ml volume) of DNA to 250 ml of competent cells in step 11. Concentrated stock DNA can be diluted using sterile 1x TE buffer. A higher volume or concentration of DNA will cause a decrease in transformation efficiency.

Besides the DNA tube, additional tubes should be set up as listed below:

(A) A control tube in which DNA is not added to the 250 ml of competent cells. The DNA volume should be substituted by an equal volume of sterile 1x TE buffer. The control tube will be treated the same as the DNA tube for the remainder of the experiment.

(B) If competent cells have been stored at -70 o C, a test should be performed to ensure that the cells still remain competent to take up DNA. The thawed cells are incubated with 10 ng of a control plasmid such as pBR322. The number of transformants per microgram of DNA will be calculated and should typically yield from 10 6 to 10 8 colonies/mg DNA for E coli MC1061 and DH1 cells.

14. Transfer the reaction to a 42 o C water bath for exactly 2 minutes.

15. Incubate on ice for 5 minutes.

16. Add 1.0 ml of SOC medium to each tube and incubate at 37 o C for 1 hour in a roller drum (250 rpm) to allow cells to recover and express the antibiotic resistance marker.

17. Spread the appropriate quantity of cells (50 to 100 ml) on selective media. Store the remaining cells at 4 o C.

19. Count the number of colonies.

20. Calculate transformation efficiency and frequency. Transformed E coli typically yields about 10 6 to 10 8 colonies/mg of DNA.

CFU/ml (colony forming unit per ml) = Number of colonies
Volume x Dilution factor


Calcium Chloride Made E coli Competent for Uptake of Extraneous DNA Through Overproduction of OmpC Protein

In the standard method of transformation of Escherichia coli with extraneous DNA, cells are made competent for DNA uptake by incubating in ice-cold 100 mM CaCl2. Analysis of the whole protein profile of CaCl2-treated E coli cells by the techniques of one- and two-dimensional gel electrophoresis, MALDI-MS and immunoprecipitation revealed overproduction of outer membrane proteins OmpC, OmpA and heat-shock protein GroEL. In parity, transformation efficiency of E. coli ompC mutant by plasmid pUC19 DNA was found to be about 40 % lower than that of the wild type strain. Außerdem, in E coli cells containing groEL-bearing plasmid, induction of GroEL caused simultaneous overproduction of OmpC. On the other hand, less OmpC was synthesized in E. coli groEL mutant compared to its wild type counterpart, by CaCl2-shock. From these results it can be suggested that in the process of CaCl2-mediated generation of competence, the heat-shock chaperone GroEL has specific role in DNA entry into the cell, possibly through the overproduced OmpC and OmpA porins.

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How do you make a bacterial cell competent?

Competent cells sind bacterial cells that can accept extra-chromosomal DNA or plasmids (naked DNA) from the environment. The generation of competent cells may occur by two methods: natural Kompetenz and artificial Kompetenz.

Secondly, how do competent cells work? Competent Cells. Eine solche Zellen sind genannt zu be "competent." Cells are gemacht competent by a process that uses calcium chloride and heat shock. Zellen das sind undergoing very rapid growth sind gemacht competent more easily than cells in other stages of growth. The growth rate of a bacterial culture is not constant.

Likewise, how do cells become competent in nature?

Naturally competent bacteria actively pull DNA fragments from their environment into their cells. These fragments provide nucleotides, but high similarity with the chromosome also allows them to change the cell's genotype by homologous recombination, a process called natürlich transformation (Fig.

How does calcium chloride make bacteria competent?

Calcium chloride Transformation. It increases the ability of a prokaryotic cell to incorporate plasmid DNA allowing them to be genetically transformed. The addition of calcium chloride to a cell suspension promotes the binding of plasmid DNA to lipopolysaccharides (LPS).


CONFLICT OF INTEREST

Dafei Chai: Conceptualization (equal) Data curation (equal) Formal analysis (equal) Investigation (equal) Methodology (equal) Writing-original draft (equal). Gang Wang: Data curation (equal) Formal analysis (equal) Investigation (equal) Software (equal) Validation (equal). Lin Fang: Investigation (equal) Methodology (equal). Huizhong Li: Investigation (equal) Methodology (equal). Shanshan Liu: Investigation (equal) Methodology (equal). Haiying Zhu: Investigation (equal) Methodology (equal). Junnian Zheng: Conceptualization (equal) Project administration (equal) Resources (equal) Supervision (equal) Writing-original draft (equal).


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