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Kann Cas13 mit mehreren crRNAs in derselben Reaktion verwendet werden?

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CRISPR-Cas13, das mit crRNA (komplementär zu den interessierenden Transkripten) ausgestattet ist, kann so gestaltet werden, dass es auf ssRNA-Transkripte in Zellen abzielt.

Bei erfolgreicher crRNA- und ssRNA-Bindung erzeugt eine fluoreszierende Domäne auf Cas13 ein Signal, das anzeigt, dass das Ziel gefunden wurde.

Soweit ich weiß, wurde diese Methode verwendet, um jeweils ein ssRNA-Ziel zu finden. Wenn wir Fluorophore mit unterschiedlichen Wellenlängen für unterschiedliche Cas13-crRNA-Targets verwenden, ist es dann theoretisch möglich, sie alle in derselben Reaktion zu mischen und das Vorhandensein verschiedener Targets anhand der unterschiedlichen Fluoreszenzwellenlängen zu unterscheiden, die während der Target-Bindung erzeugt werden?

In dieser Arbeit wird eine fluoreszenzmarkierte crRNA verwendet, um die Spaltung eines RNA-Targets durch komplementäre Bindung nachzuweisen. Ist es also theoretisch möglich, mehrere crRNAs, die jeweils mit einem anderen Fluorophor markiert sind, zu verwenden, um mehrere Ziel-RNAs zu spalten und nachzuweisen?


Antwort ist nein. Da jedes CRIPSR-Cas(xx)-System als Ribonukleoprotein-Komplex arbeitet, muss es mit einer crRNA beladen werden, um zu funktionieren. Die Funktionalität ist garantiert, während jede der Cas-Endonukleasedomänen mit einer crRNA assoziiert ist. Sie könnten möglicherweise mehrere Cas13 mit mehreren crRNA verwenden. In der molekularen Diagnostik ist es üblich, orthogonale CRISPR-Enzyme mit unterschiedlicher crRNA zu verwenden, wie in dieser ursprünglichen Forschung zu sehen ist.


RNA-Virus-Interferenz über das CRISPR/Cas13a-System in Pflanzen

CRISPR/Cas-Systeme verleihen Immunität gegen eindringende Nukleinsäuren und Phagen in Bakterien und Archaeen. CRISPR/Cas13a (früher als C2c2 bekannt) ist eine Klasse-2-Ribonuklease vom Typ VI-A, die in der Lage ist, einzelsträngige RNA-Moleküle (ssRNA) des Phagengenoms gezielt anzugreifen und zu spalten. Hier setzen wir CRISPR/Cas13a ein, um die Interferenz mit einem RNA-Virus, dem Turnip Mosaic Virus (TuMV), in Pflanzen zu erzeugen.

Ergebnisse

CRISPR/Cas13a erzeugt Interferenzen gegen grün fluoreszierendes Protein (GFP)-exprimierendes TuMV in transienten Assays und stabilen Überexpressionslinien von Nicotiana benthamiana. CRISPR-RNA (crRNAs), die auf die HC-Pro- und GFP-Sequenzen abzielt, zeigen eine bessere Interferenz als diejenigen, die auf andere Regionen wie die Hüllprotein-(CP)-Sequenz abzielen. Cas13a kann auch prä-crRNAs zu funktionellen crRNAs verarbeiten.

Schlussfolgerungen

Unsere Daten deuten darauf hin, dass CRISPR/Cas13a für die technische Interferenz gegen RNA-Viren verwendet werden kann, was einen möglichen neuen Mechanismus für eine RNA-gesteuerte Immunität gegen RNA-Viren und für andere RNA-Manipulationen in Pflanzen bietet.


Einführung

Präzise und schnelle Nukleinsäurenachweismethoden können zur Krebsfrühdiagnostik und zur Prävention von Viruspandemie beitragen 1,2 . Aktuell steigt die Nachfrage dringend, da das neuartige Coronavirus SARS-CoV-2 weltweit über 117 Millionen Infektionen und 2,6 Millionen Todesfälle verursacht hat (Stand 08. März 2021) 3,4 . Während die quantitative Polymerase-Kettenreaktion der reversen Transkription (RT-qPCR) weithin als “gold-Standard”-Methode verwendet wird, haben CRISPR-basierte Nukleinsäurenachweise, wie SHERLOCK und DETECTR, in letzter Zeit als schnelle und empfindliche Methoden große Aufmerksamkeit auf sich gezogen 4� . Diese CRISPR-basierten Methoden umfassen einen Voramplifikationsprozess von Zielnukleinsäuren und einen anschließenden Nachweis, der durch CRISPR�s-Enzyme wie Cas12a oder Cas13a über fluoreszierendes oder kolorimetrisches Auslesen vermittelt wird. Der Voramplifikationsprozess ist notwendig, um die Nachweisempfindlichkeit zu erhöhen, da die CRISPR-basierten Methoden ohne Voramplifikation

0,5 h zum Nachweis pikomolarer Mengen eines einzelsträngigen RNA (ssRNA)-Ziels (die analytische Nachweisgrenze (LOD) liegt über 50 pM) 8,11 . Der Voramplifikationsprozess verlängert jedoch die Zeit bis zur Detektion (um mindestens einige zehn Minuten) und könnte aufgrund von Amplifikationsfehlern zu falsch negativen oder -positiven Ergebnissen führen 12,13.

Um diese Herausforderungen zu meistern, haben wir das CRISPR�s13-basierte Nukleinsäure-Nachweissystem 9 und unsere Mikrokammertechnologie 14,15 kombiniert, um eine Plattform zu entwickeln, die einen genauen und schnellen Nachweis von ssRNA auf Einzelmolekülebene ermöglicht, genannt SATORI (CRI S PR-basierte amplifikatio nsfreie digitale R NA-Erkennung). SATORI ermöglichte den schnellen und sensitiven Nachweis der N-Gen-RNA und der gesamten genomischen RNA von SARS-CoV-2 und unterstreicht damit das Potenzial von SATORI als leistungsstarke neue Klasse schneller und robuster Virusdiagnostik.


Ergebnisse

Eine integrierte Pipeline für die Cas13 crRNA-Analyse für Virus-Targeting-Abdeckung, Effizienz und Spezifität

Wir haben RNA-Virusgenome aus öffentlichen Datenbanken abgerufen, darunter 16 RNA-Virusfamilien aus dem ViPR, HIV aus NCBI12 und IAV aus der Influenza Research Database (IRD)13 (Tabelle S1). Unsere Pipeline analysierte konservierte Genomsequenzen innerhalb einer bestimmten Gruppe von Viren, die die primären Regionen für das crRNA-Targeting erzeugten ( Abbildungਁ A). Wir generierten alle möglichen crRNA-Kandidaten mit perfekter Übereinstimmung mit der konservierten Sequenz. Die Pipeline eliminierte crRNAs mit mutmaßlicher Off-Target-Bindung im menschlichen Transkriptom (𢙂 Mismatches, ein Schwellenwert, der zuvor definiert wurde, um spezifische von unspezifischen crRNAs zu unterscheiden14). Wir haben einen kürzlich veröffentlichten Algorithmus zur Vorhersage der crRNA-Effizienz (Bereich 0𠄱) integriert und auch für jede crRNA den Prozentsatz der Virusstämme in der Gruppe berechnet, auf die sie abzielt. Wir haben unsere Pipeline verwendet, um zwei Arten von crRNAs mit unterschiedlichen Eigenschaften zu analysieren. Der erste Typ sind speziesspezifische crRNAs, bei denen es sich um umfassende Sätze von crRNAs handelt, die mit hoher Abdeckung, Spezifität und vorhergesagter Effizienz auf konservierte Regionen in eng verwandten Zweigen von Viren abzielen können. Der zweite Typ sind familiendeckende crRNAs, bei denen es sich um minimale Pools von crRNAs (“minipools”) handelt, die kollektiv auf jedes Virus in einer bestimmten Familie abzielen.

Analyse von PAC-MAN zur Bekämpfung von Breitband-RNA-Viren

(A) Eine integrierte Pipeline für die Cas13 crRNA-Analyse für Virus-Targeting-Abdeckung, Effizienz und Spezifität.

(B) Targeting pandemische/epidemieverursachende pathogene RNA-Virusspezies unter Verwendung von PAC-MAN.

(C) Schema von 10 RNA-Virusfamilien, die auf verschiedene Organe und Systeme im menschlichen Wirt abzielen.

(D) Die minimale Anzahl von crRNAs, die benötigt wird, um alle sequenzierten human-infektiösen Stämme in jeder der 10 RNA-Virusfamilien und HIV und IAV anzugreifen.

(E) Die minimale Anzahl von crRNAs, die benötigt wird, um 90 % der sequenzierten human-infektiösen Stämme in jeder der 10 RNA-Virusfamilien und HIV und IAV anzugreifen.

(F) Eine kumulative Kurve, die die vorhergesagte Mindestanzahl von crRNAs zeigt, um alle human-infektiösen Stämme in 10 RNA-Virusfamilien in (C) anzugreifen.

(G) Abdeckung pathogener RNA-Viren durch die ersten 14 crRNAs im Minipool von (F).

(H) Eine kumulative Kurve, die die vorhergesagte Mindestanzahl von crRNAs zeigt, um auf Nutztier-infektiöse Stämme in 10 RNA-Virusfamilien in (C) abzuzielen. Rinder-, Schaf-, Schweine-, Katzen- und Hundeviren werden in die Analyse eingeschlossen.

Bekämpfung von pandemie-/epidemieverursachenden pathogenen RNA-Virusspezies mit PAC-MAN

Wir haben speziesspezifische crRNA-Sets identifiziert, die auf jede pandemische/epidemieverursachende pathogene RNA-Virusspezies laut WHO abzielen. Zu diesen Viren gehören SARS, SARS-CoV-2, MERS, Ebola-Virus, Marburg-Virus, Zika-Virus, Chikungunya-Virus und Nipah-Virus. Für die meisten pathogenen Virusarten konnten wir eine Sammlung von crRNAs mit vorhergesagter hoher Spezifität (𢙓 Fehlpaarungen im menschlichen Transkriptom), hoher Effizienz (Score ≥ 0,5) und hoher Abdeckung (Ziele 㺐% von Viren in der Gruppe mit null Fehlpaarungen) ( Abbildungਁ B). Eine Ausnahme war das Nipah-Virus, bei dem wir festgestellt haben, dass kein crRNA-Kandidat 90 % der sequenzierten Stämme abdecken konnte. Dennoch wurde durch die Senkung der Abdeckungsanforderung auf 80 % der Virusstammabdeckung eine Reihe von crRNAs erzeugt, die auf das Nipah-Virus abzielen können.

Analyse von PAC-MAN zur Bekämpfung eines breiten Spektrums von RNA-Viren

Als nächstes identifizierten wir crRNAs, die verwendet werden können, um auf ein breites Spektrum von RNA-Virusfamilien abzuzielen. Wir analysierten 10 RNA-Virusfamilien (Calicividirae, Coronaviridae, Filoviridae, Hepeviridae, Paramyxoviridae, Phenuiviridae, Picornaviridae, Pneumoviridae, Rhabdoviridae und Togaviridae) aus der ViPR-Datenbank, die verschiedene menschliche Organe und Systeme infizieren, darunter 6 ssRNA) Virusfamilien, 4 Negativsense ssRNA Virusfamilien sowie HIV- und IAV-Spezies ( Abbildungਁ C). Für jede Familie oder HIV/IAV-Spezies haben wir einen Näherungsalgorithmus verwendet, um einen Minipool von crRNAs zu erhalten, der kollektiv auf jeden Stamm in der Familie abzielen kann.

Interessanterweise beobachteten wir, dass alle human-infektiösen Sequenzen für jede der 10 RNA-Virusfamilien und HIV umfassend von einem kleinen Minipool von crRNAs (3� crRNAs) angegriffen werden können. Eine Ausnahme bildet IAV, das für eine umfassende Abdeckung 78 crRNAs benötigt, wahrscheinlich aufgrund seiner hohen Diversität und seines segmentierten Genoms, das in 8 Segmente unterteilt ist15 ( Abbildungਁ D). Da viele Familien seltene Stämme mit hochvarianten Genomen enthalten, können die human-infektiösen Mitglieder jeder Familie von einer sehr kleinen Anzahl (1𠄶) von crRNAs angegriffen werden, wenn wir auf mindestens 90 % der Virusstämme abzielen ( Abbildung& #x000a01E).

Entscheidend ist, dass ein Minipool von 14 crRNAs in der Lage ist, 㺐% der human-infektiösen Viren in den 10 RNA-Virusfamilien anzugreifen (Abbildungen 1F und S1A). Ein vollständiger Minipool von 90 crRNAs kann auf alle human-infektiösen Stämme (24.096) in den 10 Familien mit null Fehlpaarungen abzielen. Wir beobachteten, dass die 14 Minipool-CRRNAs auf bemerkenswerte pathogene Virusspezies abzielen und keine Fehlpaarungen aufweisen ( Abbildungਁ G). Dies deutet darauf hin, dass Cas13-vermitteltes PAC-MAN eine potenzielle antivirale Breitbandstrategie (BSA) bieten könnte, um in großem Umfang auf humane infektiöse RNA-Viren abzuzielen.

Wir haben auch crRNAs analysiert, die auf tierische Viren abzielen können. Zu diesem Zweck haben wir Viren nach ihrem Wirt kategorisiert, einschließlich gewöhnlicher Nutztiere (Rinder, Schafe, Schweine, Katzen und Hunde), die eine enge Interaktion mit dem Menschen haben. Für jede Viruskategorie beobachteten wir, dass ein kleiner Minipool von crRNAs die Mehrheit der Viren angreifen konnte (Abbildungen 1H und S1B). Diese Analyse legt nahe, dass PAC-MAN über human-infektiöse Viren hinaus als BSA-Strategie bei Tieren eingesetzt werden kann, einem Bereich, der im Biotechnologiesektor unterentwickelt ist.

Erforderliche Determinanten von crRNAs, die auf ein breites Spektrum von RNA-Virusfamilien abzielen

Wir analysierten weiter, ob Familien mit mehr Virusstämmen mehr Minipool-crRNAs benötigten, um ein umfassendes Targeting zu erreichen. Für die 10 analysierten RNA-Virusfamilien beobachteten wir eine lineare Beziehung zwischen der Anzahl der human-infektiösen Stämme und der Anzahl der crRNAs im Minipool, die auf diese Stämme abzielen (R = 0,70, p = 0,023 Abbildungਂ A). Als wir alle Stämme in jeder Familie und die entsprechenden Minipools untersuchten, die auf diese Stämme abzielten, beobachteten wir eine ähnliche lineare Beziehung (R = 0,75. p = 0,012 Abbildungਂ B). Dies deutet darauf hin, dass die Anzahl der Minipool-crRNAs, die erforderlich ist, um alle Stämme einer RNA-Virusfamilie umfassend anzugreifen, erwartungsgemäß stark von der Anzahl der Stämme in dieser Familie beeinflusst wird.

Determinanten der erforderlichen crRNAs, die auf Breitband-RNA-Virusfamilien abzielen

(A) Korrelation zwischen der Anzahl der human-infektiösen Stämme in jeder RNA-Virusfamilie und der Anzahl der crRNAs, die für das Targeting dieser Stämme benötigt werden.

(B) Korrelation zwischen der Anzahl der Stämme in jeder RNA-Virusfamilie und der Anzahl der crRNAs, die für das Targeting aller Stämme in dieser Familie benötigt werden.

(C) Die Anzahl der crRNAs, die benötigt werden, um alle sequenzierten human-infektiösen Stämme in jeder der 6 RNA-Virusfamilien mit segmentierten Genomen anzugreifen.

(D) Die Anzahl der crRNAs, die benötigt werden, um 90% der sequenzierten human-infektiösen Stämme in jeder der 6 RNA-Virusfamilien mit segmentierten Genomen anzugreifen.

(E) Korrelation zwischen der Anzahl der Stämme in der RNA-Virusfamilie und der Anzahl der crRNAs, die für das Targeting aller human-infektiösen Viren in 6 segmentierten RNA-Virusfamilien benötigt werden.

Die Beobachtung, dass IAV im Vergleich zu den anderen 10 Familien und HIV mehr crRNAs für die Abdeckung benötigt, inspirierte uns, mehr RNA-Virusfamilien mit segmentierten Genomen zu analysieren. Dazu haben wir 6 segmentierte RNA-Virusfamilien eingeschlossen, darunter 5 Negativ-Sense-ssRNA-Virusfamilien und 1 doppelsträngige RNA (dsRNA) Virusfamilie. Interessanterweise haben wir beobachtet, dass segmentierte RNA-Virusfamilien im Allgemeinen größere Minipools benötigen, um alle human-infektiösen Stämme dieser Familie umfassend zu bekämpfen (10-57 crRNAs für eine vollständige Abdeckung und 3-7 crRNAs für eine 90%ige Abdeckung Abbildung 2 C und 2D). . Dies ist wahrscheinlich auf den Reassortierungsprozess zurückzuführen, ein gemeinsames Merkmal segmentierter RNA-Viren, die die Fähigkeit haben, Genomsegmente während einer Koinfektion auszutauschen.16 Die Reassortierung kann die Diversität segmentierter viraler Genomsequenzen stark erhöhen, was es schwieriger macht, nur sehr wenige zu definieren crRNAs, um Stämme breit abzudecken. Trotz der Natur dieser segmentierten Genome beobachteten wir immer noch, dass die Anzahl der erforderlichen Minipool-crRNAs für eine umfassende Erfassung human-infektiöser Stämme stark mit der Zahl der human-infektiösen Stämme in dieser Familie korreliert (R = 0,973, p  = 0,001 Zahlਂ E). Insgesamt deuten unsere Daten darauf hin, dass PAC-MAN für das Breitband-Targeting am wirksamsten gegen nicht segmentierte RNA-Virusfamilien ist.

Eine Online-Ressource zur Verwendung von CRISPR-Cas13d für das BSA-Targeting

Wir haben eine Online-Ressource (http://crispr-pacman.stanford.edu) erstellt, um die Verbreitung analysierter Cas13d-crRNAs für 16 RNA-Virusfamilien sowie für HIV, IAV und Influenza-B-Virus (IBV) zu erleichtern. Für speziesspezifische crRNAs in jeder Familie haben wir eine Bibliothek von crRNAs mit vorhergesagter hoher Spezifität (𢙓 Fehlpaarungen im menschlichen Transkriptom und kein Ziel in anderen Spezies in derselben Familie) und hoher Effizienz (Score 𢙐.5) definiert. . Wir haben ein interaktives Tool bereitgestellt, um die Auswahl von crRNAs zu erleichtern, die auf bestimmte Gene eines Virus abzielen. Wir haben auch eine grafische Benutzeroberfläche (GUI) für SARS-CoV-2 implementiert, die sich in den Genome Browser der University of California, Santa Cruz (UCSC) integriert17 und eine Visualisierung für die Zuordnung von crRNAs zur Sequenzposition entlang des annotierten viralen Genoms erstellt. Ein Beispiel wird bereitgestellt, um zu visualisieren, wo vorhergesagte crRNAs auf das SARS-CoV-2-Genom abzielen (Abbildungen 3 A�). Für familiendeckende crRNAs fügten wir einen phylogenetischen Stammbaum hinzu, der mit dem Tool Interactive Tree Of Life (iTOL) erstellt wurde, um die evolutionäre Verwandtschaft der Stämme, auf die jede crRNA abzielt, zu visualisieren.18 Wir haben jeden Virusstamm im phylogenetischen Stammbaum mit der Gattung versehen, die die Stamm gehört, ob der Stamm ein menschlicher Wirt ist und welche (falls vorhanden) der ersten 5 crRNAs im familiendeckenden Minipool auf den Stamm abzielt. Wir stellten ein Beispiel für diesen phylogenetischen Baum zur Verfügung, der familiendeckende crRNAs für die Filoviridae-Familie visualisiert, eine Virusfamilie, zu der auch das pandemische Ebola-Virus gehört ( Abbildungਃ D). Wir haben ein Video erstellt, um einen Überblick über diese Online-Ressource zu geben (Video S1).

CRIPSR-PACMAN als Online-Ressource zur Verwendung von CRISPR-Cas13d für antivirales Breitband-Targeting

(A𠄼) Ein beispielhaftes Diagramm, das die crRNAs zeigt, die gegen SARS-CoV-2 gerichtet sind, und ihre Ausrichtung auf die Gene von SARS-CoV-2. Diese crRNAs werden zum Testen in Abbildung਄ verwendet. Die Farbintensität jeder crRNA repräsentiert ihren vorhergesagten crRNA-Score.

(D) Ein beispielhaftes Diagramm, das die Analyse von familiendeckenden crRNAs zeigt, die auf die Filoviridae-Familie, einschließlich des Ebola-Virus, abzielen.

Validierung vorhergesagter crRNAs für das Targeting von SARS-CoV-2-Sequenzen

Als nächstes validierten wir experimentell, ob die vorhergesagten artspezifischen crRNAs eine wirksame Cas13d-vermittelte Hemmung der SARS-CoV-2-Sequenz ermöglichten. Wir haben unsere kürzlich berichteten SARS-CoV-2-Reporter F1 und F2 verwendet, die ein GFP-Gen kodieren, das mit SARS-CoV-2-Sequenzen fusioniert ist, die für RNA-abhängige RNA-Polymerase (RdRP) kodieren, die die Virusproliferation oder Nukleokapsid (N) aufrechterhält. die die virale Verpackung kontrolliert19 (Abbildung S2A). Die Cas13d und crRNA wurden mit 2 Plasmiden exprimiert, wie zuvor berichtet (Abbildung S2B). Um die hemmende Wirkung von crRNAs zu messen, kotransfizierten wir einzelne crRNA-Plasmide und SARS-CoV-2-Reporterplasmide in A549 Lungenepithelzellen, die Cas13d exprimierten, und quantifizierten die GFP-Expression mittels Durchflusszytometrie und die Ziel-RNA-Abundanz mittels quantitativer PCR (qPCR) 48& #x000a0h nach der Transfektion (Abbildung S2C).

Wir haben eine Liste von crRNAs entworfen, die auf RdRP oder N ohne Effizienzvorhersage abzielen ( Abbildungen 3 B und 3C Tabelle S2). Wir beobachteten unterschiedliche repressive Effekte auf die SARS-CoV-2-Reporter einzelner crRNAs mittels Durchflusszytometrie (Abbildung S3A Tabelle S3). Interessanterweise gab es eine statistisch signifikante hohe Korrelation zwischen dem Prozentsatz der GFP-Repression und den vorhergesagten Effizienzwerten, die mit einem kürzlich veröffentlichten Algorithmus erhalten wurden14 (R = 0,834, p = 1,667 × 10  = x022125 Abbildung S3B). Diese Ergebnisse stimmten mit den repressiven Wirkungen auf die RNA-Abundanz, gemessen durch qPCR, überein (R = 0,812, p = 4,302 × 10 𢄥 Abbildungen S3C und S3D Tabelle S4). Diese Daten deuten zusammen darauf hin, dass der berichtete Algorithmus in der Lage war, effiziente crRNAs für das virale Genom-Targeting zuverlässig vorherzusagen, obwohl er auf der Grundlage von Daten von crRNAs entwickelt wurde, die auf menschliche Transkripte abzielen.

Um die Leistung der vorhergesagten crRNAs weiter zu validieren, haben wir weitere vorhergesagte crRNAs getestet, die auf die SARS-CoV-2-Sequenz mit unterschiedlichen Effizienzwerten abzielen (Abbildungen 3 B und 3C). Auch hier beobachteten wir eine starke Korrelation zwischen der vorhergesagten Effizienz und der gemessenen Reporterrepression (R = 0,875, p = 0,0009 Abbildungen S3E und S3F). Wir haben einen binären Trend festgestellt: Die meisten crRNAs mit einem Effizienz-Score Ϡ.5 zeigten eine effiziente Repression, während crRNAs mit einem Effizienz-Score π.5 fast keine Repression zeigten. Dies rechtfertigte unsere Wahl von 0,5 als Schwellenwert zur Bestimmung effizienter crRNAs. Diese unabhängigen Experimente bestätigten die Wirksamkeit der vorhergesagten crRNAs unter Verwendung des Algorithmus, was auch darauf hindeutet, dass unsere Computerpipeline verwendet werden kann, um crRNAs vorzuschlagen, die andere RNA-Virussequenzen effizient hemmen.

Optimierte crRNAs, die auf SARS-CoV-2-Sequenzen abzielen, mit CRISPR-PAC-MAN

Schließlich haben wir einen Minipool von 5 hocheffizienten crRNAs (crRNA-MP5) definiert, die auf sequenzierte SARS-CoV-2-Genome abzielen.Mithilfe von SARS-CoV-2-Reportern bestätigten wir, dass einzelne crRNAs GFP bis zu 90 % unterdrücken können ( Abbildung਄ A), mit einer 85-prozentigen Unterdrückung der RNA-Abundanz ( Abbildung਄ B). Das Poolen dieser crRNAs erhöhte die Repression weiter um bis zu 95 % für die GFP-Expression und bis zu 93 % für die RNA-Abundanz. Wir haben außerdem Sequenzen von 351.670 SARS-CoV-2-Isolaten aus der Datenbank der Global Initiative on Sharing All Influenza Data (GISAID)20 (Stand 16. Januar 2021) abgerufen. Jede crRNA in crRNA-MP5 konnte ꃺst 99% der SARS-CoV-2-Isolate angreifen, und die crRNA-MP5 zusammen kann alle bekannten SARS-CoV-2-Stämme angreifen, unabhängig von den Variationen in verschiedenen SARS-CoV -2 Kladen wie in Nextstrain21 identifiziert (Abbildung਄ C). Seit Herbst 2020 sind drei neue SARS-CoV-2-Varianten aufgetaucht, darunter die UK-Variante (B.1.1.7),22 die Südafrika-Variante (B.1.351),23 und die Brasilien-Variante (P.1)24 Obwohl in diesen neuen SARS-CoV-2-Varianten mehrere Mutationen nachgewiesen wurden, befinden sich die meisten im Spike-Gen und weniger in den Zielregionen unserer ausgewählten crRNAs (z. B. RdRP, N). Jede crRNA in crRNA-MP5 könnte immer noch auf �% der Isolate jeder Variante abzielen ( Abbildung਄ D), die am 3. Februar 2021 von GISAID heruntergeladen wurden. Bemerkenswert ist die Abdeckung jeder crRNA-MP5 für den Brasilien-Stamm war 100 %. Die crRNA-MP5 zusammen kann ਊlle der sequenzierten Stämme in diesen 3 Varianten angreifen (Abbildung਄ E). Zusammenfassend bietet der optimierte Minipool von crRNA-MP5 eine nützliche Ressource, um gegen lebende SARS-CoV-2-Viren getestet zu werden in vitro und in vivo in der Zukunft.

Optimierte crRNAs, die auf SARS-CoV-2-Sequenzen abzielen, mit CRISPR-PAC-MAN

(A und B) Repressionseffekte des optimierten Minipools von crRNAs (crRNA-MP5) auf den SARS-CoV-2-GFP-Reporter (A) und die RNA-Abundanz (B).

(A) GFP-Expression, gemessen durch Durchflusszytometrie. p-Werte für jede Gruppe sind in Tabelle S3 enthalten. Linien zeigen Mittelfehlerbalken an, die SDs anzeigen (n = 3 unabhängige biologische Replikate).

(B) mRNA-Häufigkeit, gemessen durch quantitative Echtzeit-PCR. Die relative RNA-Häufigkeit wird durch Normalisieren auf die Nur-Reporter-Probe berechnet. p-Werte für jede Gruppe sind in Tabelle S3 enthalten. Linien zeigen an, dass Fehlerbalken SDs anzeigen. Die Daten stellen 3 unabhängige biologische Experimente dar, die in technischen Replikaten durchgeführt wurden (n = 9).

(C) Balkendiagramme, die den Prozentsatz der Genome von SARS-CoV-2-Isolaten zeigen, auf die einzelne oder mehrere crRNAs im optimierten crRNA-Minipool abzielen.

(D und E) Balkendiagramme, die den Prozentsatz der Genome von 3 neuen SARS-CoV-2-Varianten zeigen, auf die einzelne (D) oder mehrere crRNAs (E) im optimierten crRNA-Minipool abzielen.


Verwendung von Cas13 zur gezielten Spaltung von zellulärer RNA

In seiner einfachsten Form kann Cas13 zur gezielten RNA-Spaltung verwendet werden, beispielsweise zur Herunterregulierung eines spezifischen Transkripts (Abbildung 2a). Abudayyeh et al. ( 2017 ) identifizierte Cas13a aus Leptotrichia wadei als das aktivste Cas13a-Ortholog für den gezielten RNA-Knockdown in menschlichen Zellen. Obwohl einige Cas13a-Orthologe eine Protospacer-flankierende Stelle (PFS) analog zur PAM benötigen, gab es für LwaCas13a keine solche Einschränkung. Seine hohe Aktivität war jedoch von einer Stabilisierungsdomäne (msfGFP) abhängig. Bezüglich der zellulären Lokalisation ergab die Fusion eines nuklearen Lokalisierungssignals höhere Effizienzen als nukleare Exportsignale. Das Ausmaß des RNA-Knockdowns war mit RNAi vergleichbar, aber in Bezug auf die Spezifität war das Cas13a-System deutlich überlegen. Single- und Double-Mismatch-Analysen ergaben das Vorhandensein einer Mismatch-sensitiven „Seed-Region“ im Zentrum des Spacers, was durch den strukturellen Befund erklärt werden kann, dass der zentrale Teil des Spacers dem Lösungsmittel ausgesetzt ist und zuerst die Ziel-RNA erkennt (Liu et al., 2017a). Bemerkenswert ist, dass die transkriptomweite mRNA-Sequenzierung Hunderte von signifikanten Off-Targets für RNAi-Ansätze entdeckte, aber keine unterschiedlich exprimierten Gene außer dem Zielgen für den LwaCas13a-vermittelten RNA-Knockdown. Dies deutete auf einen Mangel an kollateraler RNA-Abbauaktivität hin, wie für beschrieben Leptotrichia shahii Cas13a (Abudayyeh et al., 2016 ), zumindest in eukaryontischen Zellen. Von derselben Gruppe wurde die Funktionalität des LwaCas13a-vermittelten RNA-Knockdowns auch für Pflanzen bestätigt: Drei verschiedene Gene wurden in Reisprotoplasten gezielt, wobei die meisten Guides bereits 48 h nach der Transformation 50% Knockdown überstiegen. Dies zeigt, dass Cas13 den zytoplasmatischen RNA-Pool in Pflanzen schnell verringern kann. Darüber hinaus weist es für LwaCas13a auf ein breites Spektrum bearbeitbarer Organismen jenseits menschlicher Zellen hin. Darüber hinaus hat Abudayyeh et al. ( 2017 ) konnte die crRNA-Reifungsaktivität von LwaCas13a erfolgreich für Multiplexing-Ansätze nutzen, wie es zuvor für Cas12 gezeigt wurde (Zetsche et al., 2017 ).

Anwendungen von Cas13 für die Pflanzenbiologie.

Aktives Cas 13 kann zur spezifischen Spaltung von Ziel-RNAs zur Herunterregulierung der Expression (a) und zur Abwehr von Pflanzen-RNA-Viren (b) verwendet werden. Wenn die RNA-Spaltstelle inaktiviert ist, kann dCas13 verwendet werden, um verschiedene Effektoren auf spezifische RNAs zu lenken (c) oder um spezifische RNAs in lebenden Zellen sichtbar zu machen (d).

Unter Verwendung eines computergestützten Sequenz-Data-Mining-Ansatzes mit veränderten Eigenschaften wurde ein weiterer Klasse-2-Effektor identifiziert, der HEPN-Domänen enthält und auf RNA wirkt. Aufgrund seiner Ähnlichkeit mit Cas13a wurde es Cas13b (früher C2c6) genannt und dem Subtyp VIB der Klasse 2 (Smargon et al., 2017). Interessanterweise fehlen diesen CRISPR-Systemen die ansonsten allgegenwärtigen Cas1- und Cas2-Proteine. Stattdessen enthalten sie zwei zuvor nicht charakterisierte assoziierte Proteine, Csx27 und Csx28, wobei Csx27 die Cas13b-vermittelte RNA-Spaltung unterdrückt und Csx28 verstärkt. Ein großer Screen auf RNA-Targeting-Aktivität in eukaryotischen Zellen ergab ein Cas13b-Ortholog von Prevotella sp. P5-125, zeigt durchweg höhere Wirkungsgrade als LwaCas13a (Cox et al., 2017). Darüber hinaus war seine hohe Aktivität nicht von der msfGFP-Stabilisierungsdomäne abhängig und war im Gegensatz zu LwaCas13a am effizientesten, wenn es mit einem nuklearen Exportsignal kombiniert wurde. Genau wie LwaCas13a fehlte PspCas13b in eukaryontischen Zellen ein kollateraler RNA-Abbau, zeigte keine PFS-Anforderungen und zeigte eine ähnliche Spezifität, einschließlich der Mismatch-sensitiven zentralen Samenregion. Darüber hinaus ist PspCas13b aufgrund einer inhärenten crRNA-Prozessierungsaktivität auf die gleiche Weise wie Cas13a einem Multiplexing zugänglich. Damit ist PspCas13b derzeit die erste Wahl für die gezielte RNA-Spaltung. Es wäre interessant zu testen, ob dies auch für Pflanzenzellen gilt.

Die RNA-spaltende Fähigkeit von Cas13 eröffnet zudem neue Möglichkeiten für Fortschritte in der Grundlagenforschung bezüglich der Funktionen nicht-kodierender RNAs (ncRNAs). Theoretisch sollten alle ncRNAs, die eine bestimmte Größe überschreiten, einer Cas13-vermittelten Spaltung zugänglich sein. In Pflanzen gilt dies hauptsächlich für lange nicht-kodierende RNAs (lncRNAs), die nun eine Kategorie umfassen, die als nicht-kodierende RNAs mittlerer Größe (im-ncRNAs) bezeichnet wird, willkürlich definiert als 50–300 nt lang (Wang und Chekanova, 2017 ). Computeransätze identifizierten über 6000 lncRNAs aus transkriptomischen Datensätzen von Arabidopsis mit meist gewebespezifischen oder stressinduzierten Expressionsprofilen (Liu et al., 2015). lncRNAs sind an einer Vielzahl von Prozessen in Pflanzen beteiligt: ​​Sie können die Genexpression in allen Stadien regulieren, als Gerüst für den Aufbau von Proteinkomplexen fungieren, die Proteintranslokation steuern, alternatives Spleißen beeinflussen und die Dynamik der Chromatinschleifen modulieren (Übersicht siehe Liu et al., 2015 Wang und Chekanova, 2017). Es müssen jedoch noch viele weitere Funktionen pflanzlicher lncRNAs und die damit verbundenen Mechanismen entdeckt werden, aber funktionelle Studien an lncRNAs werden durch einen Mangel an Mutanten behindert (Liu et al., 2015). Neben der Erzeugung dieser Mutanten auf DNA-Ebene mit Cas9 oder Cas12 ermöglicht Cas13 nun auch die direkte Spaltung dieser RNAs in vivo, was eine größere Flexibilität bei experimentellen Manipulationen bietet. Mit Cas13 soll es nun beispielsweise möglich sein, eine spezifische RNA im interessierenden Gewebe mit einem gewebespezifischen Promotor niederzuschlagen, falls komplette Knockout-Mutanten tödlich sind. Darüber hinaus können neben dem vollständigen Knockout auch unterschiedliche Knockdown-Intensitäten analysiert werden. Im Gegensatz zu RNAi bietet Cas13 den Vorteil, dass es nicht auf zytoplasmatische Transkripte beschränkt ist, sondern auch nicht-kodierende nukleäre Transkripte durch Fusion einer NLS mit Cas13 gezielt werden können.

Eine weitere mögliche Anwendung von Cas13 für die Grundlagenforschung ist die funktionelle Analyse des tRNA-Spaltungsmechanismus, der die Freisetzung von Ribonukleasen beinhaltet, die bei Stresssignalen in die Anticodon-Schleife reifer tRNAs spalten. Zum Beispiel Arabidopsis-Sämlinge, die oxidativem Stress über H . ausgesetzt sind2Ö2 Behandlung zeigte einen starken Anstieg gespaltener tRNA-Fragmente (Thompson et al., 2008). Die Spaltungsfragmente hemmen dann die Translation über die reduzierte Verfügbarkeit von funktionellen tRNAs hinaus, aber der genaue Mechanismus der Hemmung ist noch nicht aufgeklärt. Cas13 könnte nun die künstliche Spaltung von tRNAs ermöglichen, wobei es wahrscheinlich zwei Herausforderungen gibt. Erstens ist unklar, ob die in reifen tRNA vorhandenen modifizierten Nukleotide die Spaltung von Cas13 stören. Die zweite Herausforderung besteht darin, die Cas13-vermittelte Spaltung auf die richtigen Nukleotide zu lenken. Die tRNA-Spaltung der endogenen RNasen erfolgt an unterschiedlichen Positionen in der Anticodon-Schleife (Thompson et al., 2008). Es wurde festgestellt, dass die Cas13-vermittelte Spaltung hauptsächlich an Uracil-Resten an der Basis von Schleifenstrukturen stattfindet (Abudayyeh et al., 2016 ), daher sollte die Basis der tRNA-Anticodon-Schleife von Cas13 angesteuert werden können. Somit könnte die Analyse des tRNA-Spaltungsmechanismus aufgrund von Cas13 nicht mehr auf die Beobachtung beschränkt sein, sondern für experimentelle Manipulationen zugänglicher werden, um seine Funktionen zu analysieren.


STAR★methoden

Tabelle der wichtigsten Ressourcen

REAGENZ oder RESSOURCEQUELLEIDENTIFIKATOR
Bakterien- und Virusstämme
SARS-CoV-2, isolieren USA-WA1/2020BEI-RessourcenKat#NR-52281
Menschliches Coronavirus, NL63BEI-RessourcenKat#NR-470
Betacoronavirus 1 (menschliches Coronavirus OC43)ATCCKatze#VR-1558
H1N1 Influenzavirus AVirapurStamm: Kalifornien/04.2009
Grippevirus BVirapurStamm: Brisbane/60/2008
Biologische Proben
Humane Nasopharynx-Abstrich-RNA (negativ und positiv für SARS-CoV-2)Chan Zuckerberg Biohubhttps://www.czbiohub.org
Chemikalien, Peptide und rekombinante Proteine
RNA-STAT-60AMSBIOKat#CS-110
Q5 High-Fidelity-DNA-PolymeraseNEBKat#M0491
AMV Reverse TranskriptasePromegaKat#M5101
Oligo(dt)18Thermo ScientificKat#S0131
Zufällige HexamereThermo ScientificKat#S0142
Muriner RNase-InhibitorNEBKat#M0314
HEPES-LösungMillipore SigmaKatze#H3537
KaliumchloridlösungMillipore SigmaKatze#60142
Magnesiumchlorid-LösungMillipore SigmaKatze#63069
GlycerinInvitrogenKatze#15514011
Zwischen 20Millipore SigmaKatze#P9416
Kritische kommerzielle Tests
RNeasy Plus Mini-KitQIAGENKatze#741434
Direct-Zol RNA MiniPrep-KitZymo-ForschungKat#R2052
HiScribe T7 Quick High Yield RNA-Synthese-KitNEBKatze#E2050S
PrimeTime Gene Expression Master MixIDTKatze#1055771
Experimentelle Modelle: Zelllinien
Huh7.5.1-ACE2Wang etਊl., 2020bLeitender Autor: Andreas Puschnik
Vero CCL-81ATCCKat#CCL-81
Vero E6ATCCKat#CRL-1586
Oligonukleotide
ssRNA-OligosSynthegoSiehe Tabelle S1
DNA-OligosVerschiedenSiehe Tabelle S1
RNase Alert-SubstratIDTKat#11-04-03-03
Rekombinante DNA
p2CT-His-MBP-Lbu_C2c2_WTOst-Seletsky etਊl., 2016Addgen #83482
MERS-CoV-KontrollplasmidIDTKatze#10006624
2019-nCoV_N_Positives KontrollplasmidIDTKatze#10006625
Software und Algorithmen
Prisma 8GraphPadhttps://www.graphpad.com/scientific-software/prism/
MATLAB R2020aMathWorkshttps://www.mathworks.com/products/matlab.html?s_tid=hp_products_matlab
R (Version 3.6.0)Rhttps://www.r-project.org
VennDiagram-Paket (Version 1.6.20)Rhttps://cran.r-project.org/web/packages/VennDiagram/index.html
Benutzerdefinierter MATLAB-CodeDieses Papierhttps://doi.org/10.17632/r3vwyr2w5x.1
Benutzerdefinierte Android-AnwendungDieses PapierN / A
Sonstiges
384 Well-PlattenCorningKatze#3820
Absolute qPCR-PlattensiegelThermo FisherKat#AB1170
Unendlich 200 Pro M PlexTecanKatze#INF-MPLEX
TRH127-020-A-ML - ඁ/2” Achromatisches Triplet-ObjektivThorlabsTeilenummer: TRH127-020-A-ML
EmissionsfilterChromaKat#AT535/40 m²
Unmontierter reflektierender � mm ND-Filter, optische Dichte: 4.0ThorlabsTeilenummer: ND40B
Adafruchtfeder M0 Blaufrucht LEAdafruchtProdukt-ID: 2995
Powerboost 1000 Ladegerät – Wiederaufladbarer 5V Lipo USB BoostAdafruchtProdukt-ID: 2465
Lithium-Ionen-Akku – 3.7V 6600mAhAdafruchtProdukt-ID: 353
Sharp 488nm GH04850B2G 55mW Laserdiode in 12mm Kupfermodul mit Treiber und DTR-G-8 GlaslinseDTR’s Laser Shophttps://sites.google.com/site/dtrslasershop/home/diodes/sharp-gh04850b2g-55mw
Google Pixel 4 XLGooglehttps://store.google.com/us/product/pixel_4

Verfügbarkeit von Rohstoffen

Lead-Kontakt

Weitere Informationen und Anfragen nach Ressourcen und Reagenzien sind an die leitende Kontaktperson Melanie Ott ([email protected]) zu richten und werden von ihr bearbeitet.

Materialverfügbarkeit

Diese Studie erzeugte keine neuen einzigartigen Reagenzien.

Daten- und Codeverfügbarkeit

Der benutzerdefinierte MATLAB-Code für die Bildverarbeitung und Datenanalyse wurde bei Mendeley Data hinterlegt: https://doi.org/10.17632/r3vwyr2w5x.1.

Versuchsmodell und Themendetails

Säugetierzelllinien und Kulturbedingungen

Humane hepatozelluläre Karzinomzellen (Huh7.5.1, Geschenk von Frank Chisari) und Affennierenepithelzellen (Vero, ATCC CCL-81 und Vero E6, ATCC CRL-1586) wurden in DMEM (Corning), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum, kultiviert (FBS, Sigma), Penicillin/Streptomycin (Corning) und L-Glutamin (Corning) bei 37ଌ und 5 % CO2. Zelllinien wurden negativ auf Mykoplasmenkontamination getestet.

Erzeugung der Zelllinie Huh7.5.1-ACE2

Huh7.5.1-ACE2-Zellen wurden wie zuvor in (Wang, etਊl., 2020b) beschrieben erzeugt. Kurz gesagt, hACE2 (Addgene, #1786, Geschenk von Hyeryun Choe) wurde amplifiziert und in EcoRV-geschnittenes Plenti-CMV-Hygro-DEST (Addgene, #17454, Geschenk von Eric Campeau & Paul Kaufman) unter Verwendung von NEBuilder HiFi DNA Assembly kloniert Master-Mix (NEB). Lentivirus wurde in HEK293FT durch Co-Transfektion von plenti-hACE2-Hygro zusammen mit pCMV-dR8.2 dvpr (Addgene, #8455, Geschenk von Bob Weinberg), pCMV-VSV-G (Addgene, #8454, Geschenk von Bob Weinberg) hergestellt ) und pAdVAntage (Promega) unter Verwendung von FugeneHD (Promega). Der Überstand wurde 48 h nach der Transfektion gesammelt, filtriert und zu Huh7.5.1-Zellen gegeben. Transduzierte Zellen wurden anschließend 7 Tage lang unter Verwendung von Hygromycin selektiert.

Virusstämme

SARS-CoV-2-Viruskultur

Das Isolat USA-WA1/2020 von SARS-CoV-2 wurde für genomische SARS-CoV-2-RNA verwendet. Alle Experimente mit lebenden Viren wurden in einem Labor der Biosicherheitsstufe 3 durchgeführt. SARS-CoV-2-Bestände wurden in Vero CCL-81-Zellen vermehrt. Der virale Überstand wurde durch Zentrifugation gesammelt und bei �ଌ gelagert.

HCoV-NL63-Viruskultur

Isolat Amsterdam I von HCoV-NL63 (NR-470, BEI Resources) wurde in Huh7.5.1-ACE2-Zellen vermehrt. Der Überstand wurde 5 Tage nach der Infektion geerntet, gefiltert und bei �ଌ gelagert.

HCoV-OC43-Viruskultur

HCoV-OC43 (VR-1558, ATCC) wurde in Vero E6-Zellen vermehrt. Der Überstand wurde 6 Tage nach der Infektion geerntet, gefiltert und bei �ଌ gelagert.

Influenza-Virus

H1N1-Influenzavirus A (Kalifornien/04/2009) und Influenzavirus B (Brisbane/60/2008) in Hühner-Allantoisflüssigkeit wurden von Virapur bezogen und direkt für die RNA-Extraktion verwendet (siehe unten).

Organoide Kultur der menschlichen Atemwege

Organoide der menschlichen Atemwege werden unter Verwendung von Zellen der oberen Bronchien/Trachea aus Lungenresektionsgewebe erzeugt. Sie werden unter Verwendung des zuvor in (Sachs etਊl., 2019) beschriebenen Protokolls kultiviert. Atemwegsorganoide werden in Tropfen einer verdünnten Basalmembranmatrix (Cultrex, 3:4 mit Basalmedium verdünnt) in Platten mit flachem Boden und niedriger Anhaftung ausgesät. Organoide (AO)-Medien für die Atemwege werden hinzugefügt, nachdem sich die Tropfen verfestigt haben. Organoide werden bei 37ଌ, 5% CO2 kultiviert und alle zwei Wochen passagiert. Während der Passage werden die Organoidtropfen der Atemwege mit kaltem Basalmedium gesammelt, gewaschen und manuell und chemisch mit TryPLE 10X (GIBCO) und Trypsin-EDTA (Corning) dissoziiert und dann erneut in neue Platten ausgesät. Basale Medien und AO-Medienzusammensetzungen stammen aus ( Zhou etਊl., 2018 ).

Patientenproben

Anonymisierte RNA-Proben aus Nasen-Rachen-Abstrichen von Patienten, die positiv und negativ auf SARS-CoV-2 getestet wurden, wurden vom Chan Zuckerberg Biohub erhalten. Das Institutional Review Board der University of California, San Francisco, genehmigte diese Studie unter IRB #17-24056. Positive Proben wurden zuvor mit CDC N1- und N2 SARS-CoV-2-Primern quantifiziert.

Methodendetails

Cas13a-Proteinexpression und -reinigung

Bei Addgene hinterlegte Expressionsvektoren (Plasmid #83482) wurden zur Expression von LbuCas13a verwendet. Die codon-optimierten genomischen Cas13a-Sequenzen sind N-Endgültig markiert mit einem His6-MBP-TEV-Schnittstellensequenz, wobei die Expression durch einen T7-Promotor gesteuert wird. Die Reinigung von basierte auf einem zuvor veröffentlichten Protokoll mit einigen Modifikationen (East-Seletsky etਊl., 2017 East-Seletsky etਊl., 2016). Kurz gesagt wurden Expressionsvektoren in Rosetta2 DE3 oder BL21 . transformiert E.਌oli Zellen, die in Terrific-Brühe bei 37ଌ gezüchtet wurden, induziert in der mittleren logarithmischen Phase (OD600 𢏀.6) mit 0,5 mM IPTG und dann zur Übernacht-Expression auf 16ଌ übertragen. Zellpellets wurden in Lysepuffer (50 mM Tris-Cl pH 7,0, 500 mM NaCl, 5 % Glycerin, 1 mM TCEP, 0,5 mM PMSF und EDTA-freier Protease-Inhibitor (Roche)) resuspendiert, lysiert durch beschallt und durch Zentrifugation bei 35.000 xg geklärt. Lösliches Sein6-MBP-TEV-Cas13a wurde über Metallionen-Affinitätschromatographie isoliert, und um das His . abzuspalten6- MBP-Tag, das proteinhaltige Eluat wurde mit TEV-Protease bei 4ଌ über Nacht inkubiert, während in Ionenaustauscherpuffer (50 mM Tris-Cl pH 7,0, 250 mM KCl, 5 % Glycerin, 1 mM TCEP) dialysiert wurde. Gespaltenes Protein wurde auf eine HiTrap SP-Säule (GE Healthcare) geladen und über einen linearen KCl (0,25-1,0 M) Gradienten eluiert.Cas13a-haltige Fraktionen wurden gepoolt, konzentriert und mittels Größenausschlusschromatographie auf einer S200-Säule (GE Healthcare) in Gelfiltrationspuffer (20 mM HEPES-K pH 7,0, 200 mM KCl, 10 % Glycerin, 1 x000a0mM TCEP) und wurden anschließend zur Lagerung bei �ଌ schockgefroren.

In vitro RNA-Transkription

Das SARS-CoV-2 N-Gen wurde von einer einzelsträngigen DNA-Oligonukleotid-Matrize (IDT) transkribiert. Das HCoV-MERS N-Gen wurde von einem MERS-CoV-Kontrollplasmid (IDT, Cat# 10006624) transkribiert, indem zuerst ein T7-Promotor über PCR unter Verwendung von Q5 High-Fidelity DNA Polymerase (NEB) hinzugefügt wurde (siehe Tabelle S1 für Primer). Ein einzelnes PCR-Produkt wurde durch Gelelektrophorese bestätigt. In vitro Die Transkription wurde mit dem HiScribe T7 Quick High Yield RNA Synthesis Kit (NEB) gemäß den Empfehlungen des Herstellers durchgeführt. Matrizen-DNA wurde durch Zugabe von DNase I (NEB) entfernt und IVT-RNA wurde anschließend unter Verwendung von RNA STAT-60 (AMSBIO) und dem Direct-Zol RNA MiniPrep Kit (Zymo Research) gereinigt. Die RNA-Konzentration wurde durch Nanodrop quantifiziert und die Kopienzahl wurde unter Verwendung der vollen Transkriptlänge und -konzentration berechnet.

RNA-Extraktion

RNA wurde aus SARS-CoV-2, HCoV-NL63, HCoV-OC43, Influenza A und Influenza B Virusüberstand über RNA STAT-60 (AMSBIO) und das Direct-Zol RNA MiniPrep Kit (Zymo Research) extrahiert. RNA wurde aus organoiden Zellen der menschlichen Atemwege unter Verwendung des RNeasy Mini Kit (QIAGEN) extrahiert.

Quantitative Polymerase-Kettenreaktion

RNA aus dem SARS-CoV-2-Virusüberstand wurde mittels qPCR quantifiziert. Kurz gesagt wurde RNA über AMV Reverse Transcriptase (Promega) unter Verwendung von Oligo(dt) revers in cDNA transkribiert.18 und zufällige Hexamere (Thermo Scientific). cDNA wurde der qPCR-Reaktion unter Verwendung von PrimeTime Gene Expression Master Mix (IDT) zugesetzt. N- und E-Genstandards wurden verwendet, um eine Standardkurve für die Quantifizierung der Kopienzahl zu erzeugen. Der N-Genstandard wurde durch PCR aus dem 2019-nCoV_N_Positive Control Plasmid (IDT, Cat# 10006625) generiert. E-Genstandard wurde durch PCR unter Verwendung extrahierter genomischer SARS-CoV-2-RNA als Matrize erzeugt. Ein einzelnes Produkt wurde durch Gelelektrophorese bestätigt und DNA wurde durch Nanodrop quantifiziert. cDNA wurde unter Verwendung des 7500 Fast Real-Time PCR-Systems (Applied Biosystems) analysiert. Siehe Tabelle S1 für Primer.

CrRNA-Designparameter

20 Nukleotid-crRNA-Spacer-Sequenzen, die auf das N-Gen abzielen, wurden unter Verwendung zuvor veröffentlichter qPCR-Sequenzen der Centers for Disease Control and Prevention (CDC) und basierend auf (Zhu etਊl., 2020) ausgewählt. Für Spacer-Sequenzen, die auf das E-Gen abzielen, basierten unsere Spacer auf einem zuvor veröffentlichten qPCR-Primerset sowie einem veröffentlichten Cas12-Leitfaden (Broughton etਊl., 2020 Corman etਊl., 2020). Wir haben die Spezifität jeder crRNA für SARS-CoV-2 mit NCBI BLAST bestätigt und einen Schwellenwert von 16/20 Sequenzidentität mit menschlichen Transkripten festgelegt, um die Wahrscheinlichkeit einer Off-Target-Detektion aus menschlichem Gewebe zu verringern. Wir verwendeten die folgende crRNA-Stammsequenz mit 30 Nukleotiden: 5'-GACCACCCCAAAAAUGAAGGGGACUAAAAC-3'. Vollständige Sequenzen finden Sie in Tabelle S1.

4118 vollständige SARS-CoV-2-Genomsequenzen, die im NCBI RefSeq unter der Taxonomie-ID (2697049) hinterlegt sind, wurden am 05.06.2020 heruntergeladen. Wir haben jeden Leitfaden gegen die heruntergeladenen SC2-Genome ohne Fehlpaarungen durchsucht (mithilfe des grep-Befehls) und das Venn-Diagramm (Abbildung S2 D) wurde mit dem R-Paket VennDiagram (Version 1.6.20) erstellt.

Fluoreszierende Cas13a-Nuklease-Assays

LbuCas13a-crRNA-RNP-Komplexe wurden einzeln vormontiert, indem 1,33 mM LbuCas13a mit 1,33 mM crRNA für 15 min bei Raumtemperatur inkubiert wurden. In den Abbildungen 1 C und ​ und 2B, 2 B wurden 677 nM crRNA verwendet. Diese Komplexe wurden dann auf 100 nM LbuCas13a und 100 nM (oder 50 nM für die Abbildungen 1 C und ​ und 2B) 2 B) crRNA in Spaltungspuffer (20 mM HEPES-Na pH 6,8, 50 mM KCl .) verdünnt , 5 mM MgCl2und 5 % Glycerin) in Gegenwart von 400 nM Reporter-RNA (5'-FAM-rUrUrUrUrU-IowaBlack FQ-3'), 1 U/ml Muriner RNase-Inhibitor (NEB, Cat# M0314) und unterschiedlichen Mengen der Ziel-RNA. In den Abbildungen 1 C und ​ und 2B, 2 B betrug die Endkonzentration des RNP-Komplexes 50 nM. In allen anderen Figuren betrug die Endkonzentration des RNP-Komplexes 100 nM. In den Abbildungen 1 C und ​ und 2B, 2 B wurden 167 nM RNase Alert-Substrat (IDT) als Reporter-RNA verwendet, und in Abbildungਂ D wurden 400 nM RNase-Alert-Substrat verwendet. In den 3D und 3E wurden die Komplexe auch in 0,1% Tween-20 (Sigma) verdünnt und der Spaltungspuffer hatte einen pH-Wert von 7,1. Diese Reaktionen wurden in eine 384-Well-Platte (Corning, Cat# 3820) geladen, die in einem Fluoreszenzplattenlesegerät (TECAN, Infinite 200 Pro M Plex) bis zu 120 min bei 37ଌ inkubiert wurde, wobei alle 5 min Fluoreszenzmessungen vorgenommen wurden (oder alle 2,5 min in Abbildungਃ E) (λEx:485 nM λem:535 nM Gewinn: 130). Hintergrundkorrigierte Fluoreszenzwerte wurden durch Subtrahieren von Fluoreszenzwerten erhalten, die aus Reaktionen erhalten wurden, die durchgeführt wurden, die nur Reporter und Puffer enthielten. Für Assays, die gleichzeitig mehr als eine crRNA enthielten, wurden die LbuCas13a-crRNA-RNP-Komplexe separat durch 15 min Inkubation bei Raumtemperatur zusammengesetzt und dann in der Reaktion zur Hälfte (bei 2 RNP-Kombinationen) oder zu einem Drittel (bei 3 RNP-Kombinationen) kombiniert ) das Volumen, um die Gesamt- oder Gesamtkonzentration von RNP konstant zu halten. Repräsentative Diagramme von Experimenten sind gezeigt. Die meisten Experimente wurden mindestens zweimal wiederholt, mit Ausnahme von Abbildungਃ E (nur Patientenabstriche 1-3 und 5 wurden zweimal wiederholt), da das Probenmaterial begrenzt war. Für Patiententupfer 5 wurde im Vergleich zu anderen Tupfern eine etwas geringere Menge Abstrichmaterial verwendet (0,26 ml statt 0,3 ml), um eine niedrigere Viruskonzentration bei der Cas13a-Reaktion zu erreichen. Dadurch konnten wir eine niedrigere Kopienzahl nachweisen, die die Cas13a-Reaktion in Patientenproben nachweisen konnte.

Fluoreszenzmikroskop für Mobiltelefone

Wir haben ein Mobiltelefon-Fluoreszenzmikroskop mit einem 488 nm-Diodenlaser (GH04850B2G, Sharp Microelectronics), einem grünen Fluoreszenz-Interferenzfilter (Chroma Technology AT 535/40) und einer Pixel 4 XL-Telefonkamera (12,2 Megapixel, Pixelgröße) gebaut 1,4 mm, Blende f/1.7, Google). Der Laserstrahl wurde mit einer Glaskollimationslinse (10° Divergenzhalbwinkel) aufgeweitet, mit zwei als Spiegel verwendeten ND4-Filtern (ND40B, Thorlabs) auf die Probenebene gerichtet und durch eine elliptische Blende reduziert, um das kreisförmige Bildfeld auszufüllen -of-view mit einer einheitlichen Feldstärke. Die Probe wurde mit einer schrägen epi-Konfiguration beleuchtet und die Beleuchtungsleistung betrug 18 mW in der Probenebene Der beleuchtete Bereich in der Probenebene betrug 15 × 15 mm 2 . Die Abbildungsoptik besteht aus einem f = 20 mm kompakten Triplet-Objektiv (TRH127-020-A, Thorlabs), gefolgt vom Interferenzfilter zur Auswahl der Fluoreszenz-Reporter-Emissionswellenlänge und dem Pixel 4 XL-Kameraobjektiv. Die Gesamtvergrößerung vom Objekt zur Bildebene beträgt 𢏁/4,5 und die numerische Apertur beträgt 0,06. Alle optischen und Beleuchtungskomponenten wurden in einer speziell angefertigten Darkbox eingeschlossen, in die ein Probenchip für die Bildgebung eingelegt wird. Die automatisierte Zeitraffer-Bildgebung wurde durch eine benutzerdefinierte Android-Anwendung und einen Bluetooth-Empfänger (Bluefruit Feather M0, Adafruit) implementiert, der den Laser zum Zeitpunkt der Bildaufnahme auslöste. Die Cas13a-Reaktion wurde durchgeführt, indem das Gerät zur Temperaturkontrolle in einen 37ଌ-Inkubator gestellt wurde, und die Reaktionskurve wurde durch Offline-Analyse der Bildzeitreihen mit einem benutzerdefinierten MATLAB (Mathworks)-Code erhalten. Bei der Messung des Cas13-Reporterhintergrunds beträgt das Signal-Rausch-Verhältnis unseres Systems, das durch das Rauschen des Diodenlasers begrenzt wird, � ( Abbildung S3 D).

Musterchipherstellung

Probenchips mit drei Flüssigkeitskanälen wurden durch Gießen von Polydimethylsiloxan (PDMS, Ellsworth-Klebstoffe) auf eine Acrylform hergestellt. Die Acrylform wurde zusammengebaut, indem drei lasergeschnittene Acrylbahnen auf eine flache Acrylbasis geklebt wurden. Die Breite, Höhe und Länge jeder Acrylglasbahn betrugen 1,6 mm, 2 mm bzw. 12,5 mm, was zu einem Flüssigkeitskanalvolumen von 40 μL führte (Abbildungen S3 A–S3C). Einlass- und Auslassöffnungen wurden an beiden Enden der Kanäle nach dem Aushärten und Entformen des PDMS unter Verwendung einer Biopsie-Stanze geschaffen. Anschließend wurden die PDMS-Chips auf ein silikonisiertes Deckglas (Hampton Research) geklebt, um die Flüssigkeitskanäle zu verschließen. Um die Bildung von Blasen im Chip während der Messung zu vermeiden, wurden sowohl der Cas13a-Reaktionsmix als auch der Probenchip im Hausvakuum für 15 min entgast, bevor die Proben geladen und die Messung gestartet wurde.

Bildaufnahme und -analyse von Mobiltelefonen

Während des typischen Gerätebetriebs wurde alle 30 s über einen Zeitraum von 1 h ein 𢏁 s-Belichtungs-RGB-Bild aufgenommen und die Bilder wurden offline mit benutzerdefiniertem MATLAB-Code analysiert. Zuerst wurde das RGB-Bild mit 2016 × 2512 Pixeln in ein Graustufenbild demosaiced. Zweitens wurden die gesättigten Pixel oder Pixel mit zwei sehr unterschiedlichen grünen Submosaikwerten ausgeschlossen. Drittens wurde ein rechteckiger Bildbereich von Interesse (ROI) von 400 × 90 Pixeln manuell innerhalb eines Bereichs jedes Flüssigkeitskanals gezeichnet und das Reportersignal in jedem ROI wurde durch Mittelwertbildung der Pixelwerte bestimmt ( Abbildung S3 C ). Die ROI-Werte werden zeitlich akkumuliert und zur Neigungsbestimmung analysiert (siehe Quantifizierung und statistische Analyse).

Datenvergleich mit Enzymkinetik

Wir analysierten die Cas13a-Reaktion mit einer einzelnen crRNA (Abbildungen S1 B–S1D) unter Verwendung des Michaelis-Menten-Enzymkinetikmodells mit der Quasi-Steady-State-Approximation, um R, das Verhältnis von aktiver Cas13-RNP zur Ziel-RNA, aus der gemessenen Reaktion abzuschätzen Rate pro Ziel-RNA, A (unten). Zunächst wandelten wir das Plattenlesesignal in die molare Konzentration des gespaltenen Reporters um und bestimmten die Cas13a-Reaktionsgeschwindigkeit v für unterschiedliche Konzentrationen der Ziel-RNA [E0]. Wir bestimmten dann die Reaktionsgeschwindigkeit pro Ziel-RNA, A, indem wir eine lineare Kurve an die Daten anpassten. Wir verwendeten die Gesamtkonzentration des Reporters [S] = 400 nM, KKatze = 600/s, Km von 1 μM bis 3 μM (Slaymaker etਊl., 2019), um R aus A zu berechnen.

Wir schätzten, dass die Menge an aktivem Cas13a-RNP sowohl für crRNA 2 als auch für crRNA 4 so klein wie 31 – 37 % der gesamten Ziel-RNA sein kann (für Km = 1 μM) oder bis zu 75 – 89 % (für Km = 3 μM).

Simulation von Mobilgerätedaten

Wir haben MATLAB verwendet, um die Daten der mobilen Geräte zu simulieren. Wir simulierten die Daten, indem wir das zufällige Rauschen mit einer Standardabweichung von 0,002 einschlossen, um das gemessene Rauschen 𢏀,0007 in unserem System konservativ zu emulieren ( Abbildung S3 D). Wir nahmen an, dass für 50 Kopien/μL der viralen Ziel-RNA das Signal bei 37ଌ mit einer Geschwindigkeit von 0,0002-fach/min zunimmt, basierend auf Abbildungꁌ, die den Unterschied von 𢏀,002-fach/min zwischen den Reaktionen zeigt Geschwindigkeiten bei 500 Kopien/μL und RNP allein, und diese Reaktionsgeschwindigkeit ist über die Zeit konstant, wie wir mit experimentellen Daten validiert haben (Abbildungen S1 B–S1D). Obwohl wir bei den Kontrollreaktionen nur mit RNP leicht positive Steigungen beobachten, simulierten wir die Kontrollreaktion als flache Linie mit einer Standardabweichung von 0,002, nachdem wir ihre Steigung von der positiven Reaktion abgezogen hatten. In jeder Simulation testeten wir, ob sich die positive Probenkurve signifikant von der RNP-Allein-Kurve unterschied, basierend auf dem Vergleich entweder des Endpunktsignals oder der Signalsteigung. In beiden Fällen betrachteten wir das Signal als positiv, wenn es innerhalb des 95 %-Konfidenzintervalls nicht mit der Kontrolle überlappte. Für jeden Messzeitpunkt haben wir die Simulation 1.000 Mal wiederholt und die Erkennungsgenauigkeit durch Auszählen der positiven Tests ermittelt.

Quantifizierung und statistische Analyse

Die Anzahl der Experimente und Replikate sind in den einzelnen Abbildung Legends angegeben. Die Steigung der Cas13a-Reaktion wird durch einfache lineare Regression der Rohdaten vom Zeitpunkt 0 für die eingestellte Dauer berechnet. Für alle Plattenleserproben und die Patientenproben, die in einem mobilen Gerät gemessen wurden, begann die Messung unmittelbar nach dem Laden der Probe. Bei den genomischen SARS-COV-2-RNA-Proben, die in einem mobilen Gerät gemessen wurden, wurde die Probe vor Beginn der Messung 10 min im Gerät äquilibriert. Der Steigungsfehlerbalken zeigt die 95 %-Konfidenzintervalle (KI) der linearen Regression an, die entweder an einzelnen Daten oder an Daten, die aus der Gruppe von Replikaten zusammengeführt wurden, durchgeführt wurde. Um die Signifikanz zwischen Gruppen mit positiver Cas13a-Reaktion gegenüber der reinen RNP-Kontrolle zu erhalten, verwendeten wir eine Zweiwege-ANCOVA zur Steigung während der linearen Regression. Wenn die Steigung der positiven Reaktion kleiner ist als die der reinen RNP-Kontrolle, wird sie als nicht signifikant angesehen. Um die Genauigkeit unseres Nachweises positiver Proben zu bewerten, testeten wir, ob die Steigung einer einzelnen positiven Probe die einer RNP-only-Kontrolle um mehr als das 95 %-KI überstieg. Die Nachweisgenauigkeit wird als das Verhältnis der positiv getesteten Proben zur Gesamtzahl der Tests quantifiziert. Der CI kann angepasst werden, um entweder die Sensitivität oder Spezifität des Tests zu verbessern. Eine Verschärfung des CI auf 99 % führt beispielsweise zu mehr potentiellen falsch-negativen Ergebnissen, oder eine Lockerung auf 90 % führt zu mehr falsch-positiven Ergebnissen. Die Daten in den Abbildungen 1 , ​ ,2, 2 und ​ und3 3 wurden mit GraphPad Prism 8 verarbeitet und visualisiert. Die Daten in Abbildung਄ wurden mit MATLAB verarbeitet.


CRediT-Autorenbeitragserklärung

Mohd. Azhar: Konzeptualisierung, Methodik, Untersuchung, Validierung, Visualisierung. Rhythmus Phutela: Konzeptualisierung, Methodik, Untersuchung, Validierung, Visualisierung. Manoj Kumar: Konzeptualisierung, Methodik, Untersuchung, Validierung, Visualisierung. Asgar Hussain Ansari: Methodik, Datenkuration, Visualisierung, Software. Riya Rauthan: Untersuchung, Validierung. Sneha Gulati: Untersuchung, Validierung. Namrata Sharma: Untersuchung, Validierung. Dipanjali Sinha: Ermittlung. Saumya Sharma: Ermittlung. Sunaina Singh: Ermittlung. Sundaram Acharya: Ermittlung. Sajal Sarkar: Ermittlung. Deepanjan Paul: Ermittlung. Poorti Kathpalia: Ermittlung. Meghali Aich: Ermittlung. Paras Sehgal: Ressourcen. Gyan Ranjan: Ressourcen. Rahul C. Bhoyar: Ressourcen. Indian CoV2 Genomics & Genetic Epidemiology (IndiCovGEN) Konsortium: Ressourcen. Khushboo Singhal: Ressourcen. Harsha Junge: Ressourcen, Validierung. Pradeep Kumar Patra: Ressourcen, Validierung. Govind Makharia: Untersuchung, Ressourcen. Giriraj Ratan Chandak: Untersuchung, Ressourcen. Bala Pesala: Software, Ressourcen. Debojyoti Chakraborty: Konzeption, Methodik, Visualisierung, Supervision, Schreiben – Originalentwurf, Förderakquise. Souvik Maiti: Konzeption, Methodik, Betreuung, Schreiben – Originalentwurf, Förderakquise.


Abstrakt

Infektionskrankheiten sind ein globales Gesundheitsproblem, von dem Milliarden von Menschen betroffen sind. Die Entwicklung schneller und sensibler Diagnosetools ist der Schlüssel für ein erfolgreiches Patientenmanagement und die Eindämmung der Krankheitsausbreitung. Derzeit verfügbare Diagnostika sind sehr spezifisch und sensitiv, aber zeitaufwändig und erfordern teure Laboreinstellungen und gut ausgebildetes Personal, sodass sie in ressourcenbegrenzten Gebieten, für groß angelegte Screenings und bei Ausbrüchen und Epidemien nicht verfügbar sind. Die Entwicklung neuer, schneller und kostengünstiger Point-of-Care-Diagnoseassays ist dringend erforderlich. Dieser Review konzentriert sich auf CRISPR-basierte Technologien und ihre Perspektiven, um Plattformen für Point-of-Care-Nukleinsäurenachweismethoden und als einsetzbare Diagnoseplattformen zu werden, die helfen könnten, Ausbrüche und neu auftretende Epidemien zu identifizieren und einzudämmen. Wir beschreiben die Mechanismen und Funktionen verschiedener Klassen und Typen von CRISPR-Cas-Systemen, einschließlich der Vor- und Nachteile für die Entwicklung molekulardiagnostischer Tests und Anwendungen jedes Typs zum Nachweis einer Vielzahl von Infektionserregern. Viele Cas-Proteine ​​(Cas3, Cas9, Cas12, Cas13, Cas14 usw.) wurden genutzt, um hochpräzise und empfindliche Diagnosewerkzeuge in Kombination mit Technologien zur Signalverstärkung und fluoreszierenden, potentiometrischen, kolorimetrischen, Lateral-Flow-Assay-Detektion und anderen zu entwickeln. Insbesondere die fortschrittlichsten Plattformen – SHERLOCK/v2, DETECTR, CARMEN oder CRISPR-Chip – ermöglichen den Nachweis attomolarer Mengen pathogener Nukleinsäuren mit einer mit der PCR vergleichbaren Spezifität, jedoch mit minimalem technischen Aufwand. Die Weiterentwicklung von CRISPR-basierten Diagnosetools verspricht einen dramatischen Wandel in der Molekulardiagnostik, indem sie praktisch überall auf der Welt leicht erschwinglich und zugänglich wird. Die Belastung durch gesellschaftlich bedeutsame Krankheiten, häufige Ausbrüche, aktuelle Epidemien (MERS, SARS und das anhaltende COVID-19) und Ausbrüche von Zoonoseviren (Afrikanisches Schweinepestvirus etc.) erfordern dringend die Entwicklung und Verbreitung von Express-Diagnoseinstrumenten. Kürzlich entwickelte CRISPR-Technologien stellen die beispiellose Möglichkeit dar, die epidemiologische Überwachung und molekulare Diagnostik neu zu gestalten.


Wie funktionieren aktuelle Diagnosetests?

Es gibt zwei Arten von diagnostischen Tests für virale Krankheitserreger: solche, die auf Antikörper des Wirts abzielen, die als Reaktion auf eine Virusinfektion produziert werden, und solche, die auf das Genom des Virus abzielen. Antikörperbasierte Tests (auch als serologische Tests bekannt) erfordern, dass infizierten Personen mehrere Tage nach der Virusübertragung Blut abgenommen wird, um ihrem Immunsystem genügend Zeit zu geben, IgG- und IgM-Antikörper zu produzieren. Nukleinsäurebasierte Tests hingegen erfordern nur das Vorhandensein des Virus selbst. So können diese Tests Viren in Patientenproben (z. B. Nasen-Rachen-Abstriche auf Atemwegserreger) schon vor dem Einsetzen der Symptome nachweisen. Aus diesem Grund werden Nukleinsäure-basierte Tests anstelle von Antikörper-basierten Tests verwendet, um die Virusausbreitung zu bekämpfen. Antikörpertests sind jedoch unerlässlich, um Personen zu identifizieren, die bereits während einer Pandemie infiziert waren und sich seitdem erholt haben, insbesondere diejenigen, die nie Symptome entwickelt haben.

Die gängigsten Nukleinsäure-basierten Tests beruhen auf der Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR), um revers transkribierte virale RNA zu amplifizieren. Die resultierenden PCR-Amplikons werden dann unter Verwendung von Standard-RT-PCR-Nachweisverfahren nachgewiesen. Diese Tests sind nicht ohne Mängel. Eine unterdurchschnittliche Probenhandhabung kann zu falsch-negativen Ergebnissen führen und die Amplifikation verläuft langsamer als bei isothermen Amplifikationstechnologien wie der Loop-Mediated Amplification (LAMP).Da Proben normalerweise zum Testen an ein zentrales Labor geschickt werden, können RT-PCR-Tests von der Entnahme bis zum Ergebnis mehr als einen Tag dauern. Labor-RT-PCR-Tests erfordern auch geschulte Techniker, um das Protokoll auszuführen und die Ergebnisse zu interpretieren.

Point-of-Care-Tests (d. h. Tests im Feld und nicht im Labor) sind unerlässlich, um die Ausbreitung hochansteckender Viren zu bekämpfen, da sie eine schnelle Identifizierung infizierter Personen ermöglichen, um eine Isolierung und Kontaktverfolgung zu ermöglichen. Obwohl es Point-of-Care-RT-PCR-Diagnostiken gibt, wurden sie durch Tests ersetzt, die schnellere Amplifikationstechnologien (z. B. LAMP) und kleinere Instrumente verwenden. [1]


Es werden Methoden benötigt, die Nukleinsäuren, die das Vorhandensein von Krankheitserregern signalisieren, selbst in sehr geringen Konzentrationen leicht nachweisen können. Götenberg et al. kombinierten die allelspezifische Sensing-Fähigkeit von CRISPR-Cas13a mit Rekombinase-Polymerase-Amplifikationsmethoden, um spezifische RNA- und DNA-Sequenzen nachzuweisen. Mit der Methode wurden attomolare Mengen des Zika-Virus sowie das Vorhandensein pathogener Bakterien erfolgreich nachgewiesen. Es könnte auch verwendet werden, um eine menschliche Genotypisierung aus zellfreier DNA durchzuführen.

Ein schneller, kostengünstiger und sensitiver Nukleinsäurenachweis kann den Pathogennachweis, die Genotypisierung und die Krankheitsüberwachung am Point-of-Care unterstützen. Der RNA-gesteuerte, RNA-Targeting Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-Effektor Cas13a (früher bekannt als C2c2) zeigt einen „Kollateraleffekt“ von promiskuitiver Ribonuklease-Aktivität bei der Zielerkennung. Wir kombinieren die Nebenwirkung von Cas13a mit isothermer Amplifikation, um eine CRISPR-basierte Diagnostik (CRISPR-Dx) zu etablieren, die einen schnellen DNA- oder RNA-Nachweis mit attomolarer Sensitivität und Einzelbasen-Mismatch-Spezifität ermöglicht. Wir verwenden diese Cas13a-basierte molekulare Erkennungsplattform, die als Specific High-Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing (SHERLOCK) bezeichnet wird, um spezifische Stämme des Zika- und Dengue-Virus zu erkennen, pathogene Bakterien zu unterscheiden, menschliche DNA zu genotypisieren und Mutationen in zellfreier Tumor-DNA zu identifizieren. Darüber hinaus können SHERLOCK-Reaktionsreagenzien zur Kühlkettenunabhängigkeit und Langzeitlagerung lyophilisiert und für Feldanwendungen leicht auf Papier rekonstituiert werden.

Die Fähigkeit, Nukleinsäuren mit hoher Sensitivität und Einzelbasen-Spezifität auf einer tragbaren Plattform schnell nachzuweisen, kann bei der Diagnose und Überwachung von Krankheiten, der Epidemiologie und allgemeinen Laboraufgaben hilfreich sein. Es gibt zwar Methoden zum Nachweis von Nukleinsäuren (16), haben sie Kompromisse zwischen Sensitivität, Spezifität, Einfachheit, Kosten und Geschwindigkeit. Mikrobielle geclusterte, regelmäßig interspaced kurze palindromische Wiederholungen (CRISPR) und CRISPR-assoziierte (CRISPR-Cas) adaptive Immunsysteme enthalten programmierbare Endonukleasen, die für die CRISPR-basierte Diagnostik (CRISPR-Dx) genutzt werden können. Obwohl einige Cas-Enzyme auf DNA abzielen (7, 8), Einzeleffektor-RNA-gesteuerte Ribonukleasen (RNasen), wie Cas13a (früher bekannt als C2c2) (8), kann mit CRISPR-RNAs (crRNAs) umprogrammiert werden, um eine Plattform für die spezifische RNA-Erfassung bereitzustellen (912). Bei der Erkennung seines RNA-Targets beteiligt sich aktiviertes Cas13a an der „kollateralen“ Spaltung von nahegelegenen nicht-zielgerichteten RNAs (10). Diese crRNA-programmierte kollaterale Spaltungsaktivität ermöglicht es Cas13a, das Vorhandensein einer spezifischen RNA in vivo zu erkennen, indem es den programmierten Zelltod auslöst (10) oder in vitro durch unspezifischen Abbau markierter RNA (10, 12). Hier beschreiben wir Specific High-Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing (SHERLOCK), eine In-vitro-Nukleinsäure-Detektionsplattform mit attomolarer Sensitivität basierend auf Nukleinsäureamplifikation und Cas13a-vermittelter kollateraler Spaltung einer Reporter-RNA (12), was eine Echtzeiterkennung des Ziels ermöglicht (Abb. 1A).

(EIN) Schema von SHERLOCK. dsDNA, doppelsträngige DNA RT-RPA, Reverse Transkriptase-RPA. (B) Schema des ssRNA-Targets, das mit der Cas13a-Kollateraldetektion nachgewiesen wurde. Die Ziel-Site wird blau hervorgehoben. (C) Cas13a-Detektion von RNA mit RPA-Amplifikation (SHERLOCK) kann ssRNA-Target bei Konzentrationen von bis zu nachweisen

2 Uhr morgens, empfindlicher als Cas13a allein. n = 4 Balken der technischen Wiederholungen repräsentieren den Mittelwert ± SEM. (D) SHERLOCK ist auch in der Lage, Einzelmolekül-DNA zu detektieren. n = 4 Balken der technischen Wiederholungen repräsentieren den Mittelwert ± SEM.

Um eine robuste Signalerkennung zu erreichen, identifizierten wir ein Ortholog von Cas13a aus Leptotrichia wadei (LwCas13a), das im Vergleich zu eine größere RNA-gesteuerte RNase-Aktivität zeigt Leptotrichia shahii Cas13a (LshCas13a) (10) (Abb. S1). LwCas13a inkubiert mit einzelsträngiger RNA Target 1 (ssRNA 1), crRNA und Reporter (gequenchte fluoreszierende RNA) (Abb. 1B) (13) ergab eine Nachweisempfindlichkeit von

50 fM (Abb. 1C und Abb. S2). Obwohl diese Sensitivität eine Verbesserung gegenüber früheren Studien mit Cas13a von Leptotrichia bucallis (12), ist für viele diagnostische Anwendungen eine attomolare Sensitivität erforderlich (1416). Wir untersuchten daher die Kombination der Cas13a-basierten Detektion mit verschiedenen isothermen Amplifikationsschritten (Abb. S3 und S4A) (17, 18). Von den untersuchten Methoden ist die Rekombinase-Polymerase-Amplifikation (RPA) (18) zeigte die größte Sensitivität und konnte mit der T7-Transkription gekoppelt werden, um amplifizierte DNA in RNA für den anschließenden Nachweis durch LwCas13a umzuwandeln. Wir bezeichnen diese Kombination aus Amplifikation durch RPA, T7-RNA-Polymerase-Transkription von amplifizierter DNA zu RNA und Detektion von Ziel-RNA durch Cas13a-kollaterale RNA-Spaltung – vermittelte Freisetzung des Reportersignals als SHERLOCK.

Wir haben zuerst die Sensitivität von SHERLOCK für den Nachweis von RNA (wenn mit reverser Transkription gekoppelt) oder DNA-Targets bestimmt. Wir erreichten eine Einzelmolekül-Sensitivität sowohl für RNA als auch für DNA, wie durch die Digital-Droplet-Polymerase-Kettenreaktion (ddPCR) verifiziert (Abb. 1, C und D und Abb. S4, B und C). Die attomolare Sensitivität blieb erhalten, als wir alle SHERLOCK-Komponenten in einer einzigen Reaktion kombinierten, was die Lebensfähigkeit dieser Plattform als Point-of-Care-Diagnostik demonstrierte (Abb. S4D). SHERLOCK weist eine ähnliche Sensitivität auf wie die ddPCR und die quantitative PCR (qPCR), zwei etablierte Ansätze zum empfindlichen Nukleinsäurenachweis, während RPA allein nicht sensitiv genug war, um niedrige Zielkonzentrationen nachzuweisen (Abb. S5, A bis D). Darüber hinaus zeigt SHERLOCK eine geringere Variation als ddPCR, qPCR und RPA, gemessen am Variationskoeffizienten über die Replikate hinweg (Abb. S5, E und F).

Als nächstes untersuchten wir, ob SHERLOCK bei Anwendungen mit Infektionskrankheiten wirksam wäre, die eine hohe Empfindlichkeit erfordern. Wir produzierten Lentiviren, die Genomfragmente des Zika-Virus (ZIKV) oder des verwandten Flavivirus Dengue (DENV) enthalten (19) (Abb. 2A). SHERLOCK wies virale Partikel bis hinunter zu 2 aM nach und konnte zwischen ZIKV und DENV unterscheiden (Abb. 2B). Um die potenzielle Verwendung von SHERLOCK im Feld mit Papierflecken und Lyophilisation zu untersuchen (1) zeigten wir zunächst, dass Cas13a-crRNA-Komplexe lyophilisiert und anschließend rehydratisiert wurden (13) konnte 20 fM nicht-amplifizierter ssRNA 1 nachweisen (Abb. S6A) und dieser Target-Nachweis war auch auf Glasfaserpapier möglich (Abb. S6B). Die anderen Komponenten von SHERLOCK sind ebenfalls für die Gefriertrocknung geeignet: RPA wird als lyophilisiertes Reagenz bei Umgebungstemperatur bereitgestellt, und wir haben zuvor gezeigt, dass die T7-Polymerase die Gefriertrocknung toleriert (2). In Kombination mit der Gefriertrocknung und dem Papierspotting der Cas13a-Nachweisreaktion führte die ssRNA 1 zu einem sensitiven Nachweis von ssRNA 1 vergleichbar mit den wässrigen Reaktionen (Abb. S6, C bis E). Obwohl Papierflecken und Lyophilisierung das absolute Signal der Auslesung leicht reduzierten, konnte SHERLOCK (Fig. 2C) das Schein-ZIKV-Virus bei Konzentrationen von nur 20 aM (Fig. 2D) leicht nachweisen.

(EIN) Schema des ZIKV-RNA-Nachweises durch SHERLOCK. (B) SHERLOCK ist in der Lage, die lentiviralen ZIKV-Partikel hochempfindlich zu detektieren. (C) Schema des ZIKV-RNA-Nachweises mit gefriergetrocknetem Cas13a auf Papier. (D) SHERLOCK auf Papierbasis ist in der Lage, lentivirale ZIKV-Partikel hochempfindlich zu detektieren. (E) Schema des SHERLOCK-Nachweises von ZIKV-RNA, die aus humanen klinischen Proben isoliert wurde. (F) SHERLOCK ist in der Lage, humane ZIKV-positive Serum- (S) oder Urinproben (U) hochempfindlich nachzuweisen. Ungefähre Konzentrationen der gezeigten ZIKV-RNA wurden durch qPCR bestimmt. (g) Schema der Verwendung von SHERLOCK zur Unterscheidung von Bakterienstämmen mit einem universellen 16S rRNA-Gen V3-RPA-Primer-Set. (h) SHERLOCK ermöglicht einen sensitiven und spezifischen Nachweis von E coli oder P. aeruginosa gDNA. Ec, E coli Kp, K. pneumoniae Pa, P. aeruginosa Berg, Mycobacterium tuberculosis Sa, Staphylococcus aureus. (B, D, F und H) n = 4 technische Replikate, zweiseitige Student's T Prüfung *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 und ****P < 0,0001 n.d., nicht erkannte Balken repräsentieren den Mittelwert ± SEM.

SHERLOCK kann ZIKV auch in klinischen Isolaten (Serum oder Urin) nachweisen, deren Titer bis zu 2 × 10 3 Kopien/ml (3,2 aM) betragen können (20). ZIKV-RNA, die aus Patientenserum- oder Urinproben extrahiert und in cDNA revers transkribiert wurde (Abb. 2E), konnte bei Konzentrationen von bis zu 1,25 × 10 3 Kopien/ml (2,1 aM) nachgewiesen werden, wie durch qPCR verifiziert (Abb. 2F). Darüber hinaus war das Signal von Patientenproben prädiktiv für die Anzahl der ZIKV-RNA-Kopien und konnte zur Vorhersage der Viruslast verwendet werden (Abb. S6F). Um den Probennachweis ohne Nukleinsäurereinigung zu simulieren, haben wir den Nachweis von ssRNA 1 in Humanserum gemessen und festgestellt, dass Cas13a RNA in Reaktionen mit bis zu 2% Serum nachweisen konnte (Abb. S6G).

Eine weitere wichtige epidemiologische Anwendung für CRISPR-Dx ist die Identifizierung bakterieller Krankheitserreger und der Nachweis spezifischer bakterieller Gene. Wir zielten auf die V3-Region des 16S ribosomale RNA (rRNA)-Gen, wobei konservierte flankierende Regionen die Verwendung universeller RPA-Primer über Bakterienarten hinweg ermöglichen und die variable interne Region die Differenzierung der Arten ermöglicht. In einem Panel von fünf möglichen Targeting-cRNAs für verschiedene pathogene Stämme und genomische DNA (gDNA) isoliert aus Escherichia coli und Pseudomonas aeruginosa (Fig. 2G), SHERLOCK genotypisierte Stämme korrekt und zeigte eine geringe Kreuzreaktivität (Fig. 2H). Darüber hinaus konnten wir mit SHERLOCK zwischen klinischen Isolaten von Klebsiella pneumoniae mit zwei verschiedenen Resistenzgenen: Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC) und Neu-Delhi-Metallo-β-Lactamase 1 (NDM-1) (21) (Abb. S7).

Um die Spezifität von SHERLOCK zu erhöhen, haben wir synthetische Fehlpaarungen in den crRNA:Target-Duplex eingeführt, die es LwCas13a ermöglichen, zwischen Zielen zu unterscheiden, die sich durch eine Einzelbasen-Fehlpaarung unterscheiden (Abb. S8, A und B). Wir entwarfen mehrere crRNAs mit synthetischen Fehlpaarungen in den Spacer-Sequenzen, um entweder die afrikanischen oder amerikanischen Stämme von ZIKV (Abb. 3, A und B) und Stamm 1 oder 3 von DENV (Abb. 3, C und D) zu erkennen. Synthetische Mismatch-cRNAs erkannten ihre entsprechenden Stämme mit einem signifikant höheren Signal (zweiseitige Student's T Prüfung, P < 0,01) als der Off-Target-Stamm, was eine robuste Stammunterscheidung auf der Grundlage einzelner Fehlpaarungen ermöglicht (Fig. 3, B bis D und Fig. S8C). Eine weitere Charakterisierung ergab, dass der Cas13a-Nachweis maximale Spezifität erreicht, während die Target-Sensitivität beibehalten wird, wenn sich eine Mutation in Position 3 des Spacers befindet und sich die synthetische Fehlpaarung in Position 5 befindet (Abb. S9 und S10).

(EIN) Schema der Zielregionen des ZIKV-Stamms und der zum Nachweis verwendeten crRNA-Sequenzen. SNPs im Ziel sind rot oder blau hervorgehoben und synthetische Fehlpaarungen in der Leitsequenz sind rot. (B) Der hochspezifische Nachweis von Stamm-SNPs ermöglicht die Differenzierung zwischen afrikanischen und amerikanischen ZIKV-RNA-Zielen mit Cas13a. (C) Schema der Zielregionen des DENV-Stamms und der zum Nachweis verwendeten crRNA-Sequenzen. SNPs im Ziel sind rot oder blau hervorgehoben und synthetische Fehlpaarungen in der Leitsequenz sind rot markiert. (D) Der hochspezifische Nachweis von Stamm-SNPs ermöglicht die Differenzierung von DENV-Stamm-1-RNA-Targets gegenüber Stamm-3-RNA-Targets mit Cas13a. (B und D) n = 2 technische Replikate, zweiseitiger Student T Prüfung *P < 0,05, **P < 0,01 und ***P < 0,001 Balken repräsentieren den Mittelwert ± SEM.

Die Möglichkeit, Unterschiede einzelner Basen zu erkennen, eröffnet die Möglichkeit, SHERLOCK für die schnelle humane Genotypisierung zu verwenden. Als „Goldstandard“ bei diesen SNPs wählten wir fünf Loci aus, die eine Reihe gesundheitsbezogener Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs) umfassen (Tabelle S1) und verglichen die SHERLOCK-Detektion mit Genotypisierungsdaten von 23andMe, einem Unternehmen für Gentests (22) (Abb. 4A). Wir sammelten Speichel von vier menschlichen Probanden mit verschiedenen Genotypen an den interessierenden Loci und extrahierten gDNA entweder durch Säulenreinigung oder direktes Erhitzen für 5 Minuten (13). SHERLOCK unterschied Allele mit hoher Signifikanz und mit ausreichender Spezifität, um sowohl auf homozygote als auch auf heterozygote Genotypen zu schließen ( 4B und Abb. S11 und S12).

(EIN) Circos-Plot, der die Position von menschlichen SNPs zeigt, die mit SHERLOCK nachgewiesen wurden. (B) SHERLOCK kann vier verschiedene Individuen an vier verschiedenen SNP-Stellen im menschlichen Genom korrekt genotypisieren. Die Genotypen für jedes Individuum und die Identitäten der Allel-erfassenden crRNAs sind unter jedem Plot annotiert. (C) Schema des cfDNA-Nachweises von Krebsmutationen mit SHERLOCK. (D) Sequenzen von zwei genomischen Loci, die auf Krebsmutationen in cfDNA untersucht wurden. Dargestellt sind die genomischen Zielsequenzen mit blau hervorgehobenen SNPs und die mutanten- und Wildtyp-sensierenden crRNA-Sequenzen mit synthetischen Fehlpaarungen in rot. (E und F) Cas13a kann das mutierte Minor-Allel in simulierten cfDNA-Proben für das Minor-Allel EGFR L858R (E) oder BRAF V600E (F) nachweisen. (B, E und F) n = 4 technische Replikate, zweiseitige Student's T Prüfung *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 und ****P < 0,0001 Balken repräsentieren den Mittelwert ± SEM.

Schließlich wollten wir feststellen, ob SHERLOCK niedrigfrequente Krebsmutationen in zellfreien DNA-Fragmenten (cfDNA) nachweisen kann, was aufgrund der hohen Wildtyp-DNA-Werte im Patientenblut eine Herausforderung darstellt (2325). Wir fanden zuerst, dass SHERLOCK ssDNA 1 in attomolaren Konzentrationen, verdünnt in einem Hintergrund von gDNA, nachweisen konnte (Abb. S13A). Als nächstes fanden wir, dass SHERLOCK auch SNP-haltige Allele (Abb. S13, B und C) in Konzentrationen von nur 0,1 % der Hintergrund-DNA nachweisen konnte, was im klinisch relevanten Bereich liegt. Wir zeigten dann, dass SHERLOCK zwei verschiedene Krebsmutationen, EGFR L858R (L, Leu R, Arg) und BRAF V600E (V, Val E, Glu), in Schein-cfDNA-Proben mit Allelfraktionen von nur 0,1% nachweisen konnte (Abb. 4 .). , C bis F) (13).

Die SHERLOCK-Plattform eignet sich für weitere Anwendungen, darunter (i) allgemeine RNA- und DNA-Quantifizierung anstelle spezifischer qPCR-Assays, wie TaqMan, (ii) schnelle Multiplex-RNA-Expressionserkennung und (iii) andere sensitive Erkennungsanwendungen wie Detektion einer Nukleinsäurekontamination. Darüber hinaus könnte Cas13a möglicherweise Transkripte in biologischen Zusammenhängen erkennen und die allelspezifische Expression von Transkripten oder krankheitsassoziierte Mutationen in lebenden Zellen verfolgen. Wir haben gezeigt, dass SHERLOCK eine vielseitige, robuste Methode ist, die schnell einzelne DNA- oder RNA-Moleküle nachweisen kann und sich für Anwendungen mit Infektionskrankheiten und empfindlicher Genotypisierung eignet. Ein SHERLOCK-Papiertest kann innerhalb weniger Tage für nur 0,61 pro Test (Tabelle S2) mit Zuversicht neu gestaltet und synthetisiert werden, da fast jede getestete crRNA zu einer hohen Sensitivität und Spezifität führte. Diese Eigenschaften unterstreichen die Leistungsfähigkeit von CRISPR-Dx und eröffnen neue Wege für den schnellen, robusten und empfindlichen Nachweis biologischer Moleküle.


Schau das Video: Group 3 - CRISPR-Cas13 (Juli 2022).


Bemerkungen:

  1. Conchobhar

    Ich glaube, Sie haben sich geirrt. Ich bin sicher. Wir müssen diskutieren.

  2. Houston

    Ich kann viel zu diesem Thema sprechen.

  3. Telfer

    Ich entschuldige mich, aber Sie konnten nicht ein bisschen mehr Informationen geben.

  4. Abdul-Jalil

    Congratulations, your thought is very good



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