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Molekulares Klonen – Blunt-End-Restriktionsendonukleasen

Molekulares Klonen – Blunt-End-Restriktionsendonukleasen


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Ich arbeite in einem Mikrobiologielabor, in dem wir viel klonen. Ich habe immer Restriktionsendonukleasen verwendet, um die DNA so zu spalten, dass sie klebrige Enden und keine glatten Enden hat. Ich arbeite derzeit an einem Projekt, das vorschlägt, ein Restriktionsenzym mit stumpfen Enden wie EvoRV zu verwenden und dann ein T-Tailing des Plasmids pl4440 durchzuführen. Meine Frage ist, warum ich mein pcr-Insert nicht mit einem Restriktionsverdau behandle, wie ich es mit dem Plasmid tun würde, wie das Protokoll vorschlägt? Woher weiß ich, dass das Insert Enden hat, die in das Plasmid ligieren können, wenn ich die Restriktionsschnittstellen nicht in die Primer entwerfe?


Um zu wissen, ob die Enden kompatibel sind, siehe kompatible kohäsive Enden (Isoschizomere) von der NEB-Website.

Wenn Sie sich nicht sicher sind, führen Sie eine stumpfe Endligatur durch. Zum Abstumpfen eines klebrigen Endes (Aus den Kommentaren):

Verwenden Sie Klenow- oder Pfu-Polymerase (oder eine beliebige Korrekturlese-/High-Fidelity-Polymerase).

Sie können Taq verwenden, wenn Sie eine TA-Klonierung beabsichtigen.


Grundlagen von Restriktionsenzymen

Was wäre die moderne molekularbiologische Forschung ohne Restriktionsenzyme? Diese Arbeitspferde des Labors stehen seit über 40 Jahren hinter vielen Fortschritten in der biologischen Grundlagenforschung und kommerziellen Anwendungen. Restriktionsenzyme (oder Restriktionsendonukleasen) wurden zuerst in Bakterien identifiziert, wurden aber später in einigen Archaeen gefunden. Im Allgemeinen spalten Restriktionsenzyme doppelsträngige DNA. Jedes Restriktionsenzym erkennt spezifische DNA-Sequenzen und die Spaltung kann je nach Enzym innerhalb der Erkennungssequenz oder in einiger Entfernung erfolgen. Die Erkennungssequenzen sind im Allgemeinen 4 bis 8 Basenpaare (bp) lang, und die Spaltung kann klebrige Enden (5' oder 3' hervorstehende Enden) oder stumpfe Enden (Abbildung 1).

Abbildung 1. Klebrige oder hervorstehende Enden (5′ oder 3′) oder stumpfe Enden, die von spezifischen Restriktionsenzymen produziert werden.

Heute sind etwa 4000 Restriktionsenzyme charakterisiert worden, von denen über 600 kommerziell erhältlich sind. REBASE ist eine nützliche, durchsuchbare Ressource für umfassende und aktuelle Informationen über Restriktionsenzyme, einschließlich Spezifität, Sensitivität und kommerzieller Quellen [1].

Auf dieser Seite:


Molekulares Klonen - Blunt-End-Restriktionsendonukleasen - Biologie

Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) kann verwendet werden, um schnell DNA-Fragmente für die Klonierung zu erzeugen, vorausgesetzt, dass eine geeignete Quelle für Matrizen-DNA existiert und ausreichende Sequenzinformationen bekannt sind, um das Design von Primern zu ermöglichen, die für das gewünschte Amplikon spezifisch sind. Im Gegensatz zum herkömmlichen Klonen bietet die PCR die Möglichkeit, DNA-Fragmente, die in einer komplexen Probe wie genomische DNA in geringer Häufigkeit vorkommen können, oder cDNAs, die seltenen mRNA-Transkripten entsprechen, leicht zu klonen. PCR-Produkte können auf herkömmliche Weise verdaut und ligiert, direkt ligiert (stumpfe oder TA-Enden) oder in ligationsunabhängigen Klonierungs- (LIC) oder nahtlosen Klonierungsanwendungen wie Gibson Assembly ® oder NEBuilder HIFI DNA Assembly (NEBuilderHiFi.com) verwendet werden.

Während einer typischen PCR wird Matrizen-DNA (die die interessierende Region enthält) mit Desoxynukleotiden (dNTPs), einer DNA-Polymerase und Primern gemischt. Primer sind kurze Abschnitte komplementärer DNA, die stromaufwärts der interessierenden Region Basenpaare mit der Matrizen-DNA bilden und als Rekrutierungsstellen für die Polymerase dienen. Die PCR umfasst eine Reihe von Temperaturzyklen, die automatisch durch die Verwendung eines Thermocyclers gesteuert werden, der sowohl die Reaktionstemperatur als auch die Dauer jedes Temperaturschritts genau kontrolliert, um eine effiziente Amplifikation zu gewährleisten (weitere Informationen zur PCR finden Sie unter DNA-Amplifikation).

Für routinemäßige, robuste PCR-Reaktionen OneTaq DNA-Polymerase ist die häufigste Enzymauswahl. Diese Polymerase hinterlässt überwiegend matrizenunabhängige einzelne Adenine (A) am 3'-Ende des PCR-Produkts. Für eine High-Fidelity-PCR sollte eine Korrekturlese-DNA-Polymerase verwendet werden. Solche Enzyme erzeugen keine einzelnen Basenüberhänge und hinterlassen stumpfe Enden. Eine Berücksichtigung der Enden von PCR-Produkten, einschließlich ihres Phosphorylierungsstatus, ist für nachfolgende Klonierungsstrategien wichtig (siehe Endmodifikation). Wenn PCR-Primer Restriktionsenzymstellen enthalten, können die PCR-Produkte auf herkömmliche Weise verdaut und ligiert werden.

Vektormoleküle zum Klonen können auch durch PCR hergestellt werden. In den Primern enthaltene Restriktionsstellen ermöglichen die Erzeugung von klebrigen Enden (Einzelstrangüberhänge), um die Klonierung von Restriktionsfragmenten zu erleichtern. Andernfalls kann ein Vektor mit glatten Enden durch PCR unter Verwendung einer High-Fidelity-Proofreading-Polymerase oder durch Abstumpfen des Einzelbasen-3-Überhangs, der von hergestellt wird, hergestellt werden Taq Polymerase. Die reverse Transkription von RNA zu komplementärer DNA des ersten Strangs (cDNA) gefolgt von PCR (RT-PCR) ermöglicht das Klonen von doppelsträngigen DNA-Molekülen, die den Gentranskripten entsprechen (für mRNA siehe cDNA-Synthese).

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Feature-Artikel

Lesen Sie mehr über die Beziehung zwischen Polymerase-Struktur und -Funktion beim Kopieren von DNA.


Klonstrategien, Teil 3: Stumpfes Klonen

Die stumpfe Klonierung ist eine der einfachsten und vielseitigsten Methoden zur Klonierung von dsDNA in Plasmidvektoren. Es ist einfach, weil der Einsatz mit stumpfen Enden wenig bis gar keine Vorbereitung erfordert. Lesen Sie einen Überblick über das stumpfe Klonen mit Tipps für einen erfolgreichen Klonansatz.

Das Klonen von doppelsträngigen DNA-Molekülen (dsDNA) in Plasmidvektoren ist eine der am häufigsten verwendeten Techniken in der Molekularbiologie. Das Verfahren wird für die Sequenzierung, den Aufbau von Bibliotheken von DNA-Molekülen, die Expression von kodierender und nicht-kodierender RNA und vielen anderen Anwendungen verwendet. Frühere DECODED-Artikel, die online unter www.idtdna.com/DECODED verfügbar sind, haben die Gibson Assembly&Trade-Methode und Cohesive-End-Cloning-Techniken untersucht. Dort finden Sie auch im Artikel: Klonierungsstrategien, Teil 2: Cohesive-End-Klonierung weitere Informationen zu Plasmid-Grundlagen, die für die Leser dieses Artikels von Vorteil sein können. Hier werden wir das Klonen mit glatten Enden als dritte Methode diskutieren, mit der DNA-Fragmente in einen Plasmidvektor kloniert werden können.

Übersicht über das stumpfe Klonen

Das Klonen mit stumpfen Enden beinhaltet das Ligieren von dsDNA in ein Plasmid, in dem sowohl das Insert als auch das linearisierte Plasmid keine überhängenden Basen an ihren Enden aufweisen. Es profitiert nicht von der Stabilisierung der Wasserstoffbrückenbindung, die mit den komplementären überhängenden Basen verbunden ist, die beim Klonen der kohäsiven Enden verwendet werden, aber die vorübergehenden Assoziationen der verfügbaren 5 &rsquo Phosphat- und 3 &rsquo Hydroxylgruppen reichen aus, um in Gegenwart von T4-Ligase erfolgreiche Klone zu erzeugen [1] . Abbildung 1 zeigt ein einfaches Experiment zum Klonen von stumpfen Enden.

Die stumpfe Klonierung ist auch eine der einfachsten und vielseitigsten Methoden zur Klonierung von dsDNA in Plasmidvektoren. Es ist einfach, weil das Insert mit stumpfen Enden wenig bis gar keine Vorbereitung erfordert und den enzymatischen Verdau und die anschließende Reinigung, die für das Klonen mit kohäsiven Enden erforderlich sind, vermeidet. Es ist vielseitig, da Insert und Vektor weniger Sequenzbeschränkungen aufweisen als andere Verfahren. Dies bedeutet, dass das Klonen mit stumpfen Enden einige einzigartige Vorteile und auch Nachteile gegenüber dem Klonen mit kohäsiven Enden und isothermen Montageverfahren hat.

Überlegungen

Es gibt mehrere Faktoren, die das stumpfe Klonen zu einer Herausforderung machen. Es ist 10–100X weniger effizient als das Klonen an kohäsiven Enden, was zu weniger Kolonien führt und die Hälfte dieser rekombinanten Kolonien Inserts in der falschen Orientierung eingebaut haben. Außerdem findet eine starke Rezirkularisierung des Plasmids statt. Sie kann reduziert, aber nicht einfach eliminiert werden, was zu vielen leeren Vektoren führt. Daher sollten Sie bei dieser Methode vor der Sequenzverifizierung ein Screening durch Restriktionsverdau oder PCR durchführen.

Ein großer Vorteil der stumpfen Endklonierung besteht darin, dass das gewünschte Insert keine Restriktionsstellen in der Sequenz benötigt. Dies macht das Klonen von stumpfen Enden äußerst vielseitig, vereinfacht die Planung und vermeidet unerwünschte, künstliche Sequenzergänzungen, die einige Anwendungen nachteilig beeinflussen könnten. Da das Insert nicht durch Restriktionsverdau hergestellt werden muss, hat das Klonen mit glatten Enden das Potenzial, signifikant schneller zu sein.

Tipps für erfolgreiche stumpfe Ligaturen

Vorbereiten des Vektors. Der Vektor kann durch Verdau hergestellt werden, wenn die multiple Klonierungsstelle (MCS) eine Erkennungsstelle für ein Restriktionsenzym enthält, das stumpfe Enden produziert, wie EcoRV ( 1 ). Restriktionsstellen, die Sequenzüberhänge erzeugen, können ebenfalls verwendet werden, gefolgt von einer Entfernung oder Auffüllung der Überhänge, um stumpfe Enden zu erzeugen. Dieser Ansatz wird jedoch nicht empfohlen, da es keine gute Methode zur Beurteilung des Erfolgs der Abstumpfungsreaktion gibt, was die Fehlersuche bei erfolglosen Reaktionen erschwert.

Alternativ kann linearisiertes Plasmid für die stumpfe Klonierung durch Amplifikation mit einer High-Fidelity-Polymerase und anschließende PCR unter Verwendung von Primern hergestellt werden, die mit ihren 5'-Enden an der gewünschten Insertionsstelle entworfen wurden. Das linearisierte Plasmidprodukt erscheint als deutliche Bande auf einem Agarosegel, verglichen mit einem Abstrich, der von der superspiralisierten Plasmidmatrize erzeugt wird, was die Fehlersuche erleichtert. Das zirkuläre Template-Plasmid wird durch Verdau mit DpnI oder einem ähnlichen Restriktionsenzym eliminiert, das das methylierte Plasmid schneidet und das unmethylierte PCR-Produkt zurücklässt

Das Plasmid wird typischerweise für Ligations- und Amplifikationsverfahren dephosphoryliert. Es ist jedoch möglich, diese Anforderung zu vermeiden (siehe Alternative unten).

Gestaltung des Einsatzes. Der stumpfendige Einsatz muss phosphoryliert werden. Wenn Sie Oligonukleotide anlagern oder IDT-gBlocks ®-Genfragmente als Insert verwenden möchten, beachten Sie, dass diese nicht mit 5 &mgr;-Phosphatgruppen synthetisiert werden, es sei denn, dies wird angefordert. Alternativ können Phosphate mit einer einfachen Kinase-Reaktion an die 5'-Enden der dsDNA angefügt werden, beispielsweise unter Verwendung der kommerziell erhältlichen T4-Polynukleotid-Kinase. Dieses Verfahren ist jedoch weniger effizient, insbesondere wenn andere Basen als G Kinase-Ziele sind.

Wenn die Enden des Einsatzes nicht stumpf sind, ist eine Polier- oder Füllreaktion erforderlich. Beispiele für Enden, die poliert oder gefüllt werden müssen, umfassen Inserts, die durch Scheren oder Beschallen erzeugt werden, oder durch Taq-Polymerase, die vorzugsweise einen einzelnen Adenosin-Überhang an den 3 & rsquo-Enden hinterlässt, Inserts, die durch Restriktionsverdau hergestellt werden, und einige Inserts, die durch Annealing mehrerer Oligonukleotide hergestellt werden, um längere Produkte zu erzeugen. Eine Reihe von DNA-Polymerasen entfernt DNA-Überhänge und/oder kann verwendet werden, um fehlende Basen aufzufüllen, wenn ein 3&mgr;rsquo Hydroxyl zum Priming verfügbar ist. Polymerasen für solche Reaktionen umfassen T4-DNA-Polymerase, PFU und das Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I. Es stehen viele Optionen und Kits zur Verfügung. Erkundigen Sie sich daher bei den Herstellern, welche für Ihre Anwendung am besten geeignet ist.

Wie bei anderen Klonierungsverfahren ligieren kürzere Inserts normalerweise effizienter als längere. Hersteller geben in der Regel Größenempfehlungen für Plasmid-Inserts in die Plasmid-Dokumentation als nützliche Anleitung bei der Planung Ihres Klonierungsexperiments ein.

Schließlich erzeugt die Klonierung mit stumpfen Enden im Gegensatz zur Klonierung mit kohäsiven Enden nicht automatisch eine Restriktionsstelle nach der Ligation des Inserts, es sei denn, Basen werden zu der Insertsequenz hinzugefügt, um die fehlende Stelle zu vervollständigen ( 1 ).

Bedingungen für die Ligatur. Bei Ligationen mit stumpfen Enden ist die Assoziation von 5'-Phosphatgruppen und 3'-Hydroxylgruppen vorübergehender als bei Ligationen mit kohäsiven Enden. Da ihnen die Wasserstoffbindungsstabilisierung der kohäsiven Enden fehlt, sind Ligationen mit glatten Enden empfindlicher gegenüber Reaktionsbedingungen, insbesondere gegenüber den Konzentrationen der Reaktionskomponenten.

Die Wahrscheinlichkeit einer Assoziation eines Inserts mit einem linearisierten Plasmid wird durch eine hohe Konzentration an verfügbaren glatten Enden des Inserts erhöht. Die intramolekulare Zirkularisierung des Plasmids, nachdem ein Ende des Inserts verbunden wurde, funktioniert jedoch am besten bei niedrigeren Konzentrationen. Zu hohe Insertkonzentrationen oder zu hohe DNA-Gesamtkonzentrationen können zu Plasmiden mit mehreren Inserts oder Konkatemeren führen. Obwohl dies nicht immer notwendig ist, führen einige Forscher eine kurze 1-stündige Inkubation mit hohen Konzentrationen an Insert und Ligase durch, verdünnen dann die Reaktion 20X mit Ligasepuffer und lassen die Ligation weitere 4 Stunden laufen, um den zweiten Schritt der Ligation zu erleichtern Reaktion [1].

Die Qualität und Konzentration der T4-Ligase sind ebenfalls wichtig. Ligationen mit stumpfen Enden finden typischerweise in Gegenwart von höheren Konzentrationen an Ligase statt als Ligationen mit kohäsiven Enden. Während beispielsweise eine Ligation mit kohäsiven Enden 1 Einheit T4-Ligase/20 &mgr;-Reaktion verwenden kann, kann eine stumpfe Reaktion bis zu 3 Einheiten/20 &mgr;-Reaktion verwenden. Kommerziell erhältliche T4-Ligasen geben in der Regel an, ob sie für Blunt-End-Ligationen optimiert sind oder nicht. Befolgen Sie die Richtlinien des Herstellers, um zu bestimmen, welche Ligase für Ihr Klonierungsexperiment und welche Konzentration geeignet ist. Beachten Sie, dass die Taq-Ligase sowie einige andere Ligasen keine stumpfen Enden ligieren.

Eine alternative stumpfe Methode. Wie bereits erwähnt, wird die zur Linearisierung des Vektors verwendete stumpfe Restriktionsstelle, sofern das Insert nicht mit den notwendigen Basen zur Wiederherstellung der Restriktionsstelle entworfen wurde, normalerweise nicht durch die Ligation des Inserts wiederhergestellt ( 1 ). Dies ermöglicht ein alternatives, weniger verbreitetes Klonierungsverfahren mit stumpfen Enden, das keine Dephosphorylierung des Vektors erfordert. Stattdessen beruht es auf konkurrierenden Verdauungs- und Ligationsreaktionen, um den Hintergrund des leeren Vektors zu verringern.

Bei diesem Verfahren werden das zirkularisierte Plasmid und das Insert in eine Reaktionsmischung gegeben, die das stumpfe Enden&minus-produzierende Restriktionsenzym sowie die T4-Ligase enthält. Das zirkuläre Plasmid wird geschnitten und das Insert in einer Einzelröhrchen-Reaktion ligiert. Leeres Plasmid, das durch T4-Ligation hergestellt wird, wird anschließend durch das Restriktionsenzym erneut geschnitten. Solange das Insert nicht dazu bestimmt ist, diese spezifische Restriktionsstelle zu erzeugen, sollten alle zirkularisierten Plasmide das gewünschte Insert enthalten. Einzelheiten zu dieser Methode, die auch mit einer Polierenzymkomponente beschrieben wird, finden sich bei Sambrook und Russell [1]. Ein Grund, warum Forscher diese Technik möglicherweise vermeiden möchten, besteht darin, dass mehrere optimierte Enzympuffer gemischt werden, was die Aktivität einzelner Enzyme beeinträchtigen kann. Erkundigen Sie sich bei den Enzymherstellern, ob Ihre ausgewählten Enzyme mit dieser Methode kompatibel sind.


Molekulares Klonen: Ein Laborhandbuch (Vierte Edition)

Molekulares Klonen dient seit 30 Jahren als Grundlage für technisches Know-how in Laboren weltweit. Kein anderes Handbuch war so beliebt und einflussreich. Molekulares Klonen, Vierte Ausgabe des gefeierten Gründungsautors Joe Sambrook und des neuen Co-Autors, des angesehenen HHMI-Ermittlers Michael Green, bewahrt die hochgelobten Details und Klarheit früherer Ausgaben und enthält spezifische Kapitel und Protokolle, die für das Buch von erfahrenen Praktikern in Yale in Auftrag gegeben wurden. U Mass, Rockefeller University, Texas Tech, Cold Spring Harbor Laboratory, Washington University und anderen führenden Institutionen. Die theoretischen und historischen Grundlagen der Techniken sind durchweg hervorstechende Merkmale der Präsentation, Informationen, die viel dazu beitragen, experimentelle Probleme zu beheben.

Für die vierte Auflage dieses Klassikers wurde der Inhalt komplett umgestaltet, um Nukleinsäure-basierte Methoden aufzunehmen, die als die am häufigsten verwendeten und wertvollsten in molekular- und zellbiologischen Laboratorien ausgewählt wurden.

Kernkapitel der dritten Auflage wurden überarbeitet, um aktuelle Strategien und Ansätze zur Herstellung und Klonierung von Nukleinsäuren, Gentransfer und Expressionsanalyse zu präsentieren. Ergänzt werden sie durch 12 neue Kapitel, die zeigen, wie DNA, RNA und Proteine ​​präpariert, ausgewertet und manipuliert werden und wie Datengenerierung und -analyse gehandhabt werden können.

Zu den neuen Inhalten gehören Methoden zur Untersuchung von Wechselwirkungen zwischen zellulären Komponenten, wie Microarrays, Sequenzierungstechnologien der nächsten Generation, RNA-Interferenz und epigenetische Analysen mit DNA-Methylierungstechniken und Chromatin-Immunpräzipitation. Um die Fülle an Daten zu verstehen, die durch diese Techniken erzeugt werden, beschreibt ein Bioinformatik-Kapitel die Verwendung von Analysewerkzeugen zum Vergleichen von Sequenzen von Genen und Proteinen und zum Identifizieren gemeinsamer Expressionsmuster zwischen Gengruppen.

Aufbauend auf dreißig Jahren Vertrauen, Verlässlichkeit und Autorität ist die vierte Ausgabe von Molekulares Klonen ist der neue Goldstandard, die einzige unverzichtbare Laboranleitung und Referenzquelle für die Molekularbiologie.

Highlights der Neuauflage:

  • Umfangreiche neue Inhalte: 12 völlig neue Kapitel widmen sich den spannendsten aktuellen Forschungsstrategien, darunter epigenetische Analyse, RNA-Interferenz, Genomsequenzierung und Bioinformatik
  • Erweiterter Anwendungsbereich: Die für die Aufnahme ausgewählten Nukleinsäure-basierten Techniken haben die jüngsten Fortschritte beim Gentransfer, der Proteinexpression, der RNA-Analyse und der Expression klonierter Gene gefördert
  • Klassischer Inhalt: 10 ursprüngliche Kernkapitel wurden aktualisiert, um Entwicklungen und Innovationen bei Standardtechniken widerzuspiegeln und neue, hochmoderne Protokolle einzuführen
  • Übersichtliches Format: Die bekannte Liebe zum Detail und die Genauigkeit der Vorgängerausgaben bleiben vollständig erhalten
  • Wesentliche Anhänge: Eine aktuelle Sammlung von Reagenzien, Vektoren, Medien, Nachweissystemen und häufig verwendeten Techniken ist enthalten
  • Erweiterte Autorenschaft: Kapitel und Protokolle wurden gezielt bei renommierten Experten führender Institutionen in Auftrag gegeben

Lob für die vorherige Ausgabe:

“Jedes Grundlagenforschungslabor, das molekularbiologische Techniken verwendet, wird davon profitieren, ein Exemplar der neu veröffentlichten dritten Ausgabe von . zur Hand zu haben Molekulares Klonen: Ein Laborhandbuch. die ersten beiden Auflagen dieses Buches waren Grundnahrungsmittel der Molekularbiologie mit einem bewährten Ruf für Genauigkeit und Gründlichkeit.” —Der Wissenschaftler

“In jeder Küche gibt es mindestens ein unverzichtbares Kochbuch. Molekulares Klonen: Ein Laborhandbuch füllt die gleiche Nische im Labor (mit) Informationen, um sowohl dem unerfahrenen als auch dem fortgeschrittenen Benutzer zu helfen. (Es) hat als molekulares Laborhandbuch wieder einmal seinen Vorrang etabliert und dürfte auf Labortischen zu finden sein. auf der ganzen Welt.” ——Trends in den Neurowissenschaften

“Molekulares Klonen: Ein Laborhandbuch ist seit jeher die tragende Säule des Labors für Protokolle und Techniken. Es hat eine reinrassige Abstammung, und die Neuauflage enttäuscht nicht. (Es) enthält Informationstafeln am Ende jedes Kapitels, die die Prinzipien hinter den Protokollen beschreiben. Das Hinzufügen dieser Informationen verlängert Molekulares Klonen von einer essentiellen Laborressource in einen neuen Bereich, der den vorherigen Prototyp mit einer modernen molekularen Monographie verschmilzt. die nächste Generation von Molekulares Klonen führt nicht nur das stolze Erbe der ersten beiden Ausgaben fort, sondern erweitert diese Tradition auch in bewundernswerter Weise zu einem wirklich unverzichtbaren Laborhandbuch.” —Trends in der Mikrobiologie


In-vitro-Verbindung von DNA zu rekombinanten Molekülen

Beschränkung Endonukleasenan definierten Sequenzen von (normalerweise) 4 oder 6 bp geschnitten. Dadurch kann die interessierende DNA an bestimmten Stellen geschnitten werden. Die physiologische Funktion von Restriktionsendonukleasen besteht darin, als Teil eines Systems zu dienen, um Bakterien vor dem Eindringen von Viren oder anderen Organismen zu schützen. (Siehe Kapitel 7)

Tabelle 3.1. Liste der Restriktionsendonukleasen und ihrer Schnittstellen. Ein ' bedeutet, dass die Nuklease zwischen diesen 2 Nukleotiden schneidet, um ein 3'-Hydroxyl und ein 5'-Phosphat zu erzeugen.
Enzym Seite? ˅ Enzym Seite? ˅
Aluich AG'CT Nichtich GC'GGCCGC
BamHI G'GATCC PSTich CTGCA'G
BglII A'GATCT PvuII CAG'CTG
ÖkoRI G'AATTC Salich G'TCGAC
HaeIII GG'CC Sau3AI 'GATC
Hhaich GCG'C Smaich CCC'GGG
HincII GTY'RAC Speich A'CTAGT
HindIII A'AGCTT Taqich T'CGA
HinfI G'ANTC Xbaich T'CTAGA
HpaII C'CGG Xhoich C'TCGAG
Kpnich GGTAC'C Weihnachtenich C'CCGGG
Mboich 'GATC

A. Klebrige Enden

(1) Da die Erkennungssequenzen für Restriktionsendonukleasen Pseudopalindrome sind, erzeugt eine außermittige Spaltung in der Erkennungsstelle entweder einen 5'-Überhang oder einen 3'-Überhang mit selbstkomplementären (oder "klebrigen") Enden.

z.B. 5' Überhang EcoRI G'AATTC

(2) Wenn die Enden der Restriktionsfragmente komplementär sind,

die Enden können aneinander glühen. Beliebige zwei Fragmente, unabhängig von ihrer Herkunft (tierisch, pflanzlich, pilzartig, bakteriell) können in vitro zu rekombinanten Molekülen verbunden werden (Abbildung 3.3).

B. Stumpfe Enden

(1) Die Restriktionsendonuklease spaltet im Zentrum der pseudopalindromischen Erkennungsstelle, um stumpfe (oder bündige) Enden zu erzeugen.

T4-DNA-Ligase wird verwendet, um DNA-Fragmente zusammenzubinden (Abbildung 3.4). Beachten Sie, dass die angelagerten "klebrigen" Enden der Restriktionsfragmente Kerben(normalerweise 4 bp auseinander). Nicks sind Brüche im Phosphodiester-Rückgrat, aber alle Nukleotide sind vorhanden. Lückenin einem Strang fehlt eine Nukleotidkette.

Die T4-DNA-Ligase verwendet ATP als Quelle für die Adenylylgruppe, die an das 5'-Ende des Nicks gebunden ist, was nach dem Angriff durch das 3'-OH eine gute Abgangsgruppe ist. (Siehe Kapitel 5 zur Replikation).

Bei hoher Konzentration an DNA-Enden und Ligase kann das Enzym auch stumpfe DNA-Fragmente miteinander ligieren. Somit können zwei beliebige Fragmente mit glatten Enden zusammenligiert werden. Hinweis: Jedes Fragment mit einem 5'-Überhang kann durch eine durch eine DNA-Polymerase katalysierte Fill‑in-Synthese (oft das Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I) leicht in ein stumpfes Molekül umgewandelt werden. Dann kann es mit einem anderen stumpfen Fragment ligiert werden.

Linker sind kurze Duplex-Oligonukleotide, die eine Restriktionsendonuklease-Schnittstelle enthalten. Sie können an jedes Molekül mit glatten Enden ligiert werden, wodurch eine neue Restriktionsschnittstelle an den Enden des Moleküls erzeugt wird. Die Ligation eines Linkers an ein Restriktionsfragment gefolgt von der Spaltung mit der Restriktionsendonuklease ist einer von mehreren Wegen, um ein Ende zu erzeugen, das leicht an ein anderes DNA-Fragment zu ligieren ist.

Glühen von Homopolymer Schwänze sind eine weitere Möglichkeit, zwei verschiedene DNA-Moleküle zu verbinden.

Das Enzym terminales Desoxynukleotidyl Transferasekatalysiert die Addition einer Nukleotidkette an das 3'-Ende eines DNA-Fragments. Somit kann man durch Inkubieren jedes DNA-Fragments mit dem geeigneten dNTP und der terminalen Desoxynukleotidyl-Transferase komplementäre Homopolymere an die Enden der DNAs anfügen, die man kombinieren möchte. Beispielsweise kann man eine Kette von Gs an die 3'-Enden eines Fragments und eine Kette von Cs an die 3'-Enden des anderen Fragments anfügen. Nun verbinden sich die beiden Fragmente über die Homopolymerschwänze.

Abbildung 3.5. Verwendung von Linkern (links) und Homopolymerschwänzen (rechts) zur Herstellung rekombinanter DNA-Moleküle.


ANWENDUNGEN UND BEDEUTUNG VON ENZYMEN, DIE IN MOLEKULARBIOLOGISCHEN EXPERIMENTEN VERWENDET WERDEN

EINSCHRÄNKUNG ENDONUCLEASE: Restriktionsendonukleasen sind Enzyme, die Nukleinsäuren (einschließlich DNA- und RNA-Moleküle) an bestimmten Stellen schneiden. Mit Restriktionsenzymen oder Endonukleasen können Molekularbiologen DNA präzise und reproduzierbar schneiden oder einschneiden, was für Genklonierungstechniken und andere molekularbiologische Experimente entscheidend ist. Restriktionsendonukleasen sind DNA-schneidende Enzyme, die spezifisch gefunden und aus Bakterien isoliert wurden und die spezifische Stellen auf einer Nukleotidsequenz, bekannt als Restriktionsstellen. Restriktionsstellen sind die verschiedenen Stellen auf einem DNA-Molekül, das von einem bestimmten Restriktionsenzym gespalten wird. Es gibt mehrere Arten von Restriktionsenzymen, die hauptsächlich aus Mikroorganismen (insbesondere Bakterien) stammen, aber auch chemisch synthetisiert werden können. Restriktionsenzyme oder Endonukleasen werden normalerweise in drei (3) Gruppen unterteilt, nämlich: Typ I, Typ II, und Typ III Restriktionsenzyme (RE). REs vom Typ I und vom Typ III binden an das Nukleinsäuremolekül an ihren Erkennungssequenzen, aber sie spalten spezifisch das DNA-Molekül in einer beträchtlichen Entfernung von den Restriktionsstellen. REs vom Typ II sind jedoch viel besser für eine Vielzahl von molekularbiologischen Manipulationen geeignet, da sie DNA-Moleküle genau an ihren Restriktionsstellen schneiden.

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Einige Beispiele für Restriktionsenzyme sind ÖkoRI (von E coli), HaeIII (von Haemophilus aegyptius), BamHI (von Bacillus amyloliquefaciens), Pvuich (von Proteus vulgaris), HindII (von Haemophilus influenzae)und Sau3A (von S. aureus) unter anderem. Die Nomenklatur von Restriktionsendonukleasen ist ziemlich einfach. Restriktionsenzyme werden im Allgemeinen nach den Bakterien benannt, aus denen sie tatsächlich isoliert wurden. Die ersten drei Alphabete im Namen eines Restriktionsenzyms repräsentieren den Gattungs- und Speziesnamen des Bakteriums, während die restlichen Alphabete oder Zahlen, die an den Namen angehängt sind, die Entdeckungsreihenfolge der Enzyme in diesem speziellen Organismus darstellen. Diese späteren Alphabete oder Zahlen (üblicherweise in römischen Ziffern) können auch die Stammbezeichnung der Restriktionsendonukleasen und den Typ darstellen. Zum Beispiel, ÖkoRI ist E coli Restriktionsenzym I. Restriktionsendonukleasen werden in vielen molekularbiologischen Techniken verwendet, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Genklonierung, Genamplifikation, DNA-Sequenzierung und in Blotting-Techniken.

ALKALISCHE PHOSPHATASE: Alkalische Phosphatase ist ein Enzym, das von Organismen wie E coli und das Darmgewebe des Kalbs, und das die Phosphatgruppe entfernt, die am 5′ -Ende eines DNA-Moleküls vorhanden ist. Es entfernt spezifisch Phosphatgruppen vom 5′-Terminus der DNA, um den 5′-OH-Terminus zu ergeben, der sich mit dem 3′-Ende des Vektors verbinden kann, der eine exogene DNA in eine Empfänger-Wirtszelle transportiert. Somit wird eine ungewollte Religation oder Wiedervereinigung von bereits eingekerbten oder geschnittenen DNA-Molekülen verhindert.

DNA-LIGASE: DNA-Ligase ist ein Enzym, das geschnittene (eingeschnittene) DNA-Moleküle spezifisch miteinander verbindet. Sie reparieren und verbinden zwei einzelne einzelsträngige DNA-Fragmente (d. h. den Klonierungsvektor und das zu klonierende DNA-Molekül), die von derselben Restriktionsendonuklease geschnitten wurden. Die Ligation, die durch das DNA-Ligase-Enzym durchgeführt wird, ist normalerweise der letzte Schritt in der Genklonierungstechnik vor der Transformation der Empfänger-Bakterienzelle. Die Verbindung des zu klonierenden DNA-Moleküls mit dem Vektor führt zur Bildung eines neuen Moleküls, das als rekombinantes DNA-Molekül (rDNA) bekannt ist. Rekombinantes DNA-Molekül ist ein DNA-Molekül, das durch die Ligation eines Vektors mit einem geschnittenen DNA-Molekül entsteht, und dies geschieht normalerweise in einem Reagenzglas, wo die geschnittene DNA, der Vektor und die DNA-Ligase-Enzyme miteinander vermischt werden, damit die Reaktion abläuft. Bei der Genklonierungstechnik sollte beispielsweise das gleiche Restriktionsenzym, das zum Schneiden der interessierenden DNA verwendet wird, verwendet werden, um das Vehikel oder den Vektor zu schneiden, der das interessierende Gen in die Empfänger-Wirtszelle tragen soll. Die Verwendung des gleichen Restriktionsenzyms für das Schneiden oder Schneiden stellt sicher, dass ein Teil nicht abnormal geschnitten wird, sondern gleichermaßen eingeschnitten wird, damit sie richtig ligiert oder durch das DNA-Ligase-Enzym verbunden werden können, das hauptsächlich aus einem genetisch veränderten Enzym stammt E coli.

Taq POLYMERE: Taq-Polymerase-Enzym ist ein hitzestabiles DNA-Polymerase-Enzym, das aus thermostabilen Bakterien (insbesondere Thermus aquaticus) und wird in PCR-Techniken verwendet, um Primer entlang des einzelsträngigen DNA-Moleküls in Richtung 5′-3′ zu verlängern.

DNA-POLYMERASE I: DNA-Polymerase I ist ein Enzym, das DNA-Moleküle komplementär zu einer DNA-Matrize in der Richtung 5′-3′ synthetisiert. Es synthetisiert im Allgemeinen DNA auf einer DNA- oder RNA-Matrize. Die DNA-Polymerase I beginnt normalerweise mit einem Oligonukleotid-Primer mit einem 3′ OH-Terminus und wird verwendet, um die Oligonukleotid-Primer entlang der einzelsträngigen DNA-Moleküle zu verlängern. DNA-Polymerasen werden synthetisiert durch E coli, und sie führen eine ähnliche Aktivität wie das Taq-Polymerase-Enzym aus. Sie bilden Basenpaare und polymerisieren die wachsenden DNA-Stränge, bis die Terminationsstelle erreicht ist.

RNase-ENZYM: Das RNase-Enzym ist ein Nuklease-Enzym, das RNA verdaut.

DNase-ENZYM: Das DNase-Enzym ist ein Nuklease-Enzym, das DNA verdaut.

Nukleasen: Nukleasen sind abbauende Enzyme, die Nukleinsäuren (einschließlich DNA und RNA) schneiden, verkürzen und abbauen. Sie werden normalerweise in PCR-Reaktionen und anderen molekularbiologischen Experimenten verwendet, um Nukleinsäuremoleküle zu verdauen.

Alberts B, Bray D, Lewis J, Raff M, Roberts K und Watson J. D (2002). Die Molekularbiologie der Zelle. Vierte Edition. New York, Girlande, USA.

Cooper G. M. und Hausman R. E. (2004). Die Zelle: Ein molekularer Ansatz. Dritte Edition. ASM-Presse.

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Robert L. Nussbaum, Roderick R. McInnes und Huntington F. Willard (2001). Genetik in der Medizin. Philadelphia, USA. Saunders-Verlage.

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Twyman R. M. (1998). Fortgeschrittene Molekularbiologie: Eine knappe Referenz. Bios Scientific Publishers. Oxford, Großbritannien.


Was ist der Unterschied zwischen klebrigen Enden und stumpfen Enden?

Restriktionsenzyme halbieren doppelsträngige DNA. Je nach Restriktionsenzym kann der Schnitt entweder zu a klebriges Ende oder ein stumpfes Ende. Klebrige Enden sind beim molekularen Klonen nützlicher, weil sie sicherstellen, dass das menschliche DNA-Fragment in der richtigen Richtung in das Plasmid eingefügt wird.

Wofür werden stumpfe Enden außer oben verwendet? Stumpfe Enden keinen Überhang haben. Sie können nicht so spezifisch wie DNA mit klebrigen . übereinstimmen endet Sie können jedoch nützlich sein, wenn sie klebrig sind endet kann nicht sein Gebraucht. SmaI ist ein Restriktionsenzym, das stumpfe Enden.

Also, was ist der Unterschied zwischen Blunt Ends und Sticky Ends Quizlet?

Klebrige Enden sind, wenn die Enzyme versetzte Schnitte machen in dem zwei Stränge. Schnitte, die sich nicht direkt gegenüberliegen. Klebrige Enden sind in rDNA am nützlichsten, weil sie verwendet werden können, um zwei zu verbinden unterschiedlich DNA-Stücke, die mit dem gleichen Restriktionsenzym geschnitten wurden.

Wie konvertiert man stumpfe Enden in klebrige Enden?

Unverblümt und Klebrige Enden kann inter sein umgewandelt entweder durch Hinzufügen von kognitiven Restriktionsstellen oder durch Entfernen einiger von ihnen. Stumpfes Ende sind umgewandelt hinein Klebriges Ende vor dem Klonen.


Methoden

Zelllinien und Medien

Die E coli HB101 wurde zur Herstellung von Plasmid-DNA verwendet. Die Bakterien wurden in Luria-Bertani (LB)-Medien kultiviert. Humane embryonale Nieren (HEK) 293 T-Zellen wurden in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), ergänzt mit 10 % hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS), 1 mM Natriumpyruvat, 0,1 mM nicht-essentielle Aminosäuren, 2 mM L-Glutamin, kultiviert. 100 mg/ml Streptomycin und 100 Einheiten/ml Penicillin. Eine myeloische Leukämie-Zelllinie C1498 [52] wurde in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-Medium kultiviert, das mit den gleichen Reagenzien ergänzt wurde, die für DMEM verwendet wurden. Die Zellen wurden jeden zweiten Tag geteilt, um sie in der Log-Phase zu halten.

Plasmide, Primer, PCR und Sequenzierung

Ein Plasmid, das die kodierende Sequenz des tdTomato-Gens enthält, ein Plasmid, das einen alpha-retroviralen Vektor enthält, und Plasmide, die codon-optimiertes alpharetrovirales gag/pol enthalten [53] wurden freundlicherweise von Axel Schambach (MHH Hannover, Deutschland) bereitgestellt. Ein vorwärts (5'- ACCGGTGCCACCATGGCCACAACCATGGTG-3') und ein reverser (5'-GTCGACTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3') Primer, die für die Amplifikation des tdTomato-Gens verwendet wurden, wurden von Eurofins Genomics (Ebersberg, Deutschland) synthetisiert.

Die optimalen Puffer für Enzyme oder andere Reagenzien wurden von den Herstellern zusammen mit den entsprechenden Enzymen oder in den Kits bereitgestellt. Falls von den Herstellern verfügbar, werden der pH-Wert und die Inhaltsstoffe der Puffer angegeben. Primer wurden in Reinstwasser mit einer Stammkonzentration von 20 pmol/μl gelöst. Das Template-Plasmid wurde in Wasser auf eine Stammkonzentration von 50 ng/μl verdünnt. For PCR, the following reagents were mixed and filled up with water to a total volume of 50 μl: 1 μl plasmid DNA (1 ng/μl final concentration), 1.25 μl of each primer (0.5 pmol/μl final concentration for each primer), 1 μL dNTP (10 mM each), 10 μl of 5X Phusion HF buffer (1X buffer provides 1.5 mM MgCl2), and 0.5 μl Phusion DNA polymerase (2U/μl, Thermo Scientific).

PCR was performed using a peqSTAR thermocycler (PEQLAB Biotechnologie) at: 98°C for 3 minutes 25 cycles at 98°C for 10 seconds, 66°C for 30 seconds, 72°C for 30 seconds and 72°C for 10 minutes. To prepare a 0.8% agarose gel, 0.96 g agarose (CARL ROTH) was dissolved in 120 ml 1X TAE buffer (40 mM Tris, 20 mM acetic acid, 1 mM EDTA, pH of 50X TAE: 8.4) and boiled for 4 minutes. Then 3 μl SafeView nucleic acid stain (NBS Biologicals) was added to the solution and the mixture was poured into a gel-casting tray.

DNA was mixed with 10 μl loading dye (6X) (Thermo Scientific) and loaded on the agarose gel (CARL ROTH) using 80 V for one hour in TAE buffer. The separated DNA fragments were visualized using an UV transilluminator (365 nm) and quickly cut to minimize the UV exposure. DNA was extracted from the gel slice using Zymoclean™ Gel DNA Recovery Kit (Zymo Research). The concentration of DNA was determined using a NanoDrop 2000 spectrophotometer (Thermo Scientific).

For sequence validation, the PCR product was subcloned using CloneJET PCR cloning kit (Thermo Scientific). 1 μl of blunt vector (50 ng/μl), 50 ng/μl of the PCR product, and 10 μl of 2X reaction buffer (provided in the kit) were mixed and filled with water to a total volume of 20 μl. 1 μl of T4 DNA ligase (5 U/μl) was added to the mixture, mixed and incubated at room temperature for 30 minutes. For bacterial transfection, 10 μl of the mixture was mixed with 100 μl of HB101 E coli competent cells and incubated on ice for 45 minutes. Then the mixture was heat-shocked (42°C/2 minutes), put on ice again (5 minutes), filled up with 1 ml LB medium and incubated in a thermomixer (Eppendorf) for 45 minutes/37°C/450RPM. Then the bacteria were spun down for 4 minutes. The pellet was cultured overnight at 37°C on an agarose Petri dish containing 100 μg/mL of Ampicillin. The day after, colonies were picked and cultured overnight in 3 ml LB containing 100 μg/mL of ampicillin.

After 16 hours (overnight), the plasmid was isolated from the cultured bacteria using the QIAprep spin miniprep kit (QIAGEN) according to the manufacturer’s instructions. 720 to 1200 ng of plasmid DNA in a total of 12 μl water were sent for sequencing (Seqlab) in Eppendorf tubes. The sequencing primers pJET1.2-forward (5′-CGACTCACTATAGGGAG-3′), and pJET1.2-reverse (5′-ATCGATTTTCCATGGCAG-3′), were generated by the Seqlab Company (Göttingen, Germany). An ABI 3730XL DNA analyzer was used by the Seqlab Company to sequence the plasmids applying the Sanger method. Sequence results were analyzed using NCBI Blast as explained in the Results and discussion section.

Manipulation of DNA fragments

For viewing plasmid maps, Clone Manager suite 6 software (SciEd) was used. Restriction endonuclease enzymes (Thermo Scientific) were used to cut plasmid DNA. 5 μg plasmid DNA, 2 μl buffer O (50 mM Tris–HCl (pH 7.5 at 37°C), 10 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0.1 mg/mL BSA, Thermo Scientific), 1 μl SalI (10 U), and 1 μl AgeI (10 U) were mixed in a total of 20 μl water and incubated (37°C) overnight in an incubator to prevent evaporation and condensation of water under the tube lid. The next day, DNA was mixed with 4 μl loading dye (6X) (Thermo Scientific) and run on a 0.8% agarose gel at 80 V for one hour in TAE buffer. The agarose gel (120 ml) contained 3 μl SafeView nucleic acid stain (NBS Biologicals). The bands were visualized on a UV transilluminator (PEQLAB), using a wavelength of 365 nm, and quickly cut to minimize the UV damage. DNA was extracted from the gel slices using the Zymoclean™ gel DNA recovery kit (Zymo Research). The concentration of DNA was determined using a NanoDrop 2000 spectrophotometer (Thermo Scientific).

For the ligation of vector and insert fragments, a ligation calculator was designed (the Excel file available in the Additional file 1) for easy calculation of the required insert and vector volumes. The mathematical basis of the calculator is inserted into the excel spreadsheet. The size and concentration of the vector and insert fragments and the molar ratio of vector/insert (normally 1:3) must be provided for the calculation. Calculated amounts of insert (tdTomato) and vector (alpha-retroviral backbone) were mixed with 2 μl of 10X T4 ligase buffer (400 mM Tris–HCl, 100 mM MgCl2, 100 mM DTT, 5 mM ATP (pH 7.8 at 25°C), Thermo Scientific), 1 μl of T4 ligase (5 U/μl, Thermo Scientific), filled up to 20 μl using ultrapure water and incubated overnight at 16°C. The day after, HB101 E coli was transfected with the ligation mixture as mentioned above. The clones were picked and consecutively cultured for one day in LB medium containing ampicillin. Plasmid DNA was isolated using Zyppy™ plasmid miniprep kit (Zymo Research) and digested with proper restriction enzymes for screening. Digested plasmids were mixed with the loading dye and run on an agarose gel as mentioned above. The separated DNA fragments were visualized using a Gel Doc™ XR+ System (BIO-RAD) and analyzed by the Image Lab™ software (BIO-RAD). The positive clone was cultured overnight in 450 ml LB medium containing ampicillin. Plasmid DNA was isolated using QIAGEN plasmid maxi kit (QIAGEN), diluted in ultrapure water and stored at −20°C for later use.

Production of viral supernatant and transduction of cells

HEK293T cells were thawed, split every other day for one week and grown in log phase. The day before transfection, 3.5 × 10 6 cells were seeded into tissue culture dishes (60.1 cm 2 growth surface, TPP). The day after, the cells use to reach about 80% confluence. If over confluent, transfection efficiency decreases. The following plasmids were mixed in a total volume of 450 μl ultrapure water: codon-optimized alpharetroviral gag/pol (2.5 μg), VSVG envelope (1.5 μg), and the alpharetroviral vector containing the tdTomato gene (5 μg). Transfection was performed using calcium phosphate transfection kit (Sigma-Aldrich). 50 μl of 2.5 M CaCl2 was added to the plasmid DNA and the mixture was briefly vortexed. Then, 0.5 ml of 2X HEPES buffered saline (provided in the kit) was added to a 15 ml conical tube and the calcium-DNA mixture was added dropwise via air bubbling and incubated for 20 minutes at room temperature. The medium of the HEK293T cells was first replaced with 8 ml fresh medium (DMEM containing FCS and supplement as mentioned above) containing 25 μM chloroquine. Consecutively the transfection mixture was added. Plates were gently swirled and incubated at 37°C. After 12 hours, the medium was replaced with 6 ml of fresh RPMI containing 10% FCS and supplements. Virus was harvested 36 hours after transfection, passed through a Millex-GP filter with 0.22 μm pore size (Millipore), and used freshly to transduce C1498 cells. Before transduction, 24 well plates were coated with retronectin (Takara, 280 μl/well) for 2 hours at room temperature. Then, retronectin was removed and frozen for later use (it can be re-used at least five times) and 300 μl of PBS containing 2.5% bovine serum albumin (BSA) was added to the wells for 30 minutes at room temperature. To transduce C1498 cells, 5 × 10 4 of cells were spun down and resuspended with 1 ml of fresh virus supernatant containing 4 μg/ml protamine sulfate. The BSA solution was removed from the prepared plates and plates were washed two times with 0.5 ml PBS. Then cells were added to the wells. Plates were centrifuged at 2000RPM/32°C/90 minutes. Fresh medium was added to the cells the day after.

Flow cytometry and fluorescence microscope

For flow cytometry assessment, cells were resuspended in PBS containing 0.5% BSA and 2 mM EDTA and were acquired by a BD FACSCanto™ (BD Biosciences) flow cytometer. Flow cytometry data were analyzed using FlowJo software (Tree Star). Imaging was performed with an Olympus IX71 fluorescent microscope equipped with a DP71 camera (Olympus). Images were analyzed with AxioVision software (Zeiss). Fluorescent images were superimposed on bright-field images using adobe Photoshop CS4 software (Adobe).