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Was ist der subzelluläre Ort der Synthese von nicht-essentiellen Aminosäuren?

Was ist der subzelluläre Ort der Synthese von nicht-essentiellen Aminosäuren?



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Was ist der Ort der Synthese nicht-essentieller Aminosäuren in einer Zelle? Ist es eine bestimmte Organelle? Und was steckt dahinter?

Ich dachte, der springende Punkt der DNA ist die Kodierung für die Synthese von Proteinen und der Mechanismus der Genexpression. Tripletts von Nukleotiden sind Codes von Aminosäuren und das ist die Granularität, mit der die Zelle arbeitet.

Jetzt stellt sich heraus, dass Zellen mehr als die Hälfte der 20 Aminosäuren beim Menschen synthetisieren können, und ich sehe im Internet keine guten Texte darüber, wie es gemacht wird, wo und wie das kodiert wird.

Vielen Dank, dass Sie etwas Licht ins Dunkel bringen.


Ich glaube, du hast fast recht. DNA (im Kern) wird in mRNA transkribiert, und die Proteinsynthese findet an Ribosomen statt, wo die Basensequenz in der mRNA in Protein übersetzt wird. Ribosomen befinden sich im Zytoplasma oder sind mit dem endoplasmatischen Retikulum verbunden. (Die 'mRNA-Geschichte' wird in Wer hat mRNA entdeckt? gut erzählt.)

Aber es gibt auch eine andere Art von RNA, die für die Proteinsynthese entscheidend ist, und zwar die Transfer-RNA (tRNA): Jede Aminosäure ist an ein "Adapter"-Molekül (tRNA) gebunden und diese Form der Aminosäure wird verwendet durch das Ribosom. Es ist das Adaptermolekül (eine mit einer Aminosäure „beladene“ tRNA), das das Anti-Codon enthält, das während der Proteinbiosynthese Basenpaare mit der mRNA bildet.

Um die Proteinbiosynthese durchführen zu können, benötigt die Zelle eine Zufuhr von Aminosäuren, den „Bausteinen“ der Proteine. Hier ist Ihr Denken (vielleicht) ein wenig verwirrt? Die Bausteine ​​können bei der Proteinverdauung in der Nahrung entstehen oder vom Organismus selbst synthetisiert werden. Wenn sie „de novo“ synthetisiert werden können, vielleicht ausgehend von einem glykolytischen oder Krebszyklus-Zwischenprodukt, werden sie (normalerweise) als nicht essentiell angesehen. Welche Aminosäuren als essentiell oder nicht essentiell gelten, hängt vom Organismus ab. Der Mensch zum Beispiel kann die aromatischen Aminosäuren Phe, Tyr oder Trp nicht „de novo“ synthetisieren, aber wir kann wandle Phe in Tyr um. E.coli hingegen kann alle drei dieser Aminosäuren aus einfachen Bausteinen herstellen, Phe jedoch nicht in Tyr umwandeln (siehe Miller & Simmonds). Daher gilt Tyr als nicht essentiell für den Menschen (vorausgesetzt, eine ausreichende Versorgung mit Phe ist vorhanden).

Die biochemischen Wege, die zur Aminosäurebiosynthese führen, sind normalerweise recht komplex, an denen viele Genprodukte (Enzyme) beteiligt sind. Die Geschichte der Aminosäurebiosynthese wird in Umbarger (1978):Amino Acid Biosynthesis and its Regulation gut erzählt.


An der Aminosäurebiosynthese sind mehrere Enzyme beteiligt. Einige dieser Enzyme sind im menschlichen Genom kodiert. Sie können KEGG für einen detaillierten Weg in verschiedenen Organismen besuchen.

Die grünen Pfeile bezeichnen Reaktionen (und Enzyme), die in einem bestimmten Organismus vorhanden sind (Homo sapiens, in diesem Fall). Wenn Sie auf die Pfeile klicken, können Sie die Details über das Enzym erfahren.

Diese Enzyme sind sowohl im Zytoplasma als auch in Mitochondrien vorhanden. Darüber hinaus werden die Reaktionspartner für die Synthese bestimmter Aminosäuren in Mitochondrien produziert (TCA-Zyklus-Zwischenprodukte). Siehe diesen Artikel über die Rolle der Mitochondrien im Aminosäurestoffwechsel.

Überblick über das Aminosäure-Stoffwechselnetzwerk in menschlichen Mitochondrien. Die schattierten Bereiche stellen die zytoplasmatischen Segmente der Pfade dar.


Prüfung 2 Biochemie erste Runde

Repression - verlangsamt die Transkription von DNA in RNA.

Proteinkinase - sie durch eine Phosphatgruppe an einem Zielenzym.

Wenn Sie dies berechnet haben, was bedeuten die Zahlen?

Wenn Delta G kleiner als null ist, geht es vorwärts.

Wenn Delta G größer als Null ist, handelt es sich um die umgekehrte Reaktion.

Wenn Delta G gleich Null ist, befindet es sich im Gleichgewicht.

Bestehend aus zwei flachen ____________________________________________________________________ Rückseite mit einem an der Rückseite angeschweißten _______ Stab.

Die Metallblöcke haben viel größere ___________ als das zu beprobende Gewebe.

Zangen werden in Flüssigkeit ___ auf _______C gebracht.

Ohne den Blutfluss zu unterbrechen, wird ein Organ/Gewebe ____________ zwischen den Platten unter Verwendung einer erheblichen Hebelwirkung der langen Stäbchen auf ______ mm Dicke komprimiert.

Die sehr niedrige Temperatur, die hohe Wärmeübertragungsrate auf die Metallplatten und die dünne Probe führen zu Gefrierzeiten von < 1 sec für eine Leber- oder Herzfrequenz. ______________ stoppt.

Die Produkte haben eine andere _________ Energie für Produkte.

Die erste Reaktion ATP könnte

Reagieren Sie mit einem Enzym oder Substrat und verwenden Sie einen Phosphat-, Pyrophosphat- oder Adenylyltransfer auf eines dieser.

Sie kann von hier aus eine Transfergruppe oder eine Abgangsgruppe werden.

Summiere die Energien der beiden Reaktionen, um das Delta G' der Gesamtreaktion zu bestimmen.

Tyrosin ist wichtig, wenn Phe nicht da ist - Tyrosin wird aus Phe hergestellt.

Enthält Pepsin, das nach Phe, Leu und Glu spaltet. Der niedrige pH-Wert wird isoelektrischer machen, was dazu beiträgt, ähnliche Ladungen zu erzeugen, um das Molekül abzustoßen und zu trennen - dies hilft Pepsin, dort einzudringen. Protein kann sich nicht mehr falten, da es kein vollständiges Protein mehr ist.

Es gibt neutrale Proteasen - arbeiten bei neutralem pH - Chymotripsin (aromatische Verbindungen) - Trypsin (Lysin und Arginin) - Carboxypeptidase - nimmt jeweils eine AA am Carboxyl-Ende auf. Elastase - spaltet Elastin, ein hochelastisches Gewebe, das im Bindegewebe vorkommt.


Einführung

Ein universelles Merkmal der eukaryotischen DNA-Replikation ist, dass das Genom bei jeder Zellteilung nur einmal dupliziert wird. Dies wird erreicht, indem die existierenden Prä-Replikationskomplexe (Prä-RCs) nach Beginn der S-Phase inaktiviert werden, jedoch gleichzeitig der Aufbau neuer Prä-RCs verhindert wird, bis die Mitose abgeschlossen ist und eine Kernmembran vorhanden ist. Die Bedeutung dieses Prinzips wird durch die Tatsache unterstrichen, dass die Endoreduplikation (mehrere Runden der DNA-Replikation ohne dazwischenliegende Mitose) ein seltenes Ereignis ist. Bei Säugetieren kommt es nur in den terminal differenzierten Trophoblast-Riesenzellen und in Megakaryozyten vor.

Die eukaryotische DNA-Replikation beginnt mit der Bindung eines Ursprungserkennungskomplexes (ORC) an DNA, ein Ereignis, das durch zellzyklusabhängige Veränderungen in einer oder mehreren der sechs ORC-Untereinheiten reguliert wird (DePamphilis, 2005). Bei Säugetieren scheinen diese Veränderungen spezifisch für die größte ORC-Untereinheit Orc1 zu sein. Der Säuger-ORC besteht aus einem stabilen Kernkomplex der ORC-Untereinheiten Orc2, Orc3, Orc4 und Orc5 [hier als ORC(2-5) bezeichnet], die schwach mit Orc1 und Orc6 assoziieren (Dhar et al., 2001 Giordano-Coltart et al ., 2005 Kneissl et al., 2003 Vashee et al., 2001). Die Wechselwirkung von Orc1 mit dem ORC-Kernkomplex in Gegenwart von ATP ist essentiell für die Bindung von ORC an DNA und für den Aufbau von Prä-RCs in vitro (Giordano-Coltart et al., 2005). Die selektive Hemmung der Orc1-Synthese in kultivierten Zellen bestätigt, dass es auch für den Aufbau von Prä-RCs in vivo erforderlich ist (Ohta et al., 2003). nicht in ORC-depletierten replizieren Xenopus Eiextrakte (Li et al., 2000 Natale et al., 2000 Yu et al., 1998).

Die ORC-Aktivität in Säugerzellen scheint durch zellzyklusabhängige Veränderungen in der Assoziation von Orc1 mit ORC-Chromatin-Stellen reguliert zu werden (DePamphilis, 2005). Der sogenannte „ORC-Zyklus“ bei Säugetieren beinhaltet drei spezifische Veränderungen in Orc1 (siehe Diagramm in Abb. 10). Erstens wird die Affinität von Orc1 für Chromatin selektiv verringert, wenn Säugerzellen in die S-Phase eintreten (Kreitz et al., 2001 Li und DePamphilis, 2002, Ohta et al., 2003), eine Veränderung, die sich in der Tatsache widerspiegelt, dass Orc1 nicht mehr mit DNA in S-Phasen-Zellen vernetzt werden (Abdurashidova et al., 2003 Ladenburger et al., 2002). Im Gegensatz dazu bleibt der ORC(2-5)-Kern während der Zellteilung stabil an Chromatin gebunden (diskutiert in DePamphilis, 2005). Zweitens unterliegt Orc1 während der S-Phase einer Ubiquitylierung (Fujita et al., 2002 Li und DePamphilis, 2002 Mendez et al., 2002 Ritzi et al., 2003 Tatsumi et al., 2003). In transformierten menschlichen Zellen werden 70-90% des HsOrc1 während der S-Phase durch einen Ubiquitin-abhängigen Mechanismus selektiv abgebaut (Fujita et al., 2002 Mendez et al., 2002 Ritzi et al., 2003 Tatsumi et al., 2003) (AV, unveröffentlichte Daten). HsOrc1 wird dann während des Übergangs von der M- zur G1-Phase erneut synthetisiert und an Chromatin gebunden. Schließlich wird Orc1 während der G2-M-Phase aufgrund seiner Assoziation mit CcnA-Cdk1 hyperphosphoryliert (Li et al., 2004 Tatsumi et al., 2000 Thome et al., 2000). Da die Hemmung der CDK-Aktivität in Metaphase-Zellen eine schnelle Bindung von Orc1 (Li et al., 2004) und Minichromosomenerhaltungs-(MCM)-Proteinen (Ballabeni et al., 2004) an Chromatin verursacht und die DNA-Replikation vorzeitig eingeleitet wird (Itzhaki et al. , 1997), verhindert die Hyperphosphorylierung von Orc1 während der G2-M-Phase vermutlich seine stabile Assoziation mit ORC(2-5)-Chromatin-Stellen. Dies würde das Fehlen funktioneller ORC-Chromatin-Stellen auf Metaphasenchromatin erklären (Li et al., 2000 Natale et al., 2000 Yu et al., 1998). Orc1 reassoziiert fest mit Chromatin während des Übergangs von der M- zur G1-Phase (Li und DePamphilis, 2002 Mendez et al., 2002 Natale et al., 2000) gefolgt vom Auftreten von Prä-RCs an bestimmten genomischen Stellen (Li et al. , 2000 Nataleet al., 2000).

Die ektopische Expression von CHO (Cg) Orc1 induzierte den Verlust der Zelladhäsion unter Bedingungen, bei denen die ektopische Expression von CgOrc2 dies nicht tat. (A) CHO-Zellen wurden mit der angegebenen Menge von entweder pCgOrc1 (•) oder pCgOrc2 (○) transfiziert und dann 36 Stunden lang inkubiert, bevor die Fraktion der ungebundenen Zellen bestimmt wurde. (B) CHO-Zellen wurden mit 1 &mgr;g entweder pCgOrc1 (•) oder pCgOrc2 (○) transfiziert und dann für die angegebenen Zeiten inkubiert, bevor die Fraktion der ungebundenen Zellen bestimmt wurde. Daten mit pCI allein wurden von den Daten für pCgOrc1 und pCgOrc2 abgezogen. Schattierte Bereiche zeigen die Bedingungen an, unter denen pCgOrc2 und pCI nicht unterscheidbare Ergebnisse lieferten. (C) CHO-Zellen wurden mit 1 μg von entweder pFCgOrc1 (FOrc1) oder pFCgOrc2 (FOrc2) für die in Stunden nach der Transfektion (post-T) angegebenen Zeiten transfiziert. FOrc1 und FOrc2 wurden in der gesamten Zellpopulation (gebunden plus ungebunden) durch Immunblotting unter Verwendung von Anti-FLAG-Antikörper quantifiziert. Es wurde eine einzelne Bande nachgewiesen, die als 100 kDa für FOrc1 und ∼65 kDa für FOrc2 wanderte. (D) CHO-Zellen, transfiziert wie in Tafel A, wurden in solche, die sich von der Schale abhoben (ungebunden) und solche, die gebunden blieben, getrennt. Die Hälfte der ungebundenen Zellen und 10 4 angelagerte Zellen wurden entweder auf FOrc1 oder FOrc2 untersucht. (E) CHO-Zellen, transfiziert wie in Tafel B, wurden in angeheftete und nicht angeheftete Zellen getrennt, bevor sie für die angegebenen Zeiten auf FOrc1 und FOrc2 getestet wurden. In jedem Experiment wurden angeheftete und nicht angeheftete Zellproteine ​​in demselben Gel fraktioniert, auf denselben Immunoblot übertragen und mit demselben Anti-FLAG-Antikörper nachgewiesen, um einen genauen Vergleich zu gewährleisten.

Die ektopische Expression von CHO (Cg) Orc1 induzierte den Verlust der Zelladhäsion unter Bedingungen, bei denen die ektopische Expression von CgOrc2 dies nicht tat. (A) CHO-Zellen wurden mit der angegebenen Menge von entweder pCgOrc1 (•) oder pCgOrc2 (○) transfiziert und dann 36 Stunden lang inkubiert, bevor die Fraktion der nicht-gebundenen Zellen bestimmt wurde. (B) CHO-Zellen wurden mit 1 &mgr;g entweder pCgOrc1 (•) oder pCgOrc2 (○) transfiziert und dann für die angegebenen Zeiten inkubiert, bevor die Fraktion der ungebundenen Zellen bestimmt wurde. Daten mit pCI allein wurden von den Daten für pCgOrc1 und pCgOrc2 abgezogen. Schattierte Bereiche zeigen die Bedingungen an, unter denen pCgOrc2 und pCI nicht unterscheidbare Ergebnisse lieferten. (C) CHO-Zellen wurden mit 1 μg von entweder pFCgOrc1 (FOrc1) oder pFCgOrc2 (FOrc2) für die in Stunden nach der Transfektion (post-T) angegebenen Zeiten transfiziert. FOrc1 und FOrc2 wurden in der gesamten Zellpopulation (gebunden plus ungebunden) durch Immunblotting unter Verwendung von Anti-FLAG-Antikörper quantifiziert. Es wurde eine einzelne Bande nachgewiesen, die als 100 kDa für FOrc1 und ∼65 kDa für FOrc2 wanderte. (D) CHO-Zellen, transfiziert wie in Tafel A, wurden in solche, die sich von der Schale abhoben (ungebunden) und solche, die angelagert blieben, getrennt. Die Hälfte der ungebundenen Zellen und 10 4 gebundene Zellen wurden entweder auf FOrc1 oder FOrc2 untersucht. (E) CHO-Zellen, transfiziert wie in Tafel B, wurden in angeheftete und nicht angeheftete Zellen getrennt, bevor sie für die angegebenen Zeiten auf FOrc1 und FOrc2 getestet wurden. In jedem Experiment wurden angeheftete und nicht angeheftete Zellproteine ​​in demselben Gel fraktioniert, auf denselben Immunoblot übertragen und mit demselben Anti-FLAG-Antikörper nachgewiesen, um einen genauen Vergleich zu gewährleisten.

Obwohl diese Studien nahelegen, dass die ORC-Aktivität in Säugerzellen durch zellzyklusabhängige Veränderungen in Orc1 reguliert wird, haben andere Studien gezeigt, dass dies möglicherweise nicht immer der Fall ist. Im Gegensatz zu HeLa-Zellen bleibt der intrazelluläre Spiegel von Orc1 in Ovarzellen des Chinesischen Hamsters (CHO) während der Zellteilung konstant (Li und DePamphilis, 2002 Li et al., 2004 Natale et al., 2000 Okuno et al., 2001), und dieser Unterschied wurde in parallelen Studien unter identischen Bedingungen bestätigt (SG, unveröffentlichte Daten). Obwohl sowohl Hamster als auch menschliches Orc1 in vivo und in vitro ubiquityliert werden können (Li und DePamphilis, 2002, Mendez et al., 2002) (SG, unveröffentlichte Daten), wurde während der S-Phase nur eine mono-ubiquitylierte Form von Orc1 nachgewiesen in einigen Studien (Li und DePamphilis, 2002), aber nicht in anderen (Okuno et al., 2001). Darüber hinaus gibt es keine Hinweise darauf, dass die Mono-Ubiquitylierung von Orc1 seine Funktion beeinträchtigt. In ähnlicher Weise werden die Wirkungen der Hyperphosphorylierung auf die Fähigkeit von Orc1, an der DNA-Replikation teilzunehmen, aus der Hemmung der Proteinkinase-Aktivitäten in Metaphase-Zellen impliziert, es fehlen direkte Beweise.

Um zu bestimmen, ob die Mono-Ubiquitylierung und Hyperphosphorylierung von Orc1 tatsächlich die Funktion von Orc1 unterdrücken kann, modifiziert und nicht modifiziert ORC1 Gene wurden in CHO- und HeLa-Zellen transient exprimiert und ihre Wirkungen mit denen von transient exprimiertem Orc2 verglichen. Die Ergebnisse zeigten, dass die oben beschriebenen zellzyklusabhängigen Veränderungen in Orc1 tatsächlich die ORC-Aktivität beeinflussen könnten, indem sie diese während des Übergangs von der M- in die G1-Phase aktiviert und während des Übergangs von der S- in die M-Phase unterdrückt werden. Unerwarteterweise zeigten diese Experimente auch, dass unmodifiziertes Orc1 eine Apoptose induzieren konnte, die apoptotischen Zellen ähnlich war, die während der Zellproliferation spontan entstanden waren. Darüber hinaus neutralisierten die gleichen Modifikationen, die Orc1 daran hinderten, an der DNA-Replikation teilzunehmen, auch seine Fähigkeit, Apoptose zu induzieren, was darauf hindeutet, dass das Versäumnis, die ORC-Aktivität während der Säugerentwicklung zu regulieren, zum Zelltod führen könnte.


ERGEBNISSE

Erzeugung von mESCs ohne Y-RNAs

Wir verwendeten das CRISPR-Cas9-System, um mESC-Linien zu konstruieren, die Deletionen jedes der beiden Bona-fide-Y-RNA-Gene enthalten: Rny1 und Rny3. Wir wählten Mauszellen wegen der geringen Anzahl unterschiedlicher Y-RNAs in diesen Zellen und der geringeren Anzahl von Pseudogenen im Vergleich zu menschlichen Zellen. Während menschliche Zellen >1000 Y-RNA-Pseudogene enthalten, enthalten Mäuse insbesondere weniger als 60 (16). Obwohl den meisten dieser Sequenzen RNA-Polymerase-III-Promotoren fehlen und Mutationen enthalten, die die Ro60-Bindung verhindern (16, 48), werden zumindest einige Sequenzen transkribiert, möglicherweise aufgrund einer durchdringenden Polymerase-II-Transkription oder als Teil naszierender prä-mRNAs ( 36, 49) . Darüber hinaus könnte der Einsatz von mESCs als Plattform für zukünftige Studien an Mäusen dienen.

Wir erzeugten zwei unabhängige Zelllinien, denen jede der beiden Maus-Y-RNAs fehlte. Mit Northern Blotting bestätigten wir, dass die erwartete RNA nicht nachweisbar war, wenn entweder Rnja1 oder Rny3 wurde gelöscht (Abbildung 1A). Wie zuvor beobachtet (21), sind Y1- und Y3-RNAs um das 9,5- bzw. 4,5-Fache in reduziert Ro60 −/− mESCs (Abbildung 1A, Bahnen 1–2). Darüber hinaus wiesen Zellen, denen entweder Y1- oder Y3-RNA fehlte, leicht erhöhte Spiegel der anderen RNA auf (Abbildung 1A, Spuren 5–8 und 1B), was eine erhöhte Ro60-vermittelte Stabilisierung der verbleibenden Y-RNA widerspiegeln könnte. Da Y1- und Y3-RNAs überlappende oder redundante Funktionen haben könnten, erzeugten wir auch mESCs, denen beide RNAs fehlten (Abbildung 1A, Spuren 9–10).

mESCs, denen Y-RNAs fehlen, sind lebensfähig und teilen sich normal. (EIN) RNA aus zwei Ro60 −/− mESC-Linien, Wildtyp-mESCs, mESCs, die den leeren lentiCRISPR v2-Vektor (WT*) tragen, und zwei unabhängige Rny1 −/− , Rny3 −/− und Rny1 −/− Rny3 –/– mESC-Linien wurden einem Northern-Blotting unterzogen, um Y1- und Y3-RNAs nachzuweisen. 5S rRNA, Ladekontrolle. (B) Quantifizierung der Y1- und Y3-RNA-Spiegel in jeder Zelllinie relativ zu Wildtyp-mESCs (Spur 3 in A). Die Daten repräsentieren drei biologische Replikate und sind als Mittelwert ± SEM gezeigt. P die Werte wurden unter Verwendung einer Einweg-ANOVA berechnet. *, P < 0,05 ***, P < 0,001. (C) Zellzyklusprofile von Wildtyp, Ro60 −/− und zwei unabhängige Rny1 − / − Rny3 − / − mESCs. Der Einbau von BrdU wurde durch Durchflusszytometrie gemessen. Der Prozentsatz der Zellen in den G1-, S- und G2/M-Phasen des Zellzyklus wird angezeigt. Daten repräsentieren Mittelwert ± SEM (n = 6).

mESCs, denen Y-RNAs fehlen, sind lebensfähig und teilen sich normal. (EIN) RNA aus zwei Ro60 −/− mESC-Linien, Wildtyp-mESCs, mESCs, die den leeren lentiCRISPR v2-Vektor (WT*) tragen, und zwei unabhängige Rny1 −/− , Rny3 −/− und Rny1 −/− Rny3 –/– mESC-Linien wurden einem Northern-Blotting unterzogen, um Y1- und Y3-RNAs nachzuweisen. 5S rRNA, Ladekontrolle. (B) Quantifizierung der Y1- und Y3-RNA-Spiegel in jeder Zelllinie relativ zu Wildtyp-mESCs (Spur 3 in A). Die Daten repräsentieren drei biologische Replikate und sind als Mittelwert ± SEM gezeigt. P die Werte wurden unter Verwendung einer Einweg-ANOVA berechnet. *, P < 0,05 ***, P < 0,001. (C) Zellzyklusprofile von Wildtyp, Ro60 −/− und zwei unabhängige Rny1 − / − Rny3 − / − mESCs. Der Einbau von BrdU wurde durch Durchflusszytometrie gemessen. Der Prozentsatz der Zellen in den G1-, S- und G2/M-Phasen des Zellzyklus wird angezeigt. Daten repräsentieren Mittelwert ± SEM (n = 6).

Y-RNAs werden für die DNA-Replikation nicht benötigt

Obwohl berichtet wird, dass Y-RNAs für die DNA-Replikation bei Vertebraten essentiell sind (38–40, 50–52), unsere Rny1 −/− Rny3 −/− mESCs fehlten offensichtliche Wachstumsdefekte. Wir verglichen daher die Zellzyklen von Wildtyp-, Ro60 −/− und zwei unabhängige Rny1 −/− Rny3 −/− Zelllinien.Die Markierung mit Bromdesoxyuridin (BrdU), gefolgt von der Durchflusszytometrie, ergab ähnliche Zellzyklen für alle vier Zelllinien (Abbildung 1C). Wir schließen daraus, dass Y-RNAs für die DNA-Replikation in mESCs nicht essentiell sind.

Y-RNAs sind erforderlich, damit Ro60 sich auf Wildtyp-Niveau anreichern kann

Interessanterweise verringerten sich die Ro60-Spiegel in mESCs, denen sowohl Y1- als auch Y3-RNAs fehlten, >2-fach (Abbildung 2A). Um zu bestätigen, dass die reduzierten Ro60-Spiegel auf das Fehlen von Y-RNAs zurückzuführen sind, erzeugten wir stabile Rny1 −/− Rny3 − /− Zellen, in denen Rny1 und/oder Rny3 Transgene wurden an ektopischen Loci integriert (Abbildung 2B). Obwohl die Y1-RNA-Expression aus dem Transgen mit der von Wildtyp-Zellen vergleichbar war, betrug die Y3-RNA-Expression nur 45% der von Wildtyp-Zellen (Fig. 2B, vergleiche Bahn 1 mit Bahnen 5 und 6). Wichtig ist, dass die Expression von Y1 die Ro60-Expression in wiederhergestellt hat Rny1 −/− Rny3 –/– Zellen auf nahezu Wildtyp-Niveaus und die Expression von Y3 in diesen Zellen erhöhte die Ro60-Spiegel gegenüber Zellen, die nur den leeren Vektor trugen (Abbildung 2C). Wir schließen daraus, dass Y-RNAs erforderlich sind, damit Ro60 sich auf Wildtyp-Niveaus ansammelt.

Y-RNAs sind wichtig für die Ro60-Akkumulation. (EIN) Die Ebenen von Ro60 in zwei Ro60 −/− mESC-Linien, Wildtyp-mESCs, mESCs, die den leeren lentiCRISPR v2-Vektor (WT*) tragen, und zwei unabhängige Rny1 −/− , Rny3 −/− und Rny1 −/− Rny3 −/− mESC-Linien wurden durch Western-Blotting gemessen (linkes Feld). ActB ist eine Ladekontrolle. Rechtes Feld, Quantifizierung der Ro60-Proteinspiegel von drei biologischen Replikaten. Die Daten sind Mittelwerte ± SEM, normalisiert auf ActB. P die Werte wurden unter Verwendung einer Einweg-ANOVA berechnet. ***, P < 0,001. (B) Northern Blotting wurde verwendet, um die Spiegel von Y-RNAs in Wildtyp zu vergleichen, Rny1 −/− Rny3 −/− mESCs und Rny1 −/− Rny3 −/− mESCs, die den leeren pUB6/V5/His A-Vektor exprimieren oder den gleichen Vektor enthaltend Rny1, Rny3 oder beide Transgene. 5S rRNA ist eine Ladekontrolle. (C) Lysate aus Wildtyp, Rny1 − / − Rny3 − / − und Rny1 − / − Rny3 − / − mESCs, die einen leeren Vektor exprimieren oder den gleichen Vektor enthaltend Rny1, Rny3 oder beide Transgene wurden einem Immunblotting unterzogen, um Ro60 nachzuweisen (linkes Feld). ActB, Ladekontrolle. Rechtes Feld, Quantifizierung der Ro60-Spiegel in jeder Zelllinie im Vergleich zu Wildtyp-mESCs. Daten sind Mittelwert ± SEM (n = 3) normiert auf ActB. P Werte wurden mit zweiseitigen ungepaarten . berechnet T-Prüfung **, P < 0,01 ***, P < 0,001. (D) Potentielle Sekundärstrukturen für Y1, Y3 und die verkürzte Y1-RNA, Y1-S, bei der die große interne Schleife von Y1 durch eine CUUG-Tetraloop ersetzt wurde. Die Ro60-Bindungsstelle ist eingerahmt. (E) Northern Blot zeigt die Expression von Y1-S in zwei unabhängigen Rny1 −/− Rny3 −/− mESC-Linien. (F) Western Blotting wurde verwendet, um die Ro60-Spiegel in Wildtyp-mESCs zu vergleichen, Rny1 −/− Rny3 −/− mESCs und Rny1 −/− Rny3 −/− mESCs, die den leeren Vektor oder den gleichen Vektor exprimieren, der das Y1-S-Transgen enthält (linkes Feld). ActB ist eine Ladekontrolle. Rechtes Feld, Quantifizierung des Ro60-Proteins in jeder Zelllinie im Vergleich zu Wildtyp-Zellen. Daten sind Mittelwert ± SEM (n = 3) normiert auf ActB. P die Werte wurden unter Verwendung einer Einweg-ANOVA berechnet. **, P < 0,01 ***, P < 0,001. (g) RT-qPCR-Analysen von Ro60-mRNA-Spiegeln in Wildtyp-mESCs, mESCs, die den leeren lentiCRISPR v2-Vektor (WT*) tragen, Rny1 −/− , Rny3 − / − und Rny1 −/− Rny3 −/− mESCs. Daten sind Mittelwert ± SEM (n = 3), normalisiert auf β-Actin- und Gapdh-mRNAs. Für statistische Analysen wurde eine Einweg-ANOVA verwendet.

Y-RNAs sind wichtig für die Ro60-Akkumulation. (EIN) Die Ebenen von Ro60 in zwei Ro60 −/− mESC-Linien, Wildtyp-mESCs, mESCs, die den leeren lentiCRISPR v2-Vektor (WT*) tragen, und zwei unabhängige Rny1 −/− , Rny3 −/− und Rny1 −/− Rny3 −/− mESC-Linien wurden durch Western-Blotting gemessen (linkes Feld). ActB ist eine Ladekontrolle. Rechtes Feld, Quantifizierung der Ro60-Proteinspiegel von drei biologischen Replikaten. Die Daten sind Mittelwerte ± SEM, normalisiert auf ActB. P die Werte wurden unter Verwendung einer Einweg-ANOVA berechnet. ***, P < 0,001. (B) Northern Blotting wurde verwendet, um die Spiegel von Y-RNAs im Wildtyp zu vergleichen, Rny1 −/− Rny3 −/− mESCs und Rny1 −/− Rny3 −/− mESCs, die den leeren pUB6/V5/His A-Vektor exprimieren oder den gleichen Vektor mit Rny1, Rny3 oder beide Transgene. 5S rRNA ist eine Ladekontrolle. (C) Lysate aus Wildtyp, Rny1 − / − Rny3 − / − und Rny1 − / − Rny3 − / − mESCs, die einen leeren Vektor exprimieren oder den gleichen Vektor enthaltend Rny1, Rny3 oder beide Transgene wurden einem Immunblotting unterzogen, um Ro60 nachzuweisen (linkes Feld). ActB, Ladekontrolle. Rechtes Feld, Quantifizierung der Ro60-Spiegel in jeder Zelllinie im Vergleich zu Wildtyp-mESCs. Daten sind Mittelwert ± SEM (n = 3) normiert auf ActB. P Werte wurden mit zweiseitigen ungepaarten . berechnet T-Prüfung **, P < 0,01 ***, P < 0,001. (D) Potentielle Sekundärstrukturen für Y1, Y3 und die verkürzte Y1-RNA, Y1-S, bei der die große interne Schleife von Y1 durch eine CUUG-Tetraloop ersetzt wurde. Die Ro60-Bindungsstelle ist eingerahmt. (E) Northern Blot zeigt die Expression von Y1-S in zwei unabhängigen Rny1 −/− Rny3 −/− mESC-Linien. (F) Western Blotting wurde verwendet, um die Ro60-Spiegel in Wildtyp-mESCs zu vergleichen, Rny1 −/− Rny3 −/− mESCs und Rny1 −/− Rny3 −/− mESCs, die den leeren Vektor oder den gleichen Vektor exprimieren, der das Y1-S-Transgen enthält (linkes Feld). ActB ist eine Ladekontrolle. Rechtes Feld, Quantifizierung des Ro60-Proteins in jeder Zelllinie im Vergleich zu Wildtyp-Zellen. Daten sind Mittelwert ± SEM (n = 3) normiert auf ActB. P die Werte wurden unter Verwendung einer Einweg-ANOVA berechnet. **, P < 0,01 ***, P < 0,001. (g) RT-qPCR-Analysen von Ro60-mRNA-Spiegeln in Wildtyp-mESCs, mESCs, die den leeren lentiCRISPR v2-Vektor (WT*) tragen, Rny1 −/− , Rny3 − / − und Rny1 −/− Rny3 −/− mESCs. Daten sind Mittelwert ± SEM (n = 3), normalisiert auf β-Actin- und Gapdh-mRNAs. Für statistische Analysen wurde eine Einweg-ANOVA verwendet.

Da sich die hochaffine Bindungsstelle für Ro60 innerhalb der Y1- und Y3-RNA-Stämme befindet (in Abbildung 2D eingerahmt), haben wir getestet, ob die Expression dieses Stamms in Rny1 −/− Rny3 –/– Zellen war ausreichend, um die Ro60-Spiegel auf die von Wildtyp-Zellen wiederherzustellen. Wir erzeugten zwei unabhängige mESC-Linien, die eine verkürzte Y1-RNA, Y1-S, stabil exprimieren, in der die große interne Schleife von Y1 durch eine CUUG-Tetraloop ersetzt wurde (Abbildung 2D). Wir bestätigten, dass Y1-S in exprimiert wurde Rny1 −/− Rny3 −/− mESCs mit Northern Blotting (Abbildung 2E). Die Expression von Y1-S-RNA stellte die Ro60-Spiegel auf die von Wildtypzellen wieder her (Fig. 2F). Mit RT-qPCR zeigten wir, dass die Ro60-mRNA-Spiegel in mESCs, denen eine oder beide Y-RNAs fehlten, unverändert waren (Abbildung 2G). Somit erhöhen Y-RNAs die Ro60-Spiegel durch einen posttranskriptionellen Mechanismus.

Y-RNAs beeinflussen die subzelluläre Verteilung von Ro60

Frühere Studien zeigten, dass Maus-Ro60/Y-RNA-Komplexe größtenteils zytoplasmatisch sind, teilweise weil die Y-RNA-Bindung eine nukleäre Lokalisierungssequenz auf der Ro60-Oberfläche maskiert ( 21, 41). Um zu bestimmen, wie sich der Verlust von Y-RNAs auf die subzelluläre Verteilung von Ro60 auswirkt, führten wir Immunfluoreszenz an Wildtyp- und Y-RNA-deletierten mESCs durch. Wie beschrieben (21), ist Ro60 in mESCs weitgehend zytoplasmatisch (Abbildung 3). Die Verteilung von Ro60 in Rny1 −/− und Rny3 −/− mESCs ähnelten denen von Wildtypzellen, was darauf hindeutet, dass die Deletion einer der Y-RNAs nicht ausreicht, um die Ro60-Verteilung zu verändern. Allerdings in Rny1 −/− Rny3 −/− mESCs, weniger Ro60 wurde im Zytoplasma nachgewiesen (Abbildung 3A). Obwohl das verringerte zytoplasmatische Ro60 auf das reduzierte Ro60-Protein in diesen Zellen zurückzuführen sein könnte (Abbildung 2A), akkumulierte etwas Ro60 in Kernherden, die sich mit dem nukleolären Marker Fibrillarin kolokalisierten (Abbildung 3A und B).

Y-RNAs regulieren die subzelluläre Verteilung von Ro60. (EIN) Immunfluoreszenz wurde durchgeführt, um Ro60 (grün) in . nachzuweisen Ro60 − / − , Wildtyp, Rny1 −/− , Rny3 − / − , Rny1 −/− Rny3 −/− und Rny1 −/− Rny3 −/− mESCs, die entweder Y1- und Y3-RNAs oder Y1-S stabil exprimieren. Fibrillarin (rot) ist ein nukleolärer Marker. Kerne (blau) wurden mit einem DAPI-Maßstab, 20 µm, nachgewiesen. Vergrößerte Bilder von kolokalisierendem Ro60 und Fibrillarin sind in den unteren Feldern enthalten. Einschübe stellen einen 2,5-fachen Zoom ausgewählter Bereiche mit kolokalisierendem Ro60 und Fibrillarin dar. (B) Quantifizierung der mittleren nukleolären Fluoreszenzintensität von Ro60 von >35-Nukleolen in jeder der angegebenen Zelllinien. P Werte wurden mit Einweg-ANOVA *** berechnet, P < 0,001.

Y-RNAs regulieren die subzelluläre Verteilung von Ro60. (EIN) Immunfluoreszenz wurde durchgeführt, um Ro60 (grün) in . nachzuweisen Ro60 − / − , Wildtyp, Rny1 −/− , Rny3 − / − , Rny1 −/− Rny3 −/− und Rny1 −/− Rny3 −/− mESCs, die entweder Y1- und Y3-RNAs oder Y1-S stabil exprimieren. Fibrillarin (rot) ist ein nukleolärer Marker. Kerne (blau) wurden mit einem DAPI-Maßstab, 20 µm, nachgewiesen. Vergrößerte Bilder von kolokalisierendem Ro60 und Fibrillarin sind in den unteren Feldern enthalten. Einschübe stellen einen 2,5-fachen Zoom ausgewählter Bereiche mit kolokalisierendem Ro60 und Fibrillarin dar. (B) Quantifizierung der mittleren nukleolären Fluoreszenzintensität von Ro60 von >35-Nukleolen in jeder der angegebenen Zelllinien. P Werte wurden mit Einweg-ANOVA *** berechnet, P < 0,001.

Um zu bestätigen, dass die geänderte Ro60-Verteilung in Rny1 −/− Rny3 −/− mESCs auf den Verlust von Y-RNAs zurückzuführen war, haben wir festgestellt, ob die Veränderungen in der Ro60-Verteilung durch die Expression von Y-RNAs in den Zellen komplementiert werden könnten. In Rny1 −/− Rny3 −/− mESCs, die die beiden Y-RNAs stabil exprimierten, war die Verteilung von Ro60 ähnlich der von Wildtypzellen (Abbildung 3A). Interessanterweise in Rny1 −/− Rny3 −/− mESCs, die nur den Y1-RNA-Stamm (Y1-S) exprimierten, erhöhte die zytoplasmatische Ro60-Fluoreszenz, aber die Akkumulation von Ro60 in Nukleolen war ähnlich der von Rny1 −/− Rny3 −/− mESCs (Abbildung 3A). Während also der Y1-RNA-Stamm ausreicht, um die Ro60-Proteinspiegel wiederherzustellen ( 2F ) und zumindest teilweise die Akkumulation von Ro60 im Zytoplasma wiederherstellt, ist das andere Y-RNA-Modul notwendig, um die Akkumulation von Ro60 in Nukleolen zu verhindern. Da biochemische und strukturelle Daten ein Modell unterstützen, in dem dieses Modul als Tor fungiert, um andere RNAs sterisch am Zugang zur Ro60-Kavität zu hindern (25, 30), besteht eine Möglichkeit darin, dass ohne dieses Modul einige Ro60 naszierende rRNA oder andere binden nukleoläre RNAs.

Identifizierung von Y-RNA-abhängigen Ro60-assoziierten Proteinen

Um zu bestimmen, inwieweit Y-RNAs die Interaktion von Ro60 mit anderen Proteinen aufbauen, identifizierten wir den Satz von mESC-Proteinen, deren Ro60-Assoziation Y-RNA erfordert. Zu diesem Zweck haben wir gegründet Ro60 −/− mESCs, die stabil eine Ro60-cDNA mit drei Kopien des FLAG-Epitops fusioniert an den N-Terminus exprimieren (Ro60 −/− , FLAGGE3-Ro60) (Figur 4). Durch Western-Blotting haben wir festgestellt, dass das Niveau von FLAGGE3-Ro60 in diesen Zellen, die unter der Kontrolle des menschlichen Ubiquitin-C-Promotors synthetisiert wurden, war ungefähr 2,5-mal höher als bei Wildtyp-Zellen ( 4A , vergleiche Bahnen 2 und 3). Bemerkenswerterweise erhöhten sich auch die Y1-RNA-Spiegel in diesen Zellen ( 4B , Spur 3), was mit einem Modell übereinstimmt, in dem diese RNA im Überschuss hergestellt und durch Ro60-Bindung stabilisiert wird. Wir haben diese mESCs als übergeordnete Zeile zum Generieren verwendet Rny1 −/− , Rny3 −/− und Rny1 −/− Rny3 −/− Derivate. Zur Unterstützung eines posttranskriptionellen Mechanismus zur Regulierung des Ro60-Spiegels ist der Ro60 in Ro60 −/− , FLAGGE3-Ro60 Rny1 −/− Rny3 −/− mESCs, denen sowohl Y1 als auch Y3 fehlten, gingen auf 67 % der Eltern zurück Ro60 −/− , FLAGGE3-Ro60 mESCs (Abbildung 4A, vergleiche Bahnen 6 und 7 mit Bahn 3). Ob die geringere Abnahme der Ro60-Spiegel in diesen Zellen im Vergleich zu Rny1 −/− Rny3 −/− mESCs (Abbildung 2A) ist auf eine Überexpression von FLAG . zurückzuführen3-Ro60 oder das Vorhandensein des N-terminalen Tags ist nicht bekannt. Proteine, die zusammen mit FLAG . gereinigt wurden3-Ro60 aus Zellen, die Y-RNAs enthielten und ihnen fehlten, wurden unter Verwendung von Massenspektrometrie identifiziert (Fig. 4C und ergänzende Tabelle S2). Anti-FLAG-Eluate von unmarkierten Wildtyp-mESCs waren Negativkontrollen. Um die Robustheit unserer Massenspektrometriedaten zu erhöhen, haben wir drei unabhängige Aufreinigungen durchgeführt. Wir definierten potenzielle Interaktoren als Proteine, die in allen drei Replikaten beide durch mindestens zwei Peptide repräsentiert und mindestens 4-fach angereichert an . waren Ro60 −/− , FLAGGE3-Ro60 mESCs relativ zu ungetaggten Wildtyp-Zellen.

Die Assoziation von Ro60 mit Partnerproteinen erfordert Y-RNA (EIN) Ro60 und FLAG3-Ro60-Spiegel in den angegebenen Zelllinien wurden durch Western-Blotting (linkes Feld) verglichen. Rechtes Feld, Quantifizierung von drei biologischen Replikaten. Daten sind Mittelwert ± SEM (n = 3) normiert auf ActB. P die Werte wurden unter Verwendung einer Einweg-ANOVA berechnet. **, P < 0,01. (B) Die Spiegel von Y-RNAs in den angegebenen Zelllinien wurden durch Northern-Blotting verglichen. (C) Durch Massenspektrometrie identifizierte Proteine ​​in Anti-FLAG-Eluaten. Drei Replikate (R1, R2, R3) wurden durchgeführt. Die Proteine, für die das Peptidspektrum übereinstimmt, waren in Immunpräzipitaten von . >4-fach höher Ro60 −/− , FLAGGE3-Ro60 mESCs als ungetaggte Wildtyp-Zellen in allen drei Replikaten sind gezeigt.

Die Assoziation von Ro60 mit Partnerproteinen erfordert Y-RNA (EIN) Ro60 und FLAG3-Ro60-Spiegel in den angegebenen Zelllinien wurden durch Western-Blotting (linkes Feld) verglichen. Rechtes Feld, Quantifizierung von drei biologischen Replikaten. Daten sind Mittelwert ± SEM (n = 3) normiert auf ActB. P die Werte wurden unter Verwendung einer Einweg-ANOVA berechnet. **, P < 0,01. (B) Die Spiegel von Y-RNAs in den angegebenen Zelllinien wurden durch Northern-Blotting verglichen. (C) Durch Massenspektrometrie identifizierte Proteine ​​in Anti-FLAG-Eluaten. Drei Replikate (R1, R2, R3) wurden durchgeführt. Die Proteine, für die das Peptidspektrum übereinstimmt, waren in Immunpräzipitaten von . >4-fach höher Ro60 −/− , FLAGGE3-Ro60 mESCs als ungetaggte Wildtyp-Zellen in allen drei Replikaten sind gezeigt.

Interessanterweise war Ro60 von den neun Proteinen, die als wahrscheinlich spezifische Komponenten unserer Anti-FLAG-Eluate identifiziert wurden, das einzige Protein, das in Immunpräzipitaten von Zellen vorhanden war, denen beide Y-RNAs fehlten ( 4C und ergänzende Tabelle S2). Alle anderen potentiellen Interaktoren, einschließlich der Mov10 5′ bis 3′ RNA-Helikase ( 53), das mitochondriale und nukleäre RNA-bindende Protein Lrpprc ( 54), Igf2bp1/Zbp1, Ssb/La, Ptbp1, das LINE-1 Retrotransposon-kodierte Orf1 und die Y-Box-Proteine ​​Ybx1 und Ybx3, fehlten in Immunpräzipitaten aus Rny1 −/− Rny3 −/− mESCs (Abbildung 4C). Obwohl zuvor beschrieben wurde, dass jedes dieser Proteine ​​zusammen mit Maus- oder Human-Ro60 gereinigt wird (32, 34, 55), zeigen unsere Daten, dass die Assoziation dieser Proteine ​​mit Ro60 eine oder beide Y-RNAs erfordert.

Y1- und Y3-RNAs binden Ro60 an verschiedene Bindungspartner

Um zu bestimmen, welche Y-RNA für die Assoziation von Ro60 mit jedem Protein verantwortlich ist, führten wir Immunpräzipitationen mit unserem Ro60 −/− , FLAGGE3-Ro60 mESCs, denen eine oder beide Y-RNAs fehlten, und die mitreinigenden Proteine ​​durch Western-Blotting nachgewiesen wurden. Wie erwartet waren alle untersuchten Proteine, einschließlich Lrpprc, Mov10, Igf2bp1/Zbp1 und Orf1 in Anti-FLAG-Eluaten der Eltern vorhanden Ro60 −/− , FLAGGE3-Ro60 mESCs (Fig. 5A, Spur 7) und fehlen in Eluaten aus denselben Zellen, die sowohl für Y1 als auch für Y3 deletiert sind (Spur 10). Insbesondere die Prüfung von Ro60 −/− , FLAGGE3-Ro60 mESCs ohne Y1 oder Y3 zeigten, dass diese ncRNAs unterschiedliche Proteinsätze an Ro60 binden. Die gemeinsame Reinigung von Mov10, Lrpprc und Orf1 mit Ro60 erforderte Y1, während die Assoziation von Ro60 mit Igf2bp1/Zbp1 von Y3-RNA abhing (Abbildung 5A und B). Aufgrund der geringen Konzentrationen von Ybx1 und Ybx3, die in mESCs zusammen mit Ro60 aufgereinigt wurden, konnten wir nicht feststellen, ob ihre Assoziation mit Ro60 spezifische Y-RNAs erforderte.

Y1 und Y3 binden unterschiedliche Proteine ​​an Ro60. (EIN und B) Lysate von ungetaggtem Wildtyp (Bahnen 1 und 6) und Ro60 −/− , FLAGGE3-Ro60 mESCs (Bahnen 2 und 7) wurden einer Immunpräzipitation mit Anti-FLAG-Antikörpern zusammen mit Ro60 −/− , FLAGGE3-Ro60 mESCs deletiert für Y1, Y3 oder beide Y-RNAs (Spuren 3–5 und 8–10). Lysate (Bahnen 1–5) und Proteine ​​in Immunpräzipitaten (Bahnen 6–10) wurden durch Western-Blotting analysiert, um die angegebenen Proteine ​​zu erkennen. ActB ist eine Negativkontrolle. (C und D) Lysate aus Ro60 –/– (Bahnen 1 und 6), ungetaggte Wildtyp-mESCs (Bahnen 2 und 7) und Wildtyp-mESCs, die für eine oder beide Y-RNAs deletiert waren (Bahnen 3–5 und 8–10), wurden einer Immunpräzipitation mit Anti- . unterzogen -Ro60-Antikörper. Lysate (Bahnen 1 bis 5) und immunpräzipitierte Proteine ​​(Bahnen 6 bis 10) wurden einem Western-Blotting unterzogen, um Lrpprc (C) und La (D) nachzuweisen. ActB ist eine Negativkontrolle. (Eh) Lysate aus Ro60 −/− (Bahnen 1 und 6), Wildtyp-mESCs (Bahnen 2 und 7) und Wildtyp-mESCs, die für eine oder beide Y-RNAs deletiert waren (Bahnen 3–5 und 8–10) wurden einer Immunpräzipitation mit Antikörpern gegen . unterzogen Ptbp1 (E), LINE-1 Orf1 (F), Mov10 (G) und Igf2bp1/Zbp1 (H). Lysate (Bahnen 1–5) und Proteine ​​in Immunpräzipitaten (Bahnen 6–10) wurden einem Western-Blotting unterzogen, um die angegebenen Proteine ​​nachzuweisen. In jedem Blot wurde Ro60 als Positivkontrolle und ActB (E) oder Gapdh (F–H) als Negativkontrolle nachgewiesen. *, unspezifische Bande.

Y1 und Y3 binden unterschiedliche Proteine ​​an Ro60. (EIN und B) Lysate von ungetaggtem Wildtyp (Bahnen 1 und 6) und Ro60 −/− , FLAGGE3-Ro60 mESCs (Bahnen 2 und 7) wurden einer Immunpräzipitation mit Anti-FLAG-Antikörpern zusammen mit Ro60 −/− , FLAGGE3-Ro60 mESCs deletiert für Y1, Y3 oder beide Y-RNAs (Spuren 3–5 und 8–10). Lysate (Bahnen 1–5) und Proteine ​​in Immunpräzipitaten (Bahnen 6–10) wurden durch Western-Blotting analysiert, um die angegebenen Proteine ​​zu erkennen. ActB ist eine Negativkontrolle. (C und D) Lysate aus Ro60 –/– (Bahnen 1 und 6), ungetaggte Wildtyp-mESCs (Bahnen 2 und 7) und Wildtyp-mESCs, die für eine oder beide Y-RNAs deletiert waren (Bahnen 3–5 und 8–10), wurden einer Immunpräzipitation mit Anti- . unterzogen -Ro60-Antikörper. Lysate (Bahnen 1 bis 5) und immunpräzipitierte Proteine ​​(Bahnen 6 bis 10) wurden einem Western-Blotting unterzogen, um Lrpprc (C) und La (D) nachzuweisen. ActB ist eine Negativkontrolle. (Eh) Lysate aus Ro60 −/− (Bahnen 1 und 6), Wildtyp-mESCs (Bahnen 2 und 7) und Wildtyp-mESCs, die für eine oder beide Y-RNAs deletiert waren (Bahnen 3–5 und 8–10) wurden einer Immunpräzipitation mit Antikörpern gegen . unterzogen Ptbp1 (E), LINE-1 Orf1 (F), Mov10 (G) und Igf2bp1/Zbp1 (H). Lysate (Bahnen 1–5) und Proteine ​​in Immunpräzipitaten (Bahnen 6–10) wurden einem Western-Blotting unterzogen, um die angegebenen Proteine ​​nachzuweisen. In jedem Blot wurde Ro60 als Positivkontrolle und ActB (E) oder Gapdh (F–H) als Negativkontrolle nachgewiesen. *, unspezifische Bande.

Da sowohl Ro60- als auch Y1-RNA in überexprimiert wurden Ro60 −/− , FLAGGE3-Ro60 mESCs (Abbildung 4) bestätigten wir die Interaktionen von Ro60 mit jedem der identifizierten Proteine ​​unter Verwendung von Wildtyp-mESCs. Mit Anti-Ro60-Antikörpern bestätigten wir, dass die Interaktion von Lrpprc mit Ro60 Y1-RNA erfordert, während Ssb/La mit Ro60 sowohl über Y1- als auch über Y3-RNAs interagiert (Abbildung 5C und D), wie aus früheren Studien erwartet (23). In ähnlicher Weise bestätigten Immunpräzipitationen mit Antikörpern gegen Ptbp1, Orf1, Mov10 und Igf2bp1/Zbp1 und Orf1, dass ihre Assoziation mit Ro60 von einer oder beiden Y-RNAs abhing (Abbildung 5E–H). Insbesondere war die Assoziation von Orf1 und Mov10 weitgehend von Y1 abhängig, die Assoziation von Igf2bp1/Zbp1 erforderte Y3, während Ptbp1 mit beiden Ro60/Y-RNA-Komplexen interagierte (Abbildung 5E–H). Zusammenfassend schließen wir, dass eine Rolle von Y-RNAs darin besteht, die Interaktionen von Ro60 mit spezifischen RNA-bindenden Proteinen zu unterstützen, um spezialisierte RNPs zu erzeugen.


Aminosäuren als biosynthetische Materialien

Erhöhte biosynthetische Aktivitäten sind ein wesentliches Merkmal der metabolischen Reprogrammierung bei Krebs: Sie unterstützen Zellen bei der Produktion der Makromoleküle, die für die DNA-Replikation, Zellteilung und das anschließende Tumorwachstum erforderlich sind. Biosynthesewege oder anabole Wege wandeln einfache Metaboliten (z. B. Zucker und Aminosäuren) durch ATP-abhängige Prozesse in komplexe Moleküle um. Aminosäuren sind an der Synthese von drei primären Makromolekülen beteiligt: ​​Proteine, Lipide und Nukleinsäuren (Abb. 1). Alle 20 kanonischen Aminosäuren sind proteinogen, aber nur eine Untergruppe von Aminosäuren ist an der Synthese nichtessentieller Aminosäuren (NEAA) beteiligt (z. B. Glutamin, Glutamat, Methionin und Phenylalanin). Unter den Aminosäuren, die an der NEAA-Synthese beteiligt sind, liefert Glutamin Stickstoff für die Synthese der Amidgruppe von Asparagin. Es trägt auch zur Synthese mehrerer Aminosäuren durch seinen Katabolismus zu Glutamat bei. Glutamin wird hauptsächlich durch Glutaminase (GLS)-Aktivität in Glutamat umgewandelt (Fig. 1, 4b) 42 . Glutamat kann dann durch Aminotransferase-Reaktionen weiter in α-KG und andere Aminosäuren, wie Alanin, Aspartat und Phosphoserin, umgewandelt werden (Fig. 1, 4b) 43 .

Im Gegensatz zu den zuvor erwähnten von Glutamin abgeleiteten Aminosäuren, die Glutamat als Stickstoffdonor benötigen, benötigt Asparagin Glutamin für die de novo-Synthese (Abb. 1, 2e, 4b). Glutamin ist ein Substrat für die Asparagin-Synthetase (ASNS), das Aspartat mit Amid-Stickstoff versorgt, um Asparagin zu produzieren. Arginin ist eine weitere Aminosäure, die verwendet wird, um nichtessentielle Aminosäuren zu synthetisieren. Es kann als Vorläufer von Prolin oder als zusätzliche Glutamatquelle dienen, beides über die Zwischenstufe von 1-Pyrrolin-5-carboxylat (P5C) (Fig. 1) 56 . 1-Pyrrolin-5-Carboxylat-Reduktase (PYCR) wandelt P5C in Prolin um und 1-Pyrrolin-5-Carboxylat-Dehydrogenase (P5CDH kodiert durch ALDH4A1) katalysiert die Umwandlung von P5C in Glutamat 57 . Serin und Glycin sind eng verwandt und können durch Serinhydroxymethyltransferase (SHMT1 und 2) ineinander umgewandelt werden (Fig. 1) 58 . SHMT ist eines der Schlüsselenzyme im Folat-vermittelten Ein-Kohlenstoff-Stoffwechsel. Der Ein-Kohlenstoff-Metabolismus umfasst sowohl den Folat- als auch den Methionin-Zyklus und stellt Methylgruppen für die Ein-Kohlenstoff-Pools bereit, die für die De-novo-Nukleotid-Biosynthese und DNA-Methylierung erforderlich sind 59 . Tetrahydrofolat (THF) dient als universeller Ein-Kohlenstoff-Akzeptor und kann einen Kohlenstoff aus der Umwandlung von Serin in Glycin (Folat-Zyklus), der Oxidation von Glycin zu CO ., aufnehmen2 und NH3 durch das Glycin-Spaltungssystem (GCS) 6 oder die Umwandlung von Methionin in Homocystein (Methionin-Zyklus) 59 . Ein Kohlenstoff-gebundenes THF existiert in verschiedenen Oxidationsstufen (5,10-Methylentetrahydrofolat (5,10-meTHF), 5-Methyl-THF, Formiat (10-Formyl-THF)) und unterstützt unterschiedliche biosynthetische Funktionen, z. B. 5 ,10-meTHF für die Pyrimidin-Biosynthese und 5-Methyl-THF für die Purin-Biosynthese 59 .

ein Umkehrtranssulfurierungsweg: Cystein kann aus Methionin über den umgekehrten Transsulfurierungsweg hergestellt werden. Dieser Weg ist eine Kombination aus dem Methioninzyklus und dem Transsulfurierungsweg. Homocystein, das Zwischenprodukt des ersten Schrittes im Transsulfurierungsweg, wird aus dem Methionin-Zyklus gebildet. Serin kondensiert mit Homocystein und produziert Cystathionin. Cystathionin wird dann durch CGL in Cystein und Alpha-Ketobutyrat umgewandelt. Schlüsselenzyme sind im roten Kreis. THF-Tetrahydrofolat, CBS-Cystathionin-β-Synthase, SAM-S-Adenosylmethionin, CGL-Cystathionin-γ-Lyase. B Polyaminsynthese: Polyamine (Putrescin, Spermin und Spermidin) werden aus der Aminosäure Arginin synthetisiert und in eine andere umgewandelt (in der Reihenfolge Putrescin zu Spermidin zu Spermin). SAM als Vorläufer von dcSAM ist der Hauptdonor für den Aufbau von Polyaminstrukturen. Schlüsselenzyme sind im roten Kreis. ODC-Ornithin-Decarboxylase, AMD S-Adenosylmethionin-Decarboxylase, SAM S-Adenosylmethionin, dcSAM decarboxyliertes S-Adenosylmethionin. C Stickstoff- und Kohlenstoffquelle für Nukleinsäuren: Aspartat, Glycin und Glutamin liefern Stickstoff, und Glycin und Ein-Kohlenstoff-Einheiten aus dem Folatzyklus (als Formiat) liefern Kohlenstoff für Purine. Glycin ist der indirekte Vorläufer von Formiat durch den Ein-Kohlenstoff-Stoffwechsel und liefert Formiat für biochemische Reaktionen in der Purinbiosynthese. Aspartat und Glutamin sind die wichtigsten Aminosäuren, die an der Pyrimidinsynthese beteiligt sind. Kohlenstoff (C) ist gelb und Stickstoff (N) ist grün. D GSH und NADPH als Antioxidantien: Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) binden und schädigen zelluläre Makromoleküle. Die Oxidation von NADPH und GSH ermöglicht es, ROS in einen inaktiven Zustand zu reduzieren. GSH reduziert Wasserstoffperoxid zu Wasser und wird durch GPX zu GSSG oxidiert. Oxidiertes Glutathion (GSSG) wird dann durch GR in Gegenwart von NADPH wieder zu GSH reduziert. Enzyme sind in roten Kreisen dargestellt. GPX-Glutathionperoxidase, GR-Glutathionreduktase, GSH-reduziertes Glutathion, GSSG-oxidiertes Glutathion, NADPH-reduziertes Nicotinamidadenindinucleotidphosphat, NADP+ oxidiertes Nicotinamidadenindinucleotidphosphat. e Amidierungsreaktion für die Asparagin-Synthese: Asparagin wird durch eine Amidotransferase-Reaktion synthetisiert, katalysiert durch Asparagin-Synthetase (ASNS). Der konservierte Stickstoff der Amidgruppe befindet sich in einem roten Kästchen, während das Enzym in einem roten Kreis dargestellt ist.

Die schwefelhaltige Aminosäure Methionin kann Cystein über den umgekehrten Transsulfurierungsweg bereitstellen ( 2a ). Aus dem Methionin-Zyklus erzeugtes Homocystein wird mit Serin zu Cystathionin durch Cystathionin-&bgr;-Synthase (CBS) kondensiert und wird dann durch Cystathionin-&ggr;-Lyase (CGL) in Cystein umgewandelt ( 2a ). Die Umwandlung von Methionin in Cystein ist mit der Serin-Glycin-Umwandlung verbunden, da der Methionin-Zyklus Teil des Ein-Kohlenstoff-Stoffwechsels ist, der mit dem Folat-Zyklus gekoppelt ist, wo SHMT die Serin-Glycin-Synthese katalysiert (Abb. 1) 6 . Obwohl Asparagin nicht direkt an der NEAA-Biosynthese beteiligt ist, wirkt es als Aminosäureaustauschfaktor und fördert die Aminosäureaufnahme, vorzugsweise von Serin/Threonin und unpolaren Aminosäuren 60 , und kann möglicherweise die weitere Synthese von Bausteinen unterstützen.

Aminosäuren liefern sowohl Kohlenstoff als auch Stickstoff für die Nukleinsäuresynthese (Abb. 2c). Die Purinbiosynthese erfordert Formiat, Bicarbonat und drei Aminosäuren: Aspartat, Glycin und Glutamin. Während Glutamin und Aspartat als Stickstoffquelle für beide Nukleobasen (N1 aus Aspartat und N3 und N9 aus Glutamin) und die Aminogruppe der Purine (Glutamin für Adenin und Aspartat für Guanin) fungieren, kann Glycin auf zwei Arten zur Purinbiosynthese beitragen: direkter Einbau in das Purin-Rückgrat (C4, C5 und N7) oder durch Herstellung von Ein-Kohlenstoff-Einheiten für biochemische Reaktionen, die an der Purin-Biosynthese beteiligt sind (C2 und C8) (Fig. 2c) 5 . Der kritische Träger von Ein-Kohlenstoff-Einheiten im letzteren Verfahren ist 5,10-meTHF. 5,10-meTHF wird weiter in Formiat (10-Formyl-THF) umgewandelt und trägt C2- und C8-Kohlenstoffatome zur Nukleobase 4,7,61 bei. Die Pyrimidin-Biosynthese ist einfacher als die von Purin. Im Gegensatz zu Purinen, die als Ribonukleotide und nicht als Nukleobasen synthetisiert werden, werden Pyrimidine zuerst als Nukleobasen synthetisiert und dann an Phosphoribosylpyrophosphat (PRPP) konjugiert, um das entsprechende Ribonukleotid zu ergeben. Der Pyrimidinring leitet sich von Glutamin, Aspartat und Bicarbonat ab. Bei der Pyrimidinsynthese wirkt Aspartat sowohl als Kohlenstoff- als auch als Stickstoffdonor (N1, C4, C5 und C6), während Glutamin zu N3 der Nukleobasen- und Aminogruppe von Cytosin beiträgt (Fig. 2c) 4 . Die aus der Umwandlung von Serin in Glycin abgeleitete Ein-Kohlenstoff-Einheit wird für die Thymidylat-Synthese benötigt. 5,10-meTHF dient als Ein-Kohlenstoff-Donor, um eine Methylgruppe auf Desoxyuridinmonophosphat (dUMP) zu übertragen und Desoxythymidinmonophosphat (dTMP) zu produzieren, eine durch Thymidylat-Synthase (TS) katalysierte Reaktion 7,8 .

Neben ihrer primären Rolle bei der Biosynthese von stickstoffhaltigen Metaboliten können Aminosäuren Kohlenstoffatome für die Lipidbiosynthese liefern. Unter Hypoxie trägt Glutamin zu den Acetyl-CoA-Pools bei, die für die Lipogenese benötigt werden, indem es in Pyruvat umgewandelt wird, das wieder in den TCA-Zyklus eintritt 46,62 . BCAAs können auch zur Lipogenese beitragen. In differenzierten Adipozyten nimmt der katabole Fluss von BCAA zu und BCAA-abgeleitetes Acetyl-CoA macht ungefähr 30% der lipogenen Acetyl-CoA-Pools aus 3,63 . Essentielle Aminosäuren (EAAs) fungieren nicht nur als Kohlenstoffspender, sondern ihr Verhältnis kann auch die Lipogenese regulieren, indem sie die lipogene Genexpression beeinflusst 64 . In Brustepithelzellen von Rindern das „optimale“ Aminosäureverhältnis (AA) (OPAA = Lys:Met 2,9:1 Thr:Phe 1,05:1 Lys:Thr 1,8:1 Lys:His 2,38:1 Lys:Val 1,23:1) reguliert die lipogene Genexpression hoch und verändert die Expression wichtiger miRNAs, die an der Kontrolle des lipogenen Gleichgewichts beteiligt sind, was eine potenziell wichtige Rolle der EAA-Verhältnisse bei der Lipidsynthese impliziert 64 . Es wäre interessant zu sehen, ob dies bei anderen Arten sowie bei Krebs konserviert ist.


Diskussion

In diesem Beitrag präsentieren wir die erste Constraint-basierte Modellrekonstruktion und Analyse des Energiestoffwechsels in Leishmanien infantum, dem Erreger einer lebenswichtigen vernachlässigten Tropenkrankheit, der viszeralen Leishmaniose. Ausgehend von unserer einfachen modellbasierten Studie untersuchen wir die verschiedenen Facetten der Leishmanien infantum Energiestoffwechsel und zeigen neue Merkmale des Parasitenstoffwechsels unter verschiedenen Umweltbedingungen auf. Das Modell berücksichtigt zentrale Stoffwechselprozesse, die die ATP-Synthese und die Produktion von Schlüsselzwischenprodukten umfassen, die für die Produktion/das Wachstum von Biomasse essentiell sind. Darüber hinaus besteht das Modell aus Reaktionen, die in 5 verschiedene Kompartimente —Vierzellular�s Glykosom (charakteristisches Kompartiment der Trypanosomatiden), das Mitochondrium, den mitochondrialen Intermembranraum und das Zytosol sowie ein extrazelluläres für den Austausch und den Transport von Metaboliten von der Zelle zum Umgebung. Hier ist vor allem zu beachten, dass keines der bisherigen Constraint-basierten Modelle das mitochondriale Intermembranraum-Kompartiment berücksichtigt hat [15, 17, 51]. Die Einbeziehung dieses Kompartiments war zwingend erforderlich, da der durch oxidative Phosphorylierung aufgebaute Protonengradient an die ATP-Synthese zwischen Mitochondrium und Intermembranraum gekoppelt ist und nicht an das Zytosol. Basierend auf einschlägigen Literaturnachweisen und geeigneter Sequenzanalyse wurden Reaktionen spezifischen subzellulären Orten im Modell zugeordnet (was ein hohes Vertrauen für solche Reaktionen mit starken Literaturnachweisen gibt). Als Ergebnis konnten etwa 54 Reaktionen mit hoher Sicherheit ihren entsprechenden Orten zugeordnet werden.

Das metabolische Netzwerk iAS142 wurde mittels Flussbilanzanalyse im Hinblick auf eine neuartige metabolische Bedarfs-/Biomasse-Reaktion analysiert, die unter Verwendung von 13C-Isotopenanreicherungsdaten von entwickelt wurde L.mexikanisch Promastigoten, die in Medium mit 13C-markierter Glucose gezüchtet wurden [19]. Keines der früheren auf Einschränkungen basierenden FBA-Modelle [15�] hat 13C-Isotopendaten zur Entwicklung der Biomassereaktion verwendet. Aus der Modellanalyse und -validierung geht die Stärke der iAS142-Biomasse bei der genauen Vorhersage der komplizierten Details von L. infantum Stoffwechsel recht gut nachgewiesen werden konnte. Darüber hinaus wurde die Biomasse von iAS142 mit dem Biomasseziel verglichen, das aus einer zuvor veröffentlichten Trypanosoma cruzi iSR215-Modell zur Aufklärung des Einflusses des Biomasseziels auf die Reaktionsflussverteilung [15]. Das Ziel dieser Analyse war es, die Bedeutung der Biomassereaktion und der Variation der Reaktionsflüsse unter Berücksichtigung einer anderen Biomassefunktion hervorzuheben. Dies führt auch zu einem gewissen Maß an Kontrolle, das bei der Durchführung von Modellierungsstudien mit FBA aufrechterhalten werden sollte.

Eine zweistufige Validierung des Modells wurde durchgeführt, um seine Bedeutung für die Vorhersage der tatsächlichen metabolischen Aspekte, wie sie aus verschiedenen experimentellen Studien wahrgenommen wurden, zu bewerten. Die erste Phase der Modellvalidierung wurde durch die Vorhersage von Wachstumsphänotypen unter Verwendung von in silico Reaktions-Knockout-Analyse und Vergleich mit experimentell bekannten Phänotypen. In Bezug auf verfügbare Informationen zum Knockout-Phänotyp in Leishmanien, konnte das Modell die entsprechenden bekannten Wachstumsphänotypen im Zusammenhang mit 7 Reaktions-Knockouts mit einer absoluten Genauigkeit von 100 % vorhersagen. Abgesehen von Validierungszwecken lieferte die Reaktions-Knockout-Studie einen klaren biologischen Einblick in die entscheidende Rolle, die jede Reaktion in L. infantum Energiestoffwechsel. Auch wenn es unangemessen ist, die Modellvorhersagen mit Trypanosoma Arten, die stadienspezifische Unterschiede im Stoffwechsel aufweisen und in anderen Umgebungen leben als Leishmanien, wurden die Modellvorhersagen mit verfügbaren nicht-stadienspezifischen Trypanosoma Knockout-Phänotypdaten, nur um die Tatsache weiter zu betonen, dass das Modell tatsächlich war Leishmanien spezifische biologische Argumente für jeden einzelnen Gendeletionsphänotyp, der vom Modell vorhergesagt wurde. Insgesamt 61 letale Reaktionen wurden durch Einzelreaktionsdeletionen im Netzwerk identifiziert und 55 nicht triviale letale Reaktionspaare wurden als essentiell durch Doppelreaktionsdeletionen vorgeschlagen. Jede dieser Deletionen stellt ein vielversprechendes Wirkstoffziel und eine experimentell überprüfbare Hypothese dar, die wir weiter betrachteten, um die chemotherapeutischen Interventionsszenarien für 9 Reaktionen aufzuzeigen, die aus der Modellreaktions-Knockout-Analyse als essentiell für das Parasitenwachstum vorhergesagt wurden.

Obwohl die Modellvorhersagen normalerweise durch Reaktions-Knockouts validiert werden, gibt es drei wichtige Mängel bei der Validierung eines Constraint-basierten Modells durch Reaktions-Knockout-Studien [15]. Erstens, weil keine vollständigen Knockout-Daten spezifisch für L. infantum, viele Knockout-Validierungen wurden nicht gemacht L. infantum Daten allein, aber auch unter Berücksichtigung von Daten anderer Trypanosomatiden-Arten. Zweitens, da es sich bei dem hier betrachteten Modell nicht um ein Modell auf Genomskala handelt, könnte es andere wesentliche Wege geben, die mit dem Kernenergiestoffwechsel verbunden sind, aber im Modell nicht berücksichtigt werden. Daher ist es möglich, dass das Modell eine nicht-tödliche Reaktion vorhersagt, auch wenn sie im gesamten Genom-Skalen-Kontext tödlich sein könnte oder umgekehrt. Drittens wurden die experimentellen Knockout-Daten zu Validierungszwecken aus heterogenen Studien gesammelt, die möglicherweise unterschiedliche experimentelle Bedingungen oder Medien berücksichtigt haben, um Knockouts zu erzeugen, die in unserem Modell nicht explizit implementiert sind. Daher ziehen wir es vor, die Modellreaktions-Knockout-Analyse als Prädiktor für essentielle Gene zu verwenden, die für das Parasitenwachstum erforderlich sind, anstatt als Grundlage für die Validierung unseres Modells.

Um die Einschränkungen der Validierung durch Reaktions-Knockout-Studien zu überwinden, haben wir durch eine Robustheitsanalyse in Bezug auf Änderungen der Sauerstoffaufnahme in unserem Modell versucht, das Modell zu validieren, indem wir Modellbedingungen identifizierten, um die Sekretion von Überlauf-Metaboliten zu erkennen. Leishmanien Es ist bekannt, dass es einen Überlauf-Stoffwechsel aufweist, bei dem es eine beträchtliche Menge an Succinat, Acetat, Pyruvat, CO . absondert2 und geringe Mengen Laktat [57, 58]. Diese Sekretion wird weitgehend durch Unterschiede in den Sauerstoff- und Glukosekonzentrationen im Medium gesteuert. Bei Variation sowohl der Glucose- als auch der Sauerstoffaufnahme konnten wir die Sekretion aller oben genannten Überlauf-Metaboliten beobachten. Genauer gesagt entdeckte die Modellrobustheitsanalyse die Sekretion von Laktat über die D-Lactat-Dehydrogenase-Reaktion, was einer der wichtigsten Aspekte war, die bestätigen, dass das Modell tatsächlich ist Leishmanien Spezifisch. Sequenzanalyse und Experimente weisen auf das Fehlen einer funktionellen D-Lactat-Dehydrogenase in Trypanosoma Arten [6, 72, 74]. Obwohl, Trypanosoma Spezies gezeigt haben, dass sie anstelle von D-Lactat L-Lactat-Sekretion zeigen, der Weg für diesen Mechanismus ist noch unbekannt [6]. Hinsichtlich der Produktion und Sekretion von Leishmanien spezifische Überlauf-Metaboliten, konnte das Modell entsprechend validiert werden.

Aus dem Modell wurden Promastigoten- und Amastigoten-spezifische Stoffwechselszenarien erstellt, um die stadienspezifischen Unterschiede im Energiestoffwechsel von L. infantum. 13C isotopenaufgelöste Metabolomik in L. mexikanisch Entwicklungsstadien zeigten eine Verringerung der Glukoseaufnahme, Glutamataufnahme und Sekretion von Überlaufmetaboliten bei axenischen Amastigoten im Vergleich zu Promastigoten [19]. In ähnlicher Weise konnten wir nach Einbeziehung des Amastigoten-Szenarios in unser Modell die reduzierte Rate der Glucose- und Glutamataufnahme und den reduzierten Austausch von Überlaufmetaboliten mit der experimentell bei Amastigoten beobachteten Umgebung erfassen. In Bezug auf andere Kohlenstoffquellen verringerte sich auch die Aufnahme anderer nicht-essentieller Aminosäuren wie Aspartat, Prolin und Alanin. Als Ergebnis konnte im Amastigoten-Szenario eine starke Verringerung der Glykolyse, des TCA-Zyklus, der ATP-Synthese und der Reaktionsflüsse des Aminosäuremetabolismus beobachtet werden. Außerdem wurde eine deutliche Verringerung der extrazellulären Sauerstoffaufnahme und der Freisetzung von Wasserstoffionen beobachtet, was wahrscheinlich die Anpassung des Parasiten an die hypoxische und saure Umgebung der menschlichen Makrophagen anzeigt. Trotz der erheblichen Verringerung der Reaktionsflüsse war der Fluss durch Transketolase-Reaktionen im Amastigoten-Szenario im Vergleich zum Promastigoten-Szenario hoch, was auf eine Hyperaktivierung des Pentosephosphat-Shunts bei der Deckung des Bedarfs an Glucose-6-Phosphat unter Glucosemangelbedingungen hindeutet. Sowohl im Promastigot- als auch im Amastigot-Stoffwechselszenario führte die Schließung der Glucoseaufnahme auch bei einer Fülle anderer Aminosäuren zur Abschaffung des Parasitenwachstums, was bedeutet, dass Glucose die wichtigste und essentiellste Kohlenstoffquelle ist, die von beiden Entwicklungsstadien des Parasiten bevorzugt wird, obwohl sie in ganz anderen Umgebungen existieren.

Die Reaktions-Knockout-Studien könnten die Enzyme der Succinat-Fermentation als essentiell für das Wachstum des Organismus vorhersagen, was auf die Rolle des Succinat-Fermentationsweges bei der Aufrechterhaltung eines Redoxgleichgewichts innerhalb des Glykosoms durch Regenerierung der NAD-Moleküle, die von den Enzymen des oberen glykolytischen Weges verbraucht werden, hindeutet [6, 18]. Darüber hinaus zeigten die Ergebnisse für Modellsimulationen sowohl mit nur Glukose als auch mit Glukose, ergänzt mit Aminosäuren, die Auffüllung des TCA-Zyklus durch C4-Dicarbonsäure-Zwischenprodukte wie Malat, Fumarat und Succinat, die über den Succinat-Fermentationsweg hergestellt werden, was die Bedeutung der glykosomalen Succinat-Fermentation in TCA-Anaplerose. Durch die Verfolgung der Flussverteilung durch die Modellreaktionen konnten wir annehmen, dass der Hauptgrund für die Aktivierung der Succinatfermentation der Bedarf an Glutamatsynthese durch die Glutamatdehydrogenase- und Aspartataminotransferase-Reaktionen war. Das gleiche wurde beim 13C-aufgelösten Energiestoffwechsel in beobachtet L. mexikanisch Promastigoten [18]. Wichtig ist hier zu beachten, dass es sich um die Netzwerkstruktur der L. infantum Energiestoffwechsel, wie er im iAS142-Modell implementiert ist, das dieses Stoffwechselverhalten steuert. Über denselben Stoffwechselweg wird auch die zelluläre Energieerhaltung des Parasiten erreicht. Dieser spezielle Weg wurde auch in den Promastigoten- und Amastigoten-Szenarien des Energiestoffwechsels, die im Modell nachgebildet wurden, bevorzugt. Faszinierenderweise sagten Modellreaktions-Knockout-Studien auch voraus, dass die zytosolische NADPH–-abhängige Glutamatdehydrogenase entscheidend für Leishmanien infantum. All diese Informationen weisen auf die Rolle der Succinatfermentation und der Glutamatbiosynthese bei der Ankurbelung des Energiestoffwechsels hin und belegen weiter die Tatsache, dass die Enzyme der Succinatfermentation und Glutamatbiosynthese möglicherweise neue therapeutische Angriffspunkte für die L. infantum Parasit.

Als Teil des rationalen Arzneimitteldesigns in Leishmanien Spezies wird die Identifizierung neuer Wirkstoff-Targets in einer frühen Entdeckungsphase immer wichtiger, um neue niedermolekulare Inhibitoren zu entwickeln, die als potenzielle Wirkstoffkandidaten gegen den Parasiten dienen können [22, 24]. Das Entwicklungsstadium der Amastigoten ist das begehrteste für die Wirkstoffforschung, da es die Ursache für Infektionen beim Menschen ist. Gen-Essentialitätsstudien in metabolischen Netzwerken identifizieren wahrscheinliche chemotherapeutische Ziele, indem die Rolle eines bestimmten Proteins beim Wachstum des Organismus qualitativ bewertet wird [17, 75�]. Um die Anwendbarkeit der FBA-basierten Modellanalyse bei der quantitativen Vorhersage und Kategorisierung wesentlicher Reaktionen als gute Wirkstoffziele weiter zu demonstrieren, haben wir in silico Chemotherapeutische Interventionsszenarien innerhalb unseres vom Modell angenommenen Amastigoten-Stadiums für 9 wesentliche Reaktionen, vorhergesagt von in silico Reaktions-Knockout-Analyse, die im iAS142-Modell durchgeführt wurde. Durch teilweises Reduzieren des optimalen Flusswertes jeder dieser individuellen Reaktionen im Amastigoten-Szenario wurde durch diese Simulation eine minimale Hemmschwelle identifiziert, die ein Chemotherapeutikum auf jede Reaktion ausüben muss, um ein Null-Parasitenwachstum zu erreichen. Dementsprechend zeigten die Vorhersagen, dass bei Glutamat-Dehydrogenase- und Phosphoglucomutase-Reaktionen im Vergleich zu den anderen 7 Reaktionen eine minimale Verringerung der Enzymaktivität/des Reaktionsflusses zu einem sofortigen Rückgang des Parasitenwachstums führte, was ihre Wahl als wichtiges Wirkstoffziel nahelegt.


Anmerkung des Herausgebers: Springer Nature bleibt in Bezug auf gerichtliche Ansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Ergänzende Abbildung 1 Subzelluläre Fraktionen sind für unterschiedliche Protein- und RNA-Marker angereichert.

ein, Weitfeld-Bildgebung intakter mES-Zellen (links), mES-Kerne nach Zytosolextraktion, jedoch ohne Nonidet P-40 (NP-40) Detergens in Puffer (Mitte, Kontrolle) und mES-Kerne nach Zytosolextraktion und ER-Entfernung (rechts). Kernfärbung (DAPI) in Blau und ER-Tracker-Farbstoff in Rot. B, Western Blots von Proteinmarkern für verschiedene subzelluläre Kompartimente für HEK293-Zellen. Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) für die zytoplasmatische Fraktion (cy), kleine nukleäre Ribonukleoprotein U1-Untereinheit 70 (SNRP70) für die nukleoplasmatische Fraktion (np) und Histon H3 für die Chromatinfraktion (ch). Zum Vergleich ist Protein aus der ganzen Zelle (wc) gezeigt. C, RT-qPCR von RNA-Markern verschiedener Zellkompartimente. Für GAPDH und U1 zielen die RT (Reverse Transkription)-Primer auf gespleißte (reife) mRNAs, wohingegen für ACTIN-mRNA ein Intron als Ziel dient. d-e, Western-Blots von Proteinmarkern für mES-Zellen mit (d) DMSO-Behandlung und (e) NAI-N3-Behandlung. ACTIN für die zytoplasmatische und nukleoplasmatische Fraktion (cy und np), die kleine nukleäre Ribonukleoprotein U1-Untereinheit 70 (SNRP70) für die nukleoplasmatische Fraktion (np) und Histon H3 für die Chromatinfraktion (ch).

Ergänzende Abbildung 2 Reverse Transkriptionsstopps in den icSHAPE-Experimenten sind in Replikaten stark korreliert.

Kumulative Verteilungsdiagramme des Pearson-Korrelationskoeffizienten der Reversen Transkription stoppt in Replikaten von RNA-Fraktionen in Chromatin (ch), Nukleoplasma (np) und Zytoplasma (cy). Daten von DMSO-Replikaten werden in Rot angezeigt, in vitro NAI-N3 repliziert in Grün und in vivo NAI-N3 repliziert in Blau.

Ergänzende Abbildung 3 Qualitätskontrolle der icSHAPE-Reaktivität über Replikate, Fraktionen und unterschiedliche Mengen an RNAs.

ein,B, Streudiagramm und Pearson-Korrelationskoeffizienten der icSHAPE-Reaktivitäten zwischen jedem Paar von Replikaten und Fraktionen in der Maus (ein) und Mensch (B). C, Kumulatives Dichtediagramm des Pearson-Korrelationskoeffizienten der Anzahl von RT-Stopps zwischen Replikaten bei unterschiedlichen RNA-Expressionsschwellen. D, Streudiagramme der NAI-Reads-Zahl gegen RNA-seq. RPKM * Länge (nt).

Ergänzende Abbildung 4 Chromatin-Fraktionen sind für lncRNA und prä-mRNA (Intron) Strukturinformationen angereichert.

a-b, Strukturmodelle von (ein) Ribonuklease-P-RNA und (B) Signalerkennungspartikel (SRP) RNA. Modelle werden aus dem ViennaRNA-Webservice auf Basis von Daten aus der RNASTRAND-Datenbank generiert. Nukleotide sind mit icSHAPE-Scores aus der Nukleoplasmafraktion gefärbt. CHistogramme der Verhältnisse von lncRNAs gegenüber allen Transkripten in verschiedenen Zellkompartimenten für Mensch und Maus. DHistogramme der Verhältnisse der auf Introns kartierten Sequenzierungs-Reads gegenüber allen Transkripten in verschiedenen Zellkompartimenten für Mensch und Maus. z.B, Violinplot des Gini-Index von icSHAPE-Daten im Exon im Vergleich zum Intron in (e) mRNAs aus mES-Zellen, (F) mRNAs aus HEK293-Zellen ohne RBP-Bindungsstellen (20nt) und (g) mRNAs aus HEK293-Zellen, denen RBP-Bindungsstellen entzogen sind (100nt).

Ergänzende Abbildung 5 Die RNA-Struktur spielt eine zentrale Rolle bei der Verbindung von Transkription, Translation und RNA-Abbau.

a-i, Kernel-Dichte-Schätzung (KDE)-Plots (a,c,e,g), Streudiagramme (b,d,f,h) und Streudiagramme mit einem höheren Ablesetiefen-Cutoff (Ablesetiefe = 200) (ich) der Transkriptionsrate versus 5’UTR-RNA-Struktur im Chromatin, Translationseffizienz versus 5’UTR-RNA-Struktur im Zytoplasma, RNA-Halbwertszeit versus Volllängen-Transkript-RNA-Struktur im Nukleoplasma und RNA-Halbwertszeit versus RNA-Struktur im Zytoplasma. Der zweiseitige p-Wert wurde von der Python-Paketfunktion scipy.stats.pearsonr berechnet. J L, Streudiagramme der Transkriptionsrate gegen die 5’UTR-RNA-Struktur in Chromatin. Transkriptionsraten stammen aus veröffentlichten Datensätzen: Min, I. M. et al. Gene & Entwicklung. 25, 742–754, 2011 (J) und Tastemel, M. et al. Stammzellenres. 25, 250–255, 2017 (k). Translationseffizienz im Vergleich zur 5’UTR-RNA-Struktur im Zytoplasma (l). Daten zur Translationseffizienz stammen aus einem veröffentlichten Bericht (Yoshikawa, H. et al. eLife. 7, 2018).

Ergänzende Abbildung 6 Inverse Korrelationen der RNA-Halbwertszeiten mit RNA-Strukturen in verschiedenen Transkriptregionen und positive Korrelationen der RNA-Translationseffizienz mit der Transkriptionsrate.

ein, Dichtediagramm des Gini-Index mit Halbwertszeit in 5’UTR-, CDS- und 3’UTR-Regionen im Zytoplasma und Nukleoplasma. B, Dichteplot der Translationseffizienz gegen die Transkriptionsrate in mES-Zellen. Die Abbildung wird unter Verwendung veröffentlichter Daten generiert (Ingolia, N. T. et al. Zelle 147, 789–802, 2011, und Jonkers, I. et al. eLife. 3, 2014). Der zweiseitige p-Wert wurde mit der Python-Paketfunktion berechnet scipy.stats.pearsonr.

Ergänzende Abbildung 7 RNA ist im Chromatin weniger strukturiert als im Zytoplasma.

Heatmaps der durchschnittlichen icSHAPE-Scores verschiedener RNA-Typen in verschiedenen RNA-Fraktionen in Mensch (einschließlich und ausschließlich aller bekannten RNA-Bindungsprotein (RBP)-Bindungsstellen) und Maus. Gestrichelte Linien repräsentieren unzureichende Daten.

Ergänzende Abbildung 8 M 6 A, Pseudouridylierung (Ψ) und HNRNPC-Bindungsstellen sind einzelsträngiger.

a-c, Metagene-Profile von icSHAPE-Scores bei (ein) m 6 A-Stellen im Vergleich zu Kontrollstellen (unmodifizierten) mit dem m 6 A-Motiv, (B) Pseudouridylierungs-(Ψ)-Stellen im Vergleich zu zufälligen U-Stellen und (C) HNRNPC-Bindungsstellen im Vergleich zu Kontrollstellen mit dem polyU-Motiv. Die p-Werte wurden durch den einseitigen Mann-Whitney-U-Test berechnet, rote Sterne bedeuten p-Werte von weniger als 0,01.

Ergänzende Abbildung 9 Viele RBP-Bindungsstellen sind in RNA-Strukturveränderungsregionen angereichert.

Die Anzahl der RBP-Bindungsstellen in den identifizierten Veränderungsregionen (rotes Dreieck) im Vergleich zu gemischten Veränderungsregionen (blaue Punkte).

Ergänzende Abbildung 10 Die Bindung von LIN28A und IGF2BP3 an ihre Ziel-RNAs wird durch die m 6 A-Modifikation beeinflusst.

ein,B, RNA-Pull-down-Assays und RBP Western-Blots von RNA-Sonden verwendet, die nicht-modifizierten A, m 6 A enthält, und U-Mutation jeweils von (a) Transkripte IGF2BP3 bindet, und (b) LIN28A Binds bis m 6 A-Stellen mit roten ist markiert 'm'. Histogramme zeigen RNA-Pulldown mit drei Replikaten. Western-Blots werden mit (a) Anti-IGF2BP3-Antikörper oder Anti-LIN28A-Antikörper nach RNA-Pulldown durchgeführt. Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung der Replikate dar. C, Überlappung von Lin28a-Bindungsstellen (einschließlich sowohl in Mettl3-Knockout (KO) als auch in Wildtyp-(WT)-mES-Zellen) und m 6 A-Stellen. Für diese überlappenden Stellen bindet Lin28a stärker an 45 von 68 Stellen in Mettl3-KO, im Vergleich zu 23 von 68 Stellen in WT-mES-Zellen.


<p>Dieser Abschnitt bietet nützliche Informationen über das Protein, hauptsächlich biologisches Wissen.<p><a href='/help/function_section' target='_top'>Mehr. </a></p> Funktion i

Elektroneutraler Transporter der Plasmamembran, der die zelluläre Aufnahme der zweiwertigen Metallkationen Zink, Mangan und Eisen vermittelt, die für Gewebehomöostase, Stoffwechsel, Entwicklung und Immunität wichtig sind (PubMed:15642354, PubMed:27231142, PubMed:29621230).

Funktioniert als energieabhängiger Symporter, der durch die Membranen einen elektroneutralen Komplex aus einem zweiwertigen Metallkation und zwei Bicarbonatanionen transportiert (durch Ähnlichkeit).

Neben diesen endogenen zellulären Substraten kann Cadmium auch ein nicht-essentielles Metall importieren, das zytotoxisch und krebserregend ist (durch Ähnlichkeit).

Kontrolliert die zelluläre Aufnahme von systemischem Zink durch das Darmepithel, das wiederum erforderlich ist, um die Tight Junctions und die Darmpermeabilität aufrechtzuerhalten (nach Ähnlichkeit).

Modifiziert die Aktivität von Zink-abhängigen Phosphodiesterasen und reguliert dadurch indirekt G-Protein-gekoppelte Rezeptor-Signalwege, die für die Gluconeogenese und Chondrozytendifferenzierung wichtig sind (nach Ähnlichkeit).

Reguliert die Insulinrezeptor-Signalgebung, Glukoseaufnahme, Glykogensynthese und Gluconeogenese in Hepatozyten durch den zinkabhängigen intrazellulären Katabolismus von Insulin (PubMed:27703010).

Durch die Aufnahme von Zink spielt die zelluläre Aufnahme auch eine Rolle bei der Anpassung der Zellen an den Stress des endoplasmatischen Retikulums (durch Ähnlichkeit).

Als wichtiger Mangantransporter der basolateralen Membran von Darmepithelzellen spielt es eine zentrale Rolle bei der systemischen Manganhomöostase durch die Manganaufnahme im Darm (PubMed:31028174).

Auch an der extrazellulären Manganaufnahme durch Zellen der Blut-Hirn-Schranke beteiligt (PubMed:31699897).

Kann auch eine Rolle bei der Mangan- und Zinkhomöostase spielen, die an ihrer Elimination aus dem Blut durch die hepatobiliäre Ausscheidung beteiligt ist (durch Ähnlichkeit).

Funktioniert auch bei der extrazellulären Aufnahme von freiem Eisen. Kann auch intrazellulär wirken und den Transport von durch Transferrin endozytosiertem Eisen von Endosomen zum Zytosol vermitteln (PubMed:20682781).

Spielt eine Rolle bei der angeborenen Immunität, indem es die Expression von Zytokinen durch aktivierte Makrophagen reguliert (PubMed:23052185).

<p>Manuell kuratierte Informationen, die von einem verwandten experimentell charakterisierten Protein propagiert wurden.</p> <p><a href="/manual/evidences#ECO:0000250">Mehr. </a></p> Manuelle Behauptung, abgeleitet aus Sequenzähnlichkeit zu i

<p>Manuell kuratierte Informationen, für die experimentelle Beweise veröffentlicht wurden.</p> <p><a href="/manual/evidences#ECO:0000269">Mehr. </a></p> Manuelle Behauptung basierend auf dem Experiment in i


Systemische Metabolic-Engineering-Strategien für den Bau von Zellfabriken

Maofang-Teng, . Guoqiang Zhang , in Systeme und synthetischer Metabolismus , 2020

6.3 Design und Konstruktion neuartiger biologischer Teile/Systeme

Synthetische Biologie ist ein aufstrebendes Forschungsgebiet, das als Design und Konstruktion neuartiger künstlicher biologischer Pfade beschrieben werden kann, darunter (1) das Design und der Bau neuer biologischer Teile, Geräte und Systeme und (2) die Neugestaltung bestehender natürlicher biologische Systeme für nützliche Zwecke. Synthetische Biologie, integriert mit ingenieurwissenschaftlichem Denken, ist ein interdisziplinäres Forschungsgebiet, das auf der Grundlage moderner Biologie und Systemwissenschaften entwickelt wurde. Es umfasst Molekularbiologie, Zellbiologie, Evolutionäre Systematik, Biochemie, Informatik, Mathematik, Computertechnologie und Ingenieurwesen und andere multidisziplinäre Disziplinen. Mit anderen Worten, Synthetische Biologie ist das Engineering der Biologie: die Synthese komplexer, biologisch basierter (oder inspirierter) Systeme, die Funktionen aufweisen, die in der Natur nicht existieren. Diese technische Perspektive kann auf alle Ebenen der Hierarchie biologischer Strukturen angewendet werden – von einzelnen Molekülen bis hin zu ganzen Zellen, Geweben und Organismen. Im Wesentlichen wird die Synthetische Biologie das Design biologischer Systeme auf rationale und systematische Weise umsetzen. Wissenschaftliche biologische Systeme sind ein komplexes und unvorhersehbares Ganzes, die molekularen Kernkomponenten werden durch Techniken und Strategien der synthetischen Biologie kontinuierlich optimiert, entworfen und zusammengesetzt, um die biologischen Funktionen bestehender Systeme zu verbessern, biologische Zusammensetzungen zu simulieren und zu konstruieren, die zur Schaffung neuer biologischer Funktionen beitragen und Systeme [13] . Durch künstliches Entwerfen und Konstruieren biologischer Systeme werden den Menschen leistungsfähigere Theorien, Werkzeuge und erweiterte intellektuelle Perspektiven bei der Lösung von Energie-, Material-, Umweltschutz- und Gesundheitsproblemen an die Hand gegeben [14] .

1978 wurde die Ideologie der synthetischen Biologie erstmals von einem polnischen Wissenschaftler vorgeschlagen, der darauf hinwies, dass die Entdeckung der Restriktionsendonuklease den Menschen nicht nur Werkzeuge für die DNA-Rekombination lieferte, sondern auch vorhandene Gene zur Erforschung und Herstellung neuer Gene nutzen könnte. Dadurch würden die Menschen in ein neues Feld geführt, nämlich in die synthetische Biologie [15] . In den letzten Dutzenden von Jahren hat sich die synthetische Biologie rasant entwickelt. Kolisnychenko et al. reduzierte die Genomgröße durch das Löschen einiger Gene von Escherichia coli ohne seine grundlegende Lebensfunktion zu beeinträchtigen, was den Weg für die Genommodifikation mikrobieller Stämme ebnete [16] . Keaslinget al. [17] erhielt Artemisinsäure durch synthetische biologische Methoden in Saccharomyces cerevisiae, die die Vorstufe des Antimalariamittels ist. Darüber hinaus ist die DNA-Synthese eine der Technologien, die die Entwicklung der synthetischen Biologie vorantreiben. Später haben Gibson et al. synthetisierte und assemblierte ein kleines Bakteriengenom, das ohne DNA auf eine andere Bakterienzelle übertragen wurde, wodurch eine neuartige autonome replizierbare mikrobielle Zelle entstand [18] . Gegenwärtig erleichtert die synthetische Biologieforschung auf der Grundlage der Genomtechnologie, die technische Strategien, standardisierte biologische Komponenten und die Konstruktion universeller biologischer Module verwendet, das Design und den Aufbau künstlicher biologischer Systeme mit spezifischen neuen Funktionen.

In den letzten Jahren wurden die Werkzeuge und Strategien der Synthetischen Biologie kontinuierlich erweitert und verbessert. Durch den Bau und die Modulation biologischer Teile, das Design und den Bau neuer Stoffwechselwege ist es hilfreich, Stämme zu entwickeln, die eine bessere Leistung zeigen und die Ausbeute an biologischen Produkten verbessern, die für den Menschen nützlich sind.Hier werden die wichtigsten Forschungsfortschritte, Anwendungen und Errungenschaften von Instrumenten und Strategien der synthetischen Biologie der letzten Jahre unter den Aspekten des Protein-Engineerings und biologischer Teile für die feinkontrollierte Genexpression vorgestellt ( Abb. 6.1 ).

Abbildung 6.1. Repräsentative Strategien der Synthetischen Biologie und des Metabolic Engineering für den Bau von Zellfabriken.

Zu den Werkzeugen und Strategien der synthetischen Biologie gehören Promotor/RBS-Bibliothek, RNA-basierte Gen-Herunterregulierung/Gen-Überexpression, CRISPR-basierte Gen-Editierung/-Herunterregulierung, synthetisches Gerüst und so weiter.

6.3.1 Protein-Engineering zur Verbesserung der Elementeigenschaften

Synthetische Biologie erfordert im Allgemeinen die Entwicklung zellulärer Stoffwechselwege. Der übliche Weg, Stoffwechselwege zu entwerfen und zu modifizieren, besteht darin, heterogene Proteinkomponenten in bestehende zelluläre Wege einzubringen und sogar vorhandene Proteine ​​​​auszuschalten [19] . Bisher stammen die meisten in der synthetischen Biologie verwendeten Komponenten aus natürlichen Organismen. Da die synthetische Biologie darauf abzielt, neue biologische Systeme zu konstruieren, sind relativ unabhängige Proteinmodule erforderlich, die zusammengebaut werden können. Die aus der Natur gewonnenen Enzyme sind jedoch durch das Substrat und die Umgebung begrenzt und können die gewünschten Eigenschaften und Aktivitäten nicht vollständig erfüllen. Daher ist es notwendig, modulare und standardisierte Proteinmodule zu entwickeln, wie z. B. die Verbesserung der Enzymeigenschaften durch Einführung neuer Proteinkatalysefunktionen, um neue Synthesewege zu konstruieren und die Effizienz der Stoffwechselwege zu optimieren, die Veränderung regulatorischer Proteine ​​zur Manipulation von Stoffwechselwegen und die Etablierung von Proteingerüsten für die Metabolitenkanalisierung [20 ] .

Protein-Engineering hat das Potenzial, neuartige funktionelle Proteine ​​zu schaffen. Computergestütztes Proteindesign ist ein strukturbasierter Ansatz zur Proteinmodifikation. Anhand spezifischer Studien wie der Charakteristik der Reaktion und der Substratstruktur werden das Design neuer Proteinsequenzen, Strukturen und Funktionen in Abhängigkeit von Strukturen und atomistische Computersimulationen durchgeführt, um eine gerichtete Evolution katalytischer Komponenten zu realisieren und intelligente Bibliotheken aufzubauen [21] . Computergestützte Proteindesign-Tools können genutzt werden, um die Kerndomäne der Proteinstruktur zu identifizieren, Zielstellen für das Engineering bereitzustellen und sogar zuzulassen de novo Design von Enzymen. Dies kann die Material-, Zeit- und Arbeitskosten erheblich reduzieren. Um beispielsweise eine neue Substratspezifität zu erreichen, haben Liu et al. [22] gestalteten bestehende Protein-Ligand-Wechselwirkungen basierend auf katalytischen Mechanismen neu, um die Substratspezifität zu verändern. Sie entwarfen die Liponsäureligase (lpal), indem sie das Volumen der Enzymbindungstasche vergrößerten, und erhielten schließlich eine Fluorophorligase mit Aktivität auf Resorufin. Siegelet al. [6] erhielt ein Enzym durch de novo Design, das die Diels-Alder-Reaktion mit hoher Stereoselektivität und Substratspezifität katalysiert.

Durch den Aufbau und die Modifikation von Proteinmodulen kann auch der Fluss in biosynthetischen Stoffwechselwegen erhöht werden. Es ist bekannt, dass synthetische Proteingerüste oder Fusionsproteine ​​verwandte Enzyme räumlich kolokalisieren können, um die lokale Enzymkonzentration zu erhöhen und die Effizienz der Produktsynthese zu verbessern. Dueber et al. [23,24] exprimierte Gerüste mit einer modularen Protein-Protein-Interaktionsdomäne zur Optimierung des Flusses konstruierter Stoffwechselwege in vivo. Die Gerüste in den Stoffwechselwegen erhöhen die Effizienz und produzieren sogar bei relativ niedrigen Enzymkonzentrationen höhere Produkttiter, was die Diffusion von Zwischenprodukten effektiv reduzieren und möglicherweise die Reaktionsgeschwindigkeit durch Änderung der Wechselwirkung von Gerüstproteinen erhöhen kann. Diese Strategie wurde auch erfolgreich angewendet, um die Effizienz des Mevalonat-Biosynthesewegs zu steigern. Lewickaet al. [25] drückten die Fusion von Pyrylatdecarboxylase (Pdc) und Alkoholdehydrogenase (AdhB) in E coli, deren Ethanolproduktivität höher war als die von Zellen, die Pdc und AdhB coexprimieren.

Darüber hinaus kann die räumliche Organisation von Proteinen aus zellulären Komponenten toxische Zwischenprodukte wirksam begrenzen, lokale Konzentrationen von Enzymen und Zwischenprodukten erhöhen und unnötige Nebenreaktionen verhindern. Die Kompartimentierung kann durch die Nutzung der natürlichen Organellen in eukaryontischen Zellen erreicht werden. Prokaryontische Zellen können ein bakterielles Mikrokompartiment (BMC) aufbauen, ähnlich wie Organellen in eukaryontischen Zellen. Das BMC besteht aus einer Proteinhülle und kapselt die Enzyme ein, die mit dem Biosyntheseweg verbunden sind [26]. Zum Beispiel die Einführung eines heterologen Acetoin-Wegs in die Mitochondrien von Candida glabrata erhöht die Konzentration von Enzymen und Zwischenprodukten. Nach Kopplung mit dem mitochondrialen Pyruvat-Carrier (MPC) war die Produktion von Acetoin im Vergleich zum zytoplasmatischen Weg um 59,8 % erhöht [27]. Das Bakteriophagen-Lyse-Protein E wurde in rekombinante BMCs verkapselt, die die Zellen vor der Toxizität schützen könnten [28] .

6.3.2 Design und Engineering von biologischen Teilen

Mit der Entwicklung der Molekularbiologie werden Gensequenzen weiter als verschiedene funktionelle Module klassifiziert, um den Prozess der Transkription und Translation besser zu verstehen, wie Promotoren, Repressoren, Aktivatoren, Transkriptionseinheiten, Proteinkodierungsregionen, Ribosomenbindungsstellen und Terminatoren. Eine große Anzahl bekannter funktioneller biologischer Teile ist jedoch nicht standardisiert und zeigten Inkompatibilität, was zu inkonsistenter Arbeit zwischen Komponenten, stark reduzierter Effizienz oder Unfähigkeit, Funktionen auszuüben, führte. Neue biologische Teile sollten entworfen und synthetisiert werden, indem existierende oder völlig neue biologische Komponenten modifiziert werden, um ein gewünschtes biologisches System aufzubauen.

Mit der Weiterentwicklung der DNA-Sequenzierungs- und DNA-Synthesetechnologie wurden die Kosten für die Gensynthese und den Zusammenbau gesenkt, was synthetische DNA ermöglicht. Die DNA-Synthese beinhaltet die Neugestaltung von Zielgensequenzen und regulatorischen Sequenzen. DNA-Sequenzen mit den gewünschten Funktionen in verschiedenen Stoffwechselwegen können selektiv synthetisiert werden, um die Auswirkungen der Stoffwechselregulation zu vermeiden in vivo.

Um einen schnellen Aufbau biologischer Teile und Wege zu erreichen, haben Forscher eine Reihe neuer DNA-Assembly-Techniken entwickelt, die den Grundstein für den Bau hocheffizienter synthetischer Biologiesysteme legen. Die Golden Gate-Zusammensetzung verwendet ein spezielles Restriktionsenzym vom Typ IIS, um die DNA-Erkennungsstelle zu spalten, um ein variables klebriges Ende zu erzeugen, und verwendet dann DNA-Ligase, um einen nahtlosen Zusammenbau mehrerer DNA-Fragmente zu erreichen [29]. Gibsonet al. [30] entwickelten das Gibson-Assembly-Splicing-Multi-Segment, ein isothermes, narbenfreies Ein-Schritt-Verfahren. Vektoren mit DNA-Fragment-überlappender Region und mehreren DNA-Fragmenten werden bei der Reaktion mit Exonuklease gespalten und einem nahtlosen Zusammenbau unter der synergistischen Wirkung von DNA-Ligase und DNA-Polymerase unterzogen. Ligase Cycling Assembly (LCA) ist ein Ansatz zum Zusammenbau kürzerer Oligonukleotide oder doppelsträngiger DNA-Fragmente zu größeren DNA-Strukturen [31]. Darüber hinaus gibt es andere Genassemblierungstechnologien wie Polymerase Cycling Assembly (PCA) [32] , BioBrick Assembly [33] und Emulsion PCA [34] . In den letzten Jahren haben Wang et al. [35] entwickelten eine Multiplex-Automated Genome Engineering (MAGE)-Technologie, bei der die Vielfalt der Genkombinationen durch gleichzeitige Mutation mehrerer Stellen in erreicht wird E coli Chromosom basierend auf einzelsträngiger DNA (ssDNA). Diese Methode wurde in S. cerevisiae und entwickelte Hefe-Oligo-vermitteltes Genom-Engineering (YOGE) [36]. Darüber hinaus können genomische Techniken, die auf transkriptionellen Aktivator-ähnlichen Effektornukleasen (TALENs) und Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat Sequences (CRISPR) basieren, die gentechnisch verändert wurden, Schnitte einführen oder doppelsträngige DNA an bestimmten Stellen aufbrechen und Gene editieren [37] , die in der synthetischen Biologie weit verbreitet sind. Die Entwicklung von Gen-Assembly- und Gen-Editing-Technologien ermöglicht die transkriptionelle Kontrolle natürlicher und synthetischer Genome sowie die gerichtete Evolution von Genclustern in vivo oder in vitro, erleichtert die Umgestaltung von Biosynthesewegen und beschleunigt dadurch die Optimierung von gentechnisch veränderten mikrobiellen Zellen.

Aufgrund der großen biosynthetischen Gencluster (BGC) von Naturstoffen und der komplexen Regulation ist es schwierig, das entsprechende Gen durch genetische Manipulation genau zu steuern. Diese BGCs können aus mehreren Genen bestehen, die in einem oder mehreren Operons unter der komplexen und redundanten Regulation von außerhalb oder innerhalb des Gens angeordnet sind, wie Promotoren, eingebetteter Feedforward- und Feedback-Zyklus [38,39]. Daher ist es schwierig, das Expressionsniveau eines einzelnen Gens in den BGCs eines Naturprodukts zu ändern. Ebenso werden künstlich konstruierte und konstruierte biologische Komponenten und Systeme zwangsläufig auf Organismen zur Kultivierung und Funktion übertragen. Die Signalübertragungswege und Stoffwechselnetzwerke von Organismen können jedoch einige Auswirkungen auf synthetische biologische Komponenten und Systeme haben. Diese Faktoren haben Forscher dazu veranlasst, Gene und sogar Genome basierend auf DNA-Konstruktionstechniken, einschließlich DNA-Synthese und DNA-Assembly-Technologie, zu vereinfachen und zu rekonstruieren. Es könnte die synthetischen biologischen Systeme für technische Bemühungen zugänglicher machen. Während des Gene-Refactorings werden alle untranslatierten Regionen, regulatorischen Proteingene und nicht-essentiellen Gene entfernt. Dann werden Codons essentieller Gene verändert und mit dem Computer gescannt, um die interne Regulation zu eliminieren [39] . Durch das Löschen nicht-essentieller Gene und das Beibehalten essentieller Gene, die mit individuellen Lebensaktivitäten verbunden sind, kann das Genom vereinfacht und der Hintergrund der Chassis-Zellen leicht definiert und analysiert werden. So refaktorierten die Forscher beispielsweise das Genom des Bakteriophagen T7 [40] . Diese modularen DNA-Assembly-Schemata erleichtern die Entstehung einer Kombination von Regulationsstrategien des Manipulationsweges. Der erste Schritt besteht darin, einen optimalen Weg zu entwerfen, wenn die Stoffwechselwege natürlicher und nicht-natürlicher Chemikalien rekonstruiert werden. Als nächstes können die aus Organismen stammenden Kandidatenenzyme heterolog oder in Kombination eingeführt werden, um neue Stoffwechselwege zu etablieren. Der kombinatorische Aufbau und die Rekonstitution metabolischer Netzwerke regulieren die Expression verwandter Enzyme, um die Synthese von Naturstoffen wie Artemisininsäure [41] und Catechin [42] zu optimieren.


Informationen zum Autor

Mitgliedschaften

Virginia Commonwealth University, Richmond, VA, USA

João MP Alves, Myrna G Serrano und Gregory A Buck

BAMBOO Team, INRIA Grenoble-Rhône-Alpes, Villeurbanne, Frankreich

Cecilia C Klein & Marie-France Sagot

Laboratoire Biométrie et Biologie Evolutive, CNRS, UMR5558, Université de Lyon, Université Lyon 1, Villeurbanne, Frankreich

Cecilia C Klein & Marie-France Sagot

Laboratório Nacional de Computação Científica, Petrópolis, Rio de Janeiro, Brasilien

Cecilia C. Klein & Ana Tereza R. Vasconcelos

Department of Parasitology, Institute of Biomedical Sciences, University of São Paulo, São Paulo, Brasilien

João MP Alves, Flávia Maia da Silva, André G. Costa-Martins, Marta MG Teixeira & Erney P. Camargo

Laboratório de Ultraestrutura Cellular Hertha Meyer. Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brasilien