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DNA-Replikation in $ E. coli $

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$ E.coli $ hat eine zirkuläre DNA, was wohl impliziert, dass ein Strang den äußeren Kreis bildet und der andere den inneren. Gibt es also eine Möglichkeit zu wissen, ob die replizierte DNA den äußeren oder inneren Kreis bildet? Im beigefügten Bild ist zu sehen, dass die replizierte DNA den inneren Kreis bildet. Erwähnt wird auch, dass es nicht möglich ist, einzelne Stränge durch TEM zu erkennen.


14.4 DNA-Replikation in Prokaryoten

Am Ende dieses Abschnitts können Sie Folgendes tun:

  • Erklären Sie den Prozess der DNA-Replikation in Prokaryoten
  • Besprechen Sie die Rolle verschiedener Enzyme und Proteine ​​bei der Unterstützung dieses Prozesses

Die DNA-Replikation wurde in Prokaryoten hauptsächlich wegen der geringen Größe des Genoms und wegen der großen Vielfalt an verfügbaren Mutanten gut untersucht. E coli hat 4,6 Millionen Basenpaare in einem einzigen kreisförmigen Chromosom und alles wird in ungefähr 42 Minuten repliziert, beginnend an einer einzigen Stelle entlang des Chromosoms und um den Kreis in beide Richtungen fortschreitend. Dies bedeutet, dass pro Sekunde ungefähr 1000 Nukleotide hinzugefügt werden. Somit ist der Prozess recht schnell und erfolgt ohne viele Fehler.

Die DNA-Replikation verwendet eine große Anzahl von Strukturproteinen und Enzymen, von denen jedes eine entscheidende Rolle während des Prozesses spielt. Einer der Hauptakteure ist das Enzym DNA-Polymerase, auch bekannt als DNA pol, das Nukleotide nacheinander an die wachsende DNA-Kette anfügt, die komplementär zum Matrizenstrang ist. Die Addition von Nukleotiden erfordert Energie, diese Energie wird aus den Nukleosidtriphosphaten ATP, GTP, TTP und CTP gewonnen. Wie ATP, der andere NTPs (Nukleosidtriphosphate) sind hochenergetische Moleküle, die sowohl als Quelle für DNA-Nukleotide als auch als Energiequelle zum Antrieb der Polymerisation dienen können. Wenn die Bindung zwischen den Phosphaten „aufgebrochen“ ist, wird die freigesetzte Energie verwendet, um die Phosphodiester-Bindung zwischen dem ankommenden Nukleotid und der wachsenden Kette zu bilden. In Prokaryonten sind drei Haupttypen von Polymerasen bekannt: DNA-Pol I, DNA-Pol II und DNA-Pol III. Es ist nun bekannt, dass DNA pol III das für die DNA-Synthese erforderliche Enzym ist. DNA pol I ist ein wichtiges akzessorisches Enzym bei der DNA-Replikation und wird zusammen mit DNA pol II hauptsächlich für die Reparatur benötigt.

Woher weiß die Replikationsmaschinerie, wo sie anfangen soll? Es stellt sich heraus, dass es spezifische Nukleotidsequenzen gibt, die als bezeichnet werden Ursprünge der Replikation wo die Replikation beginnt. In E coli, das einen einzigen Replikationsursprung auf seinem einen Chromosom hat (wie die meisten Prokaryoten), dieser Replikationsursprung ist ungefähr 245 Basenpaare lang und ist reich an AT-Sequenzen. Der Replikationsursprung wird von bestimmten Proteinen erkannt, die an diese Stelle binden. Ein Enzym namens Helikase wickelt die DNA ab, indem es die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den stickstoffhaltigen Basenpaaren aufbricht. Für diesen Prozess ist eine ATP-Hydrolyse erforderlich. Wenn sich die DNA öffnet, entstehen Y-förmige Strukturen namens Replikationsgabeln sind geformt. Am Replikationsursprung werden zwei Replikationsgabeln gebildet, die mit fortschreitender Replikation bidirektional erweitert werden. Einzelsträngige Bindungsproteine ​​umhüllen die DNA-Einzelstränge in der Nähe der Replikationsgabel, um zu verhindern, dass sich die einzelsträngige DNA in eine Doppelhelix zurückwindet.

DNA-Polymerase hat zwei wichtige Einschränkungen: Sie kann Nukleotide nur in 5'- 3'-Richtung hinzufügen (ein neuer DNA-Strang kann nur in dieser Richtung verlängert werden). Es erfordert auch eine freie 3'-OH-Gruppe, an die es Nukleotide anhängen kann, indem es eine Phosphodiesterbindung zwischen dem 3'-OH-Ende und dem 5'-Phosphat des nächsten Nukleotids bildet. Dies bedeutet im Wesentlichen, dass es keine Nukleotide hinzufügen kann, wenn keine freie 3'-OH-Gruppe verfügbar ist. Wie fügt es dann das erste Nukleotid hinzu? Das Problem wird mit Hilfe eines Primers gelöst, der das freie 3'-OH-Ende bereitstellt. Ein anderes Enzym, RNA-Primase, synthetisiert ein RNA-Segment, das etwa fünf bis zehn Nukleotide lang und komplementär zur Matrizen-DNA ist. Da diese Sequenz die DNA-Synthese ankurbelt, wird sie passenderweise als Primer bezeichnet. DNA-Polymerase kann nun diesen RNA-Primer verlängern, indem sie nacheinander Nukleotide hinzufügt, die komplementär zum Matrizenstrang sind (Abbildung 14.14).

Visuelle Verbindung

Frage: Sie isolieren einen Zellstamm, bei dem die Verbindung von Okazaki-Fragmenten gestört ist und vermuten, dass eine Mutation in einem Enzym an der Replikationsgabel aufgetreten ist. Welches Enzym ist am wahrscheinlichsten mutiert?

Die Replikationsgabel bewegt sich mit einer Geschwindigkeit von 1000 Nukleotiden pro Sekunde. Topoisomerase verhindert das Überwinden der DNA-Doppelhelix vor der Replikationsgabel, wenn sich die DNA öffnet, indem sie vorübergehende Kerben in der DNA-Helix verursacht und sie dann wieder versiegelt. Da sich die DNA-Polymerase nur in 5'- nach 3'-Richtung erstrecken kann und die DNA-Doppelhelix antiparallel, liegt ein kleines Problem bei der Replikationsgabel vor. Die beiden DNA-Matrizenstränge haben entgegengesetzte Orientierungen: ein Strang ist in 5' nach 3'-Richtung und der andere in 3' nach 5'-Richtung orientiert. Nur ein neuer DNA-Strang, der zum 3'-5'-Eltern-DNA-Strang komplementär ist, kann kontinuierlich zur Replikationsgabel hin synthetisiert werden. Dieser kontinuierlich synthetisierte Strang wird als Leitstrang bezeichnet. Der andere Strang, der komplementär zur 5'-zu-3'-elterlichen DNA ist, wird in kleinen Fragmenten, die als Okazaki-Fragmente bekannt sind, von der Replikationsgabel weg verlängert, von denen jedes einen Primer benötigt, um die Synthese zu starten. Neue Primersegmente werden in Richtung der Replikationsgabel abgelegt, jedoch jeweils davon wegweisend. (Okazaki-Fragmente sind nach dem japanischen Wissenschaftler benannt, der sie zuerst entdeckt hat. Der Strang mit den Okazaki-Fragmenten wird als nacheilender Strang bezeichnet.)

Der führende Strang kann von einem einzelnen Primer verlängert werden, während der nachlaufende Strang für jedes der kurzen Okazaki-Fragmente einen neuen Primer benötigt. Die Gesamtrichtung des nacheilenden Strangs beträgt 3' bis 5' und die des führenden Strangs 5' bis 3'. Ein Protein, das als Gleitklemme bezeichnet wird, hält die DNA-Polymerase an Ort und Stelle, während sie weiter Nukleotide hinzufügt. Die Gleitklemme ist ein ringförmiges Protein, das an die DNA bindet und die Polymerase an Ort und Stelle hält. Im weiteren Verlauf der Synthese werden die RNA-Primer durch DNA ersetzt. Die Primer werden durch die Exonuklease-Aktivität von DNA pol I entfernt, die DNA hinter der RNA als eigenen Primer verwendet und die Lücken füllt, die durch die Entfernung der RNA-Nukleotide durch Hinzufügen von DNA-Nukleotiden entstanden sind. Die Zwischenräume, die zwischen der neu synthetisierten DNA (die den RNA-Primer ersetzte) und der zuvor synthetisierten DNA verbleiben, werden durch das Enzym DNA-Ligase versiegelt, das die Bildung von Phosphodiester-Bindungen zwischen dem 3'-OH-Ende eines Nukleotids und dem 5'-Ende katalysiert. Phosphatende des anderen Fragments.

Sobald das Chromosom vollständig repliziert wurde, wandern die beiden DNA-Kopien während der Zellteilung in zwei verschiedene Zellen.

Der Prozess der DNA-Replikation lässt sich wie folgt zusammenfassen:

  1. DNA entwickelt sich am Replikationsursprung.
  2. Helicase öffnet die DNA-bildenden Replikationsgabeln diese werden bidirektional verlängert.
  3. Einzelstrang-bindende Proteine ​​umhüllen die DNA um die Replikationsgabel herum, um ein Zurückspulen der DNA zu verhindern.
  4. Topoisomerase bindet an der Region vor der Replikationsgabel, um Supercoiling zu verhindern.
  5. Primase synthetisiert RNA-Primer, die komplementär zum DNA-Strang sind.
  6. DNA-Polymerase III beginnt, Nukleotide an das 3'-OH-Ende des Primers hinzuzufügen.
  7. Die Dehnung sowohl des nacheilenden als auch des führenden Strangs setzt sich fort.
  8. RNA-Primer werden durch Exonuklease-Aktivität entfernt.
  9. Lücken werden von DNA pol I durch Zugabe von dNTPs gefüllt.
  10. Die Lücke zwischen den beiden DNA-Fragmenten wird durch DNA-Ligase verschlossen, die bei der Bildung von Phosphodiester-Bindungen hilft.


Tabelle 14.1 fasst die an der prokaryotischen DNA-Replikation beteiligten Enzyme und deren Funktionen zusammen.


Dichtegradientenzentrifugation

Eine kleine DNA-Menge in einer konzentrierten Cäsiumchlorid-Lösung wird zentrifugiert, bis sich das Gleichgewicht fast angenähert hat. Die gegenläufigen Prozesse Sedimentation und Diffusion haben dann einen stabilen Konzentrationsgradienten des Cäsiumchlorids erzeugt. Die Konzentrations- und Druckgradienten führen zu einer kontinuierlichen Zunahme der Dichte entlang der Fliehkraftrichtung. Die in diesem Dichtegradienten vorhandenen Makromoleküle der DNA werden durch das Zentrifugalfeld in den Bereich getrieben, in dem die Lösungsdichte gleich ihrer eigenen Auftriebsdichte ist. 11 Dieser Konzentrationstendenz wird durch Diffusion entgegengewirkt, so dass im Gleichgewicht eine einzelne DNA-Spezies über eine Bande verteilt ist, deren Breite umgekehrt proportional zum Molekulargewicht dieser Spezies ist (Abb. 1).

UV-Absorptionsfotos, die aufeinanderfolgende Stadien der Bandenbildung der DNA von zeigen E coli. Ein Aliquot von Bakterienlysat, das ungefähr 10 8 lysierte Zellen enthielt, wurde bei 31.410 U/min in einer CsCl-Lösung wie im Text beschrieben zentrifugiert. Der Abstand von der Drehachse nimmt nach rechts zu. Die Zahl neben jedem Foto gibt die verstrichene Zeit nach Erreichen von 31.410 U/min an.

Wenn mehrere DNA-Spezies unterschiedlicher Dichte vorhanden sind, bildet jede eine Bande an der Stelle, an der die Dichte der CsCl-Lösung gleich der Auftriebsdichte dieser Spezies ist. Auf diese Weise kann mit schwerem Stickstoff (N 15 ) markierte DNA von unmarkierter DNA getrennt werden. Abbildung 2 zeigt die beiden Banden, die durch das Zentrifugieren einer Mischung aus ungefähr gleichen Mengen von N 14 und N 15 . entstanden sind Escherichia coli DNA.

ein: Die Auflösung von N 14 DNA aus N 15 DNA durch Dichtegradientenzentrifugation. Eine Mischung aus N 14 und N 15 Bakterienlysaten, die jeweils etwa 10 8 lysierte Zellen enthielten, wurde in CsCl-Lösung wie im Text beschrieben zentrifugiert. Das Foto wurde nach 24 Stunden Zentrifugation bei 44.770 U/min aufgenommen. B: Ein Mikrodensitometer-Tracing, das die DNA-Verteilung im Bereich der beiden Banden von Abb. 2 zeigtein. Der Abstand zwischen den Spitzen entspricht einer Auftriebsdichtedifferenz von 0,014 g. cm. -3

In dieser Arbeit wird auf das scheinbare Molekulargewicht von DNA-Proben Bezug genommen, das mittels Dichtegradientenzentrifugation bestimmt wurde. Die Überlegungen, auf denen solche Bestimmungen beruhen, sowie mehrere mögliche Fehlerquellen wurden erörtert. 12


VERORDNUNG DES DnaA-PROTEINS IN E coli

Überblick

Die Produktion und Tätigkeit von E coli Das DnaA-Protein wird auf verschiedene Weise reguliert: durch Transkription, intrazelluläre Lokalisierung und Konformation (Katayama et al. 2010 Leonard und Grimwade 2010 Kaguni 2011). DnaA-Protein ist stabil, aber spezifisch für den Replikationszyklus dnaA Gentranskription ist wichtig, um eine rechtzeitige Initiation der Replikation aufrechtzuerhalten (Bogan und Helmstetter 1997 Riber und Løbner-Olesen 2005). Dies kann durch die Rolle von ATP-DnaA bei der Aktivierung der Initiation erklärt werden (Kurokawa et al. 1999 Nishida et al. 2002) und die Idee, dass neu synthetisiertes DnaA bevorzugt ATP bindet, dessen zellulärer Spiegel 10 mal höher ist als der von ADP (Abb. 3).

Außerdem erfordert die rechtzeitige Initiierung der Replikation während des Zellzyklus spezifische chromosomale Regionen, die als DARS (DnaA-reaktivierende Sequenz) 1 und DARS2 bezeichnet werden. Diese Regionen binden ADP-DnaA-Moleküle und fördern die Regeneration von ATP-DnaA durch Nukleotidaustausch (Abb. 2 und 3) (Fujimitsu et al. 2009).

Es wurde geschätzt, dass je nach Stammhintergrund und Wachstumsrate 500–2000 DnaA-Moleküle pro Zelle vorhanden sind (Sekimizu et al. 1988 Chiaramello und Zyskind 1989 Hansen et al. 1991a). oriC kann 10–20 DnaA-Moleküle binden (Messer 2002). Eine beträchtliche Anzahl von DnaA-Molekülen kann an einem spezifischen chromosomalen Locus titriert werden, der als bezeichnet wird Daten die zur Unterdrückung von Rifamcipin-resistenten unregulierten Initiationsereignissen erforderlich ist (Abb. 2 und 3) (Kitagawa et al. 1998 Morigen et al. 2005).

Der ATP-DnaA-Spiegel schwankt während des Replikationszyklus und erreicht seinen Höhepunkt um den Zeitpunkt der Initiation (Kurokawa et al. 1999). Die ATP-DnaA-Hydrolyse ist erforderlich, um die ATP-DnaA-Spiegel nach der Initiation zu reduzieren (Fig. 3). Diese als RIDA (regulatorische Inaktivierung von DnaA) bezeichnete Regulation ist an die Wirkung des DNA-Polymerase III-Holoenzyms gekoppelt. RIDA ist entscheidend für die Regulierung der Initiation, sodass sie nur einmal pro Generation auftritt (Katayama et al. 1998 Kato und Katayama 2001 Su’etsugu et al. 2004 Camara et al. 2005).

Regulierung der DNAA Gen-Transkription

Es wurde festgestellt, dass die zelluläre DnaA-Konzentration unabhängig von Wachstumsmedium und Zellzyklus konstant ist (Hansen et al. 1991a). Allerdings ist die Transkription der dnaA Gen variiert in Abhängigkeit vom Replikationszyklus (Bogan und Helmstetter 1997). Der Hauptgrund für die Fluktuation scheint zu sein, dass die dnaA Genpromotor wird von SeqA für fast die gleiche Dauer wie der Ursprung sequestriert (Abb. 3 Tabelle 1) (Campbell und Kleckner 1990 Lu et al. 1994 Riber und Løbner-Olesen 2005). Während der Sequestrierung steht der Promotor der Transkriptionsmaschinerie nicht zur Verfügung. Weil das dnaA Gen liegt in der Nähe oriC, trägt dies dazu bei, die Produktion von DnaA und damit das Initiationspotenzial (d. h. die Fähigkeit, die Replikation zu initiieren) kurz nach Einführung neuer Replikationsgabeln zu reduzieren (Riber und Løbner-Olesen 2005). Die dnaA Der Promotorbereich enthält auch DnaA-Boxen und es wurde festgestellt, dass der Promotor zur Autoregulation fähig ist (Abb. 3 Tabelle 1) (Messer und Weigel 1997, Hansen et al. 2007). Übersetzung von dnaA mRNA ist nicht gut charakterisiert, aber es ist bekannt, dass das Startcodon GTG ineffizient in E coli.

Bindung von DNA an andere Sites als oriC

Wie erwähnt, fungiert das DnaA-Protein nicht nur als Initiator, sondern auch als Genregulationsprotein. Um das Chromosom herum gibt es etwa 300 hochaffine DnaA-Bindungsstellen und sehr viele niederaffine Stellen (Kitagawa et al. 1996 Roth und Messer 1998 Hansen et al. 2007). Wenn das Chromosom repliziert wird, werden die DnaA-Bindungsstellen dupliziert und tragen zur Titration von DnaA weg von bei oriC. Die wichtigste Titrationsstelle, Daten, liegt in der Nähe oriC und wird kurz nach Beginn der Replikation dupliziert (Kitagawa et al. 1996, 1998 Ogawa et al. 2002 Morigen et al. 2003, 2005). In-vivo-Studien zeigen, dass die Daten bindet durchschnittlich 60 DnaA-Moleküle (Hansen et al. 2007). Die Daten Standort sollte daher dazu beitragen, das Initiationspotenzial bei oriC Wenn oriC befindet sich noch in Beschlagnahme. Die Daten Die Stelle ist etwa 1 kb groß und enthält fünf hochaffine DnaA-Bindungsstellen und etwa 25 niederaffine Stellen (Fig. 2, Tabelle 1) (Kitagawa et al. 1996, 1998 Hansen et al. 2007). Die hochaffinen DNA-Boxen 2 und 3 sind entscheidend für die effiziente Bindung von DNA an Daten. Möglicherweise fungiert die an diese Stellen gebundene DnaA als Kern für eine weitere kooperative DnaA-Bindung (Ogawa et al. 2002). Die Produktion von DnaA-Protein während des Zellwachstums und die Bildung von Bindungsstellen bei der Replikation des Chromosoms sowie die Sequestrierung und RIDA wurden simuliert in silico (Hansen et al. 1991 Browning et al. 2004 Atlas et al. 2008) und kann darauf hinweisen, dass die Initiation erfolgt, sobald sich genügend ATP-DnaA bei . angesammelt hat oriC. Es wurde jedoch berichtet, dass Zellen mit ähnlicher Anzahl von Ursprüngen und chromosomalen DnaA-Bindungsstellen, aber unterschiedlichen Wachstumsbedingungen zu Beginn unterschiedliche Mengen an DnaA pro Ursprung enthalten (Torheim et al. 2000 Flåtten et al. 2009). Obwohl die Ursprungsfeuerung, sobald sich genügend ATP-DnaA angesammelt hat, ein attraktives Modell der Zellzyklusregulation ist, fehlt es jedoch selbst in den gut charakterisierten E coli Bakterium.

Regulation der DnaA-Nukleotidform durch DARS und saure Phospholipide

E coli Zellen können durch Nukleotidaustausch ADP-DnaA in ATP-DnaA umwandeln (Abb. 3) (Kurokawa et al. 1999 Fujimitsu et al. 2009). Die DARS1- und DARS2-Sequenzen fördern diese Reaktion und befinden sich auf halbem Weg innerhalb der intergenischen Region zwischen oriC und terC, rechts und links von oriC(Abb. 2A) (Fujimitsu et al. 2009). Ein gemeinsames Merkmal von DARS1 und DARS2 ist das Vorhandensein eines DnaA-Box-Clusters, in dem drei DnaA-Boxen ähnlich ausgerichtet sind und sich in ähnlicher Entfernung befinden (Abb. 2B). Mehrere ADP-DnaA-Moleküle können mit DARS Komplexe bilden, was die Freisetzung von ADP aus DnaA erleichtert. Die resultierenden Apo-DnaA-Moleküle werden wahrscheinlich aufgrund der reduzierten Komplexbildungsaktivität von DARS freigesetzt, was die Bindung von ATP und DnaA-Reaktivierung ermöglicht. Eine Erhöhung der zellulären Kopienzahl von DARS1 oder DARS2 erhöht den ATP-DnaA-Spiegel und induziert zusätzliche Initiationsereignisse, während das Löschen von DARS1 und DARS2 eine Verzögerung der Initiation verursacht (Fujimitsu et al. 2009). Neu übersetztes DnaA-Protein bindet ATP und versorgt die Zellen mit einem Grundspiegel an ATP-DnaA. Dies allein reicht jedoch nicht aus, um die Replikation rechtzeitig einzuleiten. Somit ist die Funktion von DARSs entscheidend für eine rechtzeitige Initiierung (Abb. 3 Tabelle 1). Die funktionelle Regulation von DARS muss noch geklärt werden, abgesehen von der Tatsache, dass jedes DARS neben der gemeinsamen Sequenz mit dem DnaA-Box-Cluster eine regulatorische Region enthält (Fujimitsu et al. 2009 Leonard und Grimwade 2009). Neben DARS spielen saure Phospholipide wie Cardiolipin und Phosphatidylglycerin eine wichtige Rolle bei der Nukleotidfreisetzung von ADP-DnaA (Sekimizu und Kornberg 1988), und DnaA wird durch Austausch des gebundenen Nukleotids in vitro in Gegenwart von oriC und ATP (Crooke et al. 1992). Die Reduktion der sauren Phospholipide in vivo kann die Initiation bei . hemmen oriC (Xia und Dowhan 1995), aber genau, wie saure Phospholipide die DnaA-Aktivität während des Zellzyklus beeinflussen, muss noch aufgeklärt werden.

Regulation der DNAA-Multimerbildung durch DiaA

DiaA bildet Homotetramere und jedes Protomer enthält eine spezifische Stelle zur Bindung an die DnaA-Domäne I (Fig. 3) (Ishida et al. 2004 Keyamura et al. 2007, 2009). Diese Eigenschaften ermöglichen es einem einzelnen DiaA-Tetramer, mehrere DnaA-Moleküle zu binden, was die kooperative Bindung von DnaA an stimulieren kann oriC und die Abwickelreaktion (Abb. 3 Tabelle 1). Die Bindung von ATP-DnaA an Bindungsstellen mit niedriger Affinität innerhalb von oriC wird durch DiaA erweitert (Abb. 1) (siehe Bell und Kaguni 2013 Leonard und Méchali 2013). In diaA-gestörte mutierte Zellen, Replikationsinitiation ist verzögert und Initiation bei Schwester oriC Kopien treten in schnell wachsenden Zellen asynchron auf (Ishida et al. 2004 Keyamura et al. 2007, 2009). Diese Daten stimmen mit der Beobachtung überein, dass die Replikation bei Mutanten, die DnaA-Box R4-deleted tragen, asynchron initiiert wird oriC (Bates et al. 1995), da die Bindung von DnaA an hochaffine DnaA-Box R4 die kooperative DnaA-Bindung an niedrigaffine Stellen verstärkt.

Nach dem Abwickeln von DUE in oriC Komplexe muss DiaA aus DnaA freigesetzt werden (Keyamura et al. 2009). Die DiaA-Bindungsstelle der DnaA-Domäne I wird auch verwendet, um DnaB-Helikase zu binden. Der Mechanismus der DiaA-DnaA-Dissoziation ist jedoch noch nicht aufgeklärt.

DiaA-Orthologe sind in Bakterienspezies evolutionär konserviert (Keyamura et al. 2007). Darüber hinaus ist das HobA-Protein von Helicobacter pylori (Hp), ein Mitglied der ε-Proteobakterien, weist funktionelle und strukturelle Ähnlichkeit mit DiaA auf, obwohl es keine signifikante Sequenzähnlichkeit gibt (Tabelle 1) (Natrajan et al. 2007, 2009 Zakrzewsak-Czerwinska et al. 2007 Zawilak-Pawlik et al.) 2007, 2011 Terradot et al. 2010).

Regulierung der DnaA-Nukleotidform durch RIDA

Nachdem ATP-DnaA die Replikationsinitiation fördert, wird es in Abhängigkeit von einem Komplex bestehend aus ADP-Hda-Protein und der DNA-beladenen Klammer hydrolysiert (Abb. 4 Tabelle 1) (Katayama et al. 1998 Kato und Katayama 2001 Su'etsugu ua 2008). Die resultierende ADP-DnaA ist bei der Initiation inaktiv. Dieses System wird als RIDA (regulatorische Inaktivierung von DnaA) bezeichnet. RIDA ist entscheidend für die DnaA-Inaktivierung und unterstützt dadurch effektiv die Initiation einmal pro Generation (Kurokawa et al. 1999 Camara et al. 2005 Riber et al. 2009). Die hda Gen wird benötigt, um die Zellproliferation zu fördern, den zellulären ATP-DnaA-Spiegel zu senken und die Überinitiierung zu unterdrücken (Kato und Katayama 2001 Fujimitsu et al. 2008 Charbon et al. 2011). Inkubation von temperaturempfindlichen hda mutierte Zellen bei der restriktiven Temperatur führen zu einer Überinitiierung der Replikation und induzieren eine Hemmung der Zellteilung, wodurch filamentöse Zellen entstehen (Fujimitsu et al. 2008). Es wird angenommen, dass die Hemmung der Zellteilung eine Folge der Checkpoint-Regulation ist, aber der genaue Mechanismus, durch den dies geschieht, ist unbekannt. DnaA AAA + Sensor II-Motiv Arg-334 wird spezifisch für die ATP-DnaA-Hydrolyse benötigt und die Expression eines mutierten DnaA R334A-Proteins verursacht eine Überinitiierung und Hemmung des Zellwachstums in an oriC-abhängige Weise (Tabelle 1) (Nishida et al. 2002).

Der grundlegende Mechanismus von RIDA. Wenn das DNA-Polymerase III-Holoenzym die Okazaki-Fragmentsynthese auf dem nacheilenden Strang vervollständigt, wird die Klammer-Untereinheit vom DNA-Polymerase III-Kern freigesetzt und verbleibt auf der synthetisierten DNA. ADP-Hda bindet an die hydrophobe Tasche der DNA-beladenen Form der Klammer über die Klammer-Bindungsmotive im Aminoterminus von Hda. Der resultierende ADP-Hda-Clamp-DNA-Komplex interagiert mit und fördert die DnaA-gebundene ATP-Hydrolyse, wodurch ADP-DnaA zurück in den DnaA-Zyklus freigesetzt wird. Die Interaktion zwischen den AAA + -Domänen von Hda und DnaA ist entscheidend und wird durch die Interaktion zwischen Hda und DnaA-Domäne IV (DNA-bindende Domäne) unterstützt. N, Hda-Aminoterminus I-II, DnaA-Domäne I-II III, DnaA-Domäne III (AAA + Domäne) IV, DnaA-Domäne IV (DNA-bindende Domäne).

Das Hda-Protein besteht aus einer kurzen aminoterminalen Region, die das Clamp-Bindungsmotiv enthält, und einer AAA + -Domäne, die homolog zur DnaA-Domäne III ist (Fig. 4) (Dalrymple et al. 2001 Kato und Katayama 2001 Kurz et al. 2004 Su' Etsugu ua 2005 Xu ua 2009). Das Hda-Clamp-Bindungsmotiv ist üblicherweise in Clamp-Bindungsproteinen wie der DNA-Polymerase III-Kern-Untereinheit α vorhanden (Dalrymple et al. 2001). Es bindet an die hydrophobe Tasche der Klammer, die dieselbe Stelle ist, an die die DNA-Polymerase III-Untereinheit α bindet (Dalrymple et al. 2001 Kurz et al. 2004 Su’etsugu et al. 2005). Die Hda AAA + Domäne bindet spezifisch ADP, aber nicht ATP (Su’etsugu et al. 2008). ADP-Hda ist monomer und in RIDA aktiv, während Apo-Hda multimer und in RIDA inaktiv ist (Su’etsugu et al. 2008). Die Hda AAA + -Domäne trägt einen spezifischen Arg-Rest (d. h. Arg-Finger), der für die Förderung der DnaA-ATP-Hydrolyse entscheidend ist (Su’etsugu et al. 2005). Dieser Rest kann an der Bildung des katalytischen Zentrums der ATP-Hydrolyse durch direkte DnaA-Hda-Wechselwirkung teilnehmen. Dies ist ein gemeinsames Merkmal vieler AAA+-Proteine ​​(Neuwald et al. 1999, Ogura et al. 2004 Indiani und O’Donnell 2006). Neben dem Arg-Finger werden für die DnaA-Hda-Interaktion und die DnaA-ATP-Hydrolyse spezifische Reste innerhalb der AAA + -Domänen von DnaA und Hda benötigt (Nakamura et al. 2010). Die DnaA-Domäne IV (DNA-Bindungsdomäne) fördert diese Interaktion durch Bindung an Hda (Abb. 4) (Keyamura und Katayama 2011).

Während der DNA-Elongation verbleiben die Klammern auf dem nacheilenden Strang, nachdem Okazaki-Fragmente synthetisiert wurden und der DNA-Polymerase-III-Kern freigesetzt wurde (Yuzhakov et al. 1996 Balakrishnan und Bambara 2013 Goodman und Woodgate 2013 Hedglin et al. 2013 MacAlpine und Almouzni 2013). DNA-beladene, DNA-Polymerase-freie Klammern binden ADP-Hda, was zur Aktivierung von RIDA führt (Su’etsugu et al. 2004, 2008). Darüber hinaus ist es möglich, dass Hda und die DNA-Polymerase-III-Untereinheit α an jedes Protomer der gleichen Klammer binden, weil eine Klammer ein Homodimer ist, damit Hda DnaA-ATP hydrolysieren kann, sobald Replikationsgabeln im Gange sind (Johnsen et al. 2011). DNA-freie Klammern sind in RIDA inaktiv, obwohl sie Hda binden können, was die rechtzeitige und replikationsgekoppelte Aktivierung von RIDA gewährleistet. Die die Klammer flankierende dsDNA-Region wird für RIDA benötigt und kann von DnaA erkannt werden (Abb. 4) (Su’etsugu et al. 2004).

Der ADP-Hda-Clamp-DNA-Komplex ist stabil, während die Affinität dieses Komplexes für DnaA schwach ist (Su’etsugu et al. 2008). Dies steht im Einklang mit der Tatsache, dass der Komplex für die zyklische Wechselwirkung mit mehreren ATP-DnaA-Molekülen wiederverwendet wird und nur etwa 100 Hda-Moleküle pro Zelle vorhanden sind (Katayama et al. 2010).

Das Hauptprinzip von RIDA, das die Verwendung von DNA-beladenen Klammern für eine replikationsgekoppelte negative Rückkopplung zum Initiatorprotein ist, ist evolutionär von Bakterien bis zu Eukaryoten, einschließlich Hefe, Xenopus, und menschliche Zellen (Tabelle 1) (Katayama et al. 2010 Zielke et al. 2012).


Südost-Student erforscht die DNA-Replikation von E. Coli in der NSF-Sommerforschung

Adrienne Brauer kennt sich als Langstreckenläuferin in den Cross Country- und Track-Teams der Southeast Missouri State University mit Vorbereitung, Trittfrequenz, Tempo und Tempo aus.

Diesen Sommer verwendet sie diese Fähigkeiten jedoch außerhalb des Kurses in einem Research Experiences for Undergraduates (REU) der National Science Foundation (NSF) an der Washington University in St. Louis, wo sie mit Dr. Petra Levin, Biologieprofessorin und Co-Direktorin von das Graduiertenprogramm Pflanzen- und Mikrobielle Biowissenschaften, das Einbringen der Stunden, die Vorbereitung auf die Graduiertenschule und das Sammeln der Erfahrungen für eine Karriere in der mikrobiologischen Forschung.

Adrienne aus Oakford, Illinois, weiß, dass Erfolg mit Training, Vorbereitung, Konditionierung, Überwindung der Hürden und dem Erreichen der Ziellinie einhergeht. Adrienne ist eine südöstliche Seniorin im Hauptfach Mikrobiologie mit einem Nebenfach in Chemie. Sie hofft, dass ihre Erfahrungen an der Washington University sie auf ihren nächsten Schritt auf ihrem Bildungsweg vorbereiten.

Adrienne sagt, dass sie diesen Sommer zusammen mit Postdoktoranden und anderen Studenten im Grundstudium forscht und untersucht E. coli Fähigkeit, unter Stress resistenter gegen Antibiotika zu werden. Sie sagt, sie studiert wie E coli replizieren ihre DNA während des schnellen Wachstums. Wenn die Zelle zu schnell wächst, als dass die DNA-Replikation mithalten kann, wird sie einer Multifork-Replikation unterzogen. Dies geschieht, wenn die DNA einer Zelle eine zweite (oder dritte oder vierte) Replikationsrunde beginnt, bevor die erste Runde abgeschlossen ist, sagte sie.

"Wir verwenden fluoreszierende Proteine, um bestimmte Stellen auf dem Chromosom zu markieren, und wenn Sie diese Zellen unter dem Mikroskop betrachten, sehen Sie, dass der Ursprung und das Ende hellrot und grün leuchten", sagte Adrienne. „Die Verwendung von Fluoreszenzbildgebung war für mich hier so eine tolle Erfahrung. Das von uns verwendete Mikroskop ist sehr High-Tech und ermöglicht es uns sogar, „Filme“ von Zellen zu machen, die über Stunden wachsen und sich bewegen.“

Später im Sommer plant sie, eine Handvoll Gene in die Stämme zu klonen, mit denen sie gearbeitet hat, und die Auswirkungen auf die DNA-Replikation zu beobachten.

„Meine Zeit im Labor war dank der zweijährigen Forschung, die ich im Labor von Dr. (Jeremy) Ellermeier im Südosten verbracht habe, besonders lohnend und produktiv“, sagte sie. „Er hat mir so viel beigebracht, was in Dr. Levins Labor ins Spiel gekommen ist!“

Adrienne besucht auch Seminare und Forschungskurse an der Washington University, um hilfreiche Fähigkeiten für die Graduiertenschule zu erlernen, wie z in einer Posterpräsentation ihrer Forschung zum Abschluss des Programms.

„Alle sind hilfsbereit und als Team haben sie mir schon so viel beigebracht“, sagte sie. „Ich habe einen Vorgeschmack darauf bekommen, wie meine Zukunft als Doktorand aussehen wird. Ich bin im Labor und besuche Workshops und Kurse bis zu neun Stunden am Tag, lerne etwas über Karrieren in den biologischen Wissenschaften, neue Wege zur Analyse von Bakterienzellen und wie ich ein unabhängigerer Forscher werden kann, der eigene Hypothesen erstellt.“

Außerhalb des Labors haben Adrienne und die anderen Praktikanten im Grundstudium an Kursen und Workshops teilgenommen, um ihre Forschungsfähigkeiten zu verbessern und sie auf die Graduiertenschule vorzubereiten.

Adrienne Brauer, Mitte, ist Mitglied des Südost-Frauen-Leichtathletikteams, das bei den jüngsten Leichtathletik-Meisterschaften der Ohio Valley Conference im Mai in Southeast den zweiten Platz belegte.

„Wir treffen uns und sprechen mit Fachleuten von Biotech-Unternehmen wie Pfizer und Bayer und führen persönliche Beratungsgespräche mit Fakultäten, die uns in die richtige Richtung führen, sei es eine Promotion, eine medizinische Fakultät oder ein MTSP (Medical .). Ausbildungsprogramm für Wissenschaftler“, sagte sie. "Bis Ende des Sommers werde ich zuversichtlich sein, mich bei einigen der besten Mikrobiologie-Programme des Landes zu bewerben."

Adrienne und ihre Mitpraktikanten haben auch St. Louis erkundet und haben im Danforth-Wohnheim eine Auszeit verbracht, wo sie abends inoffizielle Journalclubs veranstalteten, um die besten Möglichkeiten zur Beobachtung der Substratlokalisierung in Bakterien zu diskutieren, sagte sie. Sie hatten auch Spieleabende und da sie in der Nähe des Forest Parks wohnt, läuft sie auch fast jeden Tag im Park.

Sie sagt, sie schätze die Möglichkeit, diesen Sommer mit talentierten Studenten und Fakultätsmitgliedern in der NSF REU zusammenzuarbeiten.

„Ich bin umgeben von großartigen Profis auf dem Gebiet, in dem ich Karriere machen möchte“, sagte sie. „Ich füttere nicht nur meine Neugier in der Mikrobiologie, sondern lerne auch die Fähigkeiten und das Wissen, die ich brauche, um auf eine großartige Schule zu kommen. Ich plane, meinen Ph.D. in Mikrobiologie, und die Schulen mit den besten Programmen sind sehr wettbewerbsfähig. Diese REU wird mir ungemein helfen.”

Sie ist sich nicht sicher, wie ihre zukünftige Karriere aussehen wird, aber es wird definitiv Forschung beinhalten.

„So sehr ich es genossen habe, mit zu arbeiten Salmonellen Bei der SEMO kann ich es kaum erwarten, mich zu verzweigen und mit anderen Bakterien zu arbeiten. Ich würde gerne für die National Institutes of Health oder das CDC arbeiten, aber ich würde auch gerne selbst an einer Universität mit einem Forschungslabor lehren“, sagte sie.

Adrienne sagt, dass ihre Lehrer für Naturwissenschaften an der High School ihr Interesse an den Naturwissenschaften früh geweckt und sie auf den Weg in Naturwissenschaften, Technologie, Ingenieurwesen und Mathematik (MINT) gebracht haben.

„Sie forderten mich im Unterricht heraus und ließen mich die wissenschaftlichen Fragen lieben, die wirklich zum Nachdenken anregen, die für mich spannender waren, als nur die Definitionen von Vokabeln auswendig zu lernen“, sagte sie. „Der Aha-Moment, den ich beim Biologiestudium bekomme, ist unglaublich lohnend und lässt mich immer wieder zurückkommen“, sagte sie. „Es ist wirklich aufregend, die komplizierten Mechanismen zu verstehen, nach denen Zellen funktionieren, und die Entdeckung bisher unbekannter Mechanismen ist das Ziel, das wir verfolgen.“


Replikation in Prokaryoten

Die Replikation beginnt an einem bestimmten Startpunkt, der OriC-Punkt oder Replikon genannt wird. (Replikon: Es ist eine Einheit des Genoms, in der DNA repliziert wird, es enthält einen Startpunkt für die Initiation der Replikation) Dies ist der Punkt, an dem sich die DNA öffnet und einen offenen Komplex bildet, der zur Bildung eines Prepriming-Komplexes führt, um den Replikationsprozess einzuleiten.

Die OriC-Site befindet sich bei 74″ Minuten in der Nähe des ilv-Gens. Die OriC-Stelle besteht aus 245 Basenpaaren, von denen drei der 13 Basenpaare in vielen Bakterien hochkonserviert sind und die Konsensussequenzen (GATCTNTTNTTTTT) bilden. In der Nähe der OriC-Stelle gibt es vier von jeweils 9 Basenpaarsequenzen (TTATCCACA).

Die Abfolge der Reaktionen im Initiierungsprozess ist wie folgt:

a) Dna-A-Protein erkennt und bindet bis zu vier 9bp-Wiederholungen in OriC, um einen Komplex aus negativ superspiralisierter OriC-DNA zu bilden, die um einen zentralen Kern aus Dna-A-Proteinmonomeren gewickelt ist. Dieser Prozess erfordert die Anwesenheit von Histonen wie HU- oder 1HC-Proteinen, um die DNA-Biegung zu erleichtern.

b) Dna-A-Protein-Untereinheiten schmelzen dann nacheinander drei tandemartig wiederholte 13bp-Segmente in Gegenwart von ATP bei >=22*C (offener Komplex).

c) Das Dna A Protein leitet dann einen Dna B – Dna C Komplex in die geschmolzene Region, um einen sogenannten Prepriming-Komplex zu bilden. Anschließend wird die DNA C freigegeben. Dna B wickelt den offenen Komplex weiter ab, um einen Prepriming-Komplex zu bilden.

d) DNA-Gyrase, einzelsträngiges Bindungsprotein (SSB), Rep-Protein und Helicase – II werden an den Präprimierungskomplex gebunden und der Komplex wird jetzt als Primingkomplex bezeichnet.

e) In Gegenwart von Gyrase und SSB wickeln Helikasen die DNA weiter in beide Richtungen ab, um den Eintritt von Primase und RNA-Polymerase zu ermöglichen. Dann bildet die RNA-Polymerase einen Primer für die Synthese des führenden Strangs, während die Primase in Form eines Primers für die Synthese des Primosoms für die Synthese des nachlaufenden Strangs vorliegt.

f) An den obigen Komplex bindet DNA-Polymerase – III und bildet ein Replisom.

ANTWORT: Es ist die Multiproteinstruktur, die sich an der bakteriellen Replikationsgabel zusammenfügt, um die DNA-Synthese durchzuführen. Es enthält DNA-Polymerase und andere Enzyme.

Jetzt sind die Voraussetzungen für die Einleitung der Synthese und die Elongation geschaffen. Dies geschieht jedoch auf zwei mechanistisch unterschiedlichen Wegen im 5′–>3′ Templatstrang und 3′–>5′ Templatstrang.

ein) Initiierung der Synthese und Elongation am 5′–>3′ Template (Synthese des Leitstrangs) (Wenn sich die Replikationsgabel in Richtung 3′–>5′ bewegt)

Der DNA-Tochterstrang, der kontinuierlich auf dem 5′–>3′-Template synthetisiert wird, wird als Leitstrang bezeichnet. DNA pol-III synthetisiert DNA durch Hinzufügen von 5′-P Desoxynukleotids zur 3′-OH-Gruppe des bereits vorhandenen Fragments. Somit wächst die Kette in Richtung 5′–>3′. Die durch DNA pol-III katalysierte Reaktion ist sehr schnell. Das Enzym ist viel aktiver als DNA pol – I und kann bei 37 °C 9000 Nukleotide pro Minute hinzufügen. Der ursprünglich von der RNA-Polymerase hinzugefügte RNA-Primer wird von der RNase abgebaut.

B) Initiierung der Synthese und Elongation am 3′–>5′ Template, wenn sich die Gabel in 3′–>5′ Richtung bewegt (Synthese des nacheilenden Strangs)

The daughter DNA strand which is synthesized in discontinuous complex fashion on the 3′–>5′ template is called lagging strand. It occurs in the following steps:

i) Synthesis of Okazaki fragment:

To the RNA primer synthesized by primosome, 1000-2000 nucleotides are added by DNA pol-III to synthesis Okazaki fragments.

ii) Excision of RNA primer:

When the Okazaki fragment synthesis was completed up to RNA primer, then RNA primer was removed by DNA pol – I using its 5′–>3′ exonuclease activity.

iii) Filling the gap (Nick translation)

The gap created by the removal of primer, is filled up by DNA pol – I using the 3′-OH of nearby Okazaki fragment by its polymerizing activity.

iv) Joining of Okazaki fragment: (Nick sealing)

Finally, the nick existing between the fragments are sealed by DNA ligase which catalyze the formation of phosphodiester bond between a 3′-OH at the end of one strand and a 5′ – phosphate at the other end of another fragment. The enzyme requires NAD for during this reaction.

III) TERMINATION:

Termination occurs when the two replicating forks meet each other on the opposite side of circular E.Coli DNA. Termination sites like A, B, C, D, E and F are found to present in DNA. Of these sites, Ter A terminates the counter clockwise moving fork while ter C terminates the clockwise moving forks. The other sites are backup sites. Termination at these sites are possible because, at these sites tus protein (Termination utilizing substance) will bound to Dna B protein and inhibits its helicase activity. And Dna B protein released and termination result.

After the complete synthesis, two duplex DNA are found to be catenated (knotted). This catenation removed by the action of topoisomerase. Finally, from single parental duplex DNA, two progeny duplex DNA synthesized.

REGULATION OF PROKARYOTIC REPLICATION:

Especially initiation of replication is regulated. Dna A protein when available in high concentration then ratio of DNA to cell mass is quiet high but at low Dna A concentration, the ratio found to be low. This shows that Dna A protein regulates the initiation of replication.


DNA Replication, Repair, and Mutagenesis

Polymerase III

Polymerase I plays an essential role in the replication process in E coli, but it is not responsible for the overall polymerization of the replicating strands. The enzyme that accomplishes this is a less abundant enzyme, polymerase III (pol III). (A DNA polymerase II has also been isolated from E coli, but it probably plays no role in DNA synthesis.) Pol III catalyzes the same polymerization reaction as pot I but has certain distinguishing features. It is a very complex enzyme and is associated with eight other proteins to form the pol III holoenzyme. (The term Holoenzym refers to an enzyme that contains several different subunits and retains some activity even when one or more subunits is missing.) Pol III is similar to pol I in that it has a requirement for a template and a primer but its substrate specificity is much more limited. For a template pol III cannot act at a nick nor can it unwind a helix and carry out strand displacement. The latter deficiency means that an auxiliary system is needed to unwind the helix ahead of a replication fork. Pol III, like pol I, possesses a 3′ → 5′ exonuclease activity, which performs the major editing function in DNA replication. Polymerase III also has a 3′exonuclease activity, but this activity does not seem to play a role in replication.

Pol I and pol III holoenzyme are both essential for E coli Reproduzieren. The need for two polymerases seems to be characteristic of all cellular organisms but not all viruses, e.g., E coli. Phage T4 synthesizes its own DNA polymerase, which is capable of carrying out all functions necessary for synthesizing phage DNA.

In the usual polymerization reaction, the activation energy for phosphodiester bond formation comes from cleaving of the triphosphate. Since DNA ligase can use a monophosphate, another source of energy is needed. This energy is obtained by hydrolyzing either ATP or NAD the energy source depends on the organism from which the DNA ligase is obtained.

Ligases have two major functions: the sealing of single-strand breaks produced randomly in DNA molecules by nucleases and the joining of fragments during a particular stage of replication. DNA ligases are enzymes that can form a phosphodiester bond at a single-strand break in DNA, a reaction between a 3′-OH group and a 5′-monophosphate. These groups must be termini of adjacent base-paired deoxynucleotides ( Figure 24-4 ).

Bacteria usually contain a single species of ligase. Mammalian cells possess two DNA ligases (I and II) present in very small amounts compared with bacteria. Both eukaryotic ligases are located in the nucleus. Ligase I is predominant in proliferating cells and presumably plays a role in DNA replication ligase II predominates in resting cells.


Sandwalk

I've started reading microcosm by my favorite science writer, Carl Zimmer [Buy This Book!]. Watch for a review, coming soon.

I was mildly disappointed to see Carl repeat a common myth about DNA replication in E coli on page 29. Since we often use this myth to teach critical thinking in our undergraduate classes, I thought it would be worthwhile to discuss it here.

Today I'm going to present the problem and let everyone think about a possible solution. On Sunday, I'll publish the answer. (If you know the solution, you are not allowed to post it in the comments&mdashI'll delete those comments. You can ask for clarification or speculate.)

Here's what Carl says at the top of page 29.

Today, we're not concerned about the 20 minute generation time but I note, for the record, that the average generation time of E coli, in vivo, is about one day. I also want to mention that the 20 minute generation time is an extreme example that's achieved only under the most extraordinary circumstances. Typical generation times in the lab are about 30 minutes.

However, that's not the problem. Let's assume a generation time of 20 minutes.

In the next paragraph Carl says .

What Carl is referring to the the assembly of replication complexes (replisomes) at the origin of replication. Once those complexes are assembled, replication fires off and proceeds in opposite directions (bidirectionally) until the two fork meet at the opposite side of the chromosome.

Carl is correct when he says that the forks move at 1000 nucleotides per second. Later on in his book he mentions that the size of the E coli chromosome is 4,600,000 base pairs or 4,600 kb (p. 116). At 1000 nucs per second it would take 4600 second to replicate this DNA if there was only one replication fork. Since there are two, it will take 2,300 seconds.

You can do the math. This is 38 minutes. It is a correct number&mdashit takes at least 38 minutes to replicate the E coli chromosome, not 20 minutes as stated earlier. It is true that the generation time of E coli can be as short as 20 minutes under extraordinary circumstances.

Here's the problem. Wie kann E coli divide faster than it can replicate it's chromosome?


Because Science!

Good morning, everyone! It hasn’t been very long since you heard from me last, but I hope you all had a good night! Although I don’t normally get up at this hour on Thursdays, I have a test to study for, so I’m here to bring you the wonders of DNA replication. Today’s subject: prokaryotes!

We know that, when one cell splits into two, it has to copy its DNA so that each of the daughter cells will have a copy. We also know that the mechanism for this is a pretty straightforward one: the strands of the double helix are pulled apart, and each strand is used as a template to make its complementary strand. (This is called semiconservative, since each daughter copy has one old strand and one new one.)

High school biology students are also probably aware that DNA replication occurs at origins of replication, and replication forks move away from origins at both directions. In E coli, the origin is OriC.

As mentioned in my post on transcription, unwinding the double helix creates tension (positive supercoiling) that can stop replication if it’s not alleviated. Thus, an enzyme called DNA gyrase (a type II topoisomerase) uses ATP to introduce negative supercoiling.

Other proteins are also important to the process of replication: helicase, an ATP-dependent enzyme, binds to a single-stranded region of DNA and then unwinds the rest of it by disrupting the hydrogen bonds between base pairs. SSBs, or single-stranded binding proteins, keep the single strands from reannealing before our polymerase can do its magic.

And, speaking of the polymerase, let’s introduce our main player! The main part of replication is carried out by an enzyme (or, I guess, a class of enzymes) called DNA polymerase. These use the single-stranded template of DNA to synthesize a complementary strand by assembling dNTPs in the proper order.

However, there’s a problem with this enzyme: it can only add nucleotides in a 5′ to 3′ direction. That’s no problem for the 3′-5′ strand, whose complementary strand (the “leading” strand) runs in that direction, but a little bit of a problem arises when dealing with the opposite template. In fact, the best our DNA polymerases can do is bend the 5′-3′ strand around and replicate it in small (1000-2000 bp) backwards. This leads to the creation of fragments called Okazaki fragments, which are then sealed together in the final product to form a whole “lagging” strand.

Another limitation of DNA polymerases is that they can’t start synthesizing a complementary strand from scratch. This is easily alleviated, though, by an enzyme called primase, an enzyme that synthesizes short stretches of RNA called “primers.” Primers give the DNA polymerase a starting point, and they’re replaced with DNA in the final product.

Now, you’re noticing that I’m referring to polymerases in the plural, implying that we don’t have just one. That’s true for both prokaryotes and eukaryotes (unlike RNA polymerase, which is the only prokaryotic RNA polymerase). To keep things a little ([coughs up a lung] A LOT) simpler, we’re going to start by looking at just prokaryotic replication, and there’s no better place to start than the polymerases.

Prokaryotes have five DNA polymerases that are designated with numerals I through V. I, II and V mostly just deal with DNA repair, so we won’t talk about them too much. Wikipedia describes IV as “an error-prone polymerase involved in non-targeted mutagenesis.” III is the one that carries out most DNA replication it’s not very abundant in cells, but it’s extremely processive (good at hanging on to the DNA template) in comparison to the others.

DNA polymerase III holoenzyme is composed of seventeen different subunits, each of which confers it some sort of functionality. The most noteworthy of these is the gamma-complex, which acts as a “clamp loader” by helping clamp the beta-dimer rings of the enzyme (which help keep it on the DNA) to the strand using ATP.

Now, once we actually get our polymerase III going and making DNA, DNA polymerase I gets its time to shine. This enzyme carries out the very important job of replacing the RNA primers with DNA. It’s also special because, in addition to being able to do this, is can remove nucleotides from a DNA strand in both the 3′ to 5′ and 5′ to 3′ direction.

The 3′ to 5′ exonuclease activity is useful because it means that this enzyme can quite literally check its work as it goes. If it discovers that it’s made a mistake, all it has to do is back up and chew the incorrect base off of the growing strand. Pretty nifty, if you think about it.

After polymerase I does its thing, an enzyme called ligase comes in an seals the nicks in the backbone left behind by all of this priming and Okizaki fragment-forming nonsense.

Finally, we need to terminate our DNA replication. In prokaryotes, this isn’t too difficult: it just requires the Ter sequence (GTGTGTTGT). Tus protein, a contrahelicase, binds here and basically just goes, “Nope nope nope, no helicase is passing through here!” The replication forks end, and replication is terminated.

See, not too bad, huh? Now we get to the Ja wirklich fun stuff—those stupid, show-off eukaryotes!

See a lot of errors? Feel the need to point them out? Please have mercy—I’m posting this without proofing it, because I’m kinda in a hurry here.


70 DNA Replication in Eukaryotes

Am Ende dieses Abschnitts können Sie Folgendes tun:

  • Diskutieren Sie die Ähnlichkeiten und Unterschiede zwischen der DNA-Replikation in Eukaryoten und Prokaryoten
  • Nennen Sie die Rolle der Telomerase bei der DNA-Replikation

Eukaryontische Genome sind viel komplexer und größer als prokaryontische Genome. Eukaryoten haben auch eine Reihe verschiedener linearer Chromosomen. Das menschliche Genom hat 3 Milliarden Basenpaare pro haploiden Chromosomensatz, und 6 Milliarden Basenpaare werden während der S-Phase des Zellzyklus repliziert. Es gibt mehrere Replikationsursprünge auf jedem eukaryotischen Chromosom. Menschen können bis zu 100.000 Replikationsursprünge im gesamten Genom haben. Die Replikationsrate beträgt ungefähr 100 Nukleotide pro Sekunde, viel langsamer als die prokaryontische Replikation. In Hefe, einem Eukaryoten, finden sich auf den Chromosomen spezielle Sequenzen, die als autonom replizierende Sequenzen (ARS) bekannt sind. Diese entsprechen dem Replikationsursprung in E coli.

Die Zahl der DNA-Polymerasen in Eukaryoten ist viel größer als in Prokaryoten: 14 sind bekannt, von denen fünf eine wichtige Rolle bei der Replikation spielen und gut untersucht sind. Sie sind bekannt als pol α, pol β, pol γ, pol δ, und pol ε.

Die wesentlichen Schritte der Replikation sind die gleichen wie bei Prokaryonten. Bevor die Replikation beginnen kann, muss die DNA als Matrize zur Verfügung gestellt werden. Eukaryotische DNA ist an basische Proteine, die als Histone bekannt sind, gebunden, um Strukturen zu bilden, die Nukleosomen genannt werden. Histone müssen während des Replikationsvorgangs entfernt und dann ersetzt werden, was dazu beiträgt, die niedrigere Replikationsrate bei Eukaryoten zu erklären. Das Chromatin (der Komplex zwischen DNA und Proteinen) kann einige chemische Modifikationen erfahren, so dass die DNA von den Proteinen abgleiten kann oder für die Enzyme der DNA-Replikationsmaschinerie zugänglich ist. Am Replikationsursprung wird ein Prä-Replikationskomplex mit anderen Initiatorproteinen gebildet. Helicase and other proteins are then recruited to start the replication process ((Figure)).

Difference between Prokaryotic and Eukaryotic Replication
Eigentum Prokaryotes Eukaryoten
Origin of replication Einzel Mehrere
Rate of replication 1000 nucleotides/s 50 to 100 nucleotides/s
DNA-Polymerase-Typen 5 14
Telomerase Not present Gegenwärtig
Entfernung des RNA-Primers DNA-Pol I RNase H
Strangdehnung DNA pol III Pol α, Pol δ, Pol
Schiebeklemme Schiebeklemme PCNA

Eine Helikase, die die Energie der ATP-Hydrolyse nutzt, öffnet die DNA-Helix. Replikationsgabeln werden an jedem Replikationsstartpunkt gebildet, wenn sich die DNA abwickelt. Die Öffnung der Doppelhelix verursacht ein Überwinden oder Supercoiling in der DNA vor der Replikationsgabel. Diese werden durch die Wirkung von Topoisomerasen aufgelöst. Primer werden durch das Enzym Primase gebildet, und unter Verwendung des Primers kann DNA pol die Synthese starten. Drei Haupt-DNA-Polymerasen sind dann beteiligt: ​​α, δ und . DNA pol α fügt dem RNA-Primer auf beiden Strängen ein kurzes (20 bis 30 Nukleotide) DNA-Fragment hinzu und übergibt es dann an eine zweite Polymerase. Während der Leitstrang kontinuierlich vom Enzym pol . synthetisiert wird δ, der nacheilende Strang wird von pol . synthetisiert ε. Ein als PCNA (proliferierendes Zellkernantigen) bekanntes Gleitklemmenprotein hält den DNA-Pol an Ort und Stelle, damit er nicht von der DNA abrutscht. Da pol in die Primer-RNA auf dem nacheilenden Strang läuft, verdrängt es diese von der DNA-Matrize. Die verdrängte Primer-RNA wird dann durch RNase H (AKA-Flap-Endonuklease) entfernt und durch DNA-Nukleotide ersetzt. Die Okazaki-Fragmente im nacheilenden Strang werden nach dem Austausch der RNA-Primer durch DNA verbunden. Die verbleibenden Lücken werden durch DNA-Ligase verschlossen, die die Phosphodiesterbindung bildet.

Telomer-Replikation

Im Gegensatz zu prokaryontischen Chromosomen sind eukaryontische Chromosomen linear. As you’ve learned, the enzyme DNA pol can add nucleotides only in the 5′ to 3′ direction. Im Leitstrang wird die Synthese fortgesetzt, bis das Ende des Chromosoms erreicht ist. Auf dem nacheilenden Strang wird DNA in kurzen Abschnitten synthetisiert, die jeweils durch einen separaten Primer initiiert werden. Wenn die Replikationsgabel das Ende des linearen Chromosoms erreicht, gibt es keine Möglichkeit, den Primer am 5'-Ende des nacheilenden Strangs zu ersetzen. Die DNA an den Enden des Chromosoms bleibt somit ungepaart, und im Laufe der Zeit werden diese Enden, genannt Telomere, kann mit fortschreitender Zellteilung immer kürzer werden.

Telomere umfassen repetitive Sequenzen, die für kein bestimmtes Gen kodieren. Beim Menschen wiederholt sich eine sechs Basenpaare umfassende Sequenz, TTAGGG, 100 bis 1000 Mal in den Telomerregionen. In gewisser Weise schützen diese Telomere die Gene davor, bei der weiteren Zellteilung gelöscht zu werden. The telomeres are added to the ends of chromosomes by a separate enzyme, telomerase ((Figure)), whose discovery helped in the understanding of how these repetitive chromosome ends are maintained. Das Telomerase-Enzym enthält einen katalytischen Teil und eine eingebaute RNA-Matrize. It attaches to the end of the chromosome, and DNA nucleotides complementary to the RNA template are added on the 3′ end of the DNA strand. Once the 3′ end of the lagging strand template is sufficiently elongated, DNA polymerase can add the nucleotides complementary to the ends of the chromosomes. Somit werden die Enden der Chromosomen repliziert.


Telomerase ist typischerweise in Keimzellen und adulten Stammzellen aktiv. In adulten Körperzellen ist es nicht aktiv. For their discovery of telomerase and its action, Elizabeth Blackburn, Carol W. Greider, and Jack W. Szostak ((Figure)) received the Nobel Prize for Medicine and Physiology in 2009.


Telomerase und Alterung

Die Telomere von Zellen, die sich einer Zellteilung unterziehen, werden weiterhin verkürzt, da die meisten somatischen Zellen keine Telomerase herstellen. Dies bedeutet im Wesentlichen, dass die Verkürzung der Telomere mit dem Altern verbunden ist. Mit dem Aufkommen der modernen Medizin, der Gesundheitsvorsorge und eines gesünderen Lebensstils hat sich die Lebenserwartung des Menschen verlängert, und die Nachfrage nach einem jüngeren Aussehen und einer besseren Lebensqualität mit zunehmendem Alter steigt.

Im Jahr 2010 fanden Wissenschaftler heraus, dass Telomerase einige altersbedingte Zustände bei Mäusen umkehren kann. Dies könnte in der regenerativen Medizin Potenzial haben. 1 Telomerase-deficient mice were used in these studies these mice have tissue atrophy, stem cell depletion, organ system failure, and impaired tissue injury responses. Die Telomerase-Reaktivierung bei diesen Mäusen verursachte eine Verlängerung der Telomere, reduzierte DNA-Schäden, kehrte die Neurodegeneration um und verbesserte die Funktion von Hoden, Milz und Darm. Somit könnte die Telomerreaktivierung das Potenzial zur Behandlung altersbedingter Erkrankungen beim Menschen haben.

Krebs ist durch eine unkontrollierte Zellteilung abnormaler Zellen gekennzeichnet. Die Zellen sammeln Mutationen an, vermehren sich unkontrolliert und können durch einen Prozess namens Metastasierung in verschiedene Teile des Körpers wandern. Wissenschaftler haben beobachtet, dass Krebszellen die Telomere erheblich verkürzt haben und dass die Telomerase in diesen Zellen aktiv ist. Interessanterweise wurde die Telomerase erst aktiv, nachdem die Telomere in den Krebszellen verkürzt wurden. Wenn die Wirkung der Telomerase in diesen Zellen während der Krebstherapie durch Medikamente gehemmt werden kann, könnte die weitere Teilung der Krebszellen möglicherweise verhindert werden.

Abschnittszusammenfassung

Replication in eukaryotes starts at multiple origins of replication. The mechanism is quite similar to that in prokaryotes. A primer is required to initiate synthesis, which is then extended by DNA polymerase as it adds nucleotides one by one to the growing chain. The leading strand is synthesized continuously, whereas the lagging strand is synthesized in short stretches called Okazaki fragments. The RNA primers are replaced with DNA nucleotides the DNA Okazaki fragments are linked into one continuous strand by DNA ligase. The ends of the chromosomes pose a problem as the primer RNA at the 5’ ends of the DNA cannot be replaced with DNA, and the chromosome is progressively shortened. Telomerase, an enzyme with an inbuilt RNA template, extends the ends by copying the RNA template and extending one strand of the chromosome. DNA polymerase can then fill in the complementary DNA strand using the regular replication enzymes. In this way, the ends of the chromosomes are protected.



Bemerkungen:

  1. Edmundo

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  2. Senen

    Antwort gewinnen)

  3. Vanderveer

    Ich mache mir auch Sorgen um diese Frage. Wo kann ich weitere Informationen zu diesem Thema finden?

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  7. Toltecatl

    Jetzt ist alles klar, danke für die Erklärung.

  8. Quan

    Über dieses Thema kann man lange reden.

  9. Nezshura

    Und warum so exklusiv? Ich denke, warum nicht diese Hypothese klären.



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