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Sind ITS1 und ITS2 gut für die Schätzung der Divergenzzeit?


Ich hatte eine Diskussion mit einem Kollegen, der mir sagte, dass interne transkribierte Abstandshalter (ITSs) nicht gut für die Schätzung der Divergenzzeit sind:

  • Weil sie nicht proteincodierende Gene sind;
  • Weil sie zu einer Genfamilie gehören.

In der Literatur konnte ich dazu allerdings nichts finden. Kann mich bitte jemand aufklären?


Prämisse der Studie

Die Region des internen transkribierten Spacers (ITS) befindet sich zwischen 18S und 26S in einem polycistronischen rRNA-Vorläufertranskript. Es hat sich erwiesen, dass es die am häufigsten sequenzierte Region über Pflanzenarten hinweg ist, um phylogenetische Beziehungen von flachen bis zu tiefen taxonomischen Ebenen aufzulösen. Trotz mehrerer taxonomischer Überarbeitungen bei Cassiinae bleibt eine stabile Phylogenie auf molekularer Ebene schwer fassbar, insbesondere was die Abgrenzung von Arten in den Gattungen betrifft Cassia, Senna und Chamaecrista. Diese Studie befasst sich mit dem vergleichenden Potenzial von ITS-Datensätzen (ITS1, ITS2 und verkettet) bei der Auflösung der zugrunde liegenden morphologischen Disparität in den hochkomplexen Gattungen, um ihre Unterscheidungskraft als potenzielle Barcode-Kandidaten in Cassiinae zu bewerten.

Methodik

Eine Kombination aus experimentellen Daten und einem in-silico-Ansatz basierend auf genetischen Schwellenabständen, Sequenzähnlichkeits-basierten und hierarchischen Baum-basierten Methoden wurde durchgeführt, um die Unterscheidungskraft von ITS-Datensätzen zu 18 verschiedenen Arten des Cassiinae-Komplexes zu entschlüsseln. Im Labor erstellt SDie Sequenzen wurden unter Verwendung von BLAST mit denen in der GenBank verglichen und durch MUSCLE 3.8.31 abgeglichen und in PAUP 4.0 und BEAST1.8 mit Parsimony Ratchet, Maximum Likelihood und Bayesian Inference (BI) Methoden der Gen- und Artenbaumabstimmung mit Bootstrapping analysiert. Die DNA-Barcoding-Lücke wurde basierend auf dem Kimura-Zweiparameter-Distanzmodell (K2P) in TaxonDNA und MEGA realisiert.

Wichtigste Erkenntnisse

Basierend auf der K2P-Distanz wurden signifikante Divergenzen zwischen den inter- und intraspezifischen genetischen Distanzen beobachtet, während das Vorhandensein einer DNA-Barcoding-Lücke offensichtlich war. Die ITS1-Region identifizierte mit TaxonDNA- bzw. BI-Methoden effizient 81,63 % bzw. 90 % der Arten. Die PWG-Distanzmethode basierend auf einfachem paarweisen Matching zeigte die Signifikanz von ITS1, wobei die höchste Anzahl von Variablen (210) und informativen Standorten (206) erhalten wurde. Die BI-Baum-basierten Methoden übertrafen die ähnlichkeitsbasierten Methoden und erzeugten gut aufgelöste phylogenetische Bäume mit vielen Knoten, die durch Bootstrap-Analysen gut unterstützt wurden.

Abschluss

Die retikulierte phylogenetische Hypothese unter Verwendung der ITS1-Region stützte hauptsächlich die Verwandtschaft zwischen den Arten von Cassiinae, die durch traditionelle morphologische Methoden festgestellt wurde. Die ITS1-Region zeigte im Vergleich zu ITS2 und ITS1 + 2 ein höheres Unterscheidungsvermögen und wünschenswerte Eigenschaften, was zu dem Schluss kam, dass sie der Ort der Wahl ist. Angesichts der Komplexität der Gruppe und der zugrunde liegenden biologischen Mehrdeutigkeiten ermutigen die hier präsentierten Ergebnisse zur Entwicklung des DNA-Barcodings als nützliches Werkzeug zur Lösung taxonomischer Herausforderungen bei der Bestätigung mit morphologischen Rahmenbedingungen.


Softwaredesign und -betrieb

ITSx erwartet Abfragesequenzen im Fasta-Format (Pearson & Lipman 1988), mit oder ohne Lücken. Die Anzahl der Abfragesequenzen ist nicht begrenzt. Die Software untersucht zuerst die Sequenzen in der Standardorientierung die Suche wird in der umgekehrten komplementären Orientierung wiederholt, um falsch besetzte Sequenzen zu berücksichtigen (vgl. Nilsson et al. 2011). Rückwärtskomplementäre Sequenzen werden protokolliert, neu ausgerichtet und in allen nachfolgenden Schritten in der richtigen Ausrichtung behandelt. Jede Sequenz wird auf Übereinstimmungen mit den HMMs untersucht. Wenn die Mehrprozessoroption aktiviert ist, verwendet ITSx die vom Benutzer angegebene Anzahl von Prozessorkernen (bzw. physischen/logischen Prozessoren), so dass die Geschwindigkeit der Analyse ungefähr linear mit der Anzahl der CPU-Kerne skaliert. Ein Index wird aus allen Regionen erstellt, die von den HMMs übereinstimmen.

Die Extraktion basiert auf dem HMM-Index jeder Abfrage. Standardmäßig werden ITS1 und ITS2 aus den Abfragesequenzen extrahiert und als separate Fasta-Dateien gespeichert. Der Benutzer kann auch separate Dateien für SSU, 5.8S und LSU erstellen. Außerdem können fasta-Dateien erzeugt werden, die nur die Einträge mit der gesamten ITS-Region oder mit der gesamten ITS1- oder ITS2-Region enthalten. Diese Funktion unterstützt beispielsweise die Vorhersage der ITS1- und ITS2-Sekundärstruktur, die an Sequenzen voller Länge durchgeführt werden sollte (Koetschan et al. 2010). Die SSU wird als alles vom 5'-Ende der Abfragesequenz bis zum 3'-Ende von SSU extrahiert, wie durch die HMM-Übereinstimmung angezeigt und so weiter. Teilextraktionen werden unterstützt. Wenn zum Beispiel nur das 3′-Ende von 5.8S erkannt wird, wird ITS2 als alles stromabwärts dieser Position extrahiert. Außerdem werden verschiedene Zusammenfassungsdateien geschrieben (siehe Softwaredokumentation). Eine tabulatorgetrennte Datei gibt die Start- und Stopppositionen für alle Marker in jeder Abfragesequenz an. Eine Protokolldatei zeichnet auf, welche Abfragesequenzen, falls vorhanden, als umgekehrt komplementär gefunden wurden. Zusätzliche separate Dateien zeichnen Abfragesequenzen auf, für die keine HMMs erkannt wurden, und Abfragesequenzen, für die die HMM-Übereinstimmungen in einer unerwarteten Reihenfolge auftraten. Die Open-Source-Kommandozeilen-basierte Software ist in Perl geschrieben und für unix-artige Betriebssysteme (einschließlich MacOS X , Linux und bsd ) frei verfügbar. Obwohl über das Internet verteilt (Element S1 http://microbiology.se/software/itsx/), benötigt die Software keinen Internetzugang, um ausgeführt zu werden. Zum Ausführen der Software werden Computerspeicher (RAM) benötigt, der ungefähr das 1,5-fache der Größe des Eingabedatensatzes und freier Festplattenspeicher entspricht, der ungefähr dem 4- bis 5-fachen der Größe der Abfragedatei entspricht.


Ergebnisse

Sequenzierte Region enthielt 3`-Ende von 5.8S Gen, ITS2, und das 5` Ende des 28S Gen. Die direkte Sequenzierung von Amplikons von 30 Individuen (10 Individuen pro Art) zeigte in allen analysierten Proben intra-individuelle Heterogenitäten. Es gibt zwei Arten von Heterogenitäten: Einzelnukleotid-Substitutionen und Mono-, Bi- und Multinukleotid-Insertionen/Deletionen. Das Vorhandensein von Heterogenitäten wurde durch Doppelpeaks in den Substitutionspositionen und durch eine Reihe von gemischten Peaks im Falle von Indel-Ereignissen angezeigt, die beide nach einer Sequenz von guter Qualität positioniert waren. Die Beispiele für Heterogenitäten, die durch direkte Sequenzierung aufgedeckt wurden, sind in Abbildung ​ Abbildung1 1 dargestellt.

Beispiele für Ergebnisse aus der direkten Sequenzierung von ITS2. ein Beispiel für Polymorphismus, der durch ein Indel verursacht wird (schwarzer Pfeil zeigt die Anfangsposition eines Indels an) B Beispiel für einzelne Nukleotid-Substitutionen (angezeigt durch schwarze Pfeile).

Um die sichtbare Heterogenität zu verdeutlichen, wurden die Amplikons für 2 Exemplare von Polyommatus (Agrodiaetus) peilei, 2 Exemplare von Polyommatus (Agrodiaetus) karindus und ein Exemplar von Polyommatus (Agrodiaetus) Morgani wurden kloniert und 10 Klone pro Probe wurden sequenziert. Die Zusammenfassung der Heterogenitäten in der ES IST Die von den Klonen angezeigte Region ist in Tabelle ​ Tabelle1 dargestellt. 1. Teilsequenzen von 5,8S und 28S Gene wurden aus der weiteren Analyse beschnitten. Gesamtlänge von ITS2 variiert von 477 bp bis zu 512 bp, abhängig von der Anwesenheit von Insertionen/Deletionen. Unkorrigierte “p” paarweise Abstände für alle Klone sind in Tabelle ​ Tabelle2 2 angegeben.

Tabelle 1.

Variable Positionen zwischen sequenzierten Klonen.

ProbeKlonnummerPosition
128130131171172173235316326329330331332333334335336337338339340341342343344345346356400414465
W136 Polyommatus (Agrodiaetus) peilei#01Tg-CgCEINEINTTTTTTTT--CgTTTTT-CgggC
W136 Polyommatus (Agrodiaetus) peilei#02Tg-CgCEINEINTTTTTTTT--CgTTTTT-CgggT
W136 Polyommatus (Agrodiaetus) peilei#03TEINEINCEINCggCTTTTTTTTTTgTTTTT-CEINgEINC
W136 Polyommatus (Agrodiaetus) peilei#04Tg-CgCEINEINTTTTTTTT--TgTTTTT-CgggC
W136 Polyommatus (Agrodiaetus) peilei#05TEINEINCEINCggCTTTTTTTTTTgTTTTTT-EINggC
W136 Polyommatus (Agrodiaetus) peilei#06Tg-CgCEINEINTTTTTT----TgTTTTT-CgggC
W136 Polyommatus (Agrodiaetus) peilei#07Tg-CgCEINEINCTTTTTTTTTTgTTTTTT-EINggC
W136 Polyommatus (Agrodiaetus) peilei#08EINEIN----EINEINT------------------EINEINgC
W136 Polyommatus (Agrodiaetus) peilei#09TEINEINCEINCggCTTTTTTTTTTgTTTTTT-EINggC
W136 Polyommatus (Agrodiaetus) peilei#10Tg-CgCEINEINTTTTTTTT--TgTTTTT-CgggC
1441128131169170171176184185186187188189190191192193194195196197198199200235236326336337338345346356
W202 Polyommatus (Agrodiaetus) peilei#01TCT-EINCCT-----------------EIN-TTT-T-EIN
W202 Polyommatus (Agrodiaetus) peilei#02TTTEINEINCCTTCgCgTCggCgEINCgTgCggCTTTT-EIN
W202 Polyommatus (Agrodiaetus) peilei#03TTg----TTCgCgTCggCgEINCgTgCggTTTC-Cg
W202 Polyommatus (Agrodiaetus) peilei#04TTT-EINCCC-----------------EIN-TT-C-Cg
W202 Polyommatus (Agrodiaetus) peilei#05CCTEINEINCCTTCgCgTCggCgEINCgTgCggCTT-T-EIN
W202 Polyommatus (Agrodiaetus) peilei#06TTTEINEINCCTTCgCgTCggCgEINCgTgCggCTTTT-EIN
W202 Polyommatus (Agrodiaetus) peilei#07TTTEINEINCCTTCgCgTCggCgEINCgTgCggCTTTT-EIN
W202 Polyommatus (Agrodiaetus) peilei#08TCT-EINCCT-----------------EIN-T--C-Cg
W202 Polyommatus (Agrodiaetus) peilei#09TTTEINEINCCTTCgCgTCggCgEINCgTgCggTTTTT-EIN
W202 Polyommatus (Agrodiaetus) peilei#10TCT-EINCCTTCgCgTCggCgEINCgTgCEIN-TTTC-Cg
20150154155166239340341342
V145 Polyommatus (Agrodiaetus) karindus#01EINC--TTTT-
V145 Polyommatus (Agrodiaetus) karindus#02EINC--TTT--
V145 Polyommatus (Agrodiaetus) karindus#03EINTCgTT---
V145 Polyommatus (Agrodiaetus) karindus#04EINTCgTT---
V145 Polyommatus (Agrodiaetus) karindus#05EINTCgTTT--
V145 Polyommatus (Agrodiaetus) karindus#06EINC--TC---
V145 Polyommatus (Agrodiaetus) karindus#07EINTCgCTTTT
V145 Polyommatus (Agrodiaetus) karindus#08EINC--TTT--
V145 Polyommatus (Agrodiaetus) karindus#09EINC--TT---
V145 Polyommatus (Agrodiaetus) karindus#10gC--TT---
2784128136169170171331335336337337338339340346351352353354
Z04 Polyommatus (Agrodiaetus) karindus#01CgTTCCEINCTTTTTTTC-EINEINEIN
Z04 Polyommatus (Agrodiaetus) karindus#02CgTTCCEINTTTTTTTTC-EINEINEIN
Z04 Polyommatus (Agrodiaetus) karindus#03CgTTCCEINTTTTTTTTC-EINEINEIN
Z04 Polyommatus (Agrodiaetus) karindus#04CgTTCCEINTTTTTTTTC-EINEINEIN
Z04 Polyommatus (Agrodiaetus) karindus#05TgT-CCEINTTTTTTT-CEINEINEINEIN
Z04 Polyommatus (Agrodiaetus) karindus#06TgT-CCEINTTTTTTT-CEINEINEINEIN
Z04 Polyommatus (Agrodiaetus) karindus#07TEINT-CCEINTTTTTTT-CEINEINEINEIN
Z04 Polyommatus (Agrodiaetus) karindus#08CgTTCCEINTTTTTTT-C-EINEINEIN
Z04 Polyommatus (Agrodiaetus) karindus#09CgTTCCEINTTTTTTT-C-EINEINEIN
Z04 Polyommatus (Agrodiaetus) karindus#10Tgg----C------------
7384379127128148171172173229301318319320321322323324325326327328329330331332333334347348349350352353354355357358391400472
W127 Polyommatus (Agrodiaetus) Morgani#01EINEINC-CgT---TCEINCEINCgTTTTTTTT----EINEINCg---EINEINEINEINgg
W127 Polyommatus (Agrodiaetus) Morgani#02EINEINC-CgT---CCEINCEINCgTTTTTTTTTTTTEINEINCg---EINEINTEINgg
W127 Polyommatus (Agrodiaetus) Morgani#03EINEINC-EINTCCgCTg---------------------gCEINEINgEINggT
W127 Polyommatus (Agrodiaetus) Morgani#04EINgCgEINTTCgCTg---------------------gCEINEINgEINggg
W127 Polyommatus (Agrodiaetus) Morgani#05ggCgCgT---TCEINCEINCgTTCTTTTTTTT-EINEINCg---EINEINEINEINgg
W127 Polyommatus (Agrodiaetus) Morgani#06EINEINC-CgT---TCEINCEINCgTTTTTTTTTT--EINEINCg---EINEINEINEINEINg
W127 Polyommatus (Agrodiaetus) Morgani#07EINEINC-CgTCgCTg---------------------gCEINEINgEINggg
W127 Polyommatus (Agrodiaetus) Morgani#08EINEINCgEINTTCgCTC---------------------gCEIN-EINEINEINgT
W127 Polyommatus (Agrodiaetus) Morgani#09EINEINTgEINTTCgCTg---------------------gCEINEINgEINggg
W127 Polyommatus (Agrodiaetus) Morgani#10EINEINC-CgT---Tg---------------------gCEINEINgEINggg

Tabelle 2.

Unkorrigierte ‘‘p’’ Entfernungsmatrix von Klonen.

Polyommatus (Agrodiaetus) peileiW136_#01W136_#02W136_#03W136_#04W136_#05W136_#06W136_#07W136_#08W136_#09W136_#10
W136_#01-
W136_#020.0019-
W136_#030.01960.0216-
W136_#040.00190.00390.0177-
W136_#050.02160.02360.00580.0196-
W136_#060.00580.00780.01760.00390.0196-
W136_#070.01170.01370.01570.00980.00980.0098-
W136_#080.01820.02020.02230.01620.02020.01620.0141-
W136_#090.02160.02360.00580.019600.01960.00980.0202-
W136_#100.00190.00390.017700.01960.00390.00980.01620.0196-
Durchschnitt0,0134
Polyommatus (Agrodiaetus) peileiW202_#01W202_#02W202_#03W202_#04W202_#05W202_#06W202_#07W202_#08W202_#09W202_#10
W202_#01-
W202_#020.0139-
W202_#030.02000.0157-
W202_#040.01420.0220.0140-
W202_#050.01190.00590.01190.0259-
W202_#060.013900.01570.02190.0059-
W202_#070.013900.01570.02190.00590-
W202_#080.01220.02390.01600.00610.02390.02390.0239-
W202_#090.01190.00190.01370.01990.00780.00190.00190.0219-
W202_#100.01000.01760.01770.00800.01760.01760.01760.00600.0157-
Durchschnitt0,0135
Polyommatus (Agrodiaetus) karindusV145_#01V145_#02V145_#03V145_#04V145_#05V145_#06V145_#07V145_#08V145_#09V145_#10
V145_#01-
V145_#020.0019-
V145_#030.00780.0059-
V145_#040.00780.00590-
V145_#050.00590.00390.00190.0019-
V145_#060.00590.00590.00780.00590.0078-
V145_#070.00780.00980.00780.00780.00780.0137-
V145_#080.001900.00590.00590.00390.00590.0098-
V145_#090.00390.00190.00390.00390.00590.00190.01170.0019-
V145_#100.00590.00390.00780.00590.00780.00390.01370.00390.0019-
Durchschnitt0,0056
Polyommatus (Agrodiaetus) karindusZ704_#01Z704_#02Z704_#03Z704_#04Z704_#05Z704_#06Z704_#07Z704_#08Z704_#09Z704_#10
Z704_#01-
Z704_#020.0019-
Z704_#030.00190-
Z704_#040.001900-
Z704_#050.00980.00780.00780.0078-
Z704_#060.00980.00780.00780.00780-
Z704_#070.01170.00980.00980.00980.00190.0019-
Z704_#080.00390.00190.00190.00190.00590.00590.0078-
Z704_#090.00390.00190.00190.00190.00590.00590.00780-
Z704_#100.01410.01620.01620.01620.01620.01620.01820.01820.0182-
Durchschnitt0,0072
Polyommatus (Agrodiaetus) MorganiV127_#01V127_#02V127_#03V127_#04V127_#05V127_#06V127_#07V127_#08V127_#09V127_#10
V127_#01-
V127_#020.0101-
V127_#030.02890.0307-
V127_#040.02670.03280.0083-
V127_#050.01220.01410.03680.0246-
V127_#060.00410.01010.02670.02050.0121-
V127_#070.01440.02460.00830.00830.02660.0185-
V127_#080.01650.02660.01040.01040.02460.02460.0146-
V127_#090.02260.03280.00830.00410.02870.02670.00830.0104-
V127_#100.01240.02260.01040.01040.02670.01650.00210.01670.0104-
Durchschnitt0,0177

In Klonen der Probe W136 (Polyommatus (Agrodiaetus) peilei). Interessanterweise unterschied sich dieser Klon “W136_#08” signifikant von allen anderen darin, dass er eine 16-Nykleotid-PolyT-Deletion an den Positionen �-344” und ein 3-Basen-Indel an Position �-173” aufwies. Klone des zweiten Exemplars Polyommatus (Agrodiaetus) peilei (W202) hatte 8 Stellen mit Einzelnukleotid-Substitutionen und 8 Positionen, an denen Mono-Multinukleotid-Indels auftraten. Drei Klone wiesen an den Positionen �-200” ein großes polymorphes 17-Nukleotid-Indel auf. Die Variation zwischen den Klonen war signifikant, mit intragenomischen Unterschieden im Bereich von 0,0% bis 2,39%. Die durchschnittlichen intragenomischen genetischen Distanzen für zwei Exemplare von Polyommatus (Agrodiaetus) peilei (W136 und W202) waren sehr ähnlich: 1,34% bzw. 1,35%.

Polyommatus (Agrodiaetus) karindus hatte eine signifikant niedrigere Rate der intragenomischen Variabilität. Die Proben V145 und Z704 hatten 9 bzw. 10 polymorphe Positionen. Darüber hinaus wird die Mehrheit der Indel- und Basensubstitutionen von Z704-Proben auf einen Klon (Z704#10) zurückgeführt. Es hat eine einzelne Substitution und 3 Multinukleotid-Deletionen, die in anderen Klonen nie auftraten. Die durchschnittlichen intragenomischen genetischen Distanzen für zwei Exemplare von Polyommatus (Agrodiaetus) karindus (V145 und Z704) waren: 0,56% bzw. 0,72%. Der höchste Wert lag bei 1,82 %.

Klone von Polyommatus (Agrodiaetus) Morgani ITS2 zeigte eine größere Vielfalt als die anderen 2 Arten. Zum Beispiel betrug die genetische Distanz zwischen dem Klon V127#05 und V127#03 3,68%. Die durchschnittliche intragenomische genetische Distanz war für diese Art ebenfalls signifikant höher – 1,77 %

In der Bayesschen Analyse 50 geklonte Amplikons aus Polyommatus (Agrodiaetus) peilei, Polyommatus (Agrodiaetus) karindus, Polyommatus (Agrodiaetus) Morgani und ITS2 Sequenzen von allen Agrodiaetus Die in der GenBank verfügbaren Arten wurden eingeschlossen, was insgesamt 127 Sequenzen ergab. Schon seit Polyommatus ikarus (Rottemburg, 1775) wurde früher als Schwestergruppe der Untergattung abgeleitet Agrodiaetus (Talavera et al. 2013) haben wir ein Exemplar verwendet (GenBank Zugangsnummer <"type":"entrez-nucleotide","attrs":<"text":"AY556732","term_id":"233149402","term_text ":"AY556732">> AY556732) als Fremdgruppe, um die Phylogenie zu verwurzeln. Ein Fragment des Konsensus-Bayes-Baums, das die Clusterbildung von klonierten Sequenzen zeigt, ist in Abbildung ​ Abbildung 2 dargestellt. 2. Der komplette Baum ist online im Suppl. Stoff 1.

Fragment des Konsensus-Bayes-Baums der Untergattung Agrodiaetus abgeleitet von ITS2 Sequenzen. Posterior-Wahrscheinlichkeitswerte 㹐% werden angezeigt. Der komplette Baum ist online im Suppl. Material 1. Geklonte Sequenzen von drei untersuchten Arten werden hervorgehoben: Polyommatus (Agrodiaetus) peilei – orange Farbe, Polyommatus (Agrodiaetus) karindus – blaue Farbe, Polyommatus (Agrodiaetus) Morgani – grüne Farbe.


Phylogenie- und Divergenzzeitschätzung von Chamaecrista ser. Rigidulae (Leguminosae: Caesalpinioideae)

Chamaecrista ist eine monophyletische Gattung, aber die meisten ihrer infragenerischen Kategorien haben sich als paraphyletisch erwiesen, einschließlich Serien Rigidulae die derzeit 30 Arten umfasst, die alle in Brasilien endemisch sind und die meisten in der Cerrado-Vegetation des zentralen Hochlandes des Landes vorkommen. Diese molekular-phylogenetische Studie testet die Monophylie von C. ser. Rigidulae auf der Grundlage einer breiten Stichprobe betrachtet seine Beziehung zu Mitgliedern von C. Sekte. Absurd Unterabschnitt. Absurd, und schätzt seine Divergenzzeit in Bezug auf das Alter der Gattung. Dazu wurden Einzel- und Kombinationsanalysen nach der Parsimony- und Bayes-Methode mit Chloroplasten durchgeführt (trnL-F) und nukleäre (ITS1-5.8S-ITS2) Marker und eine Matrix mit 75 Taxa von Chamaecrista (29 gehören zur Serie Rigidulae), 6 von Senna und 1 von Cassia. Die Analysen zeigten, dass Serien Rigidulae, wie traditionell umschrieben, ist polyphyletisch. Wann C. brachyblepharis und C. ciliolata sind ausgeschlossen und C. botryoides und C. sincorana eingeschlossen, wird die Serie als monophyletisch aufgelöst und umfasst 30 Arten, die hier als Rigidulae-Klade bezeichnet werden. Diese Klade ist weiter in zwei geografisch und genetisch strukturierte Unterkladen unterteilt, wobei die erste 23 Arten enthält, die hauptsächlich aus dem Hochland des Bundesstaates Goiás stammen, und die zweite mit 6 Arten aus der Espinhaço Range, die von Norden nach Süden durch die zentralen Bundesstaaten Bahia und Minas Gerais verläuft. Divergenzzeitanalysen legen nahe, dass die Rigidulae-Klade vor etwa 5 Millionen Jahren entstand. Die jüngste Strahlung der Serie wiederholt die, die in anderen artenreichen Gattungen im Cerrado-Biom beobachtet wurde, und bestätigt damit frühere Hypothesen über das jüngere Alter des Bioms. Die Rigidulae-Klade, wie hier beschrieben, weist die folgenden morphologischen Synapomorphien auf: asymmetrische Blüten mit ihren hinteren Kronblättern ähnlich einem typischen papilionoiden Standardblütenblatt, und Blättchen divarizieren entlang der Blattachsel.

Abb. S1. Mehrheitsregel-Konsensusbaum der Sparsamkeitsanalyse (MP) als Ergebnis der trnL-F Marker. Zahlen über den Zweigen weisen auf Bootstrap-Unterstützung für Kladen hin, die in der MP-Analyse wiederhergestellt wurden. Die Zahlen unter den Zweigen geben die Posterior-Wahrscheinlichkeit der Kladen an, die in der Bayes'schen Inferenzanalyse gefunden wurden. Die Taxa rechts neben den Artnamen folgen der Klassifikation von Irwin & Barneby (1982), Abschn. = Abschnitt, Unterabschnitt. = Unterabschnitt, die Taxa ohne Präfix entsprechen Reihen.

Abb. S2. Einer der sparsamsten Bäume aus einem kombinierten Datensatz mit Rekonstruktion der Vorfahren-Charakterzustände: EIN, Charakter 1: Gewohnheit und unterirdisches System B, Zeichen 2: Ausrichtung der Flugblätter auf der Rachis. — Arten von Serien Rigidulae sind fett hervorgehoben.

Abb. S3. Einer der sparsamsten Bäume aus dem kombinierten Datensatz mit Rekonstruktion der Vorfahren-Charakterzustände: EIN, Zeichen 3: Anzahl der Blättchenpaare auf reifen Blättern B, Zeichen 4: Differenzierung der Oberflächen der Flugblätter. — Arten von Serien Rigidulae sind fett hervorgehoben.

Abb. S4. Einer der sparsamsten Bäume aus dem kombinierten Datensatz mit Rekonstruktion der Vorfahren-Charakterzustände: EIN, Zeichen 5: Sichtbarkeit von Nebenvenen auf der adaxialen Oberfläche der Segel B, Zeichen 6: Erstes Flugblattpaar „amplexicaul“. — Arten von Serien Rigidulae sind fett hervorgehoben.

Abb. S5. Einer der sparsamsten Bäume aus dem kombinierten Datensatz mit Rekonstruktion der Vorfahren-Charakterzustände: EIN, Zeichen 7: Blütenstandstyp B, Zeichen 8: Blumensymmetrie. — Arten von Serien Rigidulae sind fett hervorgehoben.

Anhang S1. Abgleich des kombinierten Datensatzes (ITS+trnL-F) in dieser Studie verwendet. ITS-Marker von 1 bis 901 bp , trnL-F von 902 bis 2067 bp .

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Methoden

Datensätze

Typfolgen von C. gloeosporioides sensu stricto, C. Asianum, C. fructicola, C. siamesisch und C. Tropicale (Zusätzliche Datei 1: Tabelle S1) wurden von GenBank abgebaut. Diese Arten innerhalb der C. gloeosporioides Artenkomplexe wurden häufig als Erreger der Anthracnose tropischer Früchte identifiziert (Phoulivong et al. 2010). Bei der Auswahl der Sequenzen aus Holotyp- und Epityp-Exemplaren für Analysen gab es drei wichtige Überlegungen: (i) Die Typsequenzen wurden basierend auf der Studie von Cannon et al. (2012) und wurden aufgenommen, um eine ausreichende Sequenzvielfalt bereitzustellen, (ii) die verwendeten Arten sind auf phylogenetischer und morphologischer Ebene gut charakterisiert und anerkannt und (iii) die ausgewählten Arten wurden in früheren unabhängigen Studien analysiert.

Um Testsequenzen zu erhalten, wurden Papayafrüchte mit Symptomen von Anthracnose im Zeitraum 2011 bis 2013 gesammelt (Zusatzdatei 1: Tabelle S2). DNA wurde aus reinen Einzelsporenkulturen von . extrahiert Colletotrichum sp. mit dem E.Z.N.A. Pilz-DNA-Extraktionskit® gemäß den Anweisungen des Herstellers (Omega bio-tek Ltd., USA). Die gesamte ITS-Region (496 bp) wurde unter Verwendung des universellen Primerpaars ITS4/5 (White et al. 1990) amplifiziert und mit unabhängiger Basecall-Verifikation (Amplicon Express, WA, USA) sequenziert. Repräsentative Sequenzen wurden der GenBank (KM117226 bis KM117228) vorgelegt. Insgesamt 56 Sequenzen wurden im endgültigen Datensatz zur Generierung von Konsensus-Sekundärstrukturen für ITS1-, 5.8S- und ITS2-Marker verwendet: 30 Typsequenzen aus Holotyp- und Epityp-Proben und 26 Abfragesequenzen, die zu den C. gloeosporioides sensu lato Komplex. Andere Pilzsequenzen wurden ebenfalls von GenBank (HQ238968, JF780523, EU480703, HQ238962, EF543854) abgebaut und als Fremdgruppen verwendet, um die Definition der helikalen Domänen der drei Marker basierend auf mfold-Alignments im UNAFold-Webserver (http:// mfold.rna.albany.edu/) (Zuker 2003 Markham und Zuker 2008).

ITS-Sequenzanalyse und -Alignment

Bei der PCR-Amplifikation können Fehler auftreten, wenn zwei verschiedene DNA-Matrizen vorhanden sein können. Das resultierende Amplikon kann chimär sein, d. h. ein Mosaik dieser ursprünglichen Sequenzen (Jumpponen 2011). Solche chimären Sequenzen können als neu interpretiert werden, was die Schätzungen der Diversität künstlich aufblähen und die phylogenetische Inferenz und Artendiskriminierung stören kann, wenn sie nicht entdeckt werden (Hugenholtz und Huber 2003). ITS-Sequenzen wurden mit dem UNITE PlutoF Chimera Checker (Nilsson et al. 2010 Edgar et al. 2011) und dem im Fungal Metagenomics Project der University of Alaska entwickelten Chimera Test (https://biotech.inbre.alaska .) auf mögliche Chimären überprüft .edu/fungal_portal/?program=chimera_test).

Überprüfung der Gültigkeit der ITS-Sequenz

Alignments wurden mit der Online-Version des Sequenz-Alignment-Programms MAFFT Version 6 ((http://mafft.cbrc.jp/alignment/server/ (Katoh et al. 2005 Katoh and Toh 2008)) durchgeführt bei der Bestimmung, ob die ITS-Sequenzen aus stochastischen, artefaktischen Nukleotiddaten zusammengesetzt waren. Der Start- und Endpunkt jedes Markers wurden zuerst für jede Spezies unter Verwendung der Pipeline definiert, die auf der ITS2-Datenbank-Website (http://its2.bioapps.biozentrum.uni .) verfügbar ist -wuerzburg.de/) Letztlich wurden drei Sätze von Sequenz-Alignments generiert: ITS1, 5.8S und ITS2 als separate Datensätze.

Vergleich von GC-Gehalt und Nukleotid-Diversität der ITS-Sequenzen

Die Sequenzlänge der ITS1- und ITS2-Region für eine bestimmte Spezies kann variabel sein, jedoch sollten die beiden Marker einen ähnlichen GC-Gehalt aufweisen, wenn es sich um authentische Sequenzen unter funktionellen und selektiven Beschränkungen und nicht um Pseudogene handelt (Harpke und Peterson 2008 Mullineaux und Hausner 2009) . Der GC-Gehalt der ITS1-, 5.8S- und ITS2-Sequenzen wurde mit der Software BioEdit Version 7.2.0 bestimmt. DNASP Version 5.10 (Rozas et al. 2003 Librado und Rozas 2009) wurde verwendet, um die Nukleotiddiversität (Pi), polymorphe und Singleton-Sites, Indel-Sites und Indel-Haplotypen unter den ITS1-, 5.8S- und ITS2-Sequenzen zu bestimmen.

Sekundärstrukturvorhersage

Für den ITS2-Marker wurde die ribosomale Sekundärstruktur und Motivdetektion bestimmt. Sekundärstrukturvorhersagen von rRNA-Sequenzen sind empfindlich gegenüber einzelnen Basenänderungen, die wiederum die Wasserstoff-Basenpaarung insbesondere entlang des Stammaspekts einer Stamm-Schleife-Sekundärstruktur beeinflussen können (Matthews et al. 2005). Folglich wurden für diese Studie die ITS-Sequenzen und ihre Elektropherogramme manuell überprüft und auf Signalqualität und genaue Nukleotidzuordnung bewertet, um benutzerinduzierte Fehler bei der Strukturvorhersage zu vermeiden. Da das Kernfaltungsmuster der ITS2-Sequenz bereits bekannt ist, stellt dies ein externes Kriterium oder eine Referenz dar, um die Richtigkeit der vorhergesagten Strukturen zu überprüfen (Schultz und Wolf 2009). Für die ITS2-Konsensus-Sekundärstrukturvorhersage wurde die ITS2-Datenbankpipeline (http://its2.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de/) (Koetschan et al. 2010 Merget et al. 2012 Koetschan et al. 2012) verwendet. Konsens-Sekundärstrukturen für die ITS1- und 5.8S-Marker wurden unter Verwendung der simultanen LocaRNA-P-RNA-Alignment- und -Folding-Option der Freiburg RNA Tools-Pipeline (http://rna.informatik.uni-freiburg.de:8080/LocARNA/Input.jsp .) bestimmt ) (Will et al. 2007, Will et al. 2012 und Smith et al. 2010) und die RNA-Faltungsform-Option des mfold-Webservers unter Verwendung von Standardbedingungen für Temperatur (37°C) und Ionenbedingungen (http://mfold .rna.albany.edu/) (Zuker 2003 Markham und Zuker 2008). Konsens-Sekundärstrukturen für ITS1-, 5.8S- und ITS2-Marker als radiale Ansichtsstrukturen wurden für Publikationszwecke mit VARNA 3.9 neu gezeichnet und annotiert (Darty et al. 2009).


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Die kurze ITS2-Sequenz dient als effizientes taxonomisches Sequenz-Tag im Vergleich mit der ITS-Volllänge

Eine ideale DNA-Barcoding-Region sollte kurz genug sein, um aus degradierter DNA amplifiziert zu werden. In diesem Artikel diskutieren wir die Möglichkeit, eine kurze nukleäre DNA-Sequenz als Barcode zu verwenden, um eine Vielzahl von Heilpflanzenarten zu identifizieren. Zunächst wurden die PCR- und Sequenzierungs-Erfolgsraten von ITS und ITS2 ausschließlich anhand von Materialien aus trockenen Arzneimittel- und Herbariumsgutscheinproben, einschließlich einiger Proben, die bis vor 90 Jahren gesammelt wurden, bewertet. Die Ergebnisse zeigten, dass ITS2 91 % zurückgewinnen konnte, während ITS nur 23 % Effizienz der PCR und Sequenzierung durch Verwendung eines Primerpaares wiedergewinnen konnte. Zweitens wurden 12861 ITS- und ITS2-Pflanzensequenzen verwendet, um die Identifizierungseffizienz der beiden Regionen zu vergleichen. Vier Identifikationskriterien (BLAST, Inter- und Intradivergenz Wilcoxon Signed Rank Tests und TaxonDNA) wurden ausgewertet. Unsere Ergebnisse unterstützten die Hypothese, dass ITS2 als Minibarcode verwendet werden kann, um Arten in einer Vielzahl von Proben und medizinischen Materialien effektiv zu identifizieren.

1. Einleitung

1.1. DNA-Barcoding von degradierten DNA-Materialien

Das DNA-Barcoding nutzt kurze Standardsequenzen, um Arten zu entdecken und zu identifizieren [1]. Ein idealer DNA-Barcode sollte kurz genug sein, um aus Archivproben mit Universalprimern amplifiziert zu werden. Der Begriff „minimalistischer Strichcode“ wurde erstmals von Herbert als Werkzeug definiert, um die geringe PCR-Effizienz der Cytochrom-c-Oxidase-Untereinheit 1 (CO1) in archivierten Tierproben in Museen zu überwinden und die Möglichkeit der Identifizierung von Tierproben mit einem Bereich von etwa 200 bp wurde diskutiert. Die Ergebnisse dieser Studie zeigten, dass Minibarcodes aus verschiedenen Arten von Proben isoliert werden können, einschließlich Museumsproben, Spurengewebeproben mit degradierter DNA und anderen Proben, von denen der Erwerb eines vollständigen Barcodes (CO1) nicht möglich ist [2] . Die Amplifikation von DNA aus Herbarium-Exemplaren ist auch für Barcoding-Studien wichtig, da es oft notwendig ist, die Artidentifikation frischer Exemplare durch Vergleich ihrer Sequenzen mit denen älterer Museumsexemplare zu bestätigen [3]. Außerdem sind die meisten auf dem Markt erhältlichen medizinischen Materialien trocken und wurden für lange Zeiträume gelagert, daher ist es sehr schwierig, lange DNA-Regionen aus einigen dieser Materialien zu amplifizieren, die die Verwendung von DNA-Barcodes zur Kräuteridentifikation verhindern.

1.2. Der Trend der Kern-DNA-Barcodes

Die Plant Working Group des Consortium for the Barcode of Life (CBOL) empfahl die Verwendung einer Kombination von matk und rbcL als Strichcode für Landpflanzen [4], und interner transkribierter Spacer (ITS)/interner transkribierter Spacer 2 (ITS2) wurde als ergänzender Marker für weitere Untersuchungen vorgeschlagen. Die ITS-Sequenz enthält in vielen Proben genügend variable Stellen für die Speziesidentifikation [5–9], aber ITS konnte aus ca. Einfügungen/Löschungen) auf dieser taxonomischen Ebene. Darüber hinaus existieren in vielen Taxa mehrere funktionale Kopien. Daher wurde ITS in früheren Phasen als universeller Landpflanzen-Barcode ausgeschlossen. Im Gegensatz dazu wird davon ausgegangen, dass sich ITS2 gemeinsam entwickelt hat, was zu einer Homogenisierung aller Kopien dieses Gens im gesamten Genom führt, und in den meisten Organismen wurde ITS2 als ein einzelner Locus behandelt. Somit könnte die ITS2-Region ein geeigneter Marker für die taxonomische Klassifikation sein [10–12]. Kürzlich wurde ITS2 als nützlicher Barcode für Heilpflanzen vorgeschlagen [13–17], als universeller DNA-Barcode zur Identifizierung von Pflanzen und als komplementärer Ort von CO1 zur Identifizierung von Tieren [18]. Die China Plant Barcode of Life Group betrachtete ITS2 als nützliche Alternative zu ITS, da es leichter amplifiziert und sequenziert werden kann [19]. Darüber hinaus erwies sich die Sekundärstruktur von ITS2 als effizientes Werkzeug zur biologischen Speziesidentifikation [20, 21].

Hier haben wir die Wirksamkeit von ITS2 als Minibarcode im Vergleich zum Volllängen-ITS zur Identifizierung einer Vielzahl archivierter Pflanzenarten demonstriert. Ein erster Satz von 100 medizinischen Proben aus Museumsexemplaren und dem Kräutermarkt wurde getestet, um die PCR- und Sequenzierungseffizienz von ITS und ITS2 zu bestimmen. Ein zweiter Satz von 12861 Sequenzen, die 8313 von GenBank gesammelte Arten repräsentieren, wurde untersucht, um die Identifizierungsfähigkeiten von ITS und ITS2 zu vergleichen. Ziel dieser Arbeit ist es, ITS2 als Minibarcode für große Proben zu evaluieren.

2. Materialien und Methoden

2.1. Pflanzenmaterial

Der erste Satz von 100 medizinischen Museumspräparaten und Kräuterprodukten von 92 Arten, die 5 Ordnungen repräsentieren (siehe Tabelle 1 des ergänzenden Materials, das online unter http://dx.doi.org/10.1155/2013/741476) verfügbar ist, wurde vom Buozhou Herbal . gesammelt Markt und aus Proben des Instituts für Heilpflanzenentwicklung, die zum Teil vor 90 Jahren gesammelt wurden, um die Effizienz von PCR und Sequenzierung zu testen. Alle Proben wurden auf Speziesebene von Professor Yulin Lin (Institut für Heilpflanzenentwicklung, Chinesische Akademie der Medizinischen Wissenschaften) authentifiziert. Ein zweiter Satz von Sequenzen für die Analyse der Identifizierungseffizienz, die in diesem Artikel vorgestellt wird, wurde aus der GenBank-Nukleotidsequenzdatenbank erhalten. Wir führten eine bioinformatische Analyse mit allen in GenBank vorhandenen ITS-Sequenzen durch, die dem Suchmuster „18S ribosomal RNA gene internal transcribed spacer 1, 5.8S ribosomal RNA gene, and internal transcribed spacer 2, and 28S ribosomal RNA gene“ entsprachen. Teilsequenzen, Pilzsequenzen und Sequenzen von weniger als 100 bp wurden entfernt. Ein Flussdiagramm ist in Abbildung 1 gezeigt. Die vollständigen ITS2- und ITS-Regionen voller Länge wurden mit dem Hidden-Markov-Modell (HMM) [22] bzw. dem ITS-Pflanzenmodell annotiert, die auf sehr ähnlichen und korrekt annotierten Referenzsequenzen in öffentliche Datenbank. Letztendlich wurden 12861 Sequenzen erhalten, die 8313 Arten aus 1699 Gattungen repräsentieren (GenBank-Zugangsnummern sind in Tabelle 2S aufgeführt) und verwendet, um die Identifizierungseffizienz von ITS und ITS2 zu analysieren.


2.2. DNA-Extraktion, PCR-Amplifikation und Sequenzierung

Die gesamte genomische DNA wurde aus den Proben mit dem Plant Genomic DNA Kit (Tiangen Biotech Beijing Co., Ltd., China) gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert. Die Primersequenzen für ITS2 wurden von Chen et al. [13]. ITS wurde mit den Primern ITS5 und ITS4 amplifiziert [23]. Die zur Amplifikation der beiden Regionen (ITS und ITS2) verwendeten PCR-Bedingungen und Sequenzen basierten auf den von Kress et al. und Chenet al. [1, 13, 24, 25].

2.3. Analyse Methode

Sechs Parameter wurden verwendet, um die interspezifischen und intraspezifischen Divergenzen nach einer zuvor beschriebenen Methode zu charakterisieren [13]. Drei der Parameter wurden verwendet, um die interspezifische Variabilität abzuschätzen: durchschnittliche interspezifische Distanz, durchschnittliche Theta-Primzahl und kleinste interspezifische Distanz. Die anderen drei Parameter wurden verwendet, um die intraspezifische Divergenz zu bewerten: durchschnittliche intraspezifische Differenz, Theta und durchschnittliche Koaleszenztiefe. Der Wilcoxon-Vorzeichenrangtest wurde wie zuvor beschrieben verwendet [13, 26, 27]. Zur Identifizierung der Spezies wurde ein Basic Local Alignment Search Tool (BLAST1) durchgeführt [13]. Zur Berechnung der Identifizierungseffizienz wurde die Software TaxonDNA verwendet [28, 29].

3. Ergebnisse

3.1. PCR und Universal-Primer

Um die Effizienz von PCR und Sequenzierung zu bewerten, wurden 100 Arzneimittelproben aus dem Kräutermarkt und Museumsexemplaren, darunter 91 Arten aus 5 Bestellungen, getestet. 16% der Proben wurden vom Kräutermarkt und die restlichen 84% vom Institut bezogen der Heilpflanzenentwicklung. Das ITS-Primerpaar ergab eine Wiederfindungsrate von nur 23%, verglichen mit 91% Wiederfindungsrate für ITS2. Alle Sequenzen wurden bei GenBank eingereicht (die GenBank-Zugangsnummern sind in Tabelle 1S, Ergänzungsmaterial aufgeführt). Die geringe Größe von ITS2 erleichtert seine Amplifikation durch universelle Primer, auch in Proben mit teilweise degradierter DNA.

3.2. Artenidentifikation
3.2.1. Vergleich inter- und intraspezifischer Divergenzen

Der Vergleich der Inter- und Intraspezies-Sequenzvariation war ein wichtiger Aspekt der Barcode-Identifizierung. Für die 12861 ITS- und ITS2-Sequenzen, die 8313 Arten aus 1699 Gattungen enthielten, betrugen die durchschnittlichen Längen von ITS und ITS2 634 bp bzw. 233 bp. Der Vergleich der inter- und intraspezifischen genetischen Distanzen ergab, dass die ITS2-Region gemäß den drei interspezifischen Parametern eine höhere interspezifische Divergenz aufwies (Tabelle 1). Ein weiterer Vorteil von ITS2 besteht darin, dass seine konservierte Sekundärstruktur mit einer relativ geringen intraspezifischen Variation verbunden ist. Die Kombination einer konservierten Sekundärstruktur mit einer variablen Sequenz scheint ein großer Vorteil des Einsatzes von ITS2 zu sein [30].

Die Unterschiede in der prozentualen Sequenzdivergenz zwischen Loci wurden unter Verwendung des Wilcoxon-Vorzeichen-Rang-Tests getestet. Die Ergebnisse zeigten, dass ITS2 ein variablerer Barcode war (Tabelle 2). ITS enthielt eine konservierte 5.8S-Region, die die komparative Divergenz verringerte. Basierend auf diesen Ergebnissen weist ITS2 eine ausreichende Variation auf, um Pflanzen zu differenzieren.

3.2.2. BLAST-basierte Identifizierung

BLAST1 wurde verwendet, um die Effizienz von ITS2 und ITS zu bewerten. ITS und ITS2 identifizierten erfolgreich 89,2 % bzw. 79,2 % der Exemplare auf Artenebene und 97,5 % bzw. 93,8 % auf Gattungsebene (Tabelle 3). Darüber hinaus macht die deutlich kleinere Größe von ITS2 (durchschnittliche Länge von ca. 233 bp) im Vergleich zu der von ITS (durchschnittliche Länge von ca. 634 bp) ITS2 zu einem besseren Kandidaten für Barcode-Studien.

Um die jeweilige Identifizierungseffizienz pro Gattung abzuschätzen, wurden unabhängig voneinander Gattungen ausgewählt, die mindestens 20 Arten enthalten (Tabelle 4). In 85 % (68/80) der Gattungen sind die Erfolgsraten von ITS und ITS2 identisch. ITS hatte in den folgenden 12 Gattungen eine der von ITS2 überlegene Identifizierungseffizienz: Gunnera, Luzula, Strobilanthes, Nepeta, Dionysien, Adenia, Clidämie, Sedum, Indigofera, Kalanchoe, Pilea, und Melampodium. Von den 603 Gattungen, die mindestens 3 Proben enthalten, hatten ITS2 und ITS bei 394 Gattungen (65,3%) die gleiche Identifizierungseffizienz und ITS und ITS2 bei 345 Gattungen (57,2%) eine 100%ige Identifizierungseffizienz auf Artebene (Tabelle .). 3S).

3.2.3. TaxonDNA-Identifizierung

Wir haben TaxonDNA auch verwendet, um die Genauigkeit der Artenbestimmung basierend auf ITS und ITS2 zu bewerten. TaxonDNA ist ein Alignment-basiertes parametrisches Clustering-Programm, das die engste Übereinstimmung einer Sequenz durch Vergleich mit allen anderen Sequenzen im Alignment-Datensatz bestimmt. Wenn die verglichenen Sequenzen von derselben Spezies stammten, wurde die Identifizierung als erfolgreich angesehen, während nicht übereinstimmende Namen als fehlgeschlagen gewertet wurden. Fälle mit mehreren gleich guten besten Übereinstimmungen verschiedener Arten wurden als mehrdeutig angesehen [29]. In dieser Studie betrugen die Erfolgsquoten der „besten Übereinstimmung“ 67,88 % bzw. 60 % für ITS und ITS2. Die zweideutigen Identifikationsraten von ITS und ITS2 betrugen 14,9% bzw. 0% und die Fehlidentifikationsraten betrugen 17,2% bzw. 40%. Der Datensatz enthielt 8607 Sequenzen mit Duplizierung.

Wir haben TaxonDNA verwendet, um den Schwellenwert festzulegen. Alle Sequenzen ohne Übereinstimmung unterhalb des 97%-Schwellenwerts blieben unidentifiziert. Wenn die Namen der verglichenen Proben identisch waren, wurde die Identifizierung als richtig angesehen, wenn die Sequenznamen nicht übereinstimmten, wurde die Identifizierung als fehlgeschlagen betrachtet.Wenn mehrere gleich gute beste Übereinstimmungen gefunden wurden, die zu mindestens zwei Arten gehörten, wurde die Identifizierung als mehrdeutig angesehen [29, 31]. Die Erfolgsquoten bei der „besten engen Übereinstimmung“ betrugen 62,53 % bzw. 32 % für ITS und ITS2. Die zweideutigen Identifikationsraten von ITS und ITS2 betrugen 14,0 % bzw. 0 %. Die Fehlidentifikationsraten von ITS und ITS2 betrugen 7,28 % bzw. 0 %. Die verbleibenden Proben wurden als nicht identifiziert betrachtet, da sie keine Übereinstimmungen unter dem Schwellenwert aufwiesen. Die Nichtübereinstimmungsverhältnisse von ITS und ITS2 betrugen 16,2 % bzw. 68 % (Tabelle 5). ITS lieferte im Vergleich zu ITS2 leicht höhere Erfolgs- und Fehlidentifikationsraten, aber ITS2 lieferte eine niedrigere mehrdeutige Identifikationsrate (0 % gegenüber 14,9 % bzw. 14,0 % unter der „besten Übereinstimmung“ bzw. der „besten nahen Übereinstimmung“ für ITS).

4. Diskussion

4.1. PCR- und Sequenzierungs-Erfolgsraten

Viele Museumsexemplare sind sehr nützlich für DNA-Barcoding-Studien. Es kann jedoch schwierig sein, qualitativ hochwertige DNA aus diesen Proben zu erhalten, was die PCR-Amplifikation und Sequenzierung ineffizient macht. In dieser Studie fanden wir kurze ITS2-Sequenzen von mehr als 90% der Kräuterproben, die 5 Ordnungen repräsentierten, während die Wiederfindungsrate für ITS mit einem einzigen Primer-Set nur 23% betrug. Diese Diskrepanz zwischen den beiden Regionen entsteht, weil ITS im Vergleich zu ITS2 sehr lang ist und ITS verschiedene PCR-Bedingungen und Additive für eine erfolgreiche Amplifikation benötigt [32]. Eine andere mögliche Erklärung ist, dass aus diesen Proben aufgrund des Abbaus, der in den Museumsexemplaren während der langen Lagerzeit und in den Kräutern aus dem Markt während der Ernte, Verarbeitung und Lagerung stattgefunden hat, schwierig intakte DNA zu extrahieren war. Im Gegensatz dazu kann die ITS2-Region leicht mit konservierten Primern amplifiziert und sequenziert werden. Aufgrund seiner relativ kurzen Länge konnte der ITS2-Minibarcode in fast allen Gruppen erfolgreicher amplifiziert werden als die ITS-Sequenzen in voller Länge.

4.2. Identifikationseffizienz von ITS und ITS2

Um festzustellen, ob in dieser Studie Strichcode-Lücken vorhanden sind, wurden die Beziehungen zwischen den inter- und intraspezifischen Divergenzen für jede Art verglichen. Für die 12861 Proben konnten ITS und ITS2 mit der BLAST-Methode 97,5 % bzw. 93,8 % der Gattungen identifizieren. Der ITS in voller Länge konnte ungefähr 89,2 % der Arten identifizieren, und der Mini-DNA-Barcode ITS2 identifizierte erfolgreich ungefähr 79,2 % der Arten, was mehr ist als die von CBOL vorgeschlagene Pflanzenkombination von mattK und rbcL (70%) [4, 5].

TaxonDNA wurde auch verwendet, um die Identifizierungseffizienzen von ITS und ITS2 zu vergleichen, und das Ergebnis schien dem mit der BLAST-Methode erhaltenen ähnlich zu sein. ITS hatte im Vergleich zu ITS2 etwas höhere Erfolgs- und Fehlidentifizierungsraten, aber die mehrdeutige Identifizierungsrate von ITS2 betrug 0 %, während die von ITS 14,9 % bzw. 14,0 % bei den Algorithmen „Best Match“ und „Best Close Match“ betrug. Die mehrdeutige Identifikationsrate von null von ITS2 kann auf seine konservierte Sekundärstruktur zurückzuführen sein. Die Sekundärstruktur von ITS2 hat sich für diagnostische Zwecke auf Speziesebene als nützlich erwiesen [21], was die Mehrdeutigkeitsraten reduzieren und die Korrektheit der Barcode-Analyse erhöhen könnte. Beweise haben gezeigt, dass eine Kombination von Nukleotid- und Sekundärstrukturdaten einige der Einschränkungen von ITS2 überwinden kann [33] und dass die ITS2-Sequenz und Sekundärstruktur (Sequenzstruktur) die genauesten Ergebnisse liefert, die von der Sekundärstruktur profitieren [30 , 34]. Daher wäre die Verwendung der ITS2-Sekundärstrukturen äußerst hilfreich, um die Herausforderungen bei der Identifizierung und Klassifizierung von Arten zu bewältigen.

4.3. ITS2 versus ITS: Vorteile und Einschränkungen

ITS2 hat viele Vorteile, die es ITS überlegen machen. Zunächst ist es wichtig, dass Arten durch systematische Analyse korrekt für das DNA-Barcoding definiert werden [3]. ITS2-Regionen mit Sekundärstrukturen sind stärker konserviert als die DNA-Sequenzen allein, was nützliche Informationen für die kladistische Inferenz von Beziehungen liefern könnte [35], und die ITS2-Sequenzstruktur-Informationen liefern ein Analyseergebnis der kompensatorischen Basenänderungen (CBCs), das korreliert mit dem biologischen Artenkonzept [21]. Daher wurde ITS2 als zweischneidiges Werkzeug für evolutionäre Vergleiche bei Eukaryoten angesehen [12].

Zweitens müssen für ein globales Barcode-Projekt Millionen von Arten sequenziert werden, was mit Standard-Sequenzierungsmethoden extrem kostspielig wäre. Die von der Hochdurchsatz-Sequenzierung bereitgestellten Leselängen würden ausreichen, um eine Datenbank mit ITS2-Mini-DNA-Barcode-Sequenzen aufzubauen. Die Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologie verwendet einen Emulsions-PCR-Ansatz, um gleichzeitig mehrere Tausend 100–200 bp DNA-Moleküle in einer Reaktion zu amplifizieren und liefert eine große Anzahl kurzer Sequenzen mit geringeren Kosten als Standardansätze. Mello bewies, dass die durch Hochdurchsatz-454-Sequenzierung erhaltene ITS2-Leselänge ausreichende Informationen für die Taxonzuordnung liefert [36]. Songet al. verwendeten Hochdurchsatz-454-Sequenzierung, um erfolgreich eine große Anzahl von ITS2-Sequenzen in einer Reaktion zu erhalten [37]. Die Eignung für Hochdurchsatzansätze und die hohe Identifikationseffizienz machen den ITS2-Minibarcode für Projekte mit einer großen Anzahl von Umweltproben nützlich.

Drittens, obwohl ITS2 weniger leistungsfähig war als ITS, um einige eng verwandte Arten aufzulösen, zeigte es viele Vorteile, insbesondere bei der Identifizierung von Kräutern und Proben, die degradierte DNA enthielten. ITS2-Sequenzen könnten verwendet werden, um taxonspezifische Sonden für die schnelle Identifizierung von Pflanzen zu entwickeln [38], und ein ITS2-Mikroarray wurde verwendet, um erfolgreich Arten mit Sequenzidentitäten von bis zu 97% zu trennen [39]. In Anbetracht der kurzen Länge und der hohen Identifizierungseffizienz der ITS2-Sequenz haben wir bestätigt, dass diese sehr kurze Barcode-Sequenz für die Identifizierung von alten Proben und medizinischen Materialien wertvoll ist.

Schließlich gibt es Hunderte von Kopien von ITS innerhalb eines Genoms. Dennoch kann ITS2 als einzelner Locus im gesamten Genom der meisten Organismen angesehen werden [10, 12, 37], einschließlich Panax-Ginseng und Panax quinquefolius (unveröffentlicht), wodurch ITS2 als Barcode besser geeignet ist als ITS.

Diese Studie zeigte das Potenzial des ITS2-Minibarcodes für DNA-Barcoding-Analysen. ITS2 zeigte eine hohe Sequenzvariabilität unter 12861 Proben von 8313 Arten. Ein idealer DNA-Barcoding-Marker für die taxonomische Klassifizierung sollte sich schnell entwickeln, um eine Klassifizierung auf Speziesebene zu ermöglichen, muss aber auch hochkonservierte Priming-Sites enthalten und für die DNA-Amplifikation und -Sequenzierung sehr zuverlässig sein [40]. Die ITS2-Region erfüllt die erwarteten Kriterien eines globalen DNA-Barcodes. Unsere Analyse unterstützt die Verwendung des ITS2-Minibarcodes als „universeller DNA-Barcode“ zur schnellen Identifizierung von medizinischen Materialien und Proben.

Interessenkonflikt

Die Autoren erklären, dass in dieser Arbeit kein Interessenkonflikt besteht.

Danksagung

Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China unterstützt (Grant-Nr. 81001608 und 81130069). Die Autoren danken ihren Kollegen, die bei der Probensammlung, Identifizierung, Laborarbeit und Papiervorbereitung geholfen haben, darunter Professor Yulin Lin, Chang Liu und viele andere.

Zusatzmaterialien

Tabelle S1: Liste von 100 Museums-Arzneimitteln und Kräuterprodukten vom Kräutermarkt in Buozhou und von Exemplaren des Instituts für Heilpflanzenentwicklung

Tabelle S2: Liste der GenBank-Zugangsnummern von 12861 ITS-Sequenzen

Tabelle S3: Liste von 603 Gattungen, die mindestens 3 Proben enthalten

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Copyright © 2013 Jianping Han et al. Dies ist ein Open-Access-Artikel, der unter der Creative Commons Attribution License vertrieben wird und die uneingeschränkte Nutzung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium erlaubt, vorausgesetzt, das Originalwerk wird ordnungsgemäß zitiert.


Diskussion

Interkontinentale Divergenz der Abstammung

Unsere Ergebnisse unterstützen nachdrücklich eine Hypothese der Abstammungsdivergenz und eines Mangels an zeitgenössischem Genfluss zwischen nordamerikanischen und skandinavischen Populationen von T. populinum. Migrationskorridore waren entweder über die Bering Land Bridge (BLB) von Ostsibirien nach Alaska oder über die North Atlantic Land Bridge (NALB) zwischen Europa und Nordamerika durch Grönland vorhanden. Die NALB war intakt, bis C. 40 Ma, aber erst nach 25–15 Ma funktionsfähig (Milne, 2006). Kürzlich hat Denk . jedoch et al. (2010) kamen zu dem Schluss, dass die NALB eine aktive Route ins späte Miozän (11,6–5,3 Ma) gewesen sein könnte. Das BLB wurde ca. durchtrennt. 5,4–5,5 Mio. (Gladenkov et al., 2002) und kann zwischen 65 und 5,4 Ma ununterbrochen funktionsfähig gewesen sein (Milne, 2006). Ingvarsson (2005), unter Verwendung einer durchschnittlichen (fünf Gene) stillen Standortdivergenz zwischen P. tremula und P. trichocarpa von 6,1% und unter Annahme einer Substitutionsrate für stille Stellen von 5,0–8,0 × 10 −9 schätzte man die Divergenz von P. tremula und P. trichocarpa zwischen 3,8 und 6,2 Ma gelegen haben. Unsere auf Koaleszenz basierenden Schätzungen legen auch die Divergenz von P. tremula und P. balsamifera/P. Trichocarpa während der Epochen des späten Miozäns bis Pliozäns (5,3–2,6 Ma), ungefähr zeitgleich mit der Eröffnung der Beringstraße (Milne, 2006). Schätzungen der Divergenz in Tricholom sind viel jünger und legen die Divergenz dieser Abstammungslinien während des Pleistozäns (2,6–0,01 Ma) fest. Unsere Divergenzschätzungen deuten stark darauf hin, dass Tricholom und sein Bevölkerung Die Wirte unterliefen nicht gleichzeitig einer interkontinentalen Migration.

Mögliche Erklärungen für die stark unterstützte, aber neuere, interkontinentale Abstammungsdivergenz innerhalb von T. populinum umfassen die folgenden: allopatrische Isolierung von T. populinum Populationen in Skandinavien und Nordamerika, die mit der Artbildung von Bevölkerung Gastgeber (P. tremula und P. balsamifera/P. trichocarpa) Auswirkungen der Populationskontraktion und -expansion während der glazialen und interglazialen Zyklen des Pleistozäns und Gründereffekt, gefolgt von genetischer Drift nach einem einzigen, seltenen Fernausbreitungsereignis. Da es keine gemeinsamen Haplotypen zwischen den Kontinenten gab, waren Analysen der gerichteten Migration nicht möglich.

Ermittlung der möglichen Rollenkoevolution mit verschiedenen Bevölkerung Spezies (P. tremula vs P. balsamifera/P. Trichocarpa) hatte auf Interkontinental T. populinum Divergenz erfordert zusätzliche Stichproben von Wirtspopulationen in Europa und Nordamerika oder gegenseitige Impfversuche. Basierend auf der taxonomischen Verteilung der Wirtsarten von T. populinum, ist es unwahrscheinlich, dass die nordamerikanischen und europäischen Abstammungslinien von T populinum divergierte allein aufgrund der Kospeziation mit Bevölkerung. Es ist merkwürdig, dass es nur wenige Sammlungen von gibt T. populinum in Nordamerika mit anderen Pappelarten als P. trichocarpa und P. balsamifera, da P. tremula und P. trichocarpa/P. Balsamifera leben in zwei verschiedenen und gut divergierenden Abschnitten der Gattung. Dieses Rätsel legt nahe, dass Umweltfaktoren, die mit borealen waldähnlichen Umgebungen verbunden sind, die Verbreitung von T. populinum.

Insgesamt, inwieweit T. populinum in Europa, Asien und Nordamerika vorkommt, ist nicht gut dokumentiert. T. populinum tritt bekanntermaßen mit auf P. alba und P. nigra und diese Populationen müssen beprobt werden, um die Populationsstruktur und die Wirtsspezifität in ganz Europa zu bewerten. Populationen von T. populinum von anderen Bevölkerung Arten, einschließlich Zitterpappel, P. tremuloides, die die nordamerikanische Schwesterart ist P. tremula, werden benötigt, um eine vollständigere nordamerikanische phylogeographische Geschichte zu liefern. Innerhalb Nordamerikas die einzige potenzielle Populationsstichprobe eines anderen Bevölkerung Gastgeber kam von Proben aus Colorado, wo P. tremuloides ist dominant, obwohl Taschen von P. balsamifera sind anwesend. Diese Isolate gruppieren sich eindeutig innerhalb der nordamerikanischen Klade in jedem der Genbäume, jedoch sind ohne eine eindeutige Identifizierung der Wirtsarten derzeit keine weiteren Schlussfolgerungen möglich.

Die Schätzungen der durchschnittlichen genetischen Vielfalt waren in Skandinavien und Nordamerika niedrig, aber ähnlich (hD, π, θ Tabelle 2), die die jüngsten demografischen Ereignisse widerspiegelt. Eine geringe Diversität ist ein Hinweis auf ein kürzliches Gründungsereignis oder postglaziale Wiederbesiedlungsengpässe (Hewitt, 2004), kann aber auch eine niedrige Mutationsrate widerspiegeln. Skandinavische Bevölkerung von P. tremula überlebte in Gletscherrefugien auf dem europäischen Kontinent ( Birks et al., 2008 Fussi et al., 2010). In Nordamerika wurden neuere Studien über P. balsamifera fand Beweise für Gletscherrefugien im südlichen Zentralkanada (Keller et al., 2010 Levsen et al., 2012 ) und möglicherweise in einer eiszeitfreien Region Beringia ( Hultén, 1937 Breen et al., 2012 ) während des letzten glazialen Maximums C. 28 000–15 000 Jahre vor der Gegenwart ( Brubaker et al., 2005 ). T. populinum möglicherweise mit diesen Wirten in glazialen Refugien überlebt haben und dann während der Eis- und Zwischeneiszeiten eine Populationskontraktion und -expansion erfahren haben.

Während die Zahl biogeographischer Studien zu Ektomykorrhiza-Pilzen zunimmt ( Douhan et al., 2011 ) haben nur wenige holarktische Ektomykorrhiza-Pilze gut dokumentierte Phylogeographien. Studien beginnen, ein wiederkehrendes Muster interkontinentaler Divergenz zu zeigen. Die Ektomykorrhiza-Pilze Leccinum scabrum und Leccinum holopus beide haben eine ähnliche phylogeographische Struktur wie T. populinum, und beide Leccinum spp. haben genetische Diskontinuitäten zwischen dem nordamerikanischen und europäischen Kontinent und wenig intrakontinentale phylogeographische Struktur (den Bakker et al., 2007). Diese Leccinum spp. sind auch Gastgeber-Spezialisten, die nur mit Betula spp., und kommen nur auf der Nordhalbkugel vor ( den Bakker et al., 2007). In einer aktuellen Studie mit Mikrosatelliten und nuklearen Loci hat Vincenot et al. (2012) fanden den Ektomykorrhiza-Pilz Laccaria Amethystin bildeten phylogenetische Linien in Europa und Japan ohne gemeinsame Haplotypen zwischen den Regionen. Die genetische Struktur wurde nicht entdeckt und in Japan wurde nur eine schwache Isolation durch Distanz (IBD) festgestellt (FNS = 0,04 960 km zwischen den beiden Populationen) und Europa (FNS = 0,041 2900 km zwischen den am weitesten entfernten Populationen) ( Vincenot et al., 2012). Unsere Ergebnisse sind denen von Vincenot . sehr ähnlich et al. (2012) sowohl auf inter- als auch auf intrakontinentaler Ebene. Wir fanden auch eine geringe Differenzierung von T. populinum Populationen in Nordamerika, die bis zu 2500 km voneinander entfernt waren (die maximale Entfernung zwischen unseren Populationen im pazifischen Nordwesten und in Alaska). Ein wesentlicher Unterschied zwischen diesen Studiensystemen besteht jedoch darin, dass L. Amethystin verbindet sich mit einer Vielzahl von Gastgebern, während T. populinum tritt nur mit auf Bevölkerung Spezies. Ein interessanter Vorschlag von Vincenot et al. (2012) ist das? L. Amethystin kann eine Ringart bilden. Zukünftige Studien zu holarktischen Ektomykorrhiza-Pilzen sollten diese Hypothese ebenfalls berücksichtigen.

Es gibt jedoch auch Beispiele für die intrakontinentale Populationsstruktur innerhalb von Ektomykorrhiza-Arten. Eine Reihe von Studien über A. muscaria, die traditionell als Wirt-generalistischer Mykorrhiza-Pilz mit einem breiten geografischen Verbreitungsgebiet angesehen werden, haben aufgrund eines fehlenden Genflusses eine starke allopatrische Divergenz zwischen Eurasien/Alaska und nordamerikanischen Abstammungslinien von ähnlichen Habitaten gezeigt ( Oda et al., 2004 Edelstein et al., 2006, 2008). Im krassen Gegensatz zu T. populinum, A. muscaria Es wurde nachgewiesen, dass es sich um einen phylogenetischen Artenkomplex mit starker Divergenz innerhalb Nordamerikas handelt, die auf ökoregionalen Endemismus zurückzuführen ist ( Geml et al., 2006, 2008, 2010). Darüber hinaus wurden in mehreren Regionen phylogenetische Arten in Sympatrie gefunden ( Geml et al., 2006, 2008 ).

Tricholom Divergenzzeitschätzungen

In dieser Studie haben wir die Divergenzzeit in geschätzt T. populinum unter Verwendung von zwei Methoden: eine basierend auf einer geschätzten durchschnittlichen Nukleotid-Substitutionsrate für den ITS und die zweite basierend auf einem Kalibrierungspunkt innerhalb der Basidiomycota, aber außerhalb von Tricholom. Da die Wahrscheinlichkeit der Entdeckung Tricholom im Fossilienbestand sehr gering ist, ist eine interne Kalibrierung von Schätzungen der Divergenzzeit möglicherweise nie möglich. Daher haben wir Kalibrierungspunkte zwischen den Hauptgruppen innerhalb der Basidiomycota verwendet. Es ist klar, dass die niedrigere Substitutionsrate, 0,1 × 10 −9 , nicht angemessen ist, da diese Schätzungen der Divergenz für Tricholom spp. von T. populinum (C. 150 Ma) entsprechen ungefähr der geschätzten Diversifikation der Agaricales ( Geml et al., 2004 Matheny et al., 2009). Im Gegensatz dazu ist die Kongruenz der Schätzungen basierend auf oberen (0,87 Ma (95% HPD: 0,35; 1,46)) und durchschnittlichen (1,7 Ma (95% HPD: 0,76,2,95 Ma)) ITS-Nukleotid-Substitutionsraten und von Kalibrierungspunkten (1,0 Ma (95% HPD: 0,17, 2,40) innerhalb der Basidiomycota ist auffällig. Wenn Sequenzen aus mehr Pilzgenomen verfügbar werden, werden robuste Schätzungen der Nukleotid-Substitutionsraten für eine steigende Anzahl repräsentativer Basidiomycota sowie die Entwicklung zahlreicher zusätzlicher Loci entwickelt, die beide die Genauigkeit der Divergenzzeitschätzungen erhöhen. Es sollte möglich sein, die hier vorgestellten Hypothesen zu den Divergenzzeitschätzungen zwischen T. populinum Linien in zukünftigen Studien.

Dies war die erste phylogenetische und phylogeographische Studie von T. populinum. Die einzige andere Studie untersuchte die Größe und Langlebigkeit von Genen auf einer sehr feinen räumlichen Skala, die mit P. nigra in Frankreich (Gryta et al., 2006). Daher wissen wir sehr wenig über die Fortpflanzungsbiologie von T. populinum. Die Zwei T. populinum Hier identifizierte Abstammungslinien können als phylogenetische Arten oder kryptische Arten betrachtet werden, gemäß der genealogischen Konkordanz der phylogenetischen Artenerkennung (GCPSR Taylor et al., 2000). Die Anzahl der verschiedenen Abstammungslinien in der T. populinum Komplex kann nur nach einer zusätzlichen Probenahme von Wirten und geografischen Standorten, wie bereits erwähnt, festgestellt werden. Der Grad bis zu dem T. populinum Abstammungslinien bleiben interfertil und unterliegen einer Hybridisierung als Folge des sekundären Kontakts zwischen nordamerikanischen T. populinum Abstammung(en) und T. populinum Abstammung(en) in Verbindung mit europäischen oder asiatischen Pappeln wurden nicht untersucht. In dieser Studie wurde Nordamerika T. populinum Populationen aus Feldsammlungen wurden mit Wirtspopulationen ohne eingeführte Bevölkerung spp. Bevölkerung spp. hybridisieren häufig und es kann möglich sein, die Hybridisierung von . zu untersuchen T. populinum von bekannt Bevölkerung Hybridzonen in der zukünftigen Arbeit.

Unsere Ergebnisse liefern starke Beweise für einen Mangel an anhaltendem Genfluss zwischen nordamerikanischen und skandinavischen Populationen von T. populinum. Der aufkommende Trend interkontinentaler genetischer Brüche bei Ektomykorrhiza-Pilzen aus mittleren Breiten impliziert, dass die Pilzbiogeographie ein reichhaltiges Forschungsgebiet mit Relevanz für vergangene und gegenwärtige Reaktionen von Organismen auf den Klimawandel sein wird.


DISKUSSION

Die Natürlichkeit und der Inhalt von Subtribe Disinae

Der ITS-rDNA-Sequenzvergleich von 30 Diseae, 20 Orchideae und vier Cranichideae- und Diurideae-Außengruppen zeigt die Natürlichkeit der Subtribus Disinae. Für die Paraphylie von Disinae eingeschränkte Topologien umfassen bis zu 17 zusätzliche Schritte und weisen im Vergleich zum besten Baum eine deutlich geringere Wahrscheinlichkeit auf (Kishino- und Hasegawa-Tests Tabelle 2).

Disinae enthalten die Gattungen Disa, Herschelia, Monadenia, und Schizodium. Der Typ des Unterstamms ist die große Gattung Disa (128 Arten). Die Abgrenzung von Disa war problematisch aufgrund: (1) dem Status von Monadenia, das als Mitglied angesehen wurde Disa von einigen Autoren, aber ohne klare Affinität zu einem Abschnitt (Kurzweil et al., 1995) (2) Anerkennung der Gattung Herschelia (oft bekannt unter dem Namen Herschelianthe), trotz seiner engen Beziehungen zu D. Sektion Stenocarpa (Kurzweil et al., 1995) und (3) mögliche Unterscheidung von D. Sektion Micranthae als eigene Gattung (Chesselet, 1989). Die molekulare Phylogenie unterstützt eine Umschreibung der Gattung Disa das beinhaltet Monadenia und Herschelia (wie Disa bracteata und Disa spatulata, bzw. Abb. 1, 3) und bestätigt damit frühere Beobachtungen (Linder und Kurzweil, 1994) und unterstützt die von Bolus (1884, 1885) und Schlechter (1901) befürwortete Umschreibung der Gattung. Zusätzlich, Disa (Herschelia) spatulata stark Cluster mit Disa chrysostachy (Sektion Micranthae), und diese Klade wird als Schwester von schwach unterstützt Disa (Monadenium) brakteata. Unter den 14 Disa von Linder (1981a, b) anerkannte Abschnitte umfasste unsere Studie nur vier Abschnitte: Disa (sechs Vertreter), Koryphäen (zwei), Micranthae (eins) und Phlebidien (eine Tabelle 1). Nach Linder (1981a, b) besitzen Pflanzen entweder aufrechte Staubbeutel (selten, Abschnitt Micranthae) oder zurückgebogene Staubbeutel. Im letzteren Fall werden die Blütenblätter neben der Anthere gespiegelt, entweder blau (Abschnitt Phlebidien) oder eine andere Farbe (Abschnitt Disa) oder Pflanzen haben aufrechte Blütenblätter, die frei von dem Rostellum sind, und haben quadratische Seitenlappen (Abschnitt Koryphäen). Abschnitte Disa und Koryphäen sind paraphyletisch, weil Disa rosea (Sektion Disa) Cluster mit D. sagittalis (Sektion Koryphäen) in einer Klade, die sich von anderen Vertretern von Sektionen unterscheidet Disa und Koryphäen. Dieses Ergebnis stimmt mit Linder (1981a, S.272) überein, der feststellte, dass D. rosea ist innerhalb der . morphologisch isoliert Corymbosen Serie. Im Gegensatz dazu ist eine wohldefinierte Klade einschließlich D. cardinalis, D. tripetaloides, D. racemosa, D. uniflora, und D. pillansii wird immer wiederhergestellt. Diese Abteilung Disa s.s. ist gekennzeichnet durch Chromosomenzahlen von 2n = 36 bis 38 und unterscheidet sich von 2n = 40 gefunden in D. sagittalis (Pienaar et al., 1989). Innerhalb D. Sektion Disa s.s., die Maximum-Parsimony-Analyse von ITS-Daten mit als fünftes Zeichen codierten Indels (Abb. 1) unterstützt die Monophylie von Serien Racemosen (D. racemosa, D. cardinalis, D. tripetaloides, D. uniflora).

Die Ergebnisse innerhalb Disa ist angesichts der relativ dünnen Stichprobe von Abschnitten der Gattung für ITS-Sequenzen (12 der 128 Disa Spezies). In morphologischen Analysen (Johnson, Linder und Steiner, 1998 Linder und Kurweil, unveröffentlichte Daten) D. Sekte. Stenocarpa war Schwester von dem Disa (Herschelia) spatulata Gruppe und die Disa (Monadenia) brakteata Gruppe gruppiert in der Nähe der Basis von Disa. Bemusterung von mehr Artenvielfalt innerhalb der großen Gattungen (Disa, Satyrium, Disperis, und Korycium) wäre erforderlich, um infragenerische Grenzen genauer zu beurteilen.

Die Natürlichkeit und der Inhalt des Unterstamms Satyriinae

Satyriinae umfassen die Gattungen Satyrium und Pachites (für diese Studie nicht verfügbar), definiert durch zwei morphologische Synapomorphien: eine verlängerte Säule und fehlende Differenzierung zwischen Kelch- und Kronblättern (Linder und Kurzweil, 1994). Fünf der sieben in der großen Gattung anerkannten Abschnitte Satyrium (100 Arten, Schlechter, 1901 88 Arten in Kurzweil und Linder, im Druck) wurden in unsere molekulare Untersuchung eingeschlossen: Eusatyrium, Leptocentrum, Chlorocorys, Brachysaccium, und Satyridium. Die ITS-Ergebnisse stimmen nicht mit einigen dieser taxonomischen Abschnitte überein, aber die Stichproben sind zu begrenzt (zehn der 100 Satyrium Arten) um Schlussfolgerungen zu ziehen. Diese Abschnitte, mit Ausnahme von Brachysaccium und Chlorokorn (eine Art von jeder hier beprobten) werden auch nicht durch morphologische, anatomische und ultrastrukturelle Merkmale von Pollen/Samen gestützt (Kurzweil und Linder, im Druck). Vertreter der Sektionen Eusatarium (Satyrium membranaceum, S. humile, S. acuminatum, und S. carneum) und Leptozentrum (S. stenopetalum und S. ligulatum) sind wechselseitig eingebettet, was auf eine Paraphylie beider Gruppen hinweist. Die Apomorphie zweier grundständiger Blätter, die für . auf den Boden gedrückt werden S. Sektion Eusatarium stellt somit einen homoplastischen Zustand dar (auch gefunden bei Kurweil und Linder, im Druck). Aus dem gleichen Grund besitzt das Labellum zwei fadenförmige Kalli (vielleicht Sporne) in Abschnitten Leptozentrum (rosa-rötliche, weißliche oder gelbliche Blätter Labellum länglich) und Chlorokorn (grünliche Blätter suborbikulares Labelum) stellt wahrscheinlich einen konvergenten Charakterzustand dar (identisch mit den Ergebnissen von Kurzweil und Linder [im Druck], aber sie fanden, dass letzterer auch andere apomorphe Charaktere aufweist und dennoch monophyletisch war).

Der monotypische Abschnitt Satyridium (Satyridium rostratum = Satyrium rhynchantum) wurde oft als monotypische Gattung behandelt. Unsere molekularen Daten unterstützen diese Ansicht nicht: Satyrium rhynchantum ist immer stark verbunden mit S. bicallosum, anzeigt, dass Satyridium sollte gleichbedeutend mit sein Satyrium. In der morphologisch/anatomischen Analyse (Kurzweil und Linder, im Druck) war es auch gut eingebettet in Satyrium, aber die Assoziation mit S. bicallosum wurde nicht vorhergesagt. Beide Arten sind morphologisch ungewöhnlich und in mehreren Merkmalen stark reduziert oder modifiziert, so dass der Eindruck entsteht, dass sie jeweils innerhalb der Gattung isoliert sind. Wie Schlechter (1901) feststellt, hat das Labellum abschnittsweise kurze „Säckchen“. Brachysaccium (hier vertreten durch S. bicallosum). In S. rhynchantum, diese sind fleischig und länglich-konisch, und so kann dieser Charakter eine echte Synapomorphie darstellen, die die . definiert S. bicallosum/S. rhynchantum klade. Um diese Hypothese zu bewerten, sollten ITS für Vertreter von Abschnitten sequenziert werden Aviceps und Leukokom denn in diesen beiden Gruppen sind auch die „Säckchen“ des Labellums anzutreffen.

Zu Satyriinae gehören auch Pachites, aber ihr Status ist unklar (für diese Studie lag kein Material vor). Diese Gattung umfasst zwei seltene Arten (P. appressa und P. bodkinii) und kann paraphyletisch sein. Pachites bodkinii kann in Satyriinae aufgrund des Vorhandenseins von monostelen (d. h. einer nicht sezierten Siphonostele) Knollen tatsächlich fehlplatziert sein, ein Merkmal, das möglicherweise bei der Lösung phylogenetischer Fragen bei Diseae eine große Hilfe sein kann (Kurzweil et al., 1995).

Coryciinae: Beziehungen zwischen dem Pterygodium/Corycium-Komplex und Disperis

Coryciinae umfasste ursprünglich die Gattungen Corycium, Pterygodium, Evotella, Ceratandra, und Disperis, alle mit Blüten, die eine Lippe mit einem Anhängsel besitzen (Kurzweil et al., 1991, stellten die Hypothese auf, dass das Fehlen des Anhängsels bei drei Arten von Ceratandra war ein Sekundärverlust). Kurzweilet al. (1995) schlugen vor, dass die beiden Kladen Korycium/Pterygodium und Ceratandra/Evotella Cluster zusammen mit Disperis als ihre Schwestergruppe. Morphologische Unterstützung für Coryciinae s. S. ist klar, mit fünf apomorphen Zeichen, während nur zwei Zeichen eine Beziehung dieser mit unterstützen Disperis (Linder und Kurzweil, 1994).

Die MP- und ML-Bäume zeigten eine Paraphylie von Coryciinae mit zwei unterschiedlichen Kladen (Abb. 1, 3): (1) Coryciinae s.s. einschließlich Korycium und Pterygodium als Schwestergruppe zu Orchideae und Satyriinae und (2) Disperis als Schwester von Orchideae und allen anderen Diseae. Der Signifikanztest der Wahrscheinlichkeitsunterschiede lehnt jedoch die Monophylie des Unterstamms nicht ab (Tabelle 2), und es sollte beachtet werden, dass wir nur zwei Mitglieder von großen und weit verbreiteten Disperis. Wenn die Monophylie von Coryciinae mit sechs zusätzlichen Schritten eingeschränkt ist, Disperis paart mit Pterygodium, im Widerspruch zu den Schlussfolgerungen von Kurzweil et al. (1995).

Das Ausmaß der ITS-Divergenz ist innerhalb der Korycium/Pterygodium komplex (z. B. Abb. 3). Korycium ist aufgrund der inneren Lage von . paraphyletisch Pterygodium mit C. carnosum Schwester der ganzen Klade. Es sind mehr Stichproben erforderlich, um die Position von besser zu bewerten Pterygodium, und es ist möglich, dass unser Ergebnis ein Effekt der Unterabtastung ist (5 der 32 Korycium/Pterygodium Arten beprobt wurden) und die festgestellten höheren Divergenzgrade. Die isolierte Position von Corycium carnosum wurde aufgrund seiner Morphologie und Anatomie hervorgehoben (Kurzweil et al., 1991). Die ITS-Daten bestätigen seine frühe divergierende Position bei Coryciinae s.s. Corycium nigrescens und C. dracomontanum sind nah und Schwester zu C. flanaganii, in voller Übereinstimmung mit der morphologischen und anatomischen Studie von Kurzweil et al. (1991). Diese Klade wird durch eine einzigartige Synapomorphie definiert: die Verschmelzung der seitlichen Kelchblätter.

Generische Abgrenzung von Disperis war nie problematisch, und die Gattung wird unter Coryciinae isoliert (Kurzweil et al., 1991). Die 5.8S rDNA-Sequenz von Disperis capensis und D. lindleyana bestätigen ihre Einzigartigkeit, da diese beiden Arten die einzigen Orchideen sind, die eine einzelne Nukleotid-Insertion in diesem Gen besitzen (dh Cytosin in Position 128), in einer Region, von der bekannt ist, dass sie über ein breites Pflanzenspektrum von variabler Länge ist (Hershkovitz und Lewis, 1996) . Ein Vorbehalt zu dieser Aussage muss auch eine Bestätigung enthalten, dass <500 ITS-Sequenzen für eine Familie mit >20.000 Arten existieren. Die ITS1- und ITS2-Sequenzen der beiden Disperis sind auch im Vergleich zu anderen Diseae- und Orchideae-Orthologen stark abweichend, wie durch die mittlere Gesamtdivergenz von 51,0 ± 3,0 % (ITS1) und 53,7 ± 3,0 % (ITS2) für 96 paarweise Vergleiche veranschaulicht wird. Wir können die Möglichkeit nicht ausschließen, dass wir ein ITS-Pseudogen amplifiziert haben, da unterschiedliche Paraloge im Kerngenom von Angiospermen beschrieben wurden (Buckler, Ippolito und Holtsford, 1997). Die Amplifikation und Sequenzierung der ITS-Region wurden jedoch zweimal unabhängig für Disperis lindleyana, ohne dass irgendwelche Unterschiede zwischen den beiden abgeleiteten Sequenzen nachgewiesen wurden. Die Zwei Disperis Sequenzen zeigten auch Ähnlichkeiten (BS = +65 Fig. 1), einschließlich drei aufeinanderfolgender 16-bp-, 5-bp- und 9-bp-Deletionen und einer einzigartigen [AATTGC]-Insertion in der ITS1-Region.

Die abweichende Position von Disperis (Abb. 1, 3) könnte durch seine scheinbar beschleunigte Substitutionsrate erklärt werden, die zu einer Anziehung mit langen Zweigen (Felsenstein, 1978) durch die Cranichiden- und Diuriden-Außengruppen führt. Zusätzliche ITS-Sequenzierung unter Disperis kann helfen, das Auftreten der molekularen Geschwindigkeitsbeschleunigung aufzuklären und den langen Ast aufzubrechen, der zu Disperis capensis und D. lindleyana. Darüber hinaus wird angenommen, dass alle phylogenetischen Rekonstruktionsmethoden Schätzungen der Baumform liefern, die unausgewogener sind als der wahre Baum, insbesondere bei hohen Evolutionsraten (Huelsenbeck und Kirkpatrick, 1996). Ein solcher Trend ist anhand der Asymmetrie unserer MP- und ML-Bäume und der langen Äste für die ITS-Daten deutlich Diuris, Elythranthera, und Disperis (Abb. 1, 3). Die Paraphylie von Diseae kann einfach das allgemeine Verhalten phylogenetischer Algorithmen widerspiegeln, um unausgeglichene Bäume zu erzeugen, und nicht die wahre Evolutionsgeschichte der Hauptgruppen von Diseae und Orchideae.

Zur Unterstützung der hier mit ITS erhaltenen Muster, Studien von drei Plastidenregionen, trnL-F, rbcL, und mattK, zeigen das gleiche Beziehungsmuster für Disperis (Kores, Molvray und Chase, unveröffentlichte Daten), und wir schlagen vor, dass die basale Position von Disperis ist weder das Ergebnis eines Problems mit langen Zweigen noch die Folge eines baumförmigen Artefakts. Auch Diseae s.l. sind in diesen Plastidenbäumen nicht monophyletisch: Satyriinae sind Schwestern zu Gattungen in Orchidinae/Habenariinae, aber Disinae und Coryciinae sind zusammen Schwestern zu Satyriinae/Orchidinae/Habenariinae (eine Beziehung, die hier durch die ML-Tests unterstützt wird) und Kernregionen hochgradig deckungsgleich sind, und wir gehen davon aus, dass wir diese und die morphologischen/anatomischen Daten schließlich in einer einzigen Analyse kombinieren können, sobald die Probennahme vergleichbarer gemacht wurde und die verbleibenden kritischen Taxa zu den molekularen Matrizen hinzugefügt wurden.

Die isolierte Position von Brownleeinae

Brownleeinae sind monogener und es wurde vermutet, dass sie als Hybrid zwischen den Arten von Disinae und Coryciinae entstanden sind (Linder und Kurzweil, 1994). Linder und Kurzweil (1994) konnten die Gruppierung von Brownleea mit jeglichem Vertrauen. Die Anerkennung der Tribus Brownleeinae ist relativ neu (Linder und Kurzweil, 1994), und wir haben hier einen einzigen Vertreter aufgenommen, Brownleea coerulea. Die ITS-Sequenz der B. coerulea ohne jeglichen Hinweis auf Heterogenität, aber eine seit langem etablierte Hybridlinie kann ihre anfängliche Heterogenität durch konzertierte Evolution beseitigen. Die Einschränkung der Diseae-Monophylie (Kladogramm nicht gezeigt) und die ML-Bewertung alternativer Hypothesen (Tabelle 2) weisen beide darauf hin, dass Brownleeinae die Schwestergruppe von Disinae sein könnte, trotz der frühen Divergenz von Brownleea coerulea unter Diseae/Orchideae in den MP- (Abb. 1) und ML-Bäumen (Abb. 3). Linder und Kurzweil (1996) demonstrierten die morphologische Heterogenität mit Brownleea, und ITS-Sequenzen von den sechs verbleibenden Brownleeinae-Arten, mindestens B. parviflora und B. mulanjiensis, werden benötigt, um die phylogenetische Position dieses isolierten Stammes besser zuordnen zu können. Brownleea für keine Plastidenregionen beprobt wurde.

Phylogenetische Beziehungen innerhalb von Orchideen

Die Monophylie von Orchidinae wird stark durch die molekularen Daten gestützt (Abb. 1, 3). Die Phylogenie der in die vorliegende Studie einbezogenen Untergruppe der Orchidinae-Gattungen bestätigt im Allgemeinen die detaillierten molekularen ITS-Analysen von Pridgeon et al. (1997) und Bateman, Pridgeon und Chase (1997). Barlia, Ophrys, Serapias, und Orchis Morio Cluster in einer Klade gekennzeichnet durch kugelige Knollen und Chromosomennummern 2n = 32 oder 36. Gymnadenia, Dactylorhiza, Pseudorchis, Platanthera, und Orchis italica fallen in eine schwächer unterstützte Klade, während sie in der Studie von Pridgeon et al. (1997). Diese Diskrepanz ist wahrscheinlich auf den unterschiedlichen Stichprobenumfang zurückzuführen. Pridgeonet al. (1997) umfasste 88 Arten mit 79 Orchidinae und neun Außengruppen, während die vorliegende Studie 54 Arten mit neun Orchidinae und 45 Außengruppen umfasste.

Monophylie von Habenariinae erscheint in unseren molekularen Bäumen, wird aber nicht gut unterstützt (Abb. 1, 3). Die Position von Brachycorythis (Orchidinae sensu Dressler, 1993) unterscheidet sich in den MP- und ML-Bäumen, hat aber in keiner der Positionen interne Unterstützung. Dieses Ergebnis für Brachycorythis war nicht unerwartet, obwohl die Blüten oberflächlich denen von Orchidinae ähneln, wird klar, dass Orchidinae ein nordgemäßigter Unterstamm ist, der in Afrika wahrscheinlich nicht vertreten ist (Pridgeon et al., 1997). Die Beziehungen zwischen den Taxa von Habenariinae werden durch die ITS-Daten eigentlich schlecht aufgelöst, mit Ausnahme der Clusterung von Herminium lanceum mit Habenaria sagittifera (vgl. Pridgeon et al., 1997) und Habenaria procera mit H. arenaria/Bonatea speciosa. Die Sequenzen von Holothrix scopularia und Habenaria repens sind praktisch identisch und erfordern eine zusätzliche Sequenzierung anderer Habenaria repens Einzelpersonen und andere Holothrix Arten auf mögliche Probleme bei der Sequenzbestimmung oder Artbestimmung zu überprüfen (sie wurden nicht gleichzeitig extrahiert, daher ist ein Wechsel der Proben nicht wahrscheinlich). Dieses Beziehungsmuster wäre mit morphologischen Daten schwer zu rechtfertigen.

Viele der anderen Gattungen, die jetzt Habenariinae zugeschrieben werden, wurden früher oder später als Mitglieder von . angesehen Habenaria. Zum Beispiel, Gennaria, Herminium, und Bonatea haben bereits Kombinationen in Habenaria. Wir erwarteten die Umschreibung von Habenaria problematisch und so überraschen uns diese Ergebnisse nicht. Habenaria ist eine große kosmopolitische Gattung und umfasste einst sogar Arten der entfernt verwandten Gattung Platanthera (Orchidina). Wir gehen davon aus, dass einige Artengruppen möglicherweise die Bestäuberbeziehungen gewechselt haben und daher von Autoren getrennt wurden, die sich ausschließlich auf florale Merkmale zur generischen Abgrenzung verlassen.

Die Position von Satyriinae als Schwester von Orchidinae/Habenariinae hat ihre Parallele in den Studien von Linder und Kurzweil (im Druck), in denen die Platzierung der ersteren mehrdeutig war, wobei zwei von drei möglichen Anordnungen in ihren Bäumen minimaler Länge vorhanden waren. Die Blüten dieses Unterstammes sind nicht resupiniert, und die Säule ist stark modifiziert, so dass die Basis oben liegt, um den Eintritt des Bestäubers von der gegenüberliegenden Seite der Blüte zu ermöglichen. Das Vorhandensein von zwei Spornen, die von der Lippe produziert werden, ist nicht wie bei anderen Diseae und ähnelt eher den Spornen bei Orchideae, bei denen ein einzelner Sporn auch von der Lippe produziert wird. Die Säule in den Blüten der meisten Habenariinae (Orchideae) ist so kurz, dass ihre genaue Ausrichtung nicht bestimmt werden kann. Der Hauptgrund für die Platzierung von Satyriinae in Diseae ist das Vorhandensein des gebogenen Staubbeutels, aber bei Blumen wie denen von Orchideae, bei denen die Lippe der unterste Teil der Blütenhülle ist, würde man einen aufrechten Staubbeutel erwarten.

Die Kongruenz zwischen morphologischen und ITS-Daten

Für Diseae liegen zahlreiche Studien und kladistische Analysen vor (z. B. Kurzweil, Linder und Chesselet, 1991 Kurzweil et al., 1995 Johnson, Linder und Steiner, 1998). Die Überlagerung morphologischer, anatomischer und palynologischer Zeichenzustände auf molekularen Kladogrammen sollte es uns ermöglichen, zwischen Zeichen zu unterscheiden, die mit dem Rest des Datensatzes inkongruent sind, Zeichen, die kleine Untergruppen von Taxa unterstützen, und solchen, die eine große Menge von Taxa unterstützen (Kurzweil et al ., 1995). Die vegetativen und reproduktiven anatomischen Merkmale von Kurzweil et al. (1995) wurden auf unseren MP-Kladogrammen kartiert, um potenzielle Synapomorphien aufzudecken, die die Kladen definieren, die durch die ITS-Daten nachgewiesen werden (Abb. 4).

Disinae ausgenommen Schizodium (in dieser Studie nicht dargestellt) werden durch drei Synapomorphien definiert, die bei Diseae exklusiv sind: die Kelchblätter sind oft apikuliert, die Lippen offen oder an der Basis absteigend und die Pollenoberfläche rauh oder hamulate. Satyrium (Plus Satyridium). Die Korycium/Pterygodium clade wird durch sechs exklusive Synapomorphien definiert: ein einzelnes und verschmolzenes Lippenanhängsel, Antherenzellen, die durch eine breite verbindende, verlängerte Pollentetraden getrennt sind, faszikulierte Massulae und eine gestreifte und sekundär tektierte Pollenoberfläche.

Diese Überprüfung der diagnostischen Merkmale von Diseae (Abb. 4) zeigt eine breite und allgemeine Übereinstimmung zwischen Morphologie/Anatomie und den ITS-Datensätzen. Die Anordnung der Gefäßstränge in Knollen wurde jedoch als große Hilfe zur Lösung der phylogenetischen Fragen bei Diseae angesehen (Kurzweil et al., 1995). Diese molekularen Daten validieren das Szenario eines monostelen (d. h. nicht sezierten Knollensiphonostele) Vorfahrenzustands bei Diseae und Orchideae. Die „polystelic“ Bedingung (d. h. dissezierte Siphonostele) wird konvergent abgeleitet in Disperis lindleyana, Brownleea, Herschelia?, und in der Satyrium/Brachycorythis/Holothrix klade. Weitere Studien zur Aufklärung der Phylogenie der Orchideen können sich auf Verbreitungsstrukturen, entweder Pollen oder Samen, konzentrieren, nach dem Beispiel von Molvray und Kores (1995) bei der Bestimmung qualitativer und quantitativer Eigenschaften der Diurid-Samenhülle.

Die phylogenetischen Affinitäten von Diseae im Vergleich zu anderen Kernorchidoiden

Der Stamm Diseae umfasst 400 Arten, die in Südafrika, Arabien, Madagaskar, Maskarenen, Indien, China und Indonesien verbreitet sind. Die größte Vielfalt findet sich im südlichen Afrika mit mehreren endemischen Gattungen (z. Schizodium). Der Stamm wurde als monophyletisch erkannt, wobei alle Diseae durch die zurückgezogenen Staubbeutel gekennzeichnet sind, wodurch Pollinien auf den ventralen Oberflächen von Bestäubern platziert werden (z ). Die größte Diskrepanz zwischen der Morphologie und dem ITS-Baum konzentriert sich daher auf die Frage, ob Diseae monophyletisch sind oder nicht. Um zu untersuchen, ob die schwach unterstützte Paraphylie von Diseae im ITS-Baum als Ablehnung der Monophylie angesehen werden kann, haben wir die ITS-Daten auf diese Topologie beschränkt (Kladogramm nicht gezeigt). Die Monophylie von Diseae umfasst 19 zusätzliche Schritte im Vergleich zu den MP-Bäumen (Abb. 1), was im Vergleich zum Baum mit der höchsten Wahrscheinlichkeit (Abb. 3, Tabelle 2) eine deutlich weniger wahrscheinliche Topologie ist. Im Rahmen der Diseae-Monophylie entsteht zuerst Satyriinae und dann Coryciinae (Schwestergruppe von Disinae) plus Brownleea. Die Unterscheidbarkeit von Satyriinae im Vergleich zu anderen Diseae wird somit bestätigt, und zukünftige Studien sollten die evolutionären Affinitäten zwischen Satyriinae, Orchidinae und Habenariinae untersuchen. Dressler (1986) schlug vor, dass Disinae und Satyriinae näher beieinander stehen als Coryciinae, weil sie leuchtend farbige Kelchblätter und ein subterminales Stigma teilen. Diese Merkmale können jedoch homoplastisch sein, da sie Teil des bestäubungsanziehenden/orientierenden Syndroms sind. Die ITS-Daten lehnen diese Hypothese ab (Tabelle 2), begünstigen jedoch die Assoziation zwischen Disinae und Coryciinae. Diese Ansicht stimmt mit Dressler (1993) und Kurzweil et al. (1995), die für Disinae plus Coryciinae die horizontal zurückgezogene Anthere und das galeate dorsale Kelchblatt als Synapomorphien betonten. Diese Beziehung findet sich auch in unserem aktuellen Plastidenbaum (Kores, Molvray und Chase, unveröffentlichte Daten).

Das Einschränken von Diseae-Monophylie beinhaltet tatsächlich die Verwurzelung des MP-Baums (Abb. 1) fast auf dem Orchideae-Internodium (Kladogramm nicht gezeigt). Diese alternative Verwurzelung des Kernorchidoiden-Unterbaums würde weder die Position von erklären Disperis noch die Beziehungen zwischen Habenariinae. Daher kann die Wurzelbildung des ITS-Baums mit Diuriden und Spiranthoiden als Fremdgruppen aufgrund der großen Divergenz zwischen diesen Fremdgruppen und den Kernorchidoiden unzureichend sein (Abb. 2). Diseae und Orchideae stellen eine abgeleitete und gut charakterisierte Klade dar, die durch ein langes Ahnensegment definiert ist (Kores et al., 1997), was die Verwendung engerer Fremdgruppen ausschließt. Dieses Problem gilt für phylogenetische Studien von Kernorchidoiden, unabhängig von der Art der verwendeten Merkmale (morphologisch, anatomisch, palynologisch, chromosomal und molekular). Im vorliegenden Fall erscheinen ITS-Charaktere geeignet, um die Phylogenie innerhalb der Hauptstamm-Orchidoid-Linien zu rekonstruieren, stoßen jedoch für Fernvergleiche in der Unterfamilie Orchidoideae an ihre Grenzen.

Umgekehrt unterstützt diese molekulare Studie die Paraphylie von Diseae (Abb. 1, 3, Tabelle 2) und widerspricht daher allen früheren Interpretationen floraler Merkmale. Die Analyse morphologischer/anatomischer Daten ergab jedoch keine apomorphen Merkmale in der vegetativen Anatomie von Diseae (Kurzweil et al., 1995). Unsere ITS-Daten könnten so interpretiert werden, dass eine reflektorische Anthere repräsentiert: (1) den angestammten Zustand unter den Kernorchidoiden und die aufgerichtete Anthere einen abgeleiteten Zustand oder (2) einen labilen Charakterzustand, der durch den mehrfach aufgetretenen Bestäuberdruck kontrolliert wird. Es ist wahrscheinlicher, dass dieses Szenario zu einfach ist. Die Säulen- und Lippenstruktur in jeder der sieben Kladen (Disperis, Brownleeinae, Disinae, Korycium/Pterogodium, Satyriinae, Orchidinae und Habenariinae), die sowohl hier als auch in den morphologischen kladistischen Studien als monophyletisch identifiziert wurden, so unterschiedlich voneinander sind, dass die einfache Beschreibung der Säule als entweder gebogen oder aufrecht zu beschreiben äußerst unbefriedigend und mit ziemlicher Sicherheit ungenau ist. In Verbindung mit dem Befund von Kurzweil et al. (1995), dass es für diese Pflanzen keine apomorphen vegetativen Merkmale gibt, ist die beste Einschätzung, dass es nie eine genaue Bewertung der Phylogenie bei Orchideae/Diseae gegeben hat, da noch keine Synapomorphien identifiziert wurden, die auf ein anderes Paar von Unterstämmen als . zutreffen könnten Disinae/Korycium/Pterogodium, die alle die Saccatehöhle / den Sporn auf ihren dorsalen Kelchblättern teilen. Vielleicht werden Orchideae/Diseae am besten als ein einzelner Stamm betrachtet.

Perspektiven

Dieser Überblick über die molekulare Phylogenie von Diseae unterstreicht die Notwendigkeit zusätzlicher taxonomischer Stichproben. Die Gattungen Schizodium und Pachites wird die generische Darstellung von Disinae und Satyriinae vervollständigen. Aufnahme der Gattungen Ceratandra und Evotella wird uns helfen, die Phylogenie von Coryciinae zu rekonstruieren, die als Schlüsselunterstamm für das Verständnis der Evolution von Diseae und Orchideae erscheint. Molekulare Studien sollten auch die seltenen Huttonäa, gekennzeichnet durch Blüten mit spatelförmigen Kelchblättern und zuvor in Orchideae platziert (Dressler, 1981). Der monogenerische Stamm Huttonaeinae wurde kürzlich anerkannt und in Diseae aufgenommen (Linder und Kurzweil, 1994) und könnte ein wesentliches Taxon darstellen, um die genaue Beziehung zwischen Diseae und Orchideae zu bestimmen (Dressler, 1993).

Weitere Studien an Kernorchidoiden unter Verwendung der ITS1- und ITS2-Marker könnten ihre molekulare Evolution untersuchen.Auch die Auswertung von ITS-Sekundärstrukturen kann helfen, divergente Sequenzen auszurichten und die Dynamik des Indel-Vorkommens zu charakterisieren. Die Sequenzierung eines phylogenetischen Markers, der sich von nicht-kodierender nuklearer DNA für die gleichen Diseae, Orchideae, Diurideae und Spiranthoiden-Taxa unterscheidet, würde ebenfalls helfen, verbleibende Mehrdeutigkeiten aufzulösen. Vielversprechende alternative Marker können im Plastidengenom gefunden werden, zum Beispiel das Protein-kodierende matK, rps4, und rbcL Gene, oder die nichtkodierende rps4/trnS, trnL-F und atpB/rbcL Introns und Spacer.

Diese Studie zu ITS-Sequenzen bestätigt die Ergebnisse einer großen Anzahl früherer Arbeiten zur Morphologie von Diseae (im Text zitiert) und identifiziert weitgehend dieselben Gruppen, die bereits aus diesen Studien klar hervorgegangen sind. Die Unterstützung für die meisten der gleichen Gruppen, die durch morphologische Apomorphien unterstützt werden, ist hoch, und die Punkte, an denen Abweichungen bestehen, könnten das Ergebnis einer unzureichenden Taxon-Stichprobe für ITS sein. Zwei wichtige neue und widersprüchliche Muster erscheinen in den ITS-Bäumen: (1) die Entfernung von Disperis von Coryciinae, und (2) die Verwurzelung der basitonischen Orchideen innerhalb von Diseae und nicht zwischen Diseae und Orchideae, wodurch Diseae paraphyletisch wird. Diese beiden Ergebnisse sind insofern ähnlich, als sie die schwächsten Punkte in unserem Verständnis dieser Pflanzen sind, die aus früheren Arbeiten abgeleitet wurden. Die genaue Position von Disperis war ein problematisches Thema für die Morphologie, und es fehlt eindeutig das Muster der reichlich vorhandenen Synapomorphien, die verbinden Pterygodium und Korycium. Die Identifizierung einer alternativen Position für Disperis ist faszinierend und wird in zukünftigen Studien (von denen einige, zumindest die molekularen, bereits im Gange sind) weiterverfolgt werden. Das zweite Muster, die Wurzelbildung, wurde nie zuvor mit irgendeiner Form von Daten analysiert und ist daher vielleicht nicht so überraschend, insbesondere wenn die gebogene Anthere dieser Gruppen, die einzige potenzielle Synapomorphie von Diseae, gegen die Vielfalt betrachtet wird von Säulen-/Lippenstrukturen beobachtet. Obwohl die ITS-Topologie selbst entlang ihrer Wirbelsäule nicht stark unterstützt wird, ist die Alternative viel weniger sparsam und auch aus ML-Perspektive weniger wahrscheinlich. Die Bedeutung dieser Studie liegt dann erstens in der Bestätigung der Ergebnisse aus akribischen und langwierigen Studien der Morphologie/Anatomie durch DNA-Sequenzanalyse und zweitens in der Entdeckung neuer Muster, die als sinnvolle Alternativen zu den bisher gehaltenen erscheinen und auf die sich die zukünftige Arbeit nun konzentrieren kann.

Tabelle 1. Liste der Arten und Gattungen, für die die ITS-Region in dieser Studie sequenziert wurde. Der taxonomische Rahmen für supragenerische Kategorien folgt Schlechter (1901), Linder (1981a), Kurzweil, Linder und Chesselet (1991), Dressler (1993) und Linder und Kurzweil (1994). In der letzten Spalte sind die Zugangsnummern in den EMBL/GenBank/DDBJ-Datenbanken aufgeführt.

Strenger Konsens der beiden sparsamsten Bäume, die von PAUP rekonstruiert wurden 3.1.1. aus der ITS1-5.8S rDNA-ITS2-Matrix von 54 Orchideentaxa und 711 Stellen (566 waren variabel und 506 phylogenetisch informativ), wobei Indels als fünfter Charakterzustand kodiert wurden. Baumstatistiken sind: Länge = 3471, CI = 0,40, RI = 0,56 und CI ohne nicht informative Seiten = 0,39. Als Fremdgruppen wurden die Spiranthoiden- und Diurid-Taxa angegeben. Die Zahlen über den Zweigen sind Bootstrap-Prozentsätze (BP) von 100 Replikaten (ein Bindestrich zeigt an, dass es keine Bootstrap-Unterstützung für den Knoten gibt). Die Zahlen unter den Zweigen sind die entsprechenden Bremer Support (BS)-Indizes, die die Anzahl der zusätzlichen Schritte anzeigen, die erforderlich sind, um den Zweig zu reduzieren. Dicke Linien zeigen eine hohe BP- und BS-Unterstützung für die Kladen an. Satyriinae bezeichnen die Untertribusteilung von Linder und Kurzweil (1994) minus Pachites (beachten Sie, dass Satyrium rhynchantum = Satyridium rostratum). Coryciinae s.s. (Kurzweil, Linder und Chesselet, 1991) entsprechen der Untertribuseinteilung von Linder und Kurzweil (1994) ohne Disperis (Gewebe von Ceratandra und Evotella waren nicht vorhanden). Habenariinae hier enthalten Brachycorythis und Holothrix. Die Habenaria repens, H. sagittifera, und H. procera Sequenzen wurden freundlicherweise von J. R. Hapeman zur Verfügung gestellt.

Plot der Anzahl der beobachteten Unterschiede (Übergänge, Transversionen und Deletionen) gegen die Anzahl der abgeleiteten Substitutionen zwischen jedem Paar von Taxa, wie durch maximale Sparsamkeit für 1431 paarweise Vergleiche zwischen den ITS1-5.8S rDNA-ITS2-Sequenzen von 54 Orchideentaxa abgeleitet. Der kürzeste Baum, an dem die patristischen Distanzen berechnet wurden, war 3471 Schritte lang. Schwarze Dreiecke repräsentieren die Vergleiche zwischen den sechs am weitesten entfernten Taxa (Cranichis, Chloraea, Diuris, Elythranthera, und die beiden Disperis) und alle anderen Diseae- und Orchideae-Taxa. Offene Kreise repräsentieren alle Vergleiche zwischen Disinae, Satyriinae, Coryciinae (außer den beiden Disperis), Brownleeinae, Orchidinae und Habenariinae Taxa. Die gestrichelte Linie entspricht einer gleichen Anzahl von beobachteten Unterschieden und abgeleiteten Substitutionen (d. h. keine mehrfachen Änderungen). Der hohe Anteil an multiplen Veränderungen zeigt sich bei Vergleichen mit Diurid, Cranichid und Disperis relativ zu den anderen.

Baum mit der höchsten Wahrscheinlichkeit, gefunden nach Auswertung von insgesamt 280 sparsamsten Bäumen und Bäumen, die ein und zwei Schritte länger als MP-Bäume sind, wie vom DNAML-Programm berechnet (Ti/Tv-Verhältnis = 1,38). Als Fremdgruppen wurden die Spiranthoiden- und Diurid-Taxa verwendet. Die Log-Likelihood dieses Baums beträgt −14099,2 und seine Länge beträgt 2905 Schritte (zwei Schritte länger als der MP-Baum). Die Log-Likelihood-Werte dieser MP-Bäume, einstufigen und zweistufigen längeren Bäume reichen vom besten bis -14118.3. Internodiumsegmente, die sich nicht signifikant von 0 unterscheiden (an der P < 0,01 Stufe) sind mit einem Stern gekennzeichnet. Der Quartett-Rätselalgorithmus (PUZZLE 2.5.1) ergab einen weniger aufgelösten Baum, und die Zuverlässigkeitsprozentsätze (RP) sind für die Knoten gemeinsam mit dem DNAML-Baum angegeben. Dicke schwarze Segmente führen zu verschiedenen Diseae-Taxa und dünne Segmente zu anderen Nicht-Diseae-Orchidoid-Taxa.

Kartierung der morphologischen, anatomischen und palynologischen Charakterzustände auf dem aus den molekularen ITS-rDNA-Daten rekonstruierten Kladogramm. Die gezeigte Topologie ist der strikte Konsens der drei sparsamsten Kladogramme, die aus der Analyse der ITS-rDNA-Matrix mit als fehlende Daten kodierten Indels abgeleitet wurden (Länge = 2903 CI = 0,37 RI = 0,53 CI ohne uninformative Sites = 0,35). Die Beziehungen innerhalb jeder Untergruppe wurden nicht detailliert beschrieben, aber die Höhe der Dreiecke ist proportional zur Anzahl der beprobten Arten. Es werden nur exklusive Synapomorphien berichtet. Die Anzahl der eindeutigen molekularen ITS-rDNA-Charakterzustandsänderungen ist für jeden Zweig in Kreisen angegeben. Die Optimierung dieser Änderungen an den drei Einzelbäumen ist für alle dargestellten Zweige die gleiche wie am strengen Konsensbaum.


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